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Energia Renovável 158 (2020) 253e262

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Energia renovável
Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/renene

Abordagem da função de desejabilidade para otimização da transesterificação

enzimática catalisada por lipase imobilizada em nanopartículas magnéticas
mesoporosas
Golmohammad Khoobbakhta, Kamran Kheiralipourb,*, Wenqiao Yuanc,
Mohammad Reza Seifid, Mahmoud Karimid,**
aDepartamento de Engenharia Agrícola, Universidade Payame Noor, Teerã, Irã
bDepartamento de Engenharia Mecânica de Biossistemas, Universidade Ilam, Ilam, Irã
cEngenharia Biológica e Agrícola, North Carolina State University, Carolina do Norte, EUA
dDepartamento de Engenharia de Biossistemas, Universidade Arak, Arak, 38156-8-8349, Irã

informações do artigo abstrato

Historia do artigo: A transesterificação catalisada por lipase para a produção de biodiesel é limpa, eficaz e tolerante à água se compara
Recebido em 17 de junho de 2019 aos métodos convencionais de síntese química ou física de biodiesel. Portanto, na presente pesquisa,Burkholderia
Recebido de forma revisada em 6
cepaciaa lipase foi imobilizada em nanopartículas magnéticas mesoporosas de sílica/óxido de ferro para conversão
de maio de 2020
de óleo de cozinha residual de canola (WCO) em biodiesel. A Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) com
Aceito em 16 de maio de 2020. Disponível
Design Composto Central (CCD) foi utilizada para otimizar os parâmetros de transesterificação. Uma equação
online em 26 de maio de 2020.
polinomial quadrática foi obtida para o rendimento de biodiesel por análise de regressão múltipla. A abordagem da
função de desejabilidade deu a condição ideal de transesterificação como: concentração de lipase imobilizada de
Palavras-chave:
36%, tempo de reação de 25 h, razão molar de metanol para WCO de 6,2 e temperatura de reação de 34-C. O
Biodiesel
Lipase imobilizada rendimento previsto de biodiesel foi de 92% na condição ideal. A transesterificação catalisada pela lipase imobilizada
Nanopartículas magnéticas foi realizada três vezes repetidamente, perdendo apenas 11% da atividade da lipase no terceiro ciclo da
Metodologia de superfície de resposta transesterificação.
©2020 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

1. Introdução Considera-se que a imobilização da enzima permite o uso frequente da enzima

O combustível biodiesel (ésteres metílicos de ácidos graxos) atraiu
recentemente considerável atenção como um combustível renovável,
biodegradável e não tóxico.1,2] que é utilizado em motores diesel devido às suas
vantagens e benefícios [3e5]. É sintetizado por transesterificação de triglicerídeos
que geralmente é acelerado usando diferentes catalisadores [6].
A reação de transesterificação é convencionalmente catalisada por
catalisadores químicos, como álcalis [7], ácido [8], catalisador sólido [9] e
enzimas lipases como biocatalisadores [10,11]. Os catalisadores enzimáticos
servem como uma tecnologia promissora para a síntese de biodiesel devido
às condições de reação suaves, fácil recuperação do produto, sendo
ecologicamente corretos e pouco exigentes em matérias-primas em
comparação com métodos químicos.10].
* Autor correspondente.
* * Autor correspondente.
Endereço de e-mail:k.kheiralipour@ilam.ac.ir (K. Kheiralipour),m-karimi@araku. ac.ir
(M. Karimi).
[12]. Além disso, a imobilização também pode melhorar a estabilidade, a atividade
e a reutilização das enzimas [13]. Os suportes apropriados no processo de
imobilização, por serem de baixo custo e proporcionarem grande área superficial
adequada, desempenham um papel fundamental para a imobilização da lipase [14
].
Nanopartículas magnéticas de sílica/óxido de ferro com benefícios
como separação fácil e rápida foram recentemente introduzidas como
suportes apropriados para imobilização de enzimas [15]. As lipases
imobilizadas em microesferas magnéticas mesoporosas como suporte
podem ser rapidamente separadas do meio de reação e controladas de
forma eficaz pela aplicação de um campo magnético. Além disso, os
métodos de ligação covalente têm sido amplamente adotados na
imobilização da lipase em diferentes suportes. Portanto, uma molécula
de lipase pode ser imobilizada formando uma ligação covalente entre
um grupo ativo no suporte e o resíduo de aminoácido da lipase [16].
O objetivo da presente pesquisa foi estudar os efeitos do catalisador
lipase imobilizado no rendimento da transesterificação do óleo de cozinha
residual de canola (OMA). A otimização da produção de biodiesel e o
desenvolvimento de modelos relacionados foram conduzidos por resposta

