A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA

2 MOLECULAR NA PRODUÇÃO
DE ENZIMAS
Carmen Lucia Antão Paiva e Paula Sá-Pereira

SUMÁRIO
Este capítulo versa sobre a contribuição da biologia molecular na busca, identificação e
manipulação de enzimas. Contém um breve histórico da evolução da biologia molecu-
lar, com enfoque na clonagem de genes e sua importância para a engenharia genética
(tecnologia do DNA recombinante). Mostra como a tecnologia do DNA recombinante
pode produzir mudanças genéticas em microrganismos com o objetivo de melhorar ca-
racterísticas bioquímicas e fisiológicas que tenham valor para a indústria e possam ser
exploradas comercialmente, como o caso da produção de enzimas. Aborda o controle
da expressão gênica e sua manipulação em microrganismos de interesse tecnológico e
enfoca os fungos filamentosos como “fábricas celulares” produtoras de enzimas, além
da produção de enzimas por organismos extremófilos. Enfatiza que as propriedades
das enzimas podem ser melhoradas por redesenho racionalizado ou evolução direcio-
nada e que muito provavelmente a associação das duas estratégias será a rota de maior
sucesso para melhorar as propriedades e função de uma enzima, ou mesmo criar uma
nova função enzimática. As plataformas tecnológicas conhecidas como ômicas, a genô-
mica, transcriptômica, proteômica e metabolômica são ferramentas moleculares que
permitem descoberta de novas enzimas e aponta ainda que, através da combinação da
pesquisa computacional e experimental em biocatálise, há de se aumentar grandemen-
te o nível de conhecimento dos sistemas biocatalíticos e de se diminuir os esforços
experimentais e conseqüentemente seus custos.

29

1ª prova
30 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

INTRODUÇÃO
Foi Wearren Weaver quem, em 1938, primeiro utilizou o termo Biologia Molecular.
Desde então enormes progressos têm acontecido neste ramo da ciência, que emergiu
da associação dos conhecimentos acumulados nas áreas de Bioquímica, Biologia Celu-
lar e Genética (WITKOWSKI, 1988). A partir de então, algumas décadas foram necessá-
rias para o surgimento da engenharia genética (ramo da biologia molecular mais apro-
priadamente denominado de tecnologia do DNA recombinante), que só pôde aconte-
cer devido aos avanços da biologia molecular, no que se refere ao conhecimento de
como as células armazenam, duplicam, transferem, expressam e regulam a expressão
da informação genética.
Nas duas últimas décadas, a engenharia genética tem sido empregada intensamen-
te para transferir um gene de interesse biotecnológico de um organismo a outro, mas
foi na década de 70 que o primeiro plasmídeo recombinante foi produzido (COHEN et
alii, 1973) e a transcriptase reversa foi descoberta (BALTIMORE,1970; TEMIN e
MIZUTANI, 1970), abrindo o caminho para a clonagem de genes eucarióticos através
das bibliotecas de DNAc (DNA complementar). Portanto, os plasmídeos e a transcripta-
se reversa são duas importantes ferramentas da biologia molecular, que juntamente
com as enzimas de restrição possibilitaram o desenvolvimento da tecnologia do DNA re-
combinante. A biologia molecular, através da engenharia genética, tem trazido novas
soluções para antigos problemas biotecnológicos. Pode-se, hoje, através da tecnologia
do DNA recombinante, produzir mudanças genéticas nos organismos vivos com o obje-
tivo de melhorar características bioquímicas e fisiológicas que tenham valor para a
indústria e possam ser exploradas comercialmente. Os microrganismos, tanto
procariotos quanto eucariotos, têm sido especialmente úteis neste sentido.
Vale lembrar que os microrganismos foram usados desde a Antigüidade em pro-
cessos biotecnológicos, como na produção do pão, da cerveja, do vinho, do queijo, do
iogurte e na preservação de alimentos. Na atualidade, têm sido também utilizados na
produção de enzimas, antibióticos, solventes, aminoácidos, suprimentos alimentares e
muitas outras substâncias, concomitantemente com a seleção de cepas altamente
eficientes na produção desses produtos (MILLER JR e NAGARAJAN, 2000).
É importante ressaltar que os únicos produtos gênicos a serem abordados neste ca-
pítulo serão as enzimas de natureza protéica, por serem o principal objeto deste livro.
Serão focalizados temas do campo da biologia molecular como a regulação da expres-
são gênica, a manipulação de genes em microrganismos, a produção de enzimas por
microrganismos geneticamente engenheirados e a evolução das enzimas in vitro, com o
objetivo de fornecer uma visão geral da contribuição da biologia molecular ao aprimo-
ramento da produção de enzimas. Serão abordados, também, a utilização de organis-
mos extremófilos na produção desses biocatalisadores e o uso dos fungos como
“fábricas celulares” de enzimas, com ênfase nos aspectos relativos à biologia molecular.
As enzimas são catalisadores biológicos presentes em todos os seres vivos. Elas são
largamente utilizadas, com aplicação em diversos campos, incluindo a biorremediação,
a síntese orgânica, as análises clínicas, a produção de produtos farmacêuticos, de deter-

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CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 31

gentes, de alimentos, de produtos de fermentação, dentre outros. Podem ser usadas de

forma muito lucrativa em meio aquoso ou em meio não convencional e, ainda, em mei-
os de reação extremos como, por exemplo, em relação à temperatura (BRAIUCA et alii,
2006). Além disso, cada vez mais tem havido aumento do interesse na utilização das en-
zimas conhecidas como catalisadores “verdes”, tanto em processos tecnológicos como
em biorremediação , como é o caso das lacases (ALCALDE et alii, 2006). Estas últimas
são oxidorredutases que utilizam o oxigênio do ar e liberam água como único produto
além do produto principal da reação (RIVA, 2006).

REGULAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA

O objetivo da engenharia genética é aumentar a produtividade e o rendimento dos pro-
dutos gênicos de interesse, o que geralmente requer o aumento da expressão do gene
que codifica para o produto gênico em questão, como por exemplo, o aumento da ex-
pressão daqueles genes que codificam enzimas de interesse industrial.
Microrganismos, tanto os procariotos (bactérias), quanto os eucariotos (fungos e
leveduras), têm sido muito úteis para a produção de enzimas. Portanto é fundamental
conhecer os mecanismos básicos que regulam a expressão gênica nesses organismos.
Enfatizamos que este assunto não poderia deixar de ser mencionado neste capítulo,
pois é um importante aspecto da biologia molecular, cujo avanço propiciou também a
evolução da engenharia genética, com repercussões na produção de enzimas.

Em procariotos
A idéia de que os genes podem ser ligados ou desligados produziu um grande impacto
sobre a biologia molecular há aproximadamente quarenta anos atrás. Hoje sabemos
que a expressão gênica é regulada, o que representa uma enorme economia para as cé-
lulas. Uma bactéria típica tem aproximadamente 4.000 genes, sendo que somente uma
fração desses genes está sendo expressa em um determinado momento.
Vale ressaltar que há duas categorias de genes: os genes constitutivos e os induzíve-
is. Os primeiros são aqueles que são sempre transcritos e cujos produtos gênicos são es-
senciais durante toda a vida da célula. Os últimos são aqueles cujos produtos gênicos au-
mentam ou diminuem de acordo com um sinal molecular, geralmente em resposta ao
suprimento de alimento. Embora os genes constitutivos sejam sempre transcritos a con-
centração de seus produtos gênicos pode variar bastante de gene para gene.
São vários os mecanismos que regulam a expressão de um gene, compreendendo
as etapas da transcrição, da tradução e do processamento do produto gênico. Portanto,
a concentração celular de um determinado produto gênico ativo não depende somen-
te da transcrição, da velocidade e freqüência com que um gene é transcrito, mas tam-
bém de mecanismos regulatórios pós-transcricionais. Estes mecanismos envolvem a re-
gulação da biossíntese protéica, como por exemplo, o controle das funções ribossoma-
is, as modificações na molécula da proteína ocorridas após a tradução e a velocidade de
sua degradação.

