Recombinant DNA Technology BCM 2009

UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA
FACULDADE DE ENGENHARIA
Licenciatura Em Engenharia Biomédica
3º Ano – 1º Semestre
Trabalho Laboratorial
CLONAGEM DE UM FRAGMENTO DE DNA GENÓMICO DA

HELICOBACTER PYLORI
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Disciplina: Biologia Celular e Molecular

Docente: Prof.ª Mónica Roxo
RELATÓRIO REALIZADO POR:
 Catarina Mendonça, Nº181907024

 Elisete Duarte, Nº 1819070287
 Pedro Noronha, Nº 181907013
11 De Novembro de 2009
Faculdade de Engenharia da Universidade Católica
Engenharia Biomédica
ÍNDICE GERAL
 Índices
1. Índice Geral……………………………………………………………………2
2. Índice de Figuras……………………………………………………………...3
3. Índice de Tabelas.…………………………………………………………….5
 Resumo analítico………………………………………………………………………6
 Introdução………………………………………………………………………………7
 Enquadramento Teórico……………………………………………………….……11
 Objectivos……………………………………………………………………………..18
 Procedimento experimental………………………………………………………...19
 Análise e discussão dos resultados……………………………………………..…32
 Conclusão…………………………………………………………………………….40
 Referências Bibliográficas.....…………………….………………………………...41
Biologia Celular e Molecular – Clonagem de um fragmento de DNA da bactéria 2

Helicobacter pylori
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Produção de DNA recombinante…………………………………………………7
Figura 2: Mapa do plasmídeo pBR322…………………………………………………...…8
Figura 3: Mapa do plasmídeo pBluescript……………..……………………………………9
Figura 4: Bactéria Echerichia coli……………………………………………………………9
Figura 5: Bactéria Helicobacter pylori……………………………………………………...10
Figura 6: Enzima de restrição a hidrolisar um fragmento de DNA……………………...11
Figura 7: Actuação da enzima de restrição originando extremidades coesivas,

permitindo que os dois fragmentos de DNA se liguem por complementaridade………12
Figura 8: Explicação do “método do cloreto de cálcio” ………………………………….14
Figura 9: Esquema representativo do processo de clonagem …………………………16
Figura 10: Aparelho para a electroforese do DNA em gel de agarose ………………..17
Figura 11: Curva de crescimento exponencial da cultura bacteriana…………………..19
Figura 12: Estrutura molecular do IPTG …………………………………………………..22
Figura 13: Estrutura molecular do X-gal …………………………………………………..22
Figura 14: Colónia com plasmídeos não recombinados ………………………………..24
Figura 15: Enzima de restrição HindIII ……………………………………………………25
Figura 16: Enzima de restrição XhoI ………………………………………………………27

Helicobacter pylori
Figura 17: Visualização dos fragmentos de DNA quando expostos à luz UV na

presença do brometo de etídio ……………………………………………………………..27
Figura 18: Marcador de pesos moleculares ……………………………………………...29
Figura 19: Aplicação das amostras no gel de agarose…………………………………..30
Figura 20: Resultados da electroforese em gel de agarose…………………………….30
Figura 21: Cultura de bactérias do grupo………………………………………………....33
Figura 22: Marcador de pesos moleculares utilizado, correspondente à figura 18…..34
Figura 23: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose ……………...34
Figura 24: Polylinker do pBs ……………………………………………………………….37
Figura 25: Possível mapa de restrição do plasmídeo recombinante….……………….38
Figura 26: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose ……………...39

Helicobacter pylori
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Concentração das soluções utilizadas na hidrólise do DNA plasmídico…...26
Tabela 2 – Concentração das soluções utilizadas no plasmídeo não hidrolisado…….27
Tabela 3: Valores dos pesos moleculares e das distâncias percorridas por cada banda
do marcador……………………………………………………………………….…………..35

Helicobacter pylori
RESUMO
O presente relatório tem como objectivo principal clonar um fragmento de DNA

da bactéria Helicobacter pylori, através da tecnologia do DNA recombinante e
determinar o mapa de restrição do respectivo plasmídeo recombinado.
Este trabalho laboratorial inicia-se com a preparação de bactérias competentes,
isto é, bactérias que ficam aptas a receber moléculas de DNA estranho. As bactérias
utilizadas neste procedimento são da estirpe Escherichia coli (E. coli) DH5α. Para que
seja possível torná-las competentes usa-se o “método do cloreto de cálcio” que
permite, através de um choque térmico, aumentar a permeabilidade da membrana
plasmática, facilitando assim a entrada do plasmídeo recombinado. Posteriormente,
insere-se a molécula de DNA recombinante nas bactérias competentes, processo
designado por transformação. Procede-se, de seguida, à selecção das colónias de
bactérias que contêm o plasmídeo recombinante. É na presença do gene lacZ’ e do
gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, que esta selecção de colónias é
efectuada.
Apenas as bactérias que possuem os plasmídeos (recombinados ou não) no
seu interior serão resistentes à ampicilina, enquanto as que não o possuem morrerão
na presença deste antibiótico.
Das bactérias resistentes ao antibiótico ampicilina pode-se obter dois tipos de
colónias: brancas e/ou azuis. As brancas contêm o plasmídeo recombinante (gene
lacZ’ inalterado) enquanto as azuis não contêm esta molécula (gene Lac Z’ alterado).
Posteriormente, é feita a extracção e purificação de DNA plasmídico através do
método de ebulição.
Por fim, determina-se o mapa de restrição do plasmídeo recombinante em
estudo. Para tal, é realizada uma electroforese que permite quantificar a molécula de
DNA e identificar os locais onde as enzimas de restrição – HindIII e XhoI – a
hidrolisam.

Helicobacter pylori
INTRODUÇÃO
A clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de DNA, pode ser descrita

do seguinte modo: o gene é ligado a um vector, que é na maior parte das vezes um
plasmídeo, formando uma molécula de DNA recombinante (rDNA). De seguida, esta
molécula é introduzida numa célula hospedeira, processo designado por
transformação, após a mesma ter sido tornada previamente competente.
O vector tem capacidade de se replicar autonomamente, geralmente, em
paralelo com a replicação do genoma do hospedeiro. À medida que a célula
hospedeira se vai dividindo por sucessivas mitoses, o vector recombinante também se
divide e é transmitido às células filhas, formando-se assim clones de células iguais.
Consequentemente, o fragmento de DNA é amplificado, procedendo depois ao seu
isolamento e caracterização. (adaptado de Videira, A., Engenharia Genética – Princípios e
aplicações, 2001).
Figura 1: Produção de DNA recombinante (Matias,O.e E Martins,P., Biologia, Arial Editores,

2005)
Neste trabalho laboratorial foram utilizados como vectores dois plasmídeos

diferentes, o pBs no qual foi introduzido o insert (fragmento de DNA da H. pylori),
formando-se assim a molécula de rDNA, e o pBR322 usado como controlo, no qual
não foi inserido nenhum fragmento de DNA.
O pBR322 é um plasmídeo de clonagem clássico. É usado para a construção
de bibliotecas genómicas, pois não permite a expressão do gene clonado. Neste
plasmídeo a clonagem é feita num sítio de restrição dentro do gene tet, que confere à
bactéria hospedeira a resistência ao antibiótico tetraciclina. Outra marca de
resistência, é representada pelo gene bla, que confere à bactéria hospedeira do
plasmídeo a resistência à ampicilina.