https://doi.org/10.1016/j.renene.2020.05.087 0960-1481/©
2020 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
254 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262
metodologia de superfície (RSM). Além disso, o uso frequente da lipase
imobilizada na transesterificação da WCO também foi examinado para
investigar a estabilidade da lipase imobilizada.
2. Materiais e métodos
2.1. Materiais
Cloreto férrico hexa-hidratado (98%), pellets de hidróxido de sódio
(97%), tetraetilortossilicato, TEOS (98%), hidróxido de tetrametil
amônio, TMA (25%), hidróxido de amônio (28e30% NH3base),
glutaraldeído (25% em H2O), cloreto ferroso tetra-hidratado (99%),
brometo de hexadeciltrimetil amônio, CTAB (99%), ácido clorídrico (36,5
e38%), metanol, etanol eBurkholderia cepacialipase foram todas
adquiridas da Sigma-Aldrich. A lipase deBurkholderia cepacia,
anteriormente conhecido comoPseudomonas cepacialipase, é uma
enzima comercial nas formas solúvel e imobilizada, amplamente
reconhecida por sua resistência térmica e tolerância a um grande
número de solventes e álcoois de cadeia curta. As principais aplicações
desta lipase são em reações de transesterificação e na síntese de
medicamentos (devido às propriedades citadas acima). O óleo de
cozinha residual de canola (OMA) foi obtido em um restaurante local
com autoridade do governo local. Todos os reagentes foram utilizados
como recebidos, sem purificação adicional. Água deionizada foi
utilizada em todos os experimentos.
2.2. Preparação de NPs magnéticos
Nanopartículas core-shell superparamagnéticas de sílica mesoporosa-
SPION foram preparadas com base no método descrito no trabalho anterior
[17]. As SPIONs foram produzidas por coprecipitação de cloreto férrico hexa-
hidratado desgaseificado e ácido (10,81 g) e cloreto ferroso tetra-hidratado
(3,97 g) em hidróxido de amônio (0,7 M) em um reator de balão de fundo
redondo sob bolha de nitrogênio gasoso e agitação magnética. A solução
preparada conhecida como ferrofluido foi mantida em 4-C sob N2atmosfera
até uso posterior como núcleo em nanopartículas magnéticas.
As nanopartículas núcleo-invólucro superparamagnéticas de sílica /
óxido de ferro mesoporosas foram preparadas com base no método sol-gel
usando tetraetilortossilicato (TEOS) como precursor e brometo de
hexadeciltrimetil amônio (CTAB) como dispersante, formação de poros e
agente de proteção. As partículas foram então separadas usando um ímã e
lavadas várias vezes. Os NPs magnéticos foram finalmente secos em estufa
a 70-Ce80-C por 12 horas e depois calcinado a 550-C por 8h. As propriedades
magnéticas dos NPs magnéticos foram então avaliadas com um
magnetômetro de amostra vibratória usando um modelo LakeShore 7304 à
temperatura ambiente.
2.3. Imobilização de lipase
Para imobilizar a lipase nas NPs magnéticas, os grupos amino primários
das microesferas foram ativados utilizando o agente de acoplamento
glutaraldeído para uma ligação com o resíduo de aminoácido da lipase [18,
19]. A lipase pode ser imobilizada covalentemente nas nanopartículas
superparamagnéticas, formando uma ligação de base de Schiff entre o
grupo aldeído do glutaraldeído e o grupo amino terminal da lipase. Para
este propósito, 2 g de NPs superparamagnéticos secos foram re-dispersos
em 20 cm3de 100 g kg-1
solução de glutaraldeído em tampão fosfato a pH 7,5 e a reação foi
deixada prosseguir a 30-C por 5h. Posteriormente, as partículas
ativadas por glutaraldeído foram decantadas por um ímã forte e
posteriormente lavadas com água destilada. Em seguida, os NPs
magnéticos foram secos a 90-C por 24 horas em forno térmico e
armazenado em ambiente ambiente até posterior uso.
Uma imobilização típica foi então iniciada com redispersão de
2 g de NPs ativadas por glutaraldeído, em 20 cm3de 3 mg cm-3
solução de lipase (25 mol m-3tampão fosfato, pH 7,5) sob agitação
magnética vigorosa a 35-C. Os experimentos foram realizados variando
a concentração de lipase em solução, temperatura e tempo de reação.
Após a conclusão da reação de imobilização, a lipase imobilizada foi
separada pela aplicação de um dispositivo magnético externo. Os
precipitados obtidos foram lavados cuidadosamente com tampão
fosfato várias vezes para remoção de toda a lipase não ligada. A lipase
imobilizada ficou pronta para uso na síntese de biodiesel de WCO após
secagem por liofilização a -50-C e 25 kPa por 48 horas. Um esquema da
síntese de NPs de sílica SPION e imobilização de lipase é mostrado em
Figura 1.
O sobrenadante foi utilizado para determinação enzimática pelo
método de Bradford usando albumina sérica bovina (BSA) como padrão
[20]. A quantidade imobilizada de enzima foi calculada subtraindo a
quantidade de enzima não imobilizada da quantidade total de enzima
utilizada para imobilização. A eficiência de imobilização da lipase nas
NPs superparamagnéticas foi determinada de acordo com a seguinte
equação.
ðCeu-CfºV1
q¼ (1)
CeuV2
ondeqrepresenta a eficiência de imobilização (%),CeueCfsão a
concentração da lipase solúvel inicial e a concentração final da lipase no
sobrenadante após a imobilização, respectivamente (mg cm-3), eV1eV2
são o volume da solução (cm3) no final e no início do processo de
imobilização, respectivamente.
2.4. Ensaios de atividade enzimática
A atividade hidrolítica da lipase livre e imobilizada em NPs
magnéticos foi medida pela hidrólise do azeite [16,21].Até 4 cm3de
emulsão de azeite e 5 cm3do tampão fosfato (0,025 mol dm-3, pH 7,5),
foi adicionada uma quantidade pré-determinada da lipase livre ou
imobilizada e a reação de hidrólise foi realizada a 40-C por 15min. Os
ácidos graxos resultantes foram então medidos por titulação com 0,05
mol dm-3Solução de NaOH usando um indicador de fenolftaleína. Uma
unidade de atividade de lipase foi definida como a quantidade de lipase
que libera 1eumol de ácido graxo por minuto nas condições de ensaio [
16]. A recuperação da atividade (%) remanescente após a imobilização
foi a razão entre a atividade da lipase ligada e a atividade total da lipase
adicionada na solução de imobilização inicial.
2.5. Reação de transesterificação enzimática
Na primeira etapa da reação de transesterificação enzimática, o
WCO foi filtrado a vácuo com papel filtro para remover quaisquer
impurezas. O WCO refinado foi continuamente agitado à temperatura
de 80-C por 10 min com 1% de H3PO4(85%). A mistura foi então
centrifugada para remover completamente o conteúdo do colóide e da
água dentro do WCO.
As reações de transesterificação foram realizadas em um recipiente de
50 cm3frasco tampado em uma incubadora com agitação. Uma mistura de