1ª prova
32 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Nesta seção são abordados apenas os mecanismos que regulam a produção do trans-
crito primário (RNA mensageiro, RNAm) em procariotos, com foco na unidade de regu-
lação chamada de operon. Embora os demais mecanismos de regulação não sejam me-
nos importantes, no que se refere à produção de um produto gênico ativo, eles não são
abordados aqui, pois são muitos e envolvem mecanismos muito diversos, como, por
exemplo, modificações pós-tradução por fosforilação, metilação, adenilação, glicosila-
ção, dentre outros.

O operon lac de Escherichia coli

Foram François Jacob e Jacques Monod que, em 1961, primeiramente descreveram a
regulação da expressão gênica em Escherichia coli. Eles observaram que as células de
E.coli preferencialmente utilizavam a glicose como fonte de carbono, mesmo em pre-
sença de outros carboidratos como, por exemplo, a lactose. Por outro lado, em ausência
de glicose e em presença de lactose havia expressão de três genes: o gene Z (que codifi-
ca para b-galactosidase), o gene Y (para a permease) e o gene A (para transacetilase).
Estes genes estão um ao lado do outro no cromossomo bacteriano, são transcritos em
conjunto e a b-galactosidase e a permease participam do catabolismo da lactose
(JACOB e MONOD, 1961).
O termo operon foi cunhado para designar uma unidade de regulação da transcri-
ção. Um operon inclui:
1. Um conjunto de genes contíguos chamados de genes estruturais, que codifi-
cam polipeptídeos.
2. O sítio promotor.
3. As seqüências regulatórias, que atuam em conjunto na regulação da expressão
dos genes estruturais. Os operons mais comuns possuem de dois a seis genes
que são expressos em conjunto, mas há outros que apresentam 20 ou mais ge-
nes estruturais (NEIDHARDT, 1996).
Para o entendimento de como, em E.coli, a lactose é capaz de induzir, na ausência
de glicose, a síntese de enzimas para seu próprio catabolismo, é necessária a compreen-
são dos elementos que regulam a transcrição dos genes estruturais Z, Y e A, tais como o
sítio promotor, o operador e demais seqüências regulatórias.
Sítio promotor: É o sítio reconhecido pela RNA polimerase como início do local de
transcrição. De modo geral, em bactérias, apresenta seqüências de consenso nas regiões
–35 e –10, além do elemento UP (up-stream), que é um elemento rico em AT situado en-
tre as posições –40 e –60, que aparece em genes com elevado nível de expressão. As se-
qüências de consenso são aquelas preservadas ao longo da evolução nos diferentes pro-
motores em diferentes genes. A figura 2.1 mostra o promotor do operon lac de E.coli.
As seqüências de nucleotídeos de diferentes promotores podem variar bastante, o
que determina as diferenças nas velocidades da transcrição. A eficiência com a qual a
RNA polimerase se liga ao promotor e inicia a transcrição é determinada pelas seqüên-
cias de consenso, pelo espaçamento entre elas e pela distância do início da transcrição.

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 33

A troca de um único par de nucleotídeos em uma seqüência de consenso pode diminu-

ir a velocidade de transcrição por várias ordens de magnitude. Por outro lado, há trocas
de nucleotídeos no promotor que aumentam a velocidade de transcrição (JENSEN e
HAMMERS, 1998).

TTTACA TATGTT

DNA região - 35 região - 10

5’ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACCTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC - 3
operador
sítio CRP
GTGAGTTAGCTCAC local de ligação da RNA polimerase

simetria AG CTC AC
binária T T GAGT G

(a)
ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG

Promotor lac TTTACA TATGTT

região - 35 região - 10
Seqüências de
consenso em TTGACA TATAAT
um promotor

ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG
(b)

Figura 2.1 a) Representação do sítio promotor do operon lac de E.coli; b) comparação entre as
regiões –35 e –10 do promotor lac e as seqüências de consenso em um promotor genérico.

¡ Operador: O operador é definido como a região do DNA, que interage com uma
proteína repressora (repressor) que controla a expressão de um gene ou grupo
de genes. A seqüência de DNA onde se liga o repressor contém aproximadamen-
te 20 pares de nucleotídeos e inclui o local do início da transcrição do RNAm. A
molécula repressora é codificada à distância por um gene chamado de gene re-
gulador. O repressor Lac pode se inativar quando ligado à lactose, mas os genes
estruturais controlados por ele só serão transcritos se um controle adicional for
acionado (KOLB et alii, 1993). Este controle, que inclui a diminuição da concen-
tração de glicose e o aumento de AMPc na célula, é descrito a seguir.
¡ Sítio CRP (do inglês camp receptor protein): Este sítio se situa próximo ao pro-
motor e é uma seqüência do DNA com simetria binária, em relação ao eixo (figu-
ra 2.1). A proteína receptora de AMPc (CRP) é também designada por CAP (do
inglês catabolite gene activator protein). É um homodímero com afinidade pelo
sítio CRP que interage com a RNA polimerase para facilitar a transcrição, quan-
do a fonte de carbono glicose se esgota. Esta proteína CRP tem um sítio de liga-

1ª prova
34 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

ção com o AMPc e este último tem sua síntese inibida e seu efluxo da célula é esti-
mulado por glicose. Assim, se a concentração de glicose é alta a de AMPc é baixa
(conseqüentemente CRP está inativa) e se a concentração de glicose é baixa a de
AMPc é alta (CRP está ativa) (KOLB et alii, 1993).
A expressão dos genes estruturais para o catabolismo da lactose depende, portan-
to, da ação em concerto do repressor, que pode estar ativo (não ligado à lactose) ou ina-
tivo (ligado à lactose) e da CRP, que pode estar ativa (ligada a AMPc) ou inativa (não li-
gada a AMPc, quando a glicose está presente).
Diversos operons catabólicos, como, por exemplo, o da arabinose, já foram descri-
tos, assim como, os operons anabólicos, como por exemplo, o da síntese do triptofano.
O operon lac é um dos mais simples, entretanto outros mecanismos de regulação, como
o do catabolismo da arabinose, incluem vários passos regulatórios adicionais, que não
serão aqui discutidos por não ser objetivo deste capítulo examinar a fundo cada operon
conhecido, mas apenas propiciar uma visão geral do controle da expressão gênica,
como subsídio para as seções seguintes.

Em eucariotos
A regulação da expressão gênica em eucariotos é bastante mais complicada do que em
procariotos. Nestes últimos, as proteínas que regulam a transcrição se ligam em locais mu-
ito próximos ao sítio de início da transcrição, embora existam exceções como a da proteí-
na regulatória de bactéria, NtrC, que ativa a transcrição à distância. NtrC se situa sobre
uma porção do DNA denominada de enhancer (realçador). O enhancer é uma seqüên-
cia regulatória que, em conseqüência de uma dobra no DNA, possibilita o encontro de
NtrC com a RNA polimerase, o que ativa a transcrição (NEIDHARDT, 1996).
Nesta seção descrevemos apenas a regulação da transcrição em eucariotos realiza-
da pela RNA polimerase II, que transcreve o DNA para os precursores dos RNA mensa-
geiros, não abordando aqui a regulação das RNA polimerases I (transcrição para molé-
culas de RNA ribossomal 18S, 5,8S e 28S) e III (para moléculas de RNA transportadores
e do RNA ribossomal 5S).
Nos eucariotos, as regiões que controlam a transcrição de um gene podem estar es-
palhadas em locais distantes, mas atuando concomitantemente. As regiões controlado-
ras da expressão gênica incluem o conjunto formado pelo sítio promotor (onde os fato-
res gerais de transcrição e a RNA polimerase, RNApol, se associam) e todas as demais se-
qüências regulatórias (onde se ligam proteínas que regulam a velocidade de associação
dos fatores gerais de transcrição com a RNApol). Muitas proteínas regulatórias que se li-
gam aos enhancers ativam a transcrição, entretanto outras a regulam negativamente
(KORNBERG, 1996).
A figura 2.2 mostra um esquema da região de controle de um gene eucariótico, evi-
denciando a localização dos fatores gerais de transcrição e da RNApol II no promotor e
a localização das proteínas regulatórias nas seqüências regulatórias. Estas últimas po-
dem se encontrar adjacentes ao promotor, longe dele à montante, dentro de introns ou
à jusante do gene (MENKA e THANOS, 2001).