Helicobacter pylori
Figura 2: Mapa do plasmídeo pBR322. É possível observar na imagem os dois genes que
conferem resistência aos antibióticos: o tet para a tetraciclina e o bla para a ampicilina. Os
sítios de restrição ao longo da sequência de nucleótidos estão indicados em azul, com o nome
da enzima. Produção de DNA recombinante (adaptado de
http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG, Dezembro 2009)
O pBs (pBlueScript KS) apresenta características importantes, típicas dos

vectores de clonagem. Contém vários locais únicos de digestão para diversas enzimas
de restrição, agrupados numa região do plasmídeo denominada local múltiplo de
clonagem (MCL - multiple cloning site) ou polylinker e além disso contém o gene que
confere resistência à ampicilina, permitindo que as células transformadas sejam
seleccionadas em placas com meio contendo este antibiótico. (adaptado de
http://w3.ualg.pt/~jbelo/documentos/Labprotocols-LEG%202006.pdf, Dezembro 2009)

Helicobacter pylori
Figura 3: Mapa do plasmídeo pBluescript. O gene lacZ’ está indicado em azul e dentro dele,
em azul mais escuro, a região de clonagem (polylinker ou MCS - multiple cloning site).
(adaptado de http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG, Dezembro 2009)
Utilizou-se como hospedeiro bactérias da espécie E. coli DH5α. A bactéria

E.coli é um dos organismos preferencialmente utilizados em experiências de
clonagem, quer pelas suas características fisiológicas quer pelo conhecimento de
décadas de investigação sobre a sua biologia. Para além disso, tem características de
manipulação fácil, crescimento rápido e económico (Videira, A., Engenharia Genética –
Princípios e aplicações, 2001). No processo de clonagem a estirpe DH5α é a mais
utilizada pois esta foi alterada de modo a não ser patogénica. Além disso a E. coli
DH5α apresenta um ciclo de vida a cada 20 minutos (adaptado de protocolo laboratorial
nº 1).
Figura 4: Bactéria Echerichia coli (adaptado de

http://www.tinycottager.net/articles/2007Fall/images/e_coli.jpg, Dezembro 2009)

Helicobacter pylori
No final do trabalho laboratorial procedeu-se ao mapeamento do plasmídeo

recombinante, sendo para tal necessário a utilização de enzimas de restrição e
posterior electroforese.
Assim, e como já foi dito anteriormente, o objectivo geral do trabalho
laboratorial, consta na clonagem de um fragmento de DNA da Helicobacter pylori e
respectiva interpretação dos resultados obtidos.
Figura 5: Bactéria Helicobacter pylori (adaptado de

http://www.expasy.org/spotlight/images/sptlt095_1.jpg, Dezembro 2009)
Seguidamente apresentar-se-á todos os fundamentos que tiveram por base a

realização e elaboração do relatório, como o enquadramento teórico, o procedimento
utilizado, os resultados e respectiva discussão e por fim a conclusão.

Helicobacter pylori
ENQUADRAMENTO TEÓRICO
Nas últimas décadas têm vindo a ser desenvolvidas novas técnicas que
permitem a análise e manipulação do DNA. Um dos grandes problemas com que se
depararam os investigadores que tentavam manipular o DNA era o isolamento dos
genes.
Ao longo da década de 60, diversas investigações com microrganismos tinham
permitido descobrir enzimas capazes de seleccionar o DNA em locais específicos.
Estas enzimas, designadas por enzimas de restrição ou endonucleases, começaram a
ser utilizadas em técnicas de manipulação in vitro.
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer pequenas sequências
especificas de nucleótidos, hidrolisando a molécula de DNA apenas nesses locais.
Cada enzima apresenta um local único de restrição.
Figura 6: Enzima de restrição a hidrolisar um fragmento de DNA (Matias,O.e E Martins,P.,

Biologia, Arial Editores, 2005)
As enzimas de restrição permitiram desenvolver uma das metodologias mais

utilizadas na Engenharia Genética: a tecnologia do DNA recombinante. Esta técnica
permite produzir moléculas de DNA a partir da combinação de sequências de
nucleótidos de proveniências diferentes, ou seja, possibilita transferir fragmentos de
DNA de um tipo celular para outro (adaptado de Matias,O. E Martins,P., Biologia, Arial
Editores, 2005).
Para que um fragmento de DNA seja inserido num vector é necessário que a
enzima de restrição que actuou sobre o fragmento actue também sobre o vector.
Muitas enzimas de restrição clivam sequências de DNA, originando fragmentos com
extremidades coesivas que permitem a ligação do insert a um vector, com a

Helicobacter pylori
participação da DNA ligase. Esta reacção de ligação é eficiente em extremidades

coesivas de DNA que podem emparelhar por complementaridade.
Figura 7: Actuação da enzima de restrição originando extremidades coesivas, permitindo que

os dois fragmentos de DNA se liguem por complementaridade (adaptado do trabalho sobre
“Enzimas de restrição”)
A escolha de um vector, molécula capaz de transportar um fragmento de DNA

para um hospedeiro, depende de vários factores, entre os quais o hospedeiro a que se
destinam, mas todos eles possuem uma série de características comuns:
a) Contêm uma origem de replicação, que lhes confere autonomia para se
replicarem no interior do hospedeiro.
b) Possuem MCS (multiple cloning site) ou polilynker, ou seja, vários locais
únicos de clivagem para enzimas de restrição, os quais constituem o sítio de inserção
no vector de clonagem;
c) Possuem marcas de selecção, como um gene que codifica resistência a um
antibiótico que permite seleccionar os hospedeiros que contêm o vector.
(adaptado de Videira, A., Engenharia Genética – Princípios e aplicações, 2001)

Helicobacter pylori
Existem vários tipos de vectores, no entanto, os plasmídeos são os mais

utilizados na tecnologia do rDNA. Os plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA
com forma circular que estão presentes nas bactérias, têm capacidade de se replicar
autonomamente e são fáceis de purificar. Têm geralmente poucos genes (< 30) e a
informação que contêm não é, normalmente, essencial à bactéria hospedeira.
Contudo, alguns dos genes que possuem são úteis sob determinadas condições,
conferindo resistência a antibióticos que existem no ambiente em que se encontram as
bactérias.
Para que seja possível a entrada do rDNA nas células bacterianas estas têm
que ser alteradas. Ao processo de entrada de rDNA em células bacterianas dá-se o
nome de transformação. A transformação é um processo natural em certas bactérias
mas, no laboratório, envolve normalmente um tratamento dos organismos de maneira
a torná-las competentes. (adaptado de Videira, A., Engenharia Genética – Princípios e
aplicações, 2001)
Uma bactéria competente é uma bactéria que está apta a receber DNA
exógeno. A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser induzida através de
diferentes técnicas, tais como, o método do cloreto de cálcio e a electroporação. O
método mais usado para tornar as bactérias competentes envolve o tratamento com
soluções com o cloreto de cálcio e mudanças bruscas de temperatura.
Neste método as células hospedeiras são colocadas numa solução de cloreto
de cálcio sob baixas temperaturas (próximas dos 0ºC), de seguida procede-se à
adição do rDNA e posterior aquecimento das células (cerca de 42ºC) para que ocorra
um choque térmico. Uma vez que os iões de cálcio apresentam carga positiva, estes
vão “mascarar” a carga negativa dos fosfatos da dupla camada fosfolipídica da
membrana, ou seja, ocorre uma diminuição de repulsões entre a membrana celular
das bactérias e as moléculas de DNA durante o processo de transformação. Assim,
este método altera a permeabilidade da membrana das bactérias permitindo a entrada
de rDNA nas células. (adaptado de www.morpheus.fmrp.usp.br/tb/apostila/apost2.htm)