reação típica incluía 5 g de WCO concentrações predeterminadas da lipase
imobilizadan-hexano, água e uma adição de metanol em três etapas com
igual quantidade e intervalo de tempo em cada etapa. Após completarem os
tempos de reação pré-determinados, as misturas reacionais foram
cuidadosamente filtradas por separação magnética. O excesso de metanol
de cada amostra foi destilado com o auxílio de um evaporador rotativo sob
pressão reduzida e, em seguida, as amostras foram retiradas em
temperatura ambiente para medir o teor de FAMEs.
Os experimentos foram realizados variando variáveis experimentais,
incluindo concentração de lipase imobilizada (x1), tempo de reação (x2),
 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262
Figura 1.Ilustração esquemática da síntese da imobilização de lipase em nanopartículas core-shell superparamagnéticas de sílica mesoporosa-SPION.
metanol para ração molar WCO (x3) e temperatura de reação (x4). Além
disso, sabe-se que a lipase é um tipo de enzima especial que atua na
interface entre uma fase aquosa e uma fase orgânica. A água facilita o
aumento da área interfacial disponível para a lipase. A ativação da
lipase depende do desmascaramento e reestruturação do sítio ativo da
molécula da enzima, o que requer a presença da interface óleo-água [
22]. Assim, o efeito do teor de água na mistura reaccional sobre a
actividade da lipase ligada foi avaliado adicionando deliberadamente
diferentes quantidades de água ao sistema reaccional.
2.6. Ensaio FAMEs
O conteúdo de FAMEs nas amostras experimentais foi analisado por
cromatografia gasosa (Shimadzu GC-2010) equipada com detector de
ionização de chama de hidrogênio. A separação foi realizada em coluna
capilar DB-1HT (30 m 0,25 mm). O GC foi calibrado com base em várias
concentrações de salicilato de metila, palmitato de metila, estearato de
metila, oleato de metila, linoleato de metila e linolenato de metila. Na
análise de duração, a temperatura de entrada da amostragem foi de
370-C e a temperatura do detector era 375-C. A temperatura da coluna
foi elevada regularmente. A temperatura da coluna foi inicialmente
mantida em 150-C por 2 minutos e depois aumentado para 360-C a
uma taxa de 10-C min-1e finalmente mantido em 360-C por 10 min.
Nitrogênio a uma pressão pré-coluna de 100 kPa foi usado como gás
de arraste. O conteúdo de FAMEs nas amostras experimentais foi
calculado pela seguinte equação:
eu
Xð%Þ ¼FAMA 100%
euOMA
ondeXé o conteúdo FAME,euFAMAé o peso do FAME calculado com
método de calibração interna, eeuOMAé o peso da OMA [23].
2.7. Projeto experimental e otimização
O processo de imobilização precisa ser otimizado para produzir
lipase imobilizada com alta qualidade e eficiência na síntese de
biodiesel. O uso de ferramentas avançadas de análise de dados não
lineares, como a metodologia de superfície de resposta (RSM) em
biotecnologia ambiental e engenharia bioquímica, tem uma tradição
bem estabelecida. A análise de superfície de resposta, os modelos mais
utilizados, inclui planejamento fatorial e análise de regressão. O RSM
avalia os fatores efetivos e na construção de modelos para estudar a
interação e selecionar condições ótimas de variáveis para uma
resposta desejada [24,25].
Na presente pesquisa, o RSM foi utilizado para investigar a influência das
variáveis do experimento que consistem na concentração de lipase
imobilizada (x1), tempo de reação (x2), metanol para ração molar WCO (x3) e
temperatura de reação (x4) no rendimento de biodiesel. As corridas
experimentais foram projetadas com base em eixos centrais giratórios
255
delineamento composto (RCCD) com cinco níveis para cada uma das quatro
variáveis independentes. As execuções totais de experimentos em um RCCD
podem ser calculadas pela seguinte equação:
N¼2nº2nºn0 (3)
ondeNé o número total de execuções experimentais,né o número de
variáveis do experimento en0é o número de pontos centrais. O
número total de execuções experimentais foi calculado em 27,
consistindo em oito pontos fatoriais (2n¼16), seis pontos axiais (2n¼8) e
seis pontos centrais (nó¼3). Cada variável experimental no RCCD foi
projetada em três níveis diferentes (-1, 0,º1) e dois pontos axiais (±a)ao
longo de cada eixo coordenado em lados opostos da origem e a uma
distância igual à semi-diagonal do hipercubo do planejamento fatorial e
novos valores extremos (baixo e alto) para cada fator adicionado neste
planejamento [26]. O valor deaque é importante para a robustez de um
projeto, foi calculado como 2 pora¼ ½2n1=4.tabela 1 resume a faixa e os
níveis das variáveis experimentais investigadas no presente estudo
nas formas reais e codificadas.
Um modelo polinomial empírico de segunda ordem, desenvolvido pela
RSM, correlaciona o rendimento da reação em função das variáveis do
experimento e suas interações conforme mostrado na seguinte equação:
X4 X4 XX
3 4
S¼b0º beuxeuº beux2euº beu jxeuxj (4)
eu¼1 eu¼1 eu¼1j¼euº1
ondeSé a resposta prevista,xeué oeua variável do experimento,
b0é a interceptação,beué o coeficiente do modelo de primeira ordem,beué o
(2)
coeficiente quadrático da variáveleuebeu jé o coeficiente de interação
das variáveiseuej.Os parâmetros dos coeficientes do modelo
desenvolvido pelo RSM foram estimados por análise de regressão
linear múltipla baseada no método dos mínimos quadrados e avaliados
estatisticamente por análise de variância (ANOVA), bem como o modelo
desenvolvido foi avaliado qualitativamente pelo valor de correlação (R2)
usando o software SAS versão 9.2.
A análise da função de desejabilidade (DFA) é um dos métodos mais
utilizados na indústria para lidar com a otimização de processos de
múltiplas respostas. RSM é uma estratégia sequencial que nos permite
abordar a região ótima e representar a resposta de forma eficiente,
enquanto a abordagem da função de desejabilidade é uma técnica útil
para análise de experimentos nos quais a resposta precisa ser
otimizada. O RSM e o DFA demonstraram ser eficientes para otimizar
os parâmetros experimentais de rugosidade superficial. A otimização
de resposta única determina como os parâmetros de entrada afetam a
conveniência da resposta individual, enquanto a otimização numérica
encontra um ponto que maximiza a função de conveniência.
Ajustar o peso ou a importância pode alterar as características de uma meta.
O feed de meta para resposta na abordagem da função de desejabilidade deve ser
uma das cinco opções: nenhuma, máximo, mínimo, alvo ou dentro do intervalo. O
DFA transforma a resposta em uma função de desejabilidade que assume valores
no intervalo 0 <d <1. A desejabilidade será 1 se
256 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262