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CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 35

Regiões Controladoras do Gene A

“enhancer”

ativador
fatores gerais
de transcrição domínio
ativador
Mediador
proteínas
RNA polimerase II
regulatórias proteínas
regulatórias
tran da expressão
scri
ção genica

TATA
gen
promotor eA
seqüência
regulatória
seqüência
regulatória

Figura 2.2 Representação esquemática do início da transcrição de um gene eucariótico (gene A)

evidenciando a localização dos fatores gerais de transcrição e da RNApol II no promotor e a
localização das proteínas junto às suas seqüências regulatórias e “enhancer”.

A iniciação da transcrição é o principal ponto de regulação da expressão gênica

tanto para procariotos como para eucariotos, embora seus respectivos mecanismos de
regulação apresentem diferenças marcantes. Em procariotos a RNApol geralmente
acessa qualquer promotor e tem a capacidade de iniciar a transcrição mesmo na ausên-
cia de seqüências controladoras. Já em eucariotos os promotores são inativos in vivo na
ausência dessas seqüências.
Há três classes de proteínas que estão envolvidas na regulação da transcrição, que
são os fatores gerais de transcrição, os transativadores e os coativadores. Os primeiros se
referem aos fatores que se ligam à região TATA para a formação do complexo de
pré-iniciação. Os segundos são os que se associam às moléculas ativadoras, ou às repres-
soras, e assim se ligam aos enhancers; eles têm a capacidade de se ligarem a moléculas si-
nalizadoras, ativando ou reprimindo a transcrição, em resposta a modificações do ambi-
ente celular. Os terceiros são aqueles que agem como intermediários entre os transati-
vadores e a RNA polimerase. Em leveduras um exemplo de coativador é o mediador,
um complexo de aproximadamente 20 polipeptídeos, que se liga à RNA polimerase II e
a transativadores situados nos enhancers (figura 2.2) (MALIK e ROEDER, 2000).
Sabemos que uma plêiade de proteínas atua orquestradamente regulando a trans-
crição. Elas, entretanto, em conjunto com os sítios no DNA a que se ligam, não são os

1ª prova
36 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

únicos elementos na regulação da expressão em nível da transcrição. Há ainda um

grande problema a ser resolvido no cromossomo eucariótico, que se refere à estrutura
da cromatina (formada de DNA e proteínas) que tem de ser modificada para liberação
da região de consenso TATA (TATA box) na região a ser transcrita. O cromossomo eu-
cariótico é muito mais complexo do que o de procariotos, pois apresenta estruturas de-
nominadas de nucleossomos (TRAVERS, 1999), que compreendem um octâmeros de
proteínas histonas circundado por DNA. Mais especificamente, a região TATA
presente no promotor deve ser liberada das moléculas de histona para se tornar
acessível à RNApol.
Modificações epigenéticas estão sendo, cada vez mais, consideradas importantes
no entendimento dos processos de regulação gênica. Em geral, a metilação do DNA
está associada com promotores silenciosos que contêm ilhas CpG, sendo, portanto, a re-
pressão gênica provavelmente mediada pela ligação de proteínas específicas ao DNA
metilado. Um outro evento epigenético é a acetilação de histonas. Em geral, a acetila-
ção das histonas está associada com a ativação dos genes e a falta de acetilação com re-
pressão dos mesmos. A fosforilação das histonas na mitose e a metilação das mesmas
também participam do silenciamento dos genes (BECK e OLEK, 2001; KWAKS e
OTTE, 2006). Todos esses mecanismos, atuando em conjunto, colaboram para a regu-
lação da expressão gênica em resposta ao ambiente celular, o que representa enorme
economia para as células, e nos eucariotos superiores garante a diferenciação das
células para produção dos tecidos que formarão os diferentes órgãos do indivíduo.
Vale ressaltar que a manipulação da expressão gênica, especialmente em micror-
ganismos, é objeto de enorme interesse por parte dos envolvidos em biotecnologia com
foco na produção de enzimas.

MANIPULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM MICRORGANISMOS

Depois de identificado, o gene responsável pela codificação de uma enzima específica
pode ser isolado e transferido por técnicas de DNA recombinante para um microrganis-
mo industrial conhecido. Geralmente, através dos vetores recombinantes de clonagem,
como os plasmídeos, incorpora-se o gene de interesse ao microrganismo hospedeiro
que vai expressá-lo. A produção desses vetores recombinantes se dá pelo emprego de
enzimas de restrição, que cortam o DNA do vetor em locais específicos onde o gene a
ser clonado será inserido. A enzima DNA ligase, após pareamento das extremidades do
DNA do plasmídeo com as do inserto, faz a ligação do DNA do vetor com o DNA do seg-
mento que contém o gene de interesse. Às vezes, inserem-se diversas cópias do gene no
microrganismo hospedeiro a fim de se potenciar a produção da enzima. Vale ressaltar
que há enzimas codificadas por mais de um gene diferente (as heterodiméricas, por
exemplo). Para facilitar o entendimento, relatamos, neste parágrafo o exemplo de
clonagem de uma enzima codificada por um único gene.
O fato de se conhecerem as condições ideais de trabalho para os microrganismos
hospedeiros favorece a produção das enzimas em grande escala. Os principais micror-
ganismos hospedeiros usados são Eschericia coli, estirpes de Bacillus sp., de Aspergillus

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 37

sp. e Saccharomyces cerevisiae. O interesse a respeito da manipulação da expressão gê-

nica em microrganismos surge da necessidade de se obter um determinado produto
gênico com alto rendimento.
Para que seja produzido um produto novo em uma célula hospedeira, há necessi-
dade da expressão coordenada dos genes que codificam as enzimas envolvidas em sua
síntese. Há necessidade, também, de um forte controle da expressão dos genes em
questão e de consistente expressão de um produto gênico ativo.
A engenharia metabólica tem se utilizado da tecnologia do DNA recombinante
para a modificação de microrganismos visando à superprodução de substâncias como
as enzimas. Para a produção de um organismo recombinante com a finalidade de ex-
pressar uma proteína heteróloga são utilizadas diversas ferramentas da biologia
molecular apresentadas a seguir.

Vetores de clonagem
Vetores de clonagem são seqüências de DNA às quais serão ligados os genes que se dese-
ja clonare expressar, em uma determinada célula hospedeira. A expressão de um gene
originará um produto gênico heterólogo (BAILEY, 1991; COHEN et alii, 1973). Os ve-
tores de clonagem precisam apresentar replicação autônoma na célula viva, propician-
do assim a proliferação dos genes neles inseridos (figura 2.3). Eles devem ter sítios clivá-
veis por endonucleases de restrição (importantes ferramentas da biologia molecular
usadas para cortar DNA em seqüências palindrômicas específicas) em que podem ser
inseridos os fragmentos de DNA para a construção do vetor recombinante. Os vetores
devem ser pequenos por conveniência de manipulação e eles são escolhidos de acordo
com o tamanho do fragmento de DNA a ser clonado. A classificação do tipo de vetor é
equivalente à classificação de seu tamanho.