Helicobacter pylori
Figura 8: Explicação do “método do cloreto de cálcio” (adaptado de

www.morpheus.fmrp.usp.br/tb/apostila/apost2.htm, Dezembro 2009)
A cultura bacteriana deve ser amplificada, para tal, é necessário colocá-la em

meio apropriado para que possa reproduzir-se exponencialmente.
Numa colónia de bactérias em crescimento, cada uma delas representa um
clone (geneticamente idêntico) pois são originárias de uma célula inicial que se dividiu
intensamente por mitose. Todas as células que fazem parte dessa colónia possuem o
mesmo plasmídeo, transportando consigo os fragmentos que foram clonados. No
entanto, apesar de as bactérias terem sido sujeitas ao processo descrito
anteriormente, nem todas recebem o rDNA.
É necessário seleccionar as bactérias que foram transformadas. Para esta
selecção é necessário ter em conta a expressão de dois genes característicos e
comuns dos plasmídeos: o gene que confere resistência ao antibiótico e o gene lacZ’.
As bactérias utilizadas, E. coli DH5α, não são resistentes ao antibiótico. No
entanto, o plasmídeo utilizado (pBs) possui o gene de resistência ao antibiótico
ampicilina. Deste modo, apenas as bactérias que possuem os plasmídeos no seu
interior serão resistentes à ampicilina enquanto as que não o têm morrerão na

Helicobacter pylori
presença deste antibiótico. Como tal, as bactérias têm de ser colocadas num meio
contendo ampicilina de modo a seleccionar colónias de bactérias transformantes.
O pBs contém também na sua sequência o gene lacZ’ que codifica a enzima β-
galactosidase. Quando o fragmento de DNA que se pretende clonar é inserido na zona
polylinker, o gene lacZ’ é alterado deixando de produzir a enzima β-galactosidase. Isto
pode ser detectado através das cores das colónias de bactérias. As que contêm o
plasmídeo sem o fragmento de interesse formam colónias azuis (presença do gene
LacZ’, gene não alterado) enquanto aquelas que contêm o pBs com o insert serão
brancas (gene LacZ’ alterado).
Este processo é o mais utilizado como forma de reconhecer as células que
transportam a sequência de nucleótidos que se pretende clonar. Assim, para fazer a
selecção de colónias, as bactérias têm de ser colocadas num meio contendo o
antibiótico e o composto X-Gal, de forma a distinguir as células que têm o rDNA.
(adaptado de um protocolo laboratorial http://w3.ualg.pt/~jbelo/documentos/Labprotocols-
LEG%202006.pdf)
De seguida, é necessário extrair o DNA plasmídico. Para tal, existem dois
métodos possíveis: o método da lise alcalina e o método da ebulição.
Neste procedimento experimental utilizou-se o método da ebulição para a
extracção e purificação do DNA plasmídico. Como a bactéria possui uma parede
celular, é essencial efectuar um tratamento por acção do calor e da enzima lisozima,
de modo a remover este invólucro externo. Neste método as células bacterianas são
tratadas com um detergente em conjunto com o calor, de modo a romper parcialmente
a membrana plasmática. No interior desta membrana fica retido o DNA genómico,
saindo pelas aberturas formadas pelo detergente os RNAs, as proteínas, o DNA
plasmídico e alguns restos celulares. Após o processo de centrifugação é possível
remover os detritos celulares, ficando na solução as moléculas do sobrenadante.
Quando se pretende extrair apenas o DNA plasmídico é possível tratar a amostra com
a enzima RNase, que permite eliminar os RNAs, e efectuar uma extracção fenólica de
modo a eliminar as proteínas. (adaptado de protocolo laboratorial nº3)

Helicobacter pylori
Figura 9: Esquema representativo do processo de clonagem (adaptado de Ribeiro,E., Silva,J.,

e Oliveira,O., Biodesafios, Edições ASA,1ªEdição, 2005)
Uma vez realizados estes passos, pode ser determinado o mapa de restrição
do plasmídeo recombinante em estudo. Para que isto seja possível é necessário
realizar uma electroforese, pois permite saber o tamanho das moléculas de DNA.
A electroforese é uma técnica de separação de partículas que, de acordo com
sua carga eléctrica e peso molecular, permite estimar o tamanho de fragmentos de
DNA, RNA e/ou proteínas. A electroforese de DNA é feita normalmente em gel de
agarose, que se prepara dissolvendo uma suspensão de agarose numa solução
tampão, deixando solidificar numa “forma” apropriada. Colocando previamente um
pente obtém-se um gel contendo uma fileira de poços numa das extremidades, onde
posteriormente serão colocadas as amostras a analisar. O gel é colocado num tanque
de electroforese, imerso em tampão (TBE), ficando entre dois eléctrodos posicionados
paralelamente à fileira dos poços do gel. As amostras de DNA são colocadas nos
poços do gel e, com a aplicação de um campo eléctrico, vão migrar para o pólo
positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm uma carga negativa.
A agarose actua como um filtro, deixando passar mais facilmente as moléculas
mais pequenas que, assim, vão migrar mais do que as moléculas maiores. As
moléculas do mesmo tamanho migram conjuntamente e formam bandas, que podem
ser visualizadas com auxílio de luz ultravioleta. Para isso, é necessário incluir no gel
brometo de etídio, uma substância mutagénica que se intercala nas cadeias de DNA, e
que, após exposição a raios UV, emite uma fluorescência alaranjada.
(adaptado de Videira, A., Engenharia Genética – Princípios e aplicações, 2001 e
http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf,
Dezembro 2009)

Helicobacter pylori
Figura 10: Aparelho para a electroforese do DNA em gel de agarose (adaptado de

http://www.enciclopedia.com.pt/images/469px-Gel_electrophoresis_apparatus.jpg, Dezembro
2009)
Para caracterizar um fragmento de DNA é geralmente efectuado um mapa de

restrição, pois este permite identificar os locais onde as enzimas hidrolisam o
fragmento. A preparação de um mapa de restrição envolve a digestão do DNA com as
enzimas seleccionadas, quer em reacções separadas quer usando duas (ou mais)
enzimas simultaneamente. Segue-se o cálculo do tamanho dos diferentes fragmentos
obtidos e o seu alinhamento, como na construção de um puzzle, obtendo-se deste
modo o mapa de restrição do plasmídeo em estudo. (adaptado de Videira, A., Engenharia
Genética – Princípios e aplicações, 2001)

Helicobacter pylori
OBJECTIVOS
A realização deste trabalho experimental tem como objectivo principal clonar

um fragmento de DNA, da bactéria da espécie H. pylori, usando a técnica do rDNA,
bem como a sua respectiva caracterização através do mapeamento do plasmídeo
recombinante. Foi utilizado um plasmídeo recombinado previamente fornecido, sendo
por isso, apenas necessário a sua amplificação para estudos posteriores.
Assim os objectivos experimentais pela ordem de trabalho deste protocolo são
os seguintes:
 Preparação de bactérias competentes da estirpe E. coli DH5α, para
transformação dos plasmídeos;
 Transformação de bactérias competentes (E. coli DH5α) com um plasmídeo
recombinado com um fragmento da H. pylori;
 Respectiva extracção e purificação do DNA plasmídico;
 Análise e determinação do mapa de restrição do plasmídeo recombinante;