tabela 1
Restrições de variáveis de processo e respectivos níveis para RCCD.

Variáveis Símbolo codificado Alcance e níveis

-2 -1 0 1 2

Concentração de enzima (%) X1 5 15 25 35 45

Tempo de reação (h) X2 5 10 15 20 25
Razão molar metanol/WCO (mol/mol) X3 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1
Temperatura (-C) X4 25 30 35 40 45

a variável de resposta está em seu objetivo ou alvo e se tornará zero se Nanopartículas core-shell de sílica mesoporosa-SPION com lipase
a variável de resposta estiver fora do intervalo aceitável [27]. No ligada foram avaliadas usando uma técnica VSM. As medições foram
presente estudo, o alvo para a resposta é um valor máximo. A resposta realizadas à temperatura ambiente. Como pode ser visto emFigura 3, a
é transformada emdcomo: magnetização de saturação da lipase imobilizada foi de 45,69 Am2
Kg-1, enquanto para o Fe puro3Ó4NPs a magnetização de saturação atingiu
1 você< T 68,14 Am2Kg-1. A histerese muito fraca confirmou que os NPs magnéticos
Você - você eram quase superparamagnéticos, o que é uma propriedade especialmente
d¼fð ºR T sim você (5)
U-T importante necessária para portadores magnéticos [28]. Pode-se observar
também na figura que o momento de magnetização do Fe3Ó4
0 você> você
as nanopartículas diminuíram ligeiramente após a imobilização da lipase. A

onde U é o limite superior de especificação, T é o valor alvo, y é a resposta e propriedade magnética das nanopartículas core-shell mesoporosas de sílica-

r é o peso. SPION é uma vantagem significativa para a imobilização enzimática em

comparação com suportes não magnéticos. Devido à manutenção de um alto
valor de magnetização de saturação, a lipase imobilizada utilizada nas reações de
2.8. Ensaio de reutilização
transesterificação das amostras experimentais pôde ser facilmente separada da
mistura reacional por meio de um campo magnético.
Para avaliar a estabilidade da lipase imobilizada, a lipase imobilizada
utilizada foi separada por um ímã forte, lavada com tampão fosfato
(0,003 mol dm-3fosfato, pH 6, 0,1 mol dm-3
NaCl) etert-butanol e finalmente congelareseco. A lipase imobilizada
recuperada foi então reutilizada na próxima reação com substratos
frescos para síntese de biodiesel. A condição das reações relacionadas
ao ensaio de reutilização da lipase imobilizada foi fixada no zero
codificado para todas as variáveis do experimento.