Construção do Seleção da cepa Optimização

vetor plasmidial transformada do Meio
Produção de
Plasmídeo
Recombinante

Fermentação

Obtenção dos
Plasmídeos
Recombinantes Purificação Lise

Figura 2.3 Etapas principais da obtenção de plasmídeos recombinantes, que portam o gene da
proteína heteróloga (em vermelho): construção do plasmídeo “in vitro”; seleção da cepa
transformada; otimização do cultivo das células transformadas; fermentação; extração e purificação
dos plasmídeos recombinantes para futura utilização.

1ª prova
38 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Os plasmídeos e os transposons são os vetores de clonagem mais usados em enge-

nharia metabólica de bactérias. Os primeiros se mantêm autonomamente na célula
hospedeira. Já os transposons se integram no cromossomo bacteriano. Os plasmídeos
têm a capacidade de comportar um inserto de até 20 kb, embora o tamanho médio
típico do inserto seja de aproximadamente 3,5 kb.
A engenharia metabólica pode ter o interesse de expressar um gene em várias célu-
las diferentes para que se possa escolher qual delas apresenta maior produção do pro-
duto gênico. Nesse caso, a melhor opção de vetor seria a dos plasmídeos de largo espec-
tro que têm, por definição, a habilidade de se replicar em muitos tipos diferentes de cé-
lulas hospedeiras (KEASLING, 1999). É necessário que o vetor plasmidial que carrega o
gene heterólogo apresente alta estabilidade segregacional, o que garante que todas as
células presentes na cultura contêm o plasmídeo recombinante. A propriedade de ser
segregado nas células filhas é alcançada pelos plasmídeos através de um de dois
mecanismos:
1. Através de um elemento de partição presente na bactéria.
2. Através da morte das células que não o contêm (KIM et alii, 2000; NORDSTROM
e AUSTIN, 1989).
Os plasmídeos podem ser classificados, quanto ao número de cópias por célula,
como plasmídeos de grande, médio e pequeno número de cópias. Os de grande núme-
ro de cópias têm mais de 100 cópias por célula e são muito instáveis segregacionalmente
na ausência de fatores de seleção, além de não comportarem longas seqüências de
DNA. São pequenos, 2 a 3 kb, incluindo o gene de resistência a antibiótico e o promotor
para expressão da proteína heteróloga (KEASLING, 1999).
Os plasmídeos de número médio de cópias apresentam de 5 a 20 cópias por célula.
Vários desse tipo foram construídos a partir de plasmídeos de largo espectro, como o
RK2. Miniplasmídeos que contêm a origem e o mecanismo de partição de RK2 podem
ser estáveis durante 200 gerações, aproximadamente, em algumas pseudomonas, na au-
sência de pressão seletiva. Os plasmídeos derivados de RK2 podem comportar diferen-
tes genes para resistência a antibiótico, diferentes sistemas de expressão induzíveis e
grupos de incompatibilidade (BLATNEY et alii, 1997). Essas propriedades possibilitam
a introdução em uma única célula de múltiplos plasmídeos (com informação para dife-
rentes passos metabólicos ou partes de um mesmo passo) originários de diferentes gru-
pos de incompatibilidade. Estes plasmídeos de largo espectro têm sido muito utilizados
na construção de uma via nova de biodegradação ou de uma via biossintética, em orga-
nismos como E.coli, sendo subseqüentemente transferidos para diversos outros orga-
nismos onde são expressos (KEASLING, 1999).
Os de número pequeno de cópias, uma a cinco por célula, são estáveis na ausência
de pressão seletiva e são alternativas excelentes em relação aos plasmídeos de grande e
médio número de cópias, quando há necessidade de alta estabilidade e baixa sobrecar-
ga metabólica imposta à célula hospedeira. Como esses plasmídeos conseguem replicar
fielmente longos segmentos de DNA, eles são capazes de replicar a maior parte dos
genes necessários à síntese de produtos complexos em bactérias (KEASLING, 1999).

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 39

O transposon é uma seqüência específica de DNA que catalisa sua própria movi-
mentação dentro dos cromossomos (CRAIG, 1996; 1997). Os transposons têm sido ex-
tremamente úteis na transferência de genes em bactérias porque os genes transferidos
por esta via são mais estáveis do que os transferidos por plasmídeos. O fenômeno da
transposição pode ocorrer praticamente em todas as células incluindo as de eucariotos.
Entretanto, o fenômeno natural da transposição é muito pouco freqüente, pois a inser-
ção de um transposon dentro de um gene essencial para a célula pode matá-la. Em
bactérias, há dois tipos de transposons:
1. Os transposons simples, que são seqüências de inserção que contêm apenas as
seqüências essenciais à transposição e os genes para as transposases que
catalisam o processo.
2. Os transposons complexos, que contêm mais de um gene além dos necessários
à transposição (ALBERTS et alii, 2002).
Em comparação com os vetores de clonagem disponíveis para E.coli e leveduras,
há menos vetores próprios para fungos filamentosos. O alto custo da produção de enzi-
mas para processos industriais torna crítica a seleção apropriada de sistemas compostos
de vetores de expressão em fungos filamentosos. Um exemplo de sistema vetor-hospe-
deiro é o proposto por Bergquist et alii (2002) para a expressão, em Trichoderma ree-
sei, de enzimas obtidas de microrganismos termófilos.
O Departament of Microbial Genetics, do National Institute of Genetics, Mishima,
Shizuoka, no Japão, oferece de forma gratuita, exclusivamente para pesquisa, 386 veto-
res para clonagem, com indicação de suas propriedades (http://gillnet.lab.ring.ac.jp/
~cvector/ NIG-cvector/aboute.html). O Instituto Pasteur é, também, depositário de ve-
tores de clonagem e de células e pode ser acessado através do endereço
http://www.pasteur.fr. O sítio http://vectordb.atcg.com oferece também uma lista de
mais de 2.600 vetores e as informações essenciais sobre eles.

Promotores
Na maior parte dos processos que envolvem engenharia genética é necessária a troca do
promotor nativo original do gene heterólogo por outro promotor específico para a cé-
lula hospedeira, ou por um promotor que permita algum tipo de controle sobre a ex-
pressão do gene. Tratamos aqui de três tipos de promotores, os induzíveis, os constituti-
vos e os múltiplos.
¡ Induzíveis: A indução da expressão de um determinado passo metabólico em
microrganismos é geralmente requerida na engenharia metabólica. Muitos siste-
mas indutores de expressão estão atualmente disponíveis, como, por exemplo,
os de E.coli, que incluem o sistema de expressão da lactose ou da arabinose. Vári-
os derivados do promotor lac original (Plac), dentre outros, estão disponíveis em
diferentes plasmideos (KEASLING, 1999).
¡ Constitutivos: Esta classe de promotores é muito útil para a engenharia metabó-
lica quando não são necessários os promotores induzíveis. Jensen e Hammers

1ª prova
40 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

(1998), desenvolveram promotores constitutivos para serem usados em E.coli e

Lactococcus lactis. Eles alteraram as seqüências de nucleotídeos nas regiões –10
ou –35 de um promotor, ou em ambas as regiões, assim como na região espaça-
dora de 16 pb entre estas seqüências, o que levou ao aumento, em várias ordens
de magnitude, da força do promotor.
¡ Múltiplos: A melhor maneira de se conseguir a regulação coordenada de múlti-
plos genes é usar diferentes promotores índuzíveis, um para cada gene. A des-
vantagem desta estratégia é que se deve adicionar múltiplos indutores ao meio.
Uma estratégia alternativa foi a proposta por Jensen e Hammers (1998), já citada
acima, que inclui promotores constitutivos de forças diferentes. Estes seriam in-
duzidos pela mesma molécula indutora, mas os diferentes genes seriam expres-
sos cada um no seu nível respectivo de acordo com o promotor a que estão associ-
ados.

