30/06/2022

MÓDULO I
LABORATÓRIO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA

Jayc Castro Leal – 11721EQU027

Marcos Vinícios Silvestre – 11721EQU019
Natália dos Reis Filipin - 11621EQU040
Vinícius Francisco da Silva - 11721EQU036

Universidade Federal de Uberlândia

PRÁTICAS REALIZADAS

Parâmetros Cinéticos Influência da

Influência do pH na
de Reação Enzimática Temperatura na
Atividade Enzimática
Atividade Enzimática
01

INTRODUÇÃO
 Cinética Enzimática
Enzimas são substâncias geralmente formadas por
aminoácidos que agem como catalisadores em reações
biológicas.

A Cinética Enzimática tem como objetivo estudar

como diferentes parâmetros influenciam nas taxas
das reações catalisadas por enzimas, ou seja como
eles influenciam na velocidade com que essas reações
ocorrem.
 02

PRÁTICA I
Parâmetros cinéticos de
reação enzimática.
 OBJETIVO

Determinar os parâmetros cinéticos da hidrólise da

sacarose pela enzima invertase, utilizando o método de
Lineweaver–Burk, à temperatura constante.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

01 02 03 04 05
Colocar 40 mL
Preparar Colocar 40 mL Retirar uma da amostra
diferentes amostra de Descarregar o
da amostra (solução de
soluções de 0,5 mL da reator,
(solução de sacarose) no
sacarose (10, solução e promovendo a
sacarose) e 1 reator e, ao
20, colocar em devida limpeza.
ml de água atingir a
30, 50, 70 e destilada no tubo de temperatura de
90 reator à Follin-Wu, no 30 °C,
g.L-1) com temperatura de qual já existiam acrescentar 1
tampão 30 °C. 1 mL de DNS mL de
acético com pH (BRANCO). solução de
igual a 4,5. invertase.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

06 07 08 09 10
Retirar 0,5 mL Colocar os Resfriar em
de solução do Homogeneizar Efetuar o
tubos de água fria e a amostra e
reator e Follin-Wu em depois mesmo
realizar a
transferir para água em completar com leitura do procedimento
tubo de ebulição por 5 água destilada BRANCO em para as
Follin-Wu, no min. até 12,5 mL. espectrofotô- amostras do
qual já metro. reator com a
existiam 1 mL sacarose.
de DNS, em
intervalos de
tempo de 3
min.
 TRATAMENTO DE DADOS
Curva de calibração

Tabela 1 – Curva de calibração

Na Tabela 1 estão apresentados os Concentração (g/L) Absorbância
dados experimentais referentes à
curva de calibração, na qual, a 0 0
coluna da absorbância foi obtida 0,1 0,017
através de um valor médio dos 0,8 0,248
dados previamente fornecidos. 1,5 0,427
2,2 0,687
2,9 0,846
3,5 1,068
 TRATAMENTO DE DADOS
Curva de calibração

A partir dos valores apresentados na tabela acima, foi realizada uma regressão linear, de modo a
encontrar os coeficientes da equação.Figura 1 – Curva de calibração

y = 3,292x + 0,0228
 TRATAMENTO DE DADOS
I – Determinação dos parâmetros cinéticos da reação enzimática

1 2 3

Mantendo-se o pH da solução em Para cada concentração Plotou-se as

4,5 e a uma temperatura de de substrato curvas que
utilizada na reação de
30°C, variadas concentrações hidrólise representam a
foi possível determinar a variação de
de sacarose tiveram sua
concentração de glicose glicose em função
absorbância lida em função do por meio da Equação 1. do tempo.
tempo. 11
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 2 – Dados experimentais referente à concentração de
10g/L de sacarose.
Concentração de 10 g/L sacarose
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0
3 0,097 0,3012
6 0,179 0,5558
9 0,275 0,8539
12 0,355 1,1023

Tabela 3 – Dados experimentais referente à concentração de

20g/L de sacarose.
Concentração de 20 g/L sacarose
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,2 0,6812
6 0,398 1,333016
9 0,584 1,945328
12 0,669 2,225148
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 4 – Dados experimentais referente à concentração de
30g/L de sacarose.
Concentração de 30 g/L sacarose
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,147 0,506724
6 0,199 0,677908
9 0,343 1,151956
12 0,377 1,263884

Tabela 5 – Dados experimentais referente à concentração de

50g/L de sacarose.
Concentração de 50 g/L sacarose
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,146 0,503432
6 0,297 1,000524
9 0,447 1,494324
12 0,546 1,820232
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 6 – Dados experimentais referente à concentração de
70g/L de sacarose.

Concentração de 70 g/L sacarose

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,161 0,552812
6 0,248 0,839216
9 0,405 1,35606
12 0,519 1,731348

Tabela 7 – Dados experimentais referente à concentração de

90g/L de sacarose.

