Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Bioquímica Experimental

Prática 5 – Cinética Enzimática: Efeito do tempo e da concentração de enzima

Renato Alexandre Polins Junior

Saira Vitória de Aquino Veneziani

Ribeirão Preto/SP

2019
1. OBJETIVOS

Observar a relação entre a velocidade da reação e a concentração de enzima, bem como o

efeito do tempo de incubação da enzima com o substrato.

2. RESULTADOS E DISCUSSÕES

2.1 Efeito da concentração da enzima sobre a velocidade da reação

Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais foram mantidas constantes as
concentrações de tampão e substrato, enquanto a concentração de enzima foi variada. Foram
calculados os volumes utilizados de tampão, substrato, água e enzima para que o volume final
fosse 1,0 mL, segundo o protocolo indicado na tabela 1. As soluções estoque utilizadas foram:
tampão de citrato de sódio 1 mol/L, pH 5.5; substrato pNFF 20 mmol/L; e a enzima fosfatase
ácida (40 ng/mL).
Em intervalos de 1 minuto foi adicionada a quantidade de enzima calculada em cada tubo,
deixando reagir por 30 minutos e então interrompendo cada reação adicionando 1,0 mL de
NaOH 1 mol/L. A base foi adicionada pois desnatura a enzima e transforma o substrato p-
nitrofenilfosfato (pNFF) em p-nitrofenol (amarelo) e fosfato inorgânico. O p-nitrofenol pode ser
dosado espectrofotometricamente, obtendo-se as absorbâncias apresentadas também na tabela 1,
medidas no comprimento de onda 410 nm:

Tabela 1 – Protocolo de preparação do experimento e absorbâncias obtidas

Tampão Enzima Enzima

Tubo PNFF (µL) Água (µL) A410
(µL) (µL) (ng/tubo)
1 100 100 800 - - 0
2 100 100 750 50 2,0 0,153
3 100 100 700 100 4,0 0,199
4 100 100 675 125 5,0 0,254
5 100 100 650 150 6,0 0,372
6 100 100 600 200 8,0 0,498
7 100 100 550 250 10,0 0,556

Utilizando a lei de Lambert-Beer (A = εbc), foi possível calcular a concentração da

-1 -1
enzima, sabendo que o coeficiente de extinção molar é de 17600 M cm e o caminho óptico é
de 1 cm. A concentração foi calculada para 2,0 mL, volume final do tubo, para determinar a
quantidade de enzima em mols por cada tubo. Por fim, a velocidade foi calculada dividindo a

2
 quantidade em mols no tubo pelo tempo de reação, que no caso deste experimento, foi de 30
minutos para todas as reações. Os resultados encontrados estão registrados na tabela 2.

𝐴 1𝐿 𝑛
𝑐= ⇒ 𝑛 = 𝐶µmol /L 𝑥 2,0 𝑚𝐿 𝑥 ⇒ 𝑣 =
17600 𝑀−1 𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚 1000 𝑚𝐿 30 𝑚𝑖𝑛

Tabela 2 - concentração de enzima em cada tubo e velocidade de cada reação

Tubo A410 Enzima (ng/tubo) C (mol/L) C (µmol/L) n (µmol) (em 2mL) v (µmol/min)
1 0 - 0 0 0 0
2 0,153 2,0 -6 8,89 0,0178 -4
8,89 x 10 5,93 x 10
3 0,199 4,0 -5 11,6 0,0231 -4
1,16 x 10 7,71 x 10
4 0,254 5,0 -5 14,8 0,0295 -4
1,48 x 10 9,84 x 10
5 0,372 6,0 -5 21,6 0,0432 -3
2,16 x 10 1,44 x 10
6 0,498 8,0 -5 28,9 0,0579 -3
2,89 x 10 1,93 x 10
7 0,556 10,0 -5 32,3 0,0646 -3
3,23 x 10 2,15 x 10

Em seguida foi preparada uma curva da velocidade da reação em função da massa da

enzima em cada tubo, registrada na figura 1 a seguir.