PROTEÍNAS HETERÓLOGAS
A engenharia genética tem propiciado nas últimas décadas o estudo das mais diferentes
proteínas, o que antes do desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinanteera mui-
to difícil, pois a maior parte das proteínas eucarióticas está presente em baixíssima quanti-
dade nas células. Somente as proteínas presentes em grandes quantidades podiam ser pu-
rificadas, dando origem a uma massa de aproximadamente 100 mg de proteína pura, su-
ficiente para a análise de sua atividade, seu seqüenciamento e para a produção de anticor-
pos. Atualmente, grandes quantidades de uma determinada proteína, até mesmo em es-
cala industrial, podem ser produzidas pela tecnologia do DNA recombinante em células
geneticamente modificadas. Tais células se multiplicam em fermentadores e expressam a
referida proteína heteróloga, que pode ser extraída e purificada.
Proteínas codificadas por genes eucarióticos podem ser expressas em células pro-
carióticas via DNAc. Esta estratégia lança mão das transcriptases reversas, que são capa-
zes de transcrever reversamente, em DNAc, uma seqüência de RNAm (BALTIMORE,
1970). Portanto, formado o DNAc este pode ser introduzido em um vetor para expres-
são em bactéria. Como as bactérias não são capazes de retirar os introns das moléculas
de RNA precursoras das de RNAm, o artifício de usar DNAc, produzido a partir de um
molde do RNA sem os introns (RNAm), possibilita a expressão em procariotos de poli-
peptídeos de origem eucariótica, contendo a seqüência de aminoácidos corresponden-
te à codificada pelo RNAm da célula eucariótica de origem. Para que uma proteína
heteróloga seja obtida com alto rendimento é necessário:
1. Que o gene que a codifica seja inserido junto a um promotor forte no vetor de
expressão.
2. Que este vetor seja incorporado em células hospedeiras e que essas células se
multipliquem eficazmente.
3. Que o vetor seja estável, se reproduza autonomamente e segregue nas células
filhas.

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 41

4. Que o gene heterólogo seja transcrito nas células hospedeiras com alta eficiência.
5. Que o RNAm seja traduzido em uma proteína com a seqüência de aminoácidos
da forma original.
6. que esta proteína seja devidamente processada e possa ser secretada ou extraí-
da da célula e, finalmente, seja purificada.
Durante a produção de proteínas recombinantes em larga escala, a concentração do
produto é talvez o parâmetro mais crucial para o monitoramento de rotina. Saber exata-
mente quando extrair a proteína recombinante evita a redução do rendimento do pro-
duto, ocasionada pela extração prematura ou pela degradação do produto no biorreator.
Uma excelente revisão sobre o monitoramento rápido de produtos protéicos recombi-
nantes, com comparação entre as tecnologias atuais, foi publicada por Baker et alii
(2002).
Um exemplo de proteína heteróloga de importância industrial e comercial é a en-
zima renina, utilizada na produção de queijo, que pode ser atualmente produzida por
microrganismos geneticamente modificados. A renina era previamente retirada do es-
tômago bovino, entretanto, mais recentemente, o gene da enzima foi inserido em célu-
las de levedura, que passaram a produzir a enzima. Esta enzima é conhecida como qui-
mozima e é comercialmente utilizada na produção do queijo vegetariano. Este produto
teve a liberação autorizada porque é idêntico ao produto animal natural e, portanto,
não necessita de rótulo que identifique sua origem como sendo de organismos geneti-
camente modificados. Ressaltamos que os alimentos produzidos que envolvem a enge-
nharia genética são objeto de forte controle. As enzimas obtidas de organismos geneti-
camente modificados que, entretanto, são inativadas por calor ou pasteurização do pro-
duto final são bem aceitas e sua identificação não é necessária. As amilases e proteases
são também importantes exemplos de enzimas usadas na indústria de alimentos que
têm sido produzidas por organismos geneticamente modificados.
Atualmente é possível clonar e expressar qualquer enzima em organismos recom-
binantes, mas somente a expressão com alto rendimento torna a enzima economica-
mente viável.

FUNGOS FILAMENTOSOS COMO “FÁBRICAS CELULARES”

PRODUTORES DE ENZIMAS
Os fungos filamentosos têm sido usados há séculos como fontes de produção de muitos
metabólitos e enzimas. Eles estão envolvidos no processamento de frutas e legumes, na
clarificação de sucos de frutas, na extração de cafés e na produção de adoçantes. Muitos
fungos secretam naturalmente proteínas e têm sido explorados comercialmente como
“fábricas” de enzimas, tanto as originadas de fungos como das heterólogas, original-
mente presentes em outros organismos. Os fungos filamentosos de maior interesse in-
dustrial incluem espécies de Aspergillus sp., como A. awamori, A. niger, A. orizae, A. ni-
dulans, de Mucor (M. Michie) e de Trichoderma (T. reesei) (VAN DEN HOMBERGH
et alii, 1997).

1ª prova
42 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Modificações genéticas têm sido usadas para melhorar a capacidade de produção

e secreção de enzimas nesses organismos, já que o rendimento da produção em fungos
selvagens é geralmente baixo. O desenvolvimento de estratégias de biologia molecular,
inicialmente para modificação genética de bactérias (E. coli e Bacillus spp.), e logo de-
pois para a modificação de fungos, rapidamente favoreceu o aprimoramento de certas
características úteis do fungo. Estas manipulações genéticas têm o intuito de que o fun-
go produza e secrete grandes quantidades de enzima, maiores do que no microrganis-
mo selvagem (PUNT et alii, 2002).
Muitos fungos convencionais são capazes de produzir grandes quantidades de pro-
teínas específicas. Entretanto, eles as secretam juntamente com outras proteínas das
quais têm que ser separadas, o que aumenta substancialmente o custo de produção.
Através de técnicas de biologia molecular, os genes de certas proteínas supérfluas po-
dem ser eliminados, resultando em altos níveis da proteína de interesse, sem necessida-
de de purificação adicional. Idealmente, o gene de interesse deve ser clonado e expres-
sado em uma cepa com baixo background de proteínas indesejadas, o que elimina
etapas adicionais de purificação (www.foodproductdesign.com).
Os fungos filamentosos têm sido utilizados também como sistemas de expressão
de proteínas heterólogas não-fúngicas. Embora no início das pesquisas as mesmas estra-
tégias tenham sido usadas para a expressão das proteínas fúngicas e não-fúngicas, o ní-
vel obtido dessas últimas é sempre mais baixo do que o das primeiras. Uma explicação
para este fato é a presença de proteases produzidas e secretadas pelo fungo hospedeiro
(VAN DE HOMBERGH, 1997). Punt el alii (2002) publicaram uma revisão em que rela-
tam suas experiências com cepas deficientes em proteases para a produção de interleu-
cina-6 de origem humana. Eles obtiveram o melhor rendimento com uma cepa trans-
formada de A. niger deficiente em proteases e que era incapaz de acidificar o meio de
cultura, impedindo assim a atividade proteásica residual sobre a interleucina-6.
Recentes pesquisas com fungos filamentosos exploraram sua rica diversidade ge-
nética e os colocaram em evidência como importantes fontes de células hospedeiras
para a engenharia genética e como fontes de novos genes de interesse biotecnológico.
Até o momento, entretanto, somente um número limitado de espécies de fungos foi ex-
plorado como células hospedeiras para a produção de proteínas recombinantes
(PUNT et alii, 2002).
Várias estratégias de biologia molecular têm sido usadas para aumentar a produ-
ção de proteínas homólogas e heterólogas (NEVALAINEN e THEO, 2003). A introdu-
ção de múltiplas cópias de genes sob o controle de um promotor homólogo forte em
uma cepa mutante alta secretora de proteína é uma delas. Vale ressaltar que ainda há
uma baixa quantidade de promotores adequados para a expressão de proteínas homó-
logas e heterólogas recombinantes. Esforços importantes estão sendo feitos no sentido
de aumentar a seleção de promotores e de conhecer as condições específicas dos pro-
motores através da transcriptômica (FOREMAN et alii, 2003) e da proteômica (LIM et
alii, 2001).