Helicobacter pylori
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
O procedimento utilizado teve por base o protocolo apresentado na respectiva

aula. Contudo, devido a factores limitativos e às necessidades inerentes à prática
laboratorial, o mesmo sofreu algumas alterações no decorrer da experiência. Em
seguida, é apresentado o procedimento com as respectivas modificações,
possibilitando uma correcta interpretação dos resultados obtidos.
A experiência laboratorial foi efectuada em quatro aulas distintas. No primeiro
trabalho laboratorial teve-se como objectivo a preparação de células competentes.
Inicialmente, foi fornecida uma cultura de 10 ml de bactérias E. coli DH5α, previamente
preparada durante a noite, a 37ºC com agitação e crescida em meio LB (Luria-Bertani
broth). O meio LB é utilizado para crescimento e manutenção de bactérias. Este meio
contém os nutrientes necessários para o seu crescimento. (adaptado de
http://repositorium.sdum. uminho.pt/bitstream/1822/2241/1/U1.pdf, Dezembro 2009)
Começou-se por retirar 500µl da cultura e inoculou-se 27ml de uma nova
cultura em meio LB. Esta nova cultura foi incubada a 37ºC com agitação1 de 225 rpm2,
até atingir uma densidade óptica de 0,4 OD/ml e absorvância de 600 nm. Este valor foi
medido num espectofetómetro, utilizando como branco o meio líquido LB. Com uma
absorvância de 600nm obteve-se uma densidade de 0,36OD/ml. Esta densidade foi
atingida antes de a cultura entrar na fase exponencial de crescimento, pois só a partir
desta fase as bactérias se encontram na fase óptima de crescimento e como tal, ideais
para serem estudas.
Figura 11: Curva de crescimento exponencial da cultura bacteriana
1
Centrifugadora: Hettich Zentrifugen – Rotanta 460 R
2
Rotações por minuto

Helicobacter pylori
Após esta operação, transferiu-se 1 ml de cultura para um tubo de centrífuga e

incubou-se o tubo no gelo (0ºC) durante um período de 15 minutos. A partir deste
momento trabalhou-se sempre no gelo pois as células a 0ºC diminuem gradualmente o
seu metabolismo, até pararem a sua divisão celular. Centrifugou-se o tubo a 3000g,
durante 10 minutos a 4ºC, obtendo-se a separação entre as bactérias (depositadas no
fundo) e o sobrenadante (meio LB), sendo este último desprezado pois possuía
resíduos indesejados para os bons resultados da experiência.
Ressuspendeu-se o pellet de células com metade do volume inicial da cultura
de solução MgCl23. Esta solução serve como lavagem para eliminar os vestígios do
meio LB, removendo os produtos tóxicos resultantes do metabolismo celular. Uma vez
que a cultura cresceu em 27ml de LB, utilizou-se 13,5ml de solução MgCl2, sendo este
o passo mais importante neste procedimento experimental. Efectuou-se uma nova
centrifugação a 3000g, durante 10 minutos a 4ºC. Este baixo valor de velocidade é
usado de modo a não danificar as bactérias.
De seguida desprezou-se novamente o sobrenadante. Ressuspendeu-se de
novo o pellet, mas agora com uma solução de CaCl24, utilizando metade do volume
inicial (13,5ml). Esta solução é essencial para que a membrana das bactérias se torne
mais permeável à entrada da molécula de rDNA, facilitando assim o processo de
transformação. Esta cultura foi deixada em repouso no gelo durante 20 minutos, para
permitir que o CaCl2 aderisse à parede das células.
Efectuou-se a última centrifugação, a 3000g, durante 10 minutos a 4ºC. Após
esta operação ressuspendeu-se, pela última vez, o pellet de células com 1/15 do
volume inicial, isto é, 1,8 ml da cultura de CaCl2 a 0,1M + glicerol 15% (v/v).
Finalmente, efectuaram-se 4 fracções de 250μl da solução que foram
colocadas cada uma num tubo eppendorf e estes guardados imediatamente a -80ºC
para serem trabalhados na aula seguinte. O glicerol presente na última solução,
envolve as células evitando o seu congelamento a esta temperatura, permitindo assim
que as células permaneçam viáveis. Esta temperatura permite que as bactérias fiquem
congeladas e possam voltar a ser utilizadas. Todas estas soluções (CaCl2 e MgCl2)
utilizadas já se encontravam previamente preparadas.
No final deste procedimento, as bactérias encontravam-se aptas a receber o
rDNA, após terem sido sujeitas ao “método do cloreto de cálcio” descrito
anteriormente.
3 Solução de Cloreto de Magnésio a 0,1mol/dm3 (VWR Prolabo, França)

4 Solução de Cloreto de Cálcio a 0,1mol/dm3 (Sigma, Alemanha)

Helicobacter pylori
No segundo trabalho laboratorial teve-se como objectivo a transformação de

células competentes. Inicialmente, colocaram-se os 4 tubos de células competentes de
E. coli DH5α congeladas a -80ºC, preparadas na aula anterior, a descongelar no gelo,
para que seguidamente as céluas fossem colocadas em “contacto” com o DNA. Foram
identificados 3 tubos em que cada um continha o seguinte:
1. 250 µl bactérias (serviu somente para controlo negativo);
2. 250 µl bactérias + 1 µl pBr322 não recombinado;
3. 250 µl bactérias + 1 µl pBs recombinado com um fragmento de DNA genómico
de H. pylori.
Os tubos foram agitados e incubados no gelo durante 30 minutos, período

durante o qual se preparou o banho seco a 42ºC. Este passo foi essencial para reduzir
a fluidez da membrana plasmática e da parede celular.
Em condições naturais, a captação do DNA torna-se difícil, devido à repulsão
electrostática existente entre as cargas negativas da bicamada fosfolipídica da
membrana bacteriana, com a carga negativa do grupo fosfato da molécula do DNA.
O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0oC a fluidez da
membrana celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados.
Os iões de Ca2+ formam um complexo com este agrupamento, cobrindo as cargas
negativas, facilitando agora a atracção electrostática entre o plasmídeo recombinado e
a superfície das bactérias. O choque térmico complementa este processo, criando
uma destabilização térmica entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando
o bombeamento das moléculas de DNA para o interior das células bacterianas.
(adaptado de http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG, Dezembro 2009)
Cessado o tempo de incubação, procedeu-se ao choque térmico das células,
sujeitando-as, durante um período de 90 segundos a uma temperatura de 42ºC. Este
foi um dos pontos críticos do protocolo, pois caso o tempo de incubação se
prolongasse mais do que o período referido as colónias poderiam ficar destruidas.
Imediatamente a seguir foram colocadas durante 2 minutos no gelo. A partir
deste momento todas as etapas do restante protocolo foram realizadas à chama, para
evitar quaisquer riscos de contaminação.
Adicionou-se a cada um dos tubos 600μl de meio LB, incubando-se os mesmo
a 37ºC, durante 45 minutos, com agitação de 220 rpm.
Posteriormente, as placas de petri contendo ampicilina e meio LB, foram
colocadas à temperatura ambiente. Estas placas foram fornecidas pela professora e já

Helicobacter pylori
se encontravam previamente preparadas. Cada placa foi identificada com a

numeração igual ao eppendorf onde ocorreu a respectiva transformação.
Acrescentou-se a cada placa 40µl de IPTG a 20% (p/v) e a mesma quantidade
de X-Gal a 2% (p/v).
Figura 12: Estrutura molecular do IPTG (adaptado de http://www.molecula.com/IPTG.gif,

Dezembro 2009)
Figura 13: Estrutura molecular do X-gal (adaptado de http://www.molecula.com/images/xgal.gif,

Dezembro 2009)
A solução IPTG (isopropil- β-D-tiogalactósido) induz a expressão do gene da

enzima β-galactosidase e é um análogo da lactose, além disso por não ser
metabolizável mantém a sua concentração constante durante o crescimento celular. O
X-gal é o substracto da enzima β-galactosidase.
A adição destes dois substratos foi um passo importante na experiência
realizada pois permitiu-nos, através da cor das colónias, verificar se o insert
interrompeu ou não o gene lacZ’. O gene LacZ’ presente nos plasmídeos é uma das
caracteristicas que nos permite seleccionar as colónias de bactérias que contém o
rDNA (plasmídeo+insert). O gene lacZ’ codifica a subunidade α da enzima