3 Resultados e discussão

3.1. Características das partículas magnéticas

Micrografias TEM típicas para NPs de sílica SPION são mostradas

em Figura 2. Os SPIONs têm um tamanho médio em torno de 20 nm e
o tamanho médio dos NPs core-shell é em torno de 100 nm. A estrutura
mesoporosa da sílica também pode ser observada emFigura 2. Os NPs
são facilmente dispersos em água e suas propriedades
superparamagnéticas evitam que tenham histerese magnética, o que
pode resultar em aglomeração. Tanto o pequeno tamanho quanto as
estruturas mesoporosas da sílica aumentam sua superfície ativa para
imobilização e adsorção. Figura 3.Curvas de magnetização à temperatura ambiente para a) Fe3Ó4eb) NPs SPION-Sílica com
As propriedades magnéticas do Fe sintetizado3Ó4nanopartículas e lipase ligada.

Figura 2.Imagens TEM de NPs de sílica SPION. Os pontos escuros mostram as SPIONs que estão embutidas dentro da sílica porosa. A estrutura porosa da casca de sílica pode ser notada nas bordas.
 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262
Figura 4.Efeito do conteúdo de lipase na eficiência da imobilização e recuperação da atividade.
Além disso, o movimento da lipase imobilizada no reator pode ser
efetivamente controlado pela utilização de dispositivos magnéticos
permanentes externos.
3.2. Eficiência e recuperação de atividade para imobilização de lipase
A lipase foi imobilizada nas nanopartículas core-shell mesoporosas de
sílica-SPION usando o grupo aldeído do glutaraldeído como agente ativador.
Vários pesos de lipase variando de 1 a 9 mg foram utilizados para
imobilização em nanopartículas core-shell de sílica mesoporosa-SPION de
200 mg, a fim de determinar a quantidade adequada de lipase para a
imobilização. Como mostrado emFigura 4, a eficiência de imobilização
diminuiu ligeiramente de 85,3% para 80,7% com o aumento da lipase de 1
para 5 mg, e depois diminuiu acentuadamente com o aumento adicional da
lipase de 5 para 9 mg. Embora tenha ocorrido uma concentração mais
elevada de ligação de lipase à medida que a concentração baixa de lipase foi
utilizada para imobilização, houve perda substancial de atividade enzimática.
A recuperação da atividade atingiu seu valor máximo de 68,4% em uma
concentração de lipase de 5 mg em 200 mg de nanopartículas core-shell de
sílica mesoporosa-SPION. Posteriormente, diminuiu ligeiramente com o
aumento adicional da concentração de lipase até 9 mg.
Figura 5ilustra a eficiência da imobilização e recuperação da
atividade em função do tempo. Fica claro na figura que com uma
quantidade constante de lipase de 5 mg com o aumento do tempo de
imobilização de 10 para 40 minutos, a eficiência de imobilização
aumentou de 30,7% para 74,3%. No entanto, a eficiência de
imobilização nas nanopartículas core-shell mesoporosas de sílica-
SPION quase se manteve constante quando o tempo de imobilização se
prolongou além de 45min. É atribuído ao fato de que a imobilização foi
rápida nos estágios iniciais da imobilização e, com o aumento adicional
do tempo de imobilização, a superfície das partículas magnéticas ficou
saturada com lipase. Além disso, como pode ser visto emFigura 5, a
recuperação da atividade da lipase imobilizada aumentou com o
aumento do tempo de imobilização e a maior recuperação da atividade
ocorreu no tempo de imobilização de 55min. Porém, a recuperação da
atividade da lipase imobilizada começou a diminuir com o aumento do
tempo de imobilização. Portanto, o tempo ideal de imobilização da
lipase nas nanopartículas core-shell mesoporosas de sílica-SPION foi
considerado como sendo de 55 minutos para a imobilização da lipase
no Fe magnético3Ó4partículas.
3.3. Desenvolvimento da equação do modelo de regressão
A matriz de projeto completa e os resultados obtidos no rendimento
da transesterificação catalisada por lipase imobilizada estão resumidos
emmesa 2. Conforme indicado na tabela, dependendo do
257
Figura 5.Efeito do tempo de imobilização na eficiência da imobilização e recuperação da
atividade, na quantidade constante de lipase de 5 mg.
condições de experimentos, o rendimento de FAMEs variou de 50% a 85%. A
análise de regressão múltipla dos dados experimentais desenvolveu um modelo
polinomial de segunda ordem baseado em unidades codificadas conforme dado
na equação(6):
S¼73:71º5:91x1º8:85x2º0:87x3º0:61x4- 2:31x2 1
º1:06x1x2- 1:04x1x4- 1:46x2 2- 1:61x2 3- 1:57x2 4
(6)
Um sinal positivo para os termos indica efeito sinérgico no
rendimento de síntese de biodiesel e um sinal negativo indica efeito
antagônico sobre isso. Com base no modelo desenvolvido pela RSM, o
rendimento da transesterificação foi afetado tanto pelos termos
lineares quanto quadráticos das quatro variáveis do experimento. A
equação de regressão e o coeficiente de determinação (R2) foram
avaliados para testar o ajuste do modelo desenvolvido pela RSM.
Verificou-se que o modelo possui o coeficiente de determinação (R2)
valor de 0,9563 indicando que as variáveis do experimento foram
altamente eficazes na representação do rendimento de síntese. O valor
do coeficiente de determinação ajustado (Adj. R2¼0,9533) também é
muito alto para defender uma alta significância do modelo, o que
indica uma excelente concordância entre as respostas previstas e reais
[27]. Além disso, um valor relativamente menor do coeficiente de
variação (CV¼1,55%) indica uma melhor precisão e confiabilidade dos
experimentos realizados [26].Assim, com base no alto valor de
correlação e no baixo valor de CV no modelo desenvolvido, pode-se
provar que existe uma boa concordância e precisão entre o rendimento
previsto e experimental de FAMEs neste modelo de regressão.
A análise estatística baseada em ANOVA para o modelo quadrático baseado
em RSM está resumida emTabela 3. O teste F de Fisher (Fmodelo¼162,97) com um
valor de probabilidade muito baixo (0,0001) demonstra uma significância muito
alta para o modelo de regressão, de modo que há apenas 0,01% de chance de que
um 'valor F do modelo' tão grande possa ocorrer devido ao ruído nos
experimentos. Além disso, o 'valor F de falta de ajuste' de 1,36 indica que a falta de
ajuste não é significativa em relação ao erro puro.
3.4. Interações entre variáveis de processo
As interações entre variáveis independentes tiveram efeitos
significativos no rendimento dos FAMEs (Tabela 3). Assim, foram
avaliadas as interações entre variáveis independentes em vez de
estudar uma variável única (como no método convencional), o que é
significativo e importante para um estudo de otimização abrangente.
Os gráficos de superfície como representações gráficas das equações de
regressão são mostrados emFigura 6aed. Como pode ser visto em Figura 6a,
um incremento em cada uma dessas duas variáveis causou um
258 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262