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 43

Outra estratégia é o estudo de genes que são ativados na célula em resposta às pro-
teínas não-dobradas (UPR, do inglês unfolded protein response). As bases moleculares
da UPR têm sido objeto, nos últimos cinco anos, de importantes estudos realizados, por
exemplo, pelo consórcio de 28 laboratórios europeus (Eurofung, Fungal Biotechno-
logy Program, www.eurofung.net) (NEVALAINEN et alii, 2006). O gene que regula a
UPR (hac) foi clonado em T. reesei, A. nyger e A. nidulans e os mecanismos de ativação
estudados em detalhes (SALOHEIMO et alii, 2003). Além disso, um outro tipo de res-
posta regulatória tem sido investigado em fungos. Esta resposta se refere à RESS
(repression under secretion stress response), que atua ao mesmo tempo em que ocorre
a ativação do gene hac 1 que codifica para um fator de transcrição UPR (NEVALAINEN
et alii, 2006).
A partir dos resultados inconsistentes obtidos através das várias estratégias usadas
para aumentar o rendimento da produção de produtos gênicos heterólogos em fungos,
tornou-se necessário mudar a abordagem de estudo gene a gene para uma abordagem
mais unificada, ou seja, estudar o organismo como um todo em relação às modificações
pós-tradução e à secreção. A coleta de informações celulares globais, a partir de dados
em nível da transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica, é tarefa da biotec-
nologia de sistemas, que ainda está em seus estágios iniciais e apresenta uma série de de-
safios (LEE et alii, 2005).
A modelagem in silico e simulações têm sido desenvolvidas para análise quantitati-
va do metabolismo celular em nível de sistema. Com base nas informações globais obti-
das será possível desenhar células com propriedades metabólicas melhores para aplica-
ções industriais. O artigo de Lee et alii (2005) descreve os recentes avanços da biotecno-
logia de sistemas e discute as perspectivas futuras dessa nova área para a produção por
fungos de proteínas de interesse econômico.
Se a célula de fungo está sendo apontada como uma importante “fábrica celular’
de proteínas de interesse industrial, é necessário que ela seja abordada efetivamente
como uma fábrica. O gerenciamento dos processos celulares deve incluir as mais impor-
tantes propriedades da fábrica - suas estratégias. A fábrica celular tem a habilidade de
desempenhar diferentes estratégias, dependendo de diversos sinais, que são:

1. A capacidade de sentir e fazer entrar as matérias primas disponíveis do meio

externo.
2. A capacidade e o potencial de alterar ou adicionar funções por indução ou mo-
dulação.
3. A capacidade de mudar a maquinaria celular, para que possa lidar com novas si-
tuações desejadas.
4. De “gerenciar” mudanças em nível celular.
5. A capacidade de realizar as ações requeridas para sobreviver, crescer e
competir.

1ª prova
44 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

6. Produzir produtos secundários indesejáveis, para o estorvo das competidoras, e

se tornar inativa sob a forma de esporos se as condições internas e externas não
forem ótimas (GIUSEPPIN, VERRIPS e Van RIEL, 1999).

PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR EXTREMÓFILOS

Microrganismos que vivem em condições extremas são, normalmente, uma fonte para
obtenção de bioprodutos como, por exemplo, amilases, proteases, lipases, xilanases e
ligninases através do uso da tecnologia do DNA recombinante. Devido a suas proprieda-
des únicas, esses organismos produzem bioprodutos que podem ser empregados nas
condições ambientais drásticas que freqüentemente ocorrem na prática industrial
(SANTOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003)
Os extremófilos são organismos que vivem e se reproduzem em condições ambi-
entais extremas no que diz respeito a pH, temperatura (calor e frio) e salinidade. Nos
últimos 40 anos têm sido encontrados em fontes de águas quentes, em áreas vulcânicas,
nos mares profundos, nas regiões ártica e antártica e seus mares, e em outros sítios geo-
térmicos especiais (GERDAY et alii, 2000; SCHIRALDI, e DE ROSA, 2002). Antes desses
achados, pensava-se que esses locais eram ambientes incompatíveis com a vida
(SCHIRALDI e DE ROSA, 2002).
A maior parte das enzimas hoje utilizadas é extraída de organismos mesófilos, por-
tanto, suas aplicações são em geral restritas, devido à limitada estabilidade nas tempera-
turas extremas (altas e baixas) e condições adversas de reação, como pH muito alterado
e presença de solventes orgânicos, dentre outras (CARRERA e COLOMBO, 2000). As
enzimas mesófilas e as extremófilas termófilas são estáveis e ativas em diferentes tempe-
raturas, não havendo pressão evolutiva para que as mesófilas sejam estáveis e ativas em
altas temperaturas e as termófilas em baixas temperaturas (SÁ-PEREIRA et alii, 2004;
GOMES et alii, 2007).
Os ambientes frios são os mais abundantes do globo terrestre e são colonizados por
numerosos organismos psicrófilos como bactérias, leveduras, fungos e algas unicelula-
res. Gerday et alii (2000) relatam as atividades especificas de várias enzimas psicrofílicas
selvagens e de algumas de suas formas recombinantes, produzidas por microrganismos
das regiões ártica e ántártica. Já foram identificadas estirpes representativas de bactérias
Gram-negativas (por exemplo, espécies de Pseudoalteromonas, Moraxella, Psychro-
bacter, Polaromonas, Psychroflexus, Polaribacter, Moritella, Vibrio e Pseudomonas),
bactérias Gram-positivas (Arthrobacter sp., Bacillus sp. e Micrococcus sp), Archaea (es-
pécies de Methanogenium, Methanococcoides e Halorubrum), leveduras (Candida sp
e Cryptococcus sp), fungos (por exemplo, Penicillium e Cladosporium) e microalgas
(Chloromonas) encontrados nestes ambientes inóspitos com características intrínsecas
de adaptação ao frio extremo (FELLER e GERDAY, 2003). Estas enzimas incluem a ál-
cool desidrogenase, a á-amilase, a aspartato transcarbamilase, a subtilisina, a b-lactama-
se, a triose fosfato isomerase, a malato desidrogenase e a xilanase. Alguns exemplos de
enzimas extraídas de organismos termófilos relatadas são a amilase, as lipases, as xilana-
ses (Sá-PEREIRA et alii, 2002a,b), as Taq polimerase e as celulases (SÁ-PEREIRA, 1994).

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 45

Estas duas últimas são marcantes exemplos de enzimas extremófilas que atingiram o
mercado e têm sido utilisadas em larga escala.
A maneira como as enzimas respondem à temperatura é fundamental para muitas
áreas da biotecnologia. Screening e seleção de proteínas, com uma propriedade térmi-
ca particular, são geralmente feitos com o objetivo de obter boa atividade ou resistência
à desnaturação em uma dada temperatura (EISENTHAL et alii, 2006).
Um exemplo de enzima muito utilizada pela biologia molecular, que resiste a tem-
peraturas acima de 90°C é a Taq DNA polimerase, também denominada Taq polime-
rase ou, simplesmente, Taq (EC 2.7.7.7). Esta é uma DNA polimerase termoestável, uti-
lizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. Seu nome
deve-se a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, uma ex-
tremófila isolada, em 1965, de uma fonte hidrotérmica do Parque Nacional Yellowsto-
ne, nos Estados Unidos da América. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas
usadas em PCR, tendo uma meia-vida enzimática de 40 minutos (em 95°C). Trata-se de
uma enzima importante, que revolucionou a biologia molecular e, conseqüentemente,
a engenharia genética, possibilitando a amplificação de moléculas de DNA de forma es-
petacular. Ela permite que muitos ciclos de replicação de DNA (que requerem altas
temperaturas) possam ser realizados sem a necessidade de adição de novas moléculas
da DNA polimerase após cada etapa de alta temperatura. A técnica que utiliza esta enzi-
ma termo resistente chama-se reação em cadeia da polimerase (PCR- polymerase chain
reaction) e foi desenvolvida por Kary Mullis, em 1983, que recebeu por isso o Prêmio
Nobel de Química dez anos depois. Com esta técnica pode-se conseguir a multiplicação
exponencial de moléculas de DNA, obtendo-se, assim, massa de material suficiente
para as mais diversas finalidades, como por exemplo, o diagnóstico de doenças
genéticas e infecciosas, a identificação de material genético necessário à medicina
forense, o seqüenciamento de ácidos nucléicos e a engenharia genética, com evidente
repercussão no aprimoramento da produção de enzimas.