Helicobacter pylori
β-galactosidase. Esta enzima é constituida por duas subunidades, α e ω e é

responsável pela degradação do substracto X-gal. A estirpe utilizada (E. coli DH5α)
codifica a subunidade ω da enzima. Desta forma, só quando os dois genes que
codificam as duas subunidades são expressos, é que se forma a enzima β-
galactosidase que degrada o substrato X-gal. Quando o fragmento de DNA que se
pretende clonar é inserido na zona do gene lacZ’, este é alterado, deixando de
codificar a subunidade α da enzima β-galactosidase. Como tal, a enzima não se forma
e não ocorre a degração do substrato X-gal. Nesta situação obtêm-se colónias
brancas e podemos concluir que estas colónias contêm o plasmídeo recombinante.
Por outro lado, quando o plasmídeo não contém o fragmento de interesse ou quando o
insert não interrompe o gene lacZ’ formam-se colónias azuis, uma vez que o substrato
foi degrado. (adaptado de protocolo nº 2, http://t15ccm.blogspot.com/2006/09/lab-biomol.html)
As soluções de X-gal e IPTG foram uniformente espalhadas na placa com o
auxílio de espalhadores. Enquanto as placas foram sujeitas a secagem junto da
chama e finalizado o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a 6000
rpm, durante 6 minutos à temperatura ambiente.
Seguidamente desprezou-se o sobrenadante. Com a gota de meio que
permaneceu no tubo, ressuspendeu-se o pellet de células com o auxílio de uma
micropipeta P200, juntando esta suspensão de células à respectiva placa, espalhando-
as de seguida e uniformemente com o espalhador.
As placas foram então incubadas durante 16 a 18 horas (overnight) na estufa a
37ºC, mantidas invertidas para que as gotas de água, resultantes do processo de
condensação, não caíssem sobre as colónias e provocasse a sua dispersão. Ao nono
dia (após este período de incubação) as colónias foram retiradas da estufa, vedadas
com parafilm e guardadas no frigorífico a 4ºC (onde permaneceram por mais 6 dias).
Ao décimo quarto dia, as colónias foram inoculadas em 3ml de meio LB
suplementado com 100µl/mg de ampicilina utilizando pontas de micropipeta. As
colónias isoladas foram picadas e colocou-se somente uma colónia em cada tubo.
Picou-se apenas uma colónia azul, uma vez que não se obteve colónias brancas na
placa. Para picar a colónia foi usada uma ponta de micropipeta P200. Esta ponta foi
colocada no eppendorf, o qual já continha as soluções de meio LB e ampicilina, sendo
de seguida recolocado no frigorífico a 4ºC.
A terceira sessão laboratorial ocorreu ao décimo quinto dia e começou com a
contagem das 427 colónias obtidas na placa onde foram semeadas as bactérias
transformadas com o plasmídeo nativo pBs322.

Helicobacter pylori
Figura 14: Colónia com plasmídeos não recombinados
Os procedimentos seguintes tiveram como objectivo a extracção e a purificação

do DNA plasmídico. Inicialmente foram transferidos 2ml de cada uma das respectivas
culturas provenientes das colónias inoculadas no dia anterior para um eppendorf de
2ml devidamente identificado.
Verificou-se que a amostra ficou turva devido à amplificação das bactérias.
Estas bactérias resistiram à ampicilina presente no meio e por isso concluiu-se que
estas continham o plasmídeo, pois este contém o gene que confere resistência a este
antibiótico. A E. coli DH5α têm um ciclo celular muito curto, replicando-se por isso a
cada 20 minutos, logo em 24 horas multiplicaram-se 72 vezes. Todas as bactérias
obtidas foram cópias das primeiras.
Efectuou-se a recolha das células bacterianas por centrifugação à temperatura
ambiente, durante 1 minuto à velocidade máxima (10.000g). Adicionou-se ao
eppendorf 750µl de tampão STET. Seguidamente agitou-se no vortéx para que a
ressuspensão fosse eficiente e deste modo maximizar a lise das bactérias. O tampão
STET apresenta na sua constituição sacarose, Triton X-100, Na2EDTA e Tris-HCl.
A sacarose impede a disrupção descontrolada das bactérias, o Triton X-100
provoca a lise da membrana plasmática e o Tris-HCl é o responsável por manter o pH
da solução. (adaptado de http://www.revista-api.com/paginas/art%20orig%206.html,
Dezembro 2009)
Após esta operação adicionou-se 37,5µl de uma solução de lisozima 10mg/ml
para que a concentração final fosse de 0,5mg/ml. A lisozima é a enzima responsável

Helicobacter pylori
pelo rompimento da parede celular. De seguida, agitou-se manualmente o eppendorf.

Incubou-se durante 2 minutos à temperatura ambiente e colocou-se o tubo em água a
ferver por um período de 4 minutos. Este calor juntamente com a acção da lisozima é
que provocou a destruição da parede celular bacteriana.
O passo seguinte consistiu na centrifugação à velocidade máxima de 10.000g,
durante 10 minutos à temperatura ambiente. Removeram-se cuidadosamente os
restos celulares (membrana+DNA genómico+alguns detritos) de aspecto “gelatinoso”,
com uma ponta de pipeta. Contudo, como a operação não foi muito eficiente repetiu-se
a centrifugação durante mais 2 minutos e efectuou-se novamente a remoção dos
restos celulares. Este último passo foi repetido mais uma vez porque a membrana se
encontrava muito fragmentada. O interesse em não desfazer o sedimento de detritos
deve-se ao facto de que este contém o DNA genómico das bactérias, o qual tem de
ser integralmente removido para assim evitar contaminações da amostra final. Após a
remoção da membrana, ficou-se apenas com o DNA plasmídico, RNAs e proteínas.
Os passos referentes à eliminação dos RNAs e das proteínas não foram
realizados. A adição de RNase teria como objectivo a eliminação dos RNAs presentes
na amostra e a adição de uma solução fenólica resultaria na destruição das proteínas.
Contudo estes passos não foram realizados.
Com o objectivo de precipitar o DNA plasmídico, juntamente com as proteínas
e RNAs, adicionou-se à amostra etanol 96% (v/v) até encher o tubo, incubou-se a -
20ºC durante 30minutos. Seguiu-se a centrifugação da amostra por um período de 15
minutos à temperatura ambiente e na velocidade máxima. A adição do etanol permite
observar o DNA precipitado pois como o DNA é polar e o etanol apolar, este último
não tem a capacidade de dissolver o DNA provocando assim a sua precipitação
(adaptado do relatório da aluna Vânia Marques Paula).
Desprezou-se o sobrenadante e deixou-se o pellet a secar ao ar. Para finalizar,
adicionou-se 50µl de dH2O5 de modo a lavar a amostra ficando assim pronta para ser
caracterizada. A quantificação do DNA plasmídico não foi efectuada uma vez que o
aparelho para medir a absorvância na região UV se encontrava avariado.
A última aula laboratorial teve como finalidade a determinação do mapa de
restrição do plasmídeo recombinante em análise.
A primeira parte do protocolo consistiu na hidrólise do DNA plasmídico com as
enzimas de restrição HindIII (enzima 1) e XhoI (enzima 2), com as quais se efectuaram
duas hidrólises simples e uma dupla.
5 Água destilada
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Figura 15: Enzima de restrição HindIII (adaptado de http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG,

Dezembro 2009)
Figura 16: Enzima de restrição XhoI (adaptado de http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG,

Dezembro 2009)
Para tal, preparou-se e identificou-se 3 tubos, conforme a tabela seguinte:
TUBO 1 - HindIII TUBO 2 – XhoI TUBO 3 – HindIII+XhoI

DNA (μl) 2 2 2
TAMPÃO 10x (μl) 1 1 1
ENZIMA (μl) 1 1 1+1
ÁGUA (H2O) (μl) 6 6 5
VOLUME TOTAL (μl) 10 10 10
Tabela 1: Concentração das soluções utilizadas na hidrólise do DNA plasmídico
NOTA: Uma vez que as enzimas de restrição perdem a sua actividade facilmente se não se
encontrarem a baixas temperaturas, estas devem ser retiradas do gelo apenas no momento
anterior à sua utilização e guardadas novamente a -20ºC após as pipetagens. Como tal, este
procedimento teve de ser efectuado o mais rápido possível.