Concentração de 90 g/L sacarose

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,113 0,394796
6 0,257 0,868844
9 0,401 1,342892
12 0,469 1,566748
TRATAMENTO DE DADOS

Figura 8. Variação da glicose em função do tempo para as diferentes concentrações de

sacarose.
 TRATAMENTO DE DADOS
Determinação dos Parâmetros Cinéticos da Hidrólise da Sacarose

1 2 3

Para obter os parâmetros da v = (Vmáx. S)/(Km+S) (Equação 2)

Equação de Michaelis-Menten,
conforme Equação 2, foi feito
o ajuste variando-se a
velocidade da reação em
função da concentração de
substrato.
A velocidade para cada
Onde: v = velocidade da reação concentração de sacarose
(mol/L.min); S = concentração de utilizada no experimento, foi
obtida através do coeficiente
substrato (mol/L);
angular das retas das figuras 1,
Vmáx = velocidade máxima teórica da reação 2, 3, 4, 5 e 6.
(mol/L.min);
Km = constante de Michaelis-Menten (mol/L).

16
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
● Na Figura 9 está a representação gráfica da tabela 9, que apresenta o comportamento
da velocidade em função da concentração de cada substrato.

Tabela 8 – Velocidade da reação em função

da concentração de substrato.
S (mol/L) v (mol/L.min)
0,00000 0
0,02921 0,000517885
0,08764 0,000578388
0,14607 0,000848709
0,20450 0,00078099
0,26293 0,000746575

O comportamento da curva experimental se aproxima do que era previsto e para que os dados se ajustassem
mais a idealidade prevista, o ponto referente à concentração de 20g/L de substrato foi excluído.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em seguida, para a obtenção dos parâmetros cinéticos foi realizada a regressão não linear com a
Equação 1 d e M i c h a e l i s M e n t e n .

Equação 1

Vmáx(mol/min) Km (mol) R²
0,000848 0,02103 0,9480
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em seguida, para a obtenção dos parâmetros cinéticos foi feita a linearização da Equação 1,
gerando a Equação 2, na qual obtém-se o método proposto por Lineweaver–Burk.

Equação 2

Tabela 9. Velocidade da reação em função da concentração

de substrato linearizada.

1/v 1/S
1930,9325 34,2297
1728,9443 11,4099
1178,2603 6,8459
1280,4264 4,8900
1339,4498 3,8033 Vmáx(mol/min) Km (mol) R²
0,000817 0,017907 0,7381
Determinar os parâmetros cinéticos da hidrólise
da sacarose pela enzima invertase, utilizando o
método de Lineweaver–Burk, à temperatura
constante.

Quanto menor for o valor de

Km, maior será a afinidade da
enzima pelo substrato e,
consequentemente, um Km
maior corresponde a uma
menor afinidade enzima-
substrato.
 Modelo Não- Linear Modelo Linear Desvio (%)

Km (mol/L) 0,02103 0,017907 14,9%

Vmáx 0,000848 0,000817 3,7%

(mol/Lmin)

Os valores encontrados experimentalmente

para a enzima invertase não foram tão
condizentes quando comparados com a
literatura. Principalmente aquele encontrado
para a máxima velocidade da reação, Vmáx.
02

PRÁTICA II
Influência do pH na
reação enzimática.
 OBJETIVO

Verificar a influência do pH sobre o desempenho da

enzima invertase na catálise da reação de hidrólise da
sacarose e determinar o melhor pH para que a reação
enzimática seja favorecida a temperatura e
concentração constantes.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

01 02 03 04 05
Colocar 40 mL
Preparar Colocar 40 mL Retirar uma da amostra
diferentes amostra de Descarregar o
da amostra (solução de
soluções de 0,5 mL da reator,
(solução de sacarose) no
sacarose 50 solução e promovendo a
sacarose) e 1 reator e, ao
g/.L com colocar em devida limpeza.
ml de água atingir a
tampão de destilada no tubo de temperatura de
citrato-fosfato reator à Follin-Wu, no 30 °C,
em diferentes temperatura de qual já existiam acrescentar 1
pH (3; 4; 4,5; 30 °C. 1 mL de DNS mL de
5; 6; 7) (BRANCO). solução de
invertase.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

06 07 08 09 10
Retirar 0,5 mL
de solução do Resfriar em Homogeneizar Efetuar o
Colocar os
reator e água fria e a amostra e mesmo
tubos de
transferir para realizar a procedimento
Follin-Wu em depois
tubo de leitura do para as
água em completar com BRANCO em
Follin-Wu, no água destilada amostras do
ebulição por 5 espectrofotô-
qual já até 12,5 mL. metro. reator com a
min.
existiam 1 mL sacarose.
de DNS, em
intervalos de
tempo de 3
min.
 TRATAMENTO DE DADOS
I – Determinação dos parâmetros cinéticos da reação enzimática

1 2 3

Mantendo-se a concentração da Para cada concentração de Plotou-se as

glicose obtida ao longo do curvas que
solução em 50 g/L a uma tempo nos diferentes valores
representam a
temperatura de 30°C, a reação de pH foi possível determinar
a concentração de glicose por variação de
de catálise da sacarose foi meio da Equação 1. glicose em função
do tempo para
observada para diferentes
diferentes pH.
valores de pH 26
TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 10 – Dados experimentais referente ao pH de 3.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,126 0,437592
6 0,278 0,937976
9 0,392 1,313264
12 0,524 1,747808
15 0,646 2,149432

Tabela 11 – Dados experimentais referente ao pH de 4.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,13 0,45076
6 0,308 1,036736
9 0,475 1,5865
12 0,636 2,116512
15 0,765 2,54118
TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 12 – Dados experimentais referente ao pH de 4,5.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,155 0,53306
6 0,305 1,02686
9 0,4 1,3396
12 0,619 2,060548
15 0,777 2,580684

Tabela 13 – Dados experimentais referente ao pH de 5.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,134 0,463928
6 0,26 0,87872
9 0,375 1,2573
12 0,544 1,813648
15 0,653 2,172476
TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 14 – Dados experimentais referente ao pH de 6.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,086 0,305912
6 0,187 0,638404
9 0,286 0,964312
12 0,388 1,300096
15 0,479 1,599668

Tabela 15 – Dados experimentais referente ao pH de 7.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,025 0,1051
6 0,057 0,210444
9 0,09 0,31908
12 0,128 0,444176
15 0,15 0,5166
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
● Na Figura está a representação gráfica da tabela, que apresenta o comportamento da
velocidade em função das soluções em diferentes pH.
Tabela 16 – Velocidades de formação de glicose
para diferentes concentrações de H+

ph v (mol/L.min) [H+]
3 0,000789871 0,001
4 0,000959169 0,0001
4,5 0,000934745 3,16228E-05
5 0,000802083 0,00001
6 0,000591709 0,000001
7 0,000189835 0,0000001
Graficamente, o valor de pH ótimo encontrado
O comportamento da curva experimental se aproxima está próximo de 4.
do que era previsto.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Velocidade em função da concentração de H+

Utilizando-se o modelo teórico:

Foi possível determinar os valores k[E 0], K1

e K2 através de modelagem no software

STATISTICA®
k[E0] K1 K2
0,001987 0,009856 0,110053E-4
03

PRÁTICA III
Influência da temperatura
na reação enzimática.
 OBJETIVO

Verificar a influência da temperatura sobre o

desempenho da enzima invertase na reação de
hidrólise da sacarose.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

01 02 03 04 05
Colocar 40 mL
Preparar uma
Colocar 40 mL Retirar uma da amostra
solução de Descarregar o
da amostra amostra de (solução de
sacarose (50 g.L- reator,
(solução de 0,5 mL da sacarose) no
1). promovendo a
sacarose) e 1 solução e reator e, ao
Ajustar o banho
colocar em devida limpeza.
ml de água atingir a
termostatizado
destilada no tubo de temperatura
para que o Follin-Wu, no
reator à desejada,
reator atinja, se qual já existiam
temperatura de acrescentar 1
possível, as
30 °C. 1 mL de DNS mL de
temperaturas de (BRANCO). solução de
20, 30, 40, 50,
invertase.
60, 70°C.
 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

06 07 08 09 10
Retirar 0,5 mL
de solução do Resfriar em Homogeneizar Efetuar o
Colocar os
reator e água fria e a amostra e mesmo
tubos de
transferir para realizar a procedimento
Follin-Wu em depois
tubo de leitura do para as
água em completar com BRANCO em
Follin-Wu, no água destilada amostras do
ebulição por 5 espectrofotô-
qual já até 12,5 mL. metro. reator com a
min.
existiam 1 mL sacarose.
de DNS, em
intervalos de
tempo de 3
min.
 TRATAMENTO DE DADOS
I – Determinação dos parâmetros cinéticos da reação enzimática

1 2 3

Mantendo-se o pH da solução em Para cada concentração de Plotou-se as

4,5 e uma solução de sacarose glicose obtida ao longo do curvas que
tempo nas diferentes valores
de 50 g/L, variou-se as representam a
de temperatura foi possível
determinar a concentração de variação de
temperaturas, que tiveram sua
glicose por meio da Equação glicose em função
absorbância lida em função do 1. do tempo para
tempo. diferentes
36
temperatura.
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 10 – Dados experimentais referente a temperatura de 20 °C.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,085 0,30262
6 0,157 0,539644
9 0,309 1,040028
12 0,357 1,198044

Tabela 11 – Dados experimentais referente a temperatura de 40 °C.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,226 0,766792
6 0,42 1,40544
9 0,627 2,086884
12 0,878 2,913176
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 10 – Dados experimentais referente a temperatura de 50 °C.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,453 1,514076
6 0,653 2,172476
9 0,967 3,206164
12 1,301 4,305692

Tabela 11 – Dados experimentais referente a temperatura de 60 °C.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,326 1,095992
6 0,62 2,06384
9 0,943 3,127156
12 1,16 3,84152
 TRATAMENTO DE DADOS
Tabela 10 – Dados experimentais referente a temperatura de 63 °C.
Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,085 0,30262
6 0,157 0,539644
9 0,309 1,040028
12 0,357 1,198044

Tabela 11 – Dados experimentais referente a temperatura de 66 °C.

Concentração
Tempo (min) Absorbância
de glicose (g/L)
0 0 0,0228
3 0,226 0,766792
6 0,42 1,40544
9 0,627 2,086884
12 0,878 2,913176
TRATAMENTO DE DADOS

Tabela 10 – Dados experimentais referente a temperatura de 70 °C.

Concentração de
Tempo (min) Absorbância
glicose (g/L)
0 0 0,0228
1 0,045 0,17094
2 0,054 0,200568
3 0,063 0,230196
4 0,063 0,230196
5 0,082 0,292744
Variação da glicose em função do tempo para as diferentes temperaturas.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
● Na Figura está a representação gráfica da tabela, que apresenta o comportamento da
velocidade em função das soluções em diferentes temperaturas.
Tabela 16 – Velocidades de formação de glicose
para diferentes temperaturas de reação.

Temperatura v (mol/L.min)
293,15 0,000571
313,15 0,001314
323,15 0,001898
333,15 0,001789
336,15 0,001225
339,15 0,000691
343,15 0,000247

O comportamento da curva experimental se aproxima

do que era previsto.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para obtenção da Ea, Eai e K0 foi feita a linearização para a Equação de Arrhenius para
os seus respectivos valores.
Energia de Ativação
(Ea)
ln v 1/T (K-1)
-7,467820778 0,003411223
-6,634784905 0,003193358
-6,267060125 0,003094538
-6,326095632 0,003001651
-6,704774108 0,002974862
-7,277272705 0,002948548
-8,306089232 0,002914177

Y = −3796,9 * X + 5,4857 R² = 1

Ea = 31,5674 KJ/mol

K0 = 241,2177
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para obtenção da Ea, Eai e K0 foi feita a linearização para a Equação de Arrhenius para
os seus respectivos valores.
Energia de Inativação (Eai)

ln v 1/T (K-1)
-7,467820778 0,003411223
-6,634784905 0,003193358
-6,267060125 0,003094538
-6,326095632 0,003001651
-6,704774108 0,002974862
-7,277272705 0,002948548
-8,306089232 0,002914177

Y = 22779 *X – 74,76 R² =
0,9742
Eai= 189,384 KJ/mol

K0i = 3,4052E-33
 CONCLUSÃO

● Variações nas temperaturas afetam muito a configuração das enzimas;

● A temperatura que maximiza a atividade geralmente é prejudicial para a

preservação, não sendo um valor tão relevante, como no pH;

● A atividade aumenta com o aumento de temperatura, na ativação;

● A atividade diminui com o aumento de temperatura, na inativação, a partir da

Tmáx;

● A temperatura ideal do processo, pode ser menor do que a temperatura

considerada ótima.
CONCLUSÃO

● Teórico: Bergamasco et. al. (2000) encontrou o valor de 29300,9

J/mol como energia de ativação da invertase livre à 55ºC;

● Experimental: foi encontrado 31567,4 J/mol à cerca de 50°C;

● A Ea determinada experimentalmente apresentou valores muito

próximos do proposto, se comparado aos dados teóricos;

● A temperatura máxima aproximou-se do encontrado na literatura.

REFERÊNCIAS

HER, CHEENOU; SINGH, JAIDEEP; KRISHNAN, V.V. Effect of

sucralose on the enzyme kinetics of invertase using real-time
NMR spectroscopy and progress curve analysis. Carbohydrate
Research, [s.l.], v. 455, p.5-9, jan. 2018. Elsevier BV.
http://dx.doi.org/10.1016/j.carres.2017.10.019.

BERGAMASCO, R., F.J.BASSETTI, F,F. DE MORAES AND G.M.ZANIN.

Characterization of free and immobilized invertase regarding activity and
energy of activation. Braz. J. Chem. Eng. vol.17 n.4-7 São Paulo Dec. 2000.
OBRIGADO PELA
ATENÇÃO!