DIVERSIDADE MICROBIANA COMO FONTE DE NOVAS ENZIMAS

A diversidade microbiana é uma fonte importante de recursos genéticos para o avanço
da biologia e biotecnologia. Nos nossos dias, conhecem-se cerca de 4.300 enzimas (se-
qüenciadas), 300 destas comercializadas (FERRER, 2004). Os microrganismos apresen-
tam imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manu-
tenção de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e
ciclos biogeoquímicos (SCHIMEL, 1995; MYERS, 1996).
Estudos recentes em ecologia molecular microbiana demonstram que a extensão
da diversidade microbiana na natureza é muito maior do que previamente pensado.
Estratégias tradicionais de isolamento e seleção de microrganismos têm garantido o de-
senvolvimento de novos fármacos e aplicações nas áreas de saúde, agricultura, indústria
e meio ambiente.

1ª prova
46 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Os metagenomas
Os metagenomas são o DNA da comunidade microbiana total extraída diretamente de
ambientes como solos ou sedimentos. A análise dos metagenomas por tecnologia de
DNA recombinante permite a exploração do potencial biotecnológico de organismos
não-cultiváveis em laboratório (RODRÍGUEZ-VALERA, 2002).
Metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas em extração di-
reta de ácidos nucléicos de amostras ambientais, associada às técnicas de hibridização
com sondas grupo-específicas ou PCR, clonagem e seqüenciamento vêm permitindo a
avaliação mais precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos
grupos de organismos, nunca antes cultivados.
Através de técnicas inovadoras como análises de 16S rDNA (MACRAE, 2000),
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e hibridação in situ por fluorescên-
cia (FISH), pode ser efetuada a caracterização filogenética dos microrganismos e poste-
riormente avaliado o seu potencial enzimático.
Apesar de estas metodologias não permitirem acesso ao potencial metabólico des-
tes novos organismos individualmente, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo
são suprimidas dos estudos, o potencial enzimático dos consórcios microbianos
estudados é quase inesgotável.
Uma estratégia alternativa para o conhecimento do potencial de cada microrganis-
mo que constitui o metagenoma é a clonagem de fragmentos grandes de DNA (>100 kb)
a partir de amostras ambientais no vetor BAC (bacterial artificial chromosome) (figura
2.3). Estes vetores têm a capacidade de albergar fragmentos de DNA exógeno de grande
dimensão em hospedeiros como Escherichia coli, e têm sido usados em bibliotecas genô-
micas de eucariotos. O método consiste na clonagem de fragmentos grandes de DNA,
originados de DNA do metagenoma, e análise das bibliotecas resultantes em busca de
uma nova expressão fenotípica na linhagem hospedeira de E. coli. No caso de se usar a es-
tratégia BAC para genomas bacterianos, existe a vantagem de que alguma expressão gêni-
ca ocorrerá nos clones BAC, pois o DNA inserido é procariótico. Este processo usando o
sistema BAC abre perspectivas para a descoberta de novos produtos naturais pela expres-
são por genes localizados em operons ou vias biossintéticas complexas.
Projetos multidisciplinares que contemplem o desenvolvimento de novas formas
de cultura de microrganismos, a descoberta de novas enzimas a partir de todos os geno-
mas de organismos (metagenoma) e a melhoria da sua performance através de técnicas
de evolução dirigida serão projetos ambiciosos e de grande interesse científico e social.

AS “ÔMICAS”, TRANSCRIPTÔMICA, PROTEÔMICA E

METABOLÔMICA NA IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS ENZIMAS
Etimologicamente, a terminação “ômica” (do inglês omics) significa “estudo global”.
Assim, a genômica- é de todos os genes, a proteômica é de todas as proteinas, a trans-
criptômica é de todos os transcriptos e a metabolômica é do perfil metabólico de uma
dada célula, tecido, fluido, órgão ou organismo em um dado instante.

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 47

Esta nova etapa da revolução biológica, denominada de era pós-genômica, está as-
sociada aos avanços tecnológicos dos últimos anos, que foram possibilitados pelo desen-
volvimento da genômica, da transcriptômica, da proteômica e da metabolômica. As pla-
taformas tecnológicas conhecidas como “ômicas” são ferramentas moleculares que per-
mitem examinar cada estágio do fluxo de informação biológica, de DNA a RNA e, deste,
a proteínas e até à função biológica. Com tais instrumentos, pode-se avaliar a expressão
de milhares de genes/proteínas em uma única hibridação, o que é muito útil no estudo
dos mecanismos moleculares das diversas doenças. Alguns investigadores utilizaram
também a tecnologia array (DNA chip) para determinar as alterações na expressão de
genes (SCHULZE e DOWNWARD, 2001).
A técnica de DNA microarray reduziu muito o tempo de análise do transcriptoma
de uma amostra de DNA e é imprescindível na análise metabolômica. Desta forma
pode-se ter acesso a novos genes codificadores de enzimas que poderão revolucionar as
indústrias às quais estão destinadas. Esta técnica é extremamente útil quando o investi-
gador quer analisar um grande número de genes rapidamente, ou quando a amostra a
ser estudada é muito pequena. Podemos analisar a expressão gênica dentro de uma úni-
ca amostra ou comparar a expressão gênica de dois tipos de células ou de dois tecidos di-
ferentes. Os microarrays de DNA são pequenos suportes sólidos nos quais milhares de
seqüências codificadoras de genes estão imobilizadas ou ligadas de forma organizada
em posições conhecidas. O suporte sólido é normalmente uma lâmina de vidro especial
de microscopia, mas também pode ser um a pastilha de silício. O DNA é impresso,
depositado ou sintetizado diretamente no suporte. As amostras podem ser DNA, cDNA
ou oligonucleotideos.

Genômica funcional e bioinformática

Por biologia computacional ou bioinformática entende-se o uso de técnicas e ferramen-
tas da ciência da computação aplicadas aos problemas da biologia, com maior expressão
para as áreas de biologia molecular e genética (THEODORIDIS e KOUTROUMBAS,
1999). Novas abordagens de trabalho envolvendo metodologias de bioinformática e bio-
logia molecular permitem a prospecção, por computador, de informações, a partir de ba-
ses de dados genômicos, e a análise de microrganismos sem a necessidade de isolamento
e cultura, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais. Com isso, são pos-
síveis a caracterização e descoberta de novos genes, enzimas, moléculas bioativas e fárma-
cos associados à rica diversidade de organismos ainda não-cultiváveis e o desenvolvimento
de novas estratégias de seleção e triagem de novos produtos, alvos e ensaios a partir do co-
nhecimento da genômica e da expressão gênica de organismos diversos.
O estudo de genomas estruturais, através de programas de bioinformática que com-
param as seqüências determinadas com as depositadas nas bases de dados disponiveis,
como EMBL (COCHRANE et alii, 2006), GenBank (BENSON et alii, 2006) e DNA Data-
bank of Japan (OKUBO et alii, 2006), e que são depois processadas, como o GenScan,
identificam novos genes com base na presença de seqüências como: TATAA box; codons
de início; codons de terminação; seqüências sinalizadoras de separação (splicing) entre