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Havia ainda um quarto tubo com o plasmídeo não hidrolisado no qual foram
adicionadas as seguintes concentrações:
TUBO 4 – plasmídeo não hidrolisado

DNA (μl) 2
ÁGUA (H2O) (μl) 8
VOLUME TOTAL (μl) 10
Tabela 2 – Concentração das soluções utilizadas no plasmídeo não hidrolisado
Após a preparação dos tubos, estes foram sujeitos a um spin-down e,

posteriormente incubados durante uma hora num banho seco a 37ºC, para que as
enzimas de restrição tivessem tempo de actuar.
De modo a apurar os resultados das reacções de hidrólise foi necessário
construir um mapa de restrição. Para que tal seja possível é necessário recorrer à
técnica da electroforese em gel de agarose6. Os passos seguintes consistiram na
preparação deste gel.
Montou-se o tabuleiro de electroforese7 na hotte (para evitar a inalação dos
gases que se formam durante este processo) e colocou-se o pente na posição
adequada. Preparou-se o gel de agarose, dissolvendo-se 148,8 ml de tampão de
electroforese, TBE 1×8, em 1,2g de agarose em pó, de modo a obter-se 150 ml de
uma solução de agarose a 0,8% (p/v). Quanto maior for a concentração de agarose
maior a capacidade de distinguir os fragmentos de DNA, pois permite aumentar a
solidificação do gel.
Tapou-se esta solução com parafilm, furando-o e colocou-se no micro-ondas
para derreter, com cuidado para não “caramelizar”. Adicionou-se brometo de etídio9,
que devido ao facto de se intercalar com o DNA, permite visualizar as bandas quando
o gel é submetido à luz UV.
(adaptado de http://www.qca.ibilce.unesp.br/prevencao/produtos/brometo_.html, Dezembro
2009)
6
Agarose: SIGMA, A 5093 – 500G
7 Tanque de electroforese: BIO – RAD SUB-CELL® GT
8
TBE 1× geral: Tris – Borate, EDTA buffer, 10× (SIGMA, Alemanha)
9
Brometo de etídio: Etidium Bromide, MERCK, Alemanha. O brometo de etídio é uma substância
mutagénica. Como tal é necessário ter muita precaução no seu manuseamento.

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Figura 17: Visualização dos fragmentos de DNA quando expostos à luz UV na presença do
brometo de etídio (adaptado de trabalho sobre”Enzimas de restrição”)
Deitou-se a solução no tabuleiro e deixou-se em repouso até solidificar

completamente. Terminado o tempo de incubação (1hora em banho seco) foi feito um
spin-down seguido da adição de 2μl do loading buffer (LB) a cada tubo, deixando a
ponta da micropipeta usada dentro do eppendorf. Este corante é uma solução
composta de azul de bromofenol e glicerol e, é utilizado para aumentar a densidade
das amostras, impedindo que estas saiam dos poços, além de dar a coloração que
serve como indicador da migração electroforética. (adaptado de
www.ufpel.edu.br/biotecnologia/Manual%20Aula%20Pratica_2009_2.doc, Dezembro 2009)
Após a preparação das amostras, colocou-se o tabuleiro na tina de
electroforese mergulhando-o em tampão TBE 1× de modo a que o gel ficasse
completamente submerso. O TBE tem um pH de 8 o que garante a ionização dos
grupos fosfatos e consequentemente a conservação da carga negativa das moléculas
de DNA. (adaptado do protocolo nº4)
Aplicou-se o conteúdo de cada uma das amostras em poços distintos do gel de
agarose. Num dos poços foi também colocado um marcador de pesos moleculares, o
qual permite determinar o tamanho dos fragmentos obtidos, bem como permite
determinar a relação entre o peso molecular e a distância de migração dos fragmentos
de DNA.

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Figura 18: Marcador de pesos moleculares (adaptado de Fermentas – Life Sciences:

http://fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis/generuler-dna-ladders/sm0333,
Dezembro 2009)
Teve-se o cuidado de registar a ordem pela qual o conteúdo dos tubos foi
aplicado, como mostra o esquema abaixo:
1ª LINHA DE POÇOS:
HindIII+ HindIII
X X X PNH HindIII XhoI M X PNH HindIII EcoRI X X
XhoI +EcoRI
2ª LINHA DE POÇOS:
X X X PNH HindIII DraI HindIII+DraI X M X X X
Legenda:
M- marcador de pesos moleculares
PNH- plasmídeo não hidrolisado
X- poço vazio

Helicobacter pylori
Figura 19: Aplicação das amostras no gel de agarose. (adaptado de

http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf,
Dezembro 2009)
De seguida colocou-se a tampa da tina e ligaram-se os eléctrodos, de modo a

que os poços de gel ficassem ligados ao pólo negativo, possibilitando a migração das
amostras para o pólo positivo. Regulou-se a diferença de potencial para 100V e o gel
correu durante cerca de 40 minutos. Teve-se finalmente a oportunidade de observar o
gel no transiluminador10 e fotografá-lo.
Desta maneira foi possível determinar o mapa de restrição do plasmídeo e
concluir o seu estudo.
Figura 20: Resultados da electroforese em gel de agarose
10
Transiluminador+Máquina fotográfica: Gel Logic 100 – Imaging System, Kodak
Helicobacter pylori
CÁLCULOS AUXILIARES:
CiVi = CfVf 10×Vi = 0,5×750 Vi = 37,5µl

1.
 Adicionou-se 37,5µl de uma solução de lisozima 10mg/ml para que a
concentração final fosse de 0,5mg/ml.
Volume inicial (Vi) = 27ml 1/2 de Vi = 27/2 = 13,5ml

2.
 Usou-se 13,5ml de MgCl2;
Volume inicial (Vi) = 27ml 1/15 de Vi = 27/15 = 1,8ml

3.
 Usou-se 1,8ml de CaCl2;
150ml de uma solução de agarose a 0,8% (p/v)
1,2ml agarose + 148,8ml TBE

4.
 Usou-se 1,2ml de agarose em pó juntamente com 148,8ml de TBE para
preparar uma solução de agarose a 0,8% (p/v);

Helicobacter pylori
ANÁLISE E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS
Ao longo do trabalho experimental foram realizadas várias etapas

determinantes para a obtenção dos resultados finais. Um dos pontos mais relevantes
foi a transformação das bactérias, isto é, a entrada do rDNA na célula hospedeira.
A eficiência desta transformação pode ser obtida contabilizando o número de
colónias de bactérias obtidas numa transformação com 1ng de vector não
recombinante, sendo expressa em número de transformantes/μg de DNA plasmídico.
O método do cloreto de cálcio utilizado neste trabalho experimental, para tornar as
células competentes, confere uma eficiência de transformação na ordem de 10 5 – 107
transformantes por μg de DNA plasmídico. (adaptado do protocolo laboratorial nº1)
Uma vez que foram contabilizadas 427 colónias é possível calcular a eficiência
da transformação:
Equação 1:
Assim, a quantidade obtida de células transformadas por 1 micrograma de DNA

foi de 4,27x105. A eficiência da transformação também depende do tamanho e da
forma da molécula de DNA.
Após finalizado o processo de transformação, as bactérias foram amplificadas
numa placa contendo ampicilina. Seria de esperar que as colónias obtidas fossem de
cor branca, uma vez que o plasmídeo já se encontrava recombinado. No entanto,
fomos surpreendidas com o resultado obtido, pois as colónias presentes na placa
eram todas azuis. Tal facto ocorreu devido ao fragmento que se pretendia clonar estar
inserido no polylinker, que nesta situação pontual, não interrompe o gene lacZ’ do
plasmídeo. Desta forma, é sintetizada a subunidade α da enzima β-galactosidase e
por isso o substrato X-gal é degradado formando assim colónias azuis.
Após a observação da cor das colónias, concluímos que o plasmídeo se
encontrava alterado, pois numa situação regular o polylinker interrompe o gene lacZ’
dando origem a colónias brancas.

