A ESPECTROMETRIA DE MASSAS

COMO FERRAMENTA PARA ANÁLISE

DE PRODUTOS NATURAIS ORIUNDOS
DE PLANTAS USADAS NA MEDICINA
TRADICIONAL
Dra. Simony Mendonça
Bela. Thamirys Fonseca
Me. Brendo Araujo
Me. Marcos Toledo
NOSSO MINICURSO
TÓPICOS
Produtos naturais - breve histórico
Técnicas analíticas utilizadas para análise de PN
Aplicações gerais da Espectrometria de massas
O que é esta técnica?
Estrutura de um espectrômetro de massas
Como é o espectro?
Aplicações da técnica em produtos naturais: nossas pesquisas
Uso das plantas pela
humanidade
Samambaia
(Pteridium aquilinum)
Tratamento parasitas intestinais

PALEOMEDICINA
Múmia Ötz - 4.500 anos encontrado em 1991
nos Alpes italianos.
Musgos
Análises de DNA de cálculo dentário permite
(Sphagnum imbricatum)
identificar microrganismos patogênicos e
Usado como curativo
plantas.
Hardy, K. Paleomedicine and the Evolutionary Context of Medicinal Plant Use. Rev. Bras. Farmacogn. 31, 1–15 (2021).
Uso das plantas pela
humanidade

Matéria Médica
Papiro de Ebers
Medicina greco-romana
Papiro egípcio
50 e 70 d.C.
1536 a.C.

Huangdi Neijing
Medicina Chinesa
século III a.C.
Hardy, K. Paleomedicine and the Evolutionary Context of Medicinal Plant Use. Rev. Bras. Farmacogn. 31, 1–15 (2021).
PRODUTOS NATURAIS NA MEDICINA HUMANA

VALLI, MARILIA and BOLZANI, VANDERLAN S.Natural Products: Perspectives and Challenges for use of Brazilian Plant
Species in the Bioeconomy. Anais da Academia Brasileira de Ciências [online]. 2019, v. 91, suppl 3, e20190208. Disponível
em: <https://doi.org/10.1590/0001-3765201920190208>.
Técnicas utilizadas no estudo de PN

Cromatografia Ressonância
Espectrômetro de Espectrômetro de
(técnica de Magnética
Infravermelho Ultravioleta (UV)
separação) Nuclear
 Controle de qualidade
de produtos
alimentícios e
Exploração espacial industriais

P&D em diferentes áreas

Exames clínicos e
toxicológicos

ESPECTROMETRIA DE MASSAS Análises forenses

A TÉCNICA PRESENTE EM TUDO

 Mas afinal
o que é a Espectrometria de Massas?
Espectrometria de
Massas - MS pentano

Uma técnica altamente versátil

Detectar e identificar substâncias de interesse

de acordo com sua razão massa/carga (m/z).

Gera íons da amostra em análise, separa de acordo com

sua m/z e registra a abundância relativa de cada íon.
 História da Espectrometria de massas
Como tudo começou…
A importância do desenvolvimento desta técnica analítca pode ser notada
pelo grande número de Prêmios Nobel que foram dados aos seus criadores.

1918/1919 1950 1980

1897
John Bennet Fenn
Joseph J. Thomson Arthur J. Dempster Hans G. Dehmelt e
• Desenvolvimento do método
- Descobriu os elétrons → • Construiu o 1º MS e Wolfgang Paul
de ionização por eletrospray
prêmio Nobel de Física em descobriu o isótopo ²³⁵U. • Desenvolvimento do Ion
(ESI - electrospray ionization).
1906 → considerado pai da Francis W. Aston trap (armadilha de íons)
Koichi Tanaka
MS. • Desenvolveu e melhorou o → prêmio Nobel de Física
• Desenvolvimento do método
• Descobriu a existência de MS → 212 isótopos → em 1989.
de ionização soft laser
isótopos do neônio Prêmio Nobel de Química desorption (1987).
(²⁰Ne, ²¹Ne e ²²Ne). em 1922. Ambos ganhadores do prêmio
Nobel de Química em 2002.
Estrutura de um espectrômetro
de massas produção dos íons em fase gasosa

separação dos íons em função de sua razão m/z

Quais as partes
conversão da corrente iônica em elétrica
que o compõe?

Fonte de
Amostra Analisador Detector
ionização

vácuo

Espectro de
Massas

Sistema de
dados
Inserção da amostra
Fonte de
Amostra Analisador Detector
ionização

vácuo

Cromatografia gasosa

Injeção Direta
Cromatografia líquida
 As mais utilizadas:

Fontes de
• Ionização por elétron (Electron Impact - EI)
• Ionização química (Chemical Ionization - CI)

ionização • Ionização por electrospray (Electrospray ionization - ESI)

• Ionização química por pressão atmosférica (Atmospheric
pressure chemical ionization - APCI)
O ponto de partida
• Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz (Matrix-
assisted laser desorption/ionization- MALDI)
Outras também disponíveis:
• Fotoionização à pressão atmosférica (Atmospheric
Pressure Photon Ionization - APPI)
• Plasma Acoplado Indutivamente (Inductively coupled
plasma - ICP)
• Easy Ambient Sonic-Spray Ionization – EASI
• Desorption Electrospray Ionization – DESI
• Ionização térmica (Thermal ionization - TI)
EI (Cromatografia com fase gasosa)
Ionização por elétron

• Necessário vácuo • 70 eV - energia suficiente para ter boa

• Amostras voláteis eficiência de ionização
• Bibliotecas padronizadas (ex.: NIST)
https://www.youtube.com/watch?v=22dr-3XDNmQ
CI (Cromatografia com fase gasosa)
Ionização química

Gases reagentes:
metano, amônia,
isobutano dentre
outros.

• Necessário vácuo
• Ionização mais branda
• Amostras voláteis
 MALDI (Cromatografia com fase sólida)
Ionização por dessorção a laser assistida por matriz

• Pode ser em vácuo ou pressão atmosférica • Usada para imageamento de diferentes

• Amostras não precisam ser voláteis amostras
ESI (Cromatografia