mesa 2
Matriz de planejamento experimental e rendimentos de biodiesel em valores experimentais e previstos pelo modelo RSM.

Correr Variáveis de processo codificadas Rendimento experimental (%) Rendimento previsto (%) Resíduos (%)

Catalisador (%) Tempo (h) Razão molar (mol/mol) Temperatura (-C)

1 -1 -1 -1 -1 50,24 50,55 0,62

2 -1 -1 -1 1 54,81 53,83 1,78
3 -1 -1 1 -1 52,60 52h30 0,57
4 -1 -1 1 1 56,41 55,58 1,46
5 -1 1 -1 -1 66,57 66,13 0,67
6 -1 1 -1 1 70,68 69,41 1,80
7 -1 1 1 -1 68,59 67,88 1.03
8 -1 1 1 1 70,76 71.16 0,56
9 1 -1 -1 -1 62,44 62,33 0,18
10 1 -1 -1 1 61,99 61,45 0,87
11 1 -1 1 -1 62,57 64.08 2,42
12 1 -1 1 1 63.02 63,20 0,29
13 1 1 -1 -1 81,43 82,14 0,88
14 1 1 -1 1 81,63 81,26 0,45
15 1 1 1 -1 84,31 83,89 0,50
16 1 1 1 1 82.12 83.01 1.08
17 -2 0 0 0 50,99 52,66 3.28
18 2 0 0 0 77,47 76,29 1,53
19 0 -2 0 0 50,05 50.18 0,25
20 0 2 0 0 85,21 85,57 0,42
21 0 0 -2 0 64,43 65,53 1,70
22 0 0 2 0 69,64 69.03 0,88
23 0 0 0 -2 66,74 66,22 0,78
24 0 0 0 2 67,62 68,63 1,48
25 0 0 0 0 74,40 73,72 0,92
26 0 0 0 0 74,17 73,72 0,60
27 0 0 0 0 72,58 73,72 1,57

Tabela 3 aumento do tempo de reação, a taxa crescente de conteúdo de FAMEs diminuiu.