Helicobacter pylori
Figura 21: Cultura de bactérias do grupo
De modo a determinar os tamanhos dos fragmentos obtidos pelas hidrólises

das enzimas de restrição (HindIII e XhoI) e, consequentemente o tamanho do
plasmídeo, foi necessário comparar o local das bandas obtidas com o respectivo
marcador de pesos moleculares, o qual nos fornece o tamanho do fragmento.
É também possível determinar a massa molecular de qualquer fragmento de
DNA que tenha migrado no respectivo gel, a partir da distância percorrida pelo mesmo.
A equação 2, que corresponde a uma recta, relaciona precisamente a distância
percorrida pelos diferentes fragmentos de DNA e a sua respectiva massa molecular.
Equação 2:
D = a – b ( log M )
Onde:
D - distância percorrida (cm);
M - massa molecular (pb);
a – ordenada na origem;
b – declive da recta;
Para determinar os valores da equação anterior (a e b) e assim saber os

tamanhos dos fragmentos obtidos, realizaram-se medições desde o poço do marcador
até cada um dos diferentes pesos moleculares do marcador utilizado.

Helicobacter pylori
Figura 22: Marcador de pesos moleculares utilizado, correspondente à figura 18
Para que seja possível determinar o mapa de restrição do plasmídeo foi

necessário a realização de uma electroforese em gel de agarose.
Local onde se iniciou a medição da

distância percorrida (cm)
POÇO1 POÇO2 POÇO3 POÇO4 MARCADOR
Figura 23: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose

Helicobacter pylori
Legenda da Fotografia do gel:
Poço 1 – plasmídeo recombinante não hidrolisado;

Poço 2 - plasmídeo recombinante + enzima HindIII;
Poço 3 - plasmídeo recombinante + enzima XhoI;
Poço 4 - plasmídeo recombinante + enzima HindIII + enzima XhoI;
Massa molecular (pb) Distância percorrida (cm) Log M

10000 1,9 4
8000 2,1 3,903
6000 2,3 3,778
5000 2,4 3,699
4000 2,7 3,602
3500 2,9 3,544
3000 3 3,477
2500 3,3 3,398
2000 3,7 3,301
1500 4,2 3,176
1200 4,6 3,079
1031 5 3,013
900 5,3 2,954
Tabela 3: Valores dos pesos moleculares e das distâncias percorridas por cada banda do
marcador
A regressão linear obtida a partir dos valores da tabela é a seguinte:
Gráfico 1: Regressão linear obtida entre o logaritmo dos pesos moleculares e a respectiva
distância de cada um desses pesos

Helicobacter pylori
A recta que descreve a progressão linear, representada no gráfico anterior é:
Equação 3:
y = -3,2719x + 14,645
onde y corresponde à distância percorrida pelo fragmento de DNA, x corresponde ao

logM, o declive da recta apresenta um valor de -3,2719 e a ordenada na origem
corresponde a 14,645. Assim podemos encontrar uma equação que forneça a massa
molecular de qualquer fragmento de DNA a partir da respectiva distância percorrida.
Equação 4:
D = 14,645 - 3,2719 (log M)
Uma vez determinada esta equação (equação 4) já é possível averiguar o

tamanho das amostras hidrolisadas pelas enzimas HindIII e XhoI.
No primeiro poço do gel não é possível determinar o tamanho do plasmídeo,
pois este não se encontra hidrolisado mas sim numa forma super enrolada. Esta
conformação permite-lhe atravessar mais facilmente os poros do gel de agarose,
migrando por isso com uma velocidade superior relativamente aos plasmídeos
hidrolisados.
No segundo poço o plasmídeo recombinante foi hidrolisado com a enzima
HindIII. Uma vez que se podem observar duas bandas na figura 23, conclui-se que
este foi hidrolisado duas vezes pela respectiva enzima. Pela equação 4 podemos
determinar o tamanho dos dois fragmentos. O fragmento mais próximo do poço
encontra-se a uma distância de 2,2cm, o que corresponde a um peso molecular de
4,187kb e a banda mais afastada do poço está a uma distância de 4,8cm
apresentando, por isso, um tamanho de 1,025kb.
No terceiro poço o plasmídeo recombinante foi hidrolisado com a enzima de
restrição XhoI. Pela observação da fotografia conclui-se que este apenas apresenta
um local de hidrólise para esta enzima. O plasmídeo fica assim linearizado e por isso é
possível determinar o seu tamanho. A banda correspondente ao plasmídeo hidrolisado
encontra-se a 2,5cm de distância, como tal, apresenta um tamanho de 5,188kb.
No quarto e último poço, o plasmídeo foi hidrolisado três vezes, pelas duas
enzimas HindIII e XhoI.

Helicobacter pylori
Seria de esperar a visualização 3 bandas, contudo apenas conseguimos

observa duas delas. Este fenómeno deve-se ao facto do gel de agarose não permitir
diferenciar bandas cujo tamanho do fragmento seja muito próximo.
Por comparação com os poços dois e três é possível concluir que a enzima
HindIII é a responsável pela hidrólise corresponde à banda que se encontra mais
distante do poço. Relativamente à outra banda, não é possível distinguir os dois
fragmentos hidrolisados pelas enzimas, uma vez que o local único de restrição
correspondente a cada uma delas se encontra muito próximo.
É possível visualizar que os locais

de restrição de ambas as enzimas
se encontram muito próximos
Figura 24: Polylinker do pBs (adaptado de http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG, Dezembro

2009)
Caso esta electroforese tivesse sido realizada em gel de poliacrilamida já seria

possível visualizar as três bandas, isto porque a resolução dos géis de acrilamida é
muito grande, podendo facilmente separar fragmentos de DNA com apenas um
nucleótido de diferença (rede de poros muito pequena).
CÁLCULOS AUXILIARES
POÇO 2:
1º Fragmento:
2º Fragmento:

Helicobacter pylori
POÇO 3:
Fragmento de DNA:
POÇO 4:
2º Fragmento:
No que se refere à hidrólise, pode-se concluir através da visualização da figura