Velocidade de reação x massa de enzima

0,0025
Velocidade de reação (μmol/min)

0,002
y = 2,18.10-4x + 4,21.10-5
R² = 0,9560
0,0015

0,001

0,0005

0
0 2 4 6 8 10 12
Massa da enzima (ng)

Figura 1 - curva da velocidade da reação em função da massa da enzima em cada tubo

3
 Como se observa no gráfico, a velocidade aumenta linearmente com o aumento da massa
da enzima, ou seja, a velocidade da reação é proporcional à massa de enzima colocada no tubo,
com pequenos desvios da linearidade, provavelmente devido a erros experimentais,
principalmente no rigor ao efetuar cada pipetagem para realizar as reações.
Os valores de velocidade determinados são considerados valores de velocidade inicial,
pois foi consumido menos do que 5% da quantidade inicial de substrato. Foram pipetados 100
μL de substrato com uma concentração de 20 mmol/L, portanto a quantidade inicial de substrato
no tubo era 2,0 μmol. Sendo assim, 5% desta quantidade correspondem a 0,1 μmol, e conforme
verificado na tabela 2, a maior quantidade de produto formado corresponde ao tubo 7, que foi
0,0646 μmol, quantidade abaixo dos 5% calculados.
Sabendo que a massa molecular da enzima é 66.000 g/mol, foi possível determinar o
número de renovação da enzima em relação ao pNFF. Selecionando o valor de 10 ng de enzima
no tubo, utilizou-se a equação da reta obtida no gráfico para encontrar a velocidade da reação, e
então se calculou o número de renovação a partir da divisão desta velocidade pela quantidade em
mols da enzima:

𝑣 = 2,18. 10−4 𝑥 10 + 4,21. 10−5 = 2,22 𝑥 10−3 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛

𝑣 𝑣 2,22 𝑥 10−9 𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛

k cat = = 𝑚 = −9 = 14652 𝑚𝑖𝑛−1
𝑛 10 𝑥 10 𝑔
𝑀𝑀 66000 𝑔/𝑚𝑜𝑙

2.2. Efeito do tempo de incubação da enzima com o substrato

Assim como no experimento anterior, preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais
foram mantidas constantes as concentrações de tampão, substrato e enzima, variando apenas o
tempo de reação. Foram calculados os volumes utilizados de tampão, substrato, água e enzima
para que o volume final fosse 1,0 mL, segundo o protocolo indicado na tabela 3. As soluções
estoque utilizadas foram: MR, mistura de tampão de citrato de sódio 200 mmol/L, pH 5.5;
substrato pNFF 4 mmol/L; e a enzima fosfatase ácida (40 ng/mL). A
A enzima foi adicionada ao tubo em intervalos de 1 minuto foi e a reação foi interrompida no
tempo determinado para cada tubo, adicionando 1,0 mL de NaOH 1 mol/L. Assim como no
experimento anterior, o mesmo produto p-nitrofenol foi obtido e pode ser dosado
espectrofotometricamente, obtendo-se as absorbâncias apresentadas também na tabela 3,
medidas no comprimento de onda 410 nm:

4
 Tabela 3 – Protocolo de preparação do experimento e absorbâncias obtidas

Tubo MR (µL) Enzima Água Tempo de A410

(µL) (µL) reação (min)
Branco 500 - 500 - 0
1 500 250 250 5 0,302
2 500 250 250 10 0,354
3 500 250 250 15 0,455
4 500 250 250 20 0,547
5 500 250 250 25 0,627
6 500 250 250 30 0,722

Utilizando a lei de Lambert-Beer (A = εbc), foi possível calcular a concentração da

-1 -1
enzima, sabendo que o coeficiente de extinção molar é de 17600 M cm e o caminho óptico é
de 1 cm. A concentração foi calculada para 2,0 mL, volume final do tubo, para determinar a
quantidade de enzima em mols por cada tubo. Por fim, a velocidade foi calculada dividindo a
quantidade em mols no tubo pelo tempo de cada reação. Os resultados encontrados estão
registrados na tabela 4.