1ª prova
48 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

exons e introns. Entretanto, a presença de uma região codificadora não implica necessa-
riamente em que essa seqüência será transcrita e traduzida na forma de uma proteína,
com função bioquímica e biológica. A obtenção e anotação do genoma estrutural de uma
espécie geram um mapa físico de toda a seqüência de DNA do genoma. Mapas físicos, em
conjunto com mapas de ligação (gerados pelo uso de RFLP, microsatélites, AFLP, etc)
são ferramentas cada vez mais úteis em programas de melhoramento genético assistido
por marcadores moleculares.
A estruturação de bancos de Expressed Sequence Tags (EST) (ISELI et alii, 1999)
é extremamente útil para a identificação da função bioquímica e biológica de muitos
genes. As EST são seqüências curtas de fragmentos de mRNA. A obtenção dos EST é um
método relativamente simples e rápido, visto que o seqüenciamento total do mRNA é
um trabalho muito complexo, ao passo que a obtenção de fragmentos curtos é bem
mais fácil. A informação genética contida nestes fragmentos é suficiente para a dedução
da proteína que eles codificam. Após a obtenção dos fragmentos, as seqüências são in-
troduzidas na base de dados de EST, que os investigadores podem utilizar para obter a
mensagem completa sobre mRNAs de interesse e, através da genômica funcional, po-
dem produzir a enzima codificada. Assim, genes expressos que codificam proteínas
com funções enzimáticas podem ser identificados com o uso destas novas ferramentas
da bioinformática.

EVOLUÇÃO DAS ENZIMAS IN VITRO

A expansão contínua do uso de enzimas nas indústrias químicas, têxteis, farmacêuticas
e de alimentos, cria a necessidade da produção de enzimas com alta estabilidade opera-
cional, alta especificidade e enantiosseletividade, além de novas atividades sobre subs-
tratos naturais e sintéticos (COHEN et alii, 2001). A engenharia enzimática promete
uma expansão extraordinária da produção e utilização de enzimas modificadas. Duas
estratégias têm sido utilizadas: a evolução direcionada e o redesenho racional (rational
redesign) (CHEN, 2001).
A evolução direcionada de enzimas surgiu há alguns anos como uma abordagem
muito eficaz para a adaptação de biocatalisadores para aplicações médicas e industriais.
A evolução direcionada mimetiza o darwinismo in vitro, combinando mutação e recom-
binação com o screening ou seleção de variantes da enzima com as propriedades deseja-
das (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999). Esta estratégia possui vantagens sobre o
uso de luz ultravioleta ou de substâncias mutagênicas, porque na evolução direcionada
a seqüência de nucleotídeos sujeita à mutação ao acaso se restringe ao gene que codifi-
ca a proteína de interesse ou até mesmo a partes deste gene. Já na mutagênese por ultra-
violeta e agentes químicos todo o genoma da célula é alvo de mutação. A fase crítica da
evolução direcionada é achar as variantes de efetivo interesse. Um exemplo marcante é
a subtilisina, da qual embora formas variantes tinham sido produzidas e secretadas com
alto rendimento, nenhuma delas tinha atividade aumentada nos processos utilizados
nas lavanderias (SCHMIDT-DANNERT e ARNOLD, 1999).

1ª prova
CAPÍTULO 2 ¡ A APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 49

No redesenho racional, empregam-se mutações sítio-dirigidas com o intuito de

trocar com precisão certos aminoácidos da enzima. A nova seqüência é concebida com
base em conhecimentos detalhados da estrutura protéica, sua função e mecanismo de
ação (CHEN, 1999). O poder do redesenho racional foi evidenciado pela produção de
uma superóxido dismutase redesenhada, muito mais ativa que as já conhecidas
(GETZOFF, 1992).
Os estudos de mutações que melhoram as propriedades enzimáticas revelaram
que em muitas enzimas, mas não em todas, as mutações próximas do centro ativo po-
dem aumentar drasticamente o sucesso de muitos experimentos que envolvem evolu-
ção direcionada (MORLEY et alii, 2006). Estes autores afirmam que, para a estabilidade
térmica e atividade catalítica, tanto as mutações próximas do centro catalítico como as
distantes parecem ser efetivas no melhoramento da enzima. Já no caso da enantioseleti-
vidade, da seletividade quanto ao substrato e da atividade catalítica alternativa,
mutações próximas ao centro ativo parecem mais efetivas do que as distantes.
Não se pode deixar de mencionar que avanços recentes no campo da ciência da
computação propiciaram a elaboração de novos métodos, sofisticados e refinados, ca-
pazes de descrever a maquinaria dos biocatalisadores com detalhes; embora a previsão
por computadores da quantidade de atividade enzimática ainda seja uma formidável
meta a ser atingida. A identificação de motivos estruturais, no substrato e nas enzimas,
específicos para o reconhecimento enzima/substrato não é nada trivial, porém, cada
vez mais, técnicas de modelagem molecular são usadas como ferramentas rotineiras
para a descrição da interação enzima/substrato. Uma excelente revisão dos métodos
computacionais usados para a orientação de estratégias experimentais em biocatálise,
foi recentemente publicada por Braiuca et alii (2006).
Escolher a abordagem mais adequada para melhorar uma enzima depende de
quanto se sabe de seu mecanismo e dos esquemas de seleção disponíveis. Com o au-
mento do número de estruturas tridimensionais depositadas nos banco de dados e com
o desenvolvimento de ferramentas poderosas para a modelagem de proteínas, o redese-
nho racional tornar-se-á mais eficiente e largamente aplicado. Por outro lado, a evolu-
ção direcionada poderá ser aplicada cada vez mais a enzimas de interesse industrial
quando houver processos de screening ou seleção eficazes das variantes de interesse.
Muito provavelmente, a associação das duas estratégias será uma rota de maior sucesso
para melhorar as propriedades e função de uma enzima, ou até mesmo criar uma nova
função enzimática. Vale ressaltar que a habilidade de alterar o metabolismo manten-
do-se o equilíbrio celular em termos de metabólitos será a chave da aplicação de
alterações em vias metabólicas de um grande número de organismos produtores de
enzimas de interesse industrial (CHATTERJEE e YUAN, 2006).

PERSPECTIVAS
Encontrar uma nova enzima significa encontrar uma nova função microbiana, portan-
to deve-se examinar o maior número possível de microrganismos, através de um poten-
te sistema de screening. Estima-se que 100 milhões de microrganismos estão presentes

1ª prova
50 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

em 1g de solo e que, portanto, há muitas enzimas ainda a serem descobertas. Além do

desafio da descoberta de uma nova enzima, há também o desafio de torná-la economi-
camente viável para o consumo e, também, de modificá-la. Os avanços na área da biolo-
gia molecular são contribuições importantes para a produção de microrganismos gene-
ticamente modificados que superexpressam certas enzimas e para a produção de enzi-
mas recombinantes extremófilas, capazes de atuar em processos nos quais as enzimas
mesófilas geralmente perdem a atividade. A biologia molecular também tem contribuí-
do para a evolução das enzimas in vitro visando o aumento da atividade e da estabilida-
de, ou mesmo a aquisição de nova função. A combinação da pesquisa computacional e
experimental em biocatálise oferece a possibilidade de aumentar grandemente o nível
de conhecimento dos sistemas biocatalíticos e de reduzir os esforços experimentais e,
conseqüentemente, seus custos. A coleta de informações celulares globais a partir de
dados em nível da transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica é tarefa
para a biotecnologia de sistemas, que ainda está em seus estágios iniciais, mas que
aponta para o fato de que, com base em tais informações globais, um dia será possível
desenhar células com propriedades metabólicas melhores para aplicações industriais.

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