23, que esta não foi completa, visto que ainda se encontra muito DNA plasmídico no
interior dos poços.
Na figura 3, podemos verificar que o plasmídeo pBs nativo tem um tamanho de
2,961kb. Através dos cálculos realizados podemos averiguar que o plasmídeo
recombinado apresenta uma dimensão de 5,188kb. Como tal, da subtracção destes
dois valores obtém-se o tamanho do insert, que corresponde a 2,227Kb.
Por comparação entre as figuras 25 (que representa o polylinker) e 23,
verificámos que a enzima HindIII hidrolisa o plasmídeo recombinado duas vezes.
Como existe um local de restrição na região do polylinker conclui-se que o outro local
se encontra no fragmento clonado. Como não sabemos qual é o local específico do
insert no polylinker (uma vez que este já vinha previamente recombinado) apresenta-
se de seguida uma possibilidade do mapa de restrição para o plasmídeo recombinado:
Insert (2,2kb)
1kb
5,2kb
Polylinker
Figura 25: Possível mapa de restrição do plasmídeo recombinante. Os valores do tamanho

dos fragmentos encontram-se arredondados

Helicobacter pylori
Devido ao facto de não se terem removido os RNAs e as proteínas, durante o

procedimento experimental, obtivemos no resultado da electroforese, umas bandas
pouco nítidas no final da migração do plasmídeo recombinante, hidrolisado ou não.
Estas bandas representam os RNAs que se encontravam presentes no hospedeiro.
Além disso, também é possível visualizar um “arrastamento” do rDNA devido à
presença das proteínas.
Deslizamento das
bandas devido à
presença de proteínas
na solução
Bandas pouco nítidas

que correspondem à
presença de RNAs na
solução
Figura 26: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose

Helicobacter pylori
CONCLUSÃO
Com o avanço tecnológico e o domínio das técnicas, emergiu um novo campo

de estudo na biologia, a Engenharia Genética, que permite a modificação do DNA de
um organismo para produzir novos genes com novas características.
Uma das técnicas utilizadas em Engenharia Genética e de extrema importância
para a biologia molecular, é a tecnologia do DNA recombinante.
No entanto, este processo nem sempre conduz aos resultados pretendidos,
devido a determinados factores que podem ocorrer ao longo de todo o procedimento,
tais como os que registamos:
 Erros nas medições;
 O valor ideal, de 0,4 OD/ml, da densidade óptica não ser atingido;
 Não colocar as amostras no gelo após a sua utilização, quando
necessário;
 A prolongação do tempo do choque térmico (90 segundos). Caso este
tempo seja superior danifica as colónias;
 Contaminações, devido ao facto de não trabalhar próximo da chama em
algumas situações que o exigiam;
 A proximidade da placa de petri da chama, poderá provocar a destruição
da ampicilina do meio;
 Remoção não eficiente dos restos celulares (membrana+DNA
genómico+alguns detritos); estes têm de ser integralmente removidos para
evitar contaminações da amostra final.
Assim, todos estes factores devem ser tidos em conta para que em futuros
procedimentos o resultado final seja mais viável.
Apesar de alguns erros cometidos, como os referidos anteriormente, o
resultado final foi ao encontro do esperado, pois foi possível a visualização das bandas
na fotografia obtida do resultado da electroforese, o que permitiu construir o mapa de
restrição do plasmídeo recombinado.

Helicobacter pylori
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Analógicas
 Matias,O.e E Martins,P., Biologia, Arial Editores, 2005;
 Ribeiro,E., Silva,J., e Oliveira,O., Biodesafios, Edições ASA,1ªEdição, 2005;
Digitais
 http://www.molecula.com/IPTG.gif,
 http://www.molecula.com/images/xgal.gif, Dezembro 2009)
 http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG;
 http://www.enciclopedia.com.pt/images/469px-
Gel_electrophoresis_apparatus.jpg;
 http://www.ufpe.br/biolmol/pBR322.JPG
 http://www.tinycottager.net/articles/2007Fall/images/e_coli.jpg,
 http://www.expasy.org/spotlight/images/sptlt095_1.jpg
 www.morpheus.fmrp.usp.br/tb/apostila/apost2.htm,
 http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletrofores
e.pdf;
 Fermentas – Life Sciences: http://fermentas.com/en/products/all/dna-

electrophoresis/generuler-dna-ladders/sm0333,

Helicobacter pylori

Recombinant DNA Technology BCM 2009

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UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA

Licenciatura Em Engenharia Biomédica

CLONAGEM DE UM FRAGMENTO DE DNA GENÓMICO DA

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Disciplina: Biologia Celular e Molecular

RELATÓRIO REALIZADO POR:

 Catarina Mendonça, Nº181907024

 Análise e discussão dos resultados……………………………………………..…32

Biologia Celular e Molecular – Clonagem de um fragmento de DNA da bactéria 2

Figura 1: Produção de DNA recombinante…………………………………………………7

Figura 2: Mapa do plasmídeo pBR322…………………………………………………...…8

Figura 3: Mapa do plasmídeo pBluescript……………..……………………………………9

Figura 4: Bactéria Echerichia coli……………………………………………………………9

Figura 5: Bactéria Helicobacter pylori……………………………………………………...10

Figura 6: Enzima de restrição a hidrolisar um fragmento de DNA……………………...11

Figura 7: Actuação da enzima de restrição originando extremidades coesivas,

Figura 8: Explicação do “método do cloreto de cálcio” ………………………………….14

Figura 9: Esquema representativo do processo de clonagem …………………………16

Figura 10: Aparelho para a electroforese do DNA em gel de agarose ………………..17

Figura 11: Curva de crescimento exponencial da cultura bacteriana…………………..19

Figura 12: Estrutura molecular do IPTG …………………………………………………..22

Figura 13: Estrutura molecular do X-gal …………………………………………………..22

Figura 14: Colónia com plasmídeos não recombinados ………………………………..24

Figura 15: Enzima de restrição HindIII ……………………………………………………25

Figura 16: Enzima de restrição XhoI ………………………………………………………27

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Figura 17: Visualização dos fragmentos de DNA quando expostos à luz UV na

Figura 18: Marcador de pesos moleculares ……………………………………………...29

Figura 19: Aplicação das amostras no gel de agarose…………………………………..30

Figura 20: Resultados da electroforese em gel de agarose…………………………….30

Figura 21: Cultura de bactérias do grupo………………………………………………....33

Figura 22: Marcador de pesos moleculares utilizado, correspondente à figura 18…..34

Figura 23: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose ……………...34

Figura 24: Polylinker do pBs ……………………………………………………………….37

Figura 25: Possível mapa de restrição do plasmídeo recombinante….……………….38

Figura 26: Fotografia do resultado da electroforese em gel de agarose ……………...39

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Tabela 1: Concentração das soluções utilizadas na hidrólise do DNA plasmídico…...26

Tabela 2 – Concentração das soluções utilizadas no plasmídeo não hidrolisado…….27

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O presente relatório tem como objectivo principal clonar um fragmento de DNA

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A clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de DNA, pode ser descrita

Figura 1: Produção de DNA recombinante (Matias,O.e E Martins,P., Biologia, Arial Editores,

Neste trabalho laboratorial foram utilizados como vectores dois plasmídeos

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O pBs (pBlueScript KS) apresenta características importantes, típicas dos

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Utilizou-se como hospedeiro bactérias da espécie E. coli DH5α. A bactéria

Figura 4: Bactéria Echerichia coli (adaptado de

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No final do trabalho laboratorial procedeu-se ao mapeamento do plasmídeo

Figura 5: Bactéria Helicobacter pylori (adaptado de

Seguidamente apresentar-se-á todos os fundamentos que tiveram por base a

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Figura 6: Enzima de restrição a hidrolisar um fragmento de DNA (Matias,O.e E Martins,P.,

As enzimas de restrição permitiram desenvolver uma das metodologias mais

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participação da DNA ligase. Esta reacção de ligação é eficiente em extremidades

Figura 7: Actuação da enzima de restrição originando extremidades coesivas, permitindo que

A escolha de um vector, molécula capaz de transportar um fragmento de DNA

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Existem vários tipos de vectores, no entanto, os plasmídeos são os mais

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