Análise de variância (ANOVA) do modelo quadrático de superfície de resposta para rendimento de Esta tendência pode ser atribuída ao fato de que a taxa de reação foi afetada por
biodiesel. limitações de transferência de massa [30]. As taxas mais baixas de conversão de
Fonte Valor do coeficiente Soma do quadrado DF P-Valor biodiesel na reação tardia podem ser devidas à transferência de massa
insuficiente devido à baixa solubilidade mútua do metanol e do WCO, que se deve
Modelo 2924.31 14 <0,0001
Constante - 149,93 principalmente à formação de glicerol à medida que a reação ocorre, tornando a
x1 2.16 837,92 1 <0,0001 solubilidade e a transferência de massa progressivamente limitadas.31].
x2 2,99 1878,51 1 <0,0001
x3 20h18 18h39 1 0,0026
Devido à reversibilidade da reacção de transesterificação, o metanol
x4 5.04 8,67 1 0,0231
- 0,02 113,88 1 <0,0001
deve ser utilizado numa quantidade excessiva da razão estequiométrica (isto
x1x1
x1x2 0,02 17.91 1 0,0028 é, uma razão molar de metanol para óleo de 3:1). Além disso, o metanol é
x1x3 0,15 1 0,7413 conhecido como um inibidor da lipase e, portanto, um alto teor de metanol
x1x4 - 0,02 17h33 1 0,0032 na reação pode inibir significativamente a atividade da lipase. Portanto, uma
x2x2 - 0,06 45,51 1 <0,0001
estratégia passo a passo de adição de metanol é comumente aplicada por
x2x3 0,01 1 0,7397
x2x4 1.04 1 0,3842 pesquisadores [32]. Como pode ser visto emFigura 6b, o teor de FAMEs
x3x3 - 1,61 55,25 1 <0,0001 aumentou com o aumento da proporção molar de metanol para WCO, e
x3x4 1.10 1 0,3731 então começou a diminuir quando esta proporção foi aumentada de 6 para
x4x4 - 0,06 52,79 1 <0,0001
9. Em razões molares abaixo de 6 para o metanol para WCO, houve uma
interação positiva entre metanol e Razão WCO e conteúdo de lipase
Residual 15h38 12
Falta de ajuste 13.42 10 0,4950 imobilizada na conversão de biodiesel. Na proporção constante de 6 para
Erro puro 1,96 2 metanol para WCO, o teor de FAME aumentou mais fortemente com um
Cor. total 2.939,69 26 aumento no conteúdo de lipase em comparação com o mesmo aumento no
conteúdo de enzima e uma proporção de metanol para WCO de 4. Em
contraste, em proporções molares superiores a 6 para a relação metanol/
aumento no rendimento, de modo que o maior rendimento de biodiesel foi OMA, foi encontrada uma interação negativa entre esses fatores. Isto
obtido na maior concentração de lipase imobilizada e tempo de reação. O significa que, juntamente com o aumento da proporção de metanol de 6
conteúdo de FAMEs aumentou junto com o aumento da lipase imobilizada, para 8, o efeito positivo do conteúdo da enzima na conversão do biodiesel
porque quanto mais lipase disponível, mais moléculas de substrato foram diminui.
absorvidas no centro ativo da lipase [29]. No entanto, a taxa de aumento do Como ilustrado emFigura 6c, a atividade da lipase aumentou
teor de FAMEs diminuiu à medida que o teor de enzimas aumentou de 25% acentuadamente quando a temperatura aumentou de 25-C a 35-C.
para 35%. Este fenómeno pode ser atribuído ao facto de o teor de OMA ser Metanol en- hexano volatiliza a uma temperatura >60-C e uma
excessivo quando o teor de enzima era inferior a 25%, e à medida que o teor temperatura mais alta afetam a estabilidade térmica da enzima e a vida
de enzima aumentava para se tornar suficiente de 25% para 35%. O útil. No entanto, uma temperatura variando de 35-C a 40-C parece mais
conteúdo de FAMEs também aumentou juntamente com o aumento do adequado para o processo de transesterificação enzimática [23,33].
tempo de reação. No entanto, com Como mostrado noFigura 6d, o rendimento do biodiesel aumentou junto com
 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262 259

Figura 6.Gráfico de superfície do efeito de a) concentração do catalisador e tempo de reação, b) concentração do catalisador e razão molar metanol/óleo, c) concentração do catalisador e temperatura
de reação, d) tempo de reação e razão molar metanol/óleo, e) tempo de reação e reação temperatura e f) razão molar metanol/óleo e temperatura de reação na produção de biodiesel.
260 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262
o aumento do tempo de reação. No entanto, com o aumento do tempo de
reação, a taxa crescente de conversão do biodiesel diminuiu, o que pode ser
atribuído à transferência de massa insuficiente na reação tardia devido à
baixa solubilidade mútua do álcool e do óleo.34].
Os efeitos e variáveis de interação no rendimento do biodiesel poderiam ser
mais inteligíveis usandoFigura 6, e posteriormente dadas as informações obtidas
através dos gráficos de superfície e do modelo desenvolvido pela RSM, é possível
fazer análises de otimização para determinar as condições ótimas para atingir o
rendimento máximo de biodiesel.
3.5. Análise de otimização
O objetivo da otimização foi encontrar as condições do experimento,
incluindo concentração de lipase imobilizada, tempo de reação, razão molar
metanol para WCO e temperatura de reação, que proporcionassem o
rendimento máximo de biodiesel. A análise da função desejabilidade foi
empregada no procedimento de otimização. Para a resposta da produção de
biodiesel, Y(min)¼48% e S(máx.)¼92%, que foram considerados os valores
mínimo e máximo da resposta, foram escolhidos para a otimização. De
acordo com os trabalhos de Derringer [27], o valor da constanteRé
especificado pelo usuário. Ser<1, a conveniênciad-fiprimeiro aumenta
rapidamente à medida queScomeçando a aumentar, depois se achata à
medida queSabordagem para Y(máx.).R¼1 foi escolhido porque descobrimos
que, na prática, o rendimento de 92% não é difícil de ser alcançado.
O perfil de predição do experimento utilizado no presente trabalho para
combinação das configurações dos fatores é mostrado emFigura 7(Software
SAS, versão 9.2). Pode-se observar na figura que o valor máximo de
rendimento de biodiesel baseado na otimização das variáveis do
experimento pelo DFA foi obtido com um rendimento de até 92%. As
variáveis de projeto correspondentes ao valor máximo da função objetivo,
incluindo concentração de lipase imobilizada, tempo de reação, razão molar
metanol/WCO e temperatura de reação foram fixadas em 36%, 25h, 6,2 e 34-
C, respectivamente.
As influências das variáveis de projeto na função objetivo em pontos
ótimos são mostradas emFigura 7. Em cada parcela apresentada na figura, a
influência de uma das variáveis do experimento no
Figura 7.O perfilador de previsão do projeto do experimento para combinação das configurações dos fatores.
o rendimento da reação foi representado mantendo os outros fatores constantes
no ponto ideal.
Como mostrado na figura, o valor da função objetivo sendo a
produção de biodiesel aumentou junto com o aumento no conteúdo de
lipase imobilizada e no tempo de reação, enquanto aumentou primeiro
e depois diminuiu com o aumento da razão molar de metanol para
WCO e da temperatura de reação.
Vale ressaltar que estando próximo do ponto ótimo, a inclinação da curva
relacionada à concentração de lipase imobilizada diminuiu acentuadamente, mas
a curva relacionada ao tempo de reação aproximou-se do ponto ótimo com uma
inclinação acentuada. Este fenómeno indica que em condições óptimas, o
rendimento da reacção poderia ser significativamente aumentado se o tempo de
reacção continuasse durante 25 horas.
Porém entre as execuções do experimento, o rendimento máximo
foi alcançado em 85,2% na execução número 20 (mesa 2) sob
concentração enzimática de 25%, razão molar metanol/WCO de 6:1, 25
h e 35-C.Tabela 4fornece os estudos relatados na literatura sobre
transesterificação enzimática utilizando diferentes tipos de lipases,
juntamente com o do presente estudo. Em comparação com outros
estudos, imobilizadosBurkholderia cepaciaem nanopartículas
magnéticas mesoporosas teve um papel bastante aceitável como
catalisador na transesterificação da OMA.
3.6. Reutilização da lipase imobilizada
O custo do biocatalisador na síntese de biodiesel diminuirá
significativamente se ele puder ser usado repetidamente durante muitos
ciclos. A condição das reações de transesterificação foi definida no zero
codificado para todas as variáveis do experimento. Os resultados do
experimento indicaram que a conversão de WCO em FAMEs para as
amostras foi de 74%, 71% e 66% após 1, 2 e 3 ciclos, respectivamente. Isto
indicou que a lipase ligada resultante tinha uma reutilização aceitável, o que
é desejável para aplicações na síntese de biodiesel. A perda de atividade
pode ser atribuída a alterações conformacionais da lipase ou ao bloqueio
dos sítios ativos da lipase ou à perda gradual da lipase ligada durante os
procedimentos de reação.
 G. Khoobbakht et al. / Energia Renovável 158 (2020) 253e262 261

Tabela 4
Resumo da síntese de biodiesel utilizando diferentes tipos de lipases na literatura e comparação com o presente estudo.

Lipase Peso da lipase (%) Substrato Álcool Álcool/óleo Condições de reação Colheita Ref.
/conversão (%)

Novozym 435 5 Óleo de soja Metanol 3:1 24 horas, 37-C 90 [35]

Novozym 435 5 Óleo de soja Etanol 3:1 24 horas, 37-C 95 [35]
Novozym 435 20 azeite de dendê Carbonato de dimetila 10:1 24 horas, 55-C 90,5 [36]
Novozym 435 10 Resíduos de óleo de cozinha Carbonato de dimetila 6:1 24h, 60h-C 77,8 [37]
ImobilizadoP. cepacia 1,46 Trioleína Metanol 3:1 24 horas, 40-C 40 [38]
ImobilizadoP. cepacia 1,46 Trioleína Etanol 3:1 24 horas, 40-C 90 [38]
ImobilizadoP. cepacia 1,46 Trioleína Propanol 3:1 24 horas, 40-C 100 [38]
ImobilizadoM. miehei 10 Sebo Metanol 3:1 5h, 45-C 77,8 [39]
ImobilizadoM. miehei 10 Sebo Etanol 3:1 5h, 45-C 98,3 [39]
ImobilizadoBurkholderia cepacia 25:1 Resíduos de óleo de cozinha Metanol 6:1 25h35-C 85,2 O presente estudo

4. Conclusões [9]R. Jothiramalingam, MK Wang, Revisão de desenvolvimentos recentes em ácidos

OBurkholderia cepaciaa lipase foi imobilizada com sucesso em
nanopartículas magnéticas mesoporosas de sílica / óxido de ferro. A lipase
imobilizada foi utilizada como biocatalisador para transesterificação de WCO
com metanol para produzir biodiesel. As análises VSM mostraram que as
propriedades magnéticas do Fe3Ó4as nanopartículas magnéticas não
tiveram alteração significativa após imobilização da lipase. Para atingir um
teor máximo de FAMEs, a concentração de lipase imobilizada, o tempo de
reação, a razão molar metanol/WCO e a temperatura de reação foram
considerados como as principais variáveis de projeto e uma função objetivo
para o problema foi proposta. Uma equação de superfície de resposta
quadrática desenvolvida pela RSM foi estabelecida com sucesso para
estudar a modelagem e interação das variáveis de rendimento de biodiesel
utilizando os dados experimentais baseados no planejamento composto
central. O modelo matemático desenvolvido foi validado e provou ser
estatisticamente adequado e preciso para prever o conteúdo de FAMEs. A
abordagem da função de desejabilidade previu conteúdo máximo de FAMEs
de 92% na concentração de lipase imobilizada de 36%, tempo de reação de
25 h, razão molar de metanol para WCO de 6,2 e temperatura de reação de
34-C. Na conversão enzimática do OMA em biodiesel, a lipase imobilizada
nas partículas magnéticas perdeu 11% de atividade ao ser submetida ao
terceiro ciclo, permitindo assim sua recuperação e reaproveitamento.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram não haver conflito de interesses para o presente
manuscrito.
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