𝐴 1𝐿 𝑛
𝑐= ⇒ 𝑛 = 𝐶µmol /L 𝑥 2,0 𝑚𝐿 𝑥 ⇒ 𝑣 =
17600 𝑀−1 𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚 1000 𝑚𝐿 𝑡

Tabela 4 - concentração de enzima em cada tubo e velocidade de cada reação

Tempo de A410 C (mol/L) C (µmol/L) n (µmol) v

Tubo
reação (min) (em 2mL) (µmol/min)
-5 -3
1 5 0,202 1,15 x 10 15,5 0,0230 4,59 x 10
-5 -3
2 10 0,354 2,01 x 10 20,1 0,0402 4,02 x 10
-5 -3
3 15 0,455 2,58 x 10 25,8 0,0517 3,44 x 10
-5 -3
4 20 0,547 3,11 x 10 31,1 0,0622 3,11 x 10
-5 -3
5 25 0,627 3,56 x 10 35,6 0,0712 2,85 x 10
-5 -3
6 30 0,722 4,10 x 10 41,0 0,0820 2,73 x 10

Em seguida foram preparadas duas curvas, da quantidade de produtos formada em função

do tempo, bem como da velocidade da reação em função do tempo, registrada nas figuras 2 e 3.

5
 Quantidade de produtos x tempo
0,09
Quantidade de produto formado (μmol)
0,08 y = 2,28.10-3x + 1,52.10-2
R² = 0,988
0,07

0,06

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)

Figura 2 - curva da quantidade de produto formado em função do tempo

Velocidade da reação x tempo

0,005
Velocidade da reação (μmol/min)

0,004

0,003

0,002

0,001

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)

Figura 3 - curva da velocidade da reação em função do tempo

Os valores de velocidade determinados são considerados valores de velocidade inicial,

pois foi consumido menos do que 5% da quantidade inicial de substrato. A quantidade inicial de
substrato nos tubos de ensaio neste experimento era a mesma do experimento anterior, 2,0 μmol.
Sendo assim, 5% desta quantidade correspondem a 0,1 μmol, e conforme verificado na tabela 4,

6
a maior quantidade de produto formado corresponde ao tubo 6, que foi 0,0820 μmol, quantidade
abaixo dos 5% calculados.
Como se observa no primeiro gráfico, a quantidade de produto formado aumenta
linearmente com o tempo de incubação, ou seja, a quantidade de produto formado é diretamente
proporcional ao tempo de incubação da enzima com o substrato, pois dentro dos valores de
velocidade inicial, espera-se que a velocidade das reações seja constante, de modo que mais
produtos sejam formados conforme o tempo de reação aumenta, ou seja, o tempo em que a
enzima transforma o substrato em produto aumenta; sendo que esta relação se mantém linear na
taxa da velocidade da reação.
Porém, ao observar o segundo gráfico, percebe-se que as velocidades obtidas para cada
reação não se manteve constante. Esperava-se para este gráfico que uma reta de tendência
paralela ao eixo x fosse obtida, pois a velocidade deveria ser constante em todos os tubos, já que
as concentrações de substratos, enzimas e tampão utilizadas foram as mesmas em todos os tubos,
variando-se apenas o tempo da reação. Porém, devido a erros experimentais, obteve-se uma alta
imprecisão nas medidas, com desvio padrão de uma ordem de grandeza abaixo da média das
-3 -4
velocidades obtidas. A velocidade média obtida foi de 3,27x10 ± 7,50x10 μmol/min.

3. CONCLUSÕES

O primeiro experimento realizado permitiu observar a relação entre a concentração da

enzima e a velocidade da reação. Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais foram
mantidas constantes as concentrações de tampão e substrato, enquanto a concentração de enzima
foi variada na faixa de 2,0 a 10,0 ng/mL. Os resultados indicaram que a velocidade da reação é
proporcional à massa de enzima colocada no tubo.
O segundo experimento realizado permitiu observar o efeito do tempo de incubação da
enzima com o substrato. Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais foram mantidas
constantes as concentrações de tampão, substrato e enzima, variando apenas o tempo de reação.
Os resultados indicaram que a quantidade de produto formado é diretamente proporcional ao
tempo de incubação da enzima com o substrato. Esperava-se que velocidade fosse constante em
todos os tubos, já que as concentrações de substratos, enzimas e tampão utilizadas foram as
mesmas. Porém devido a erros experimentais, obteve-se uma alta imprecisão nas medidas, e as
velocidades obtidas não se mostraram constantes.

4. REFERÊNCIAS

VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4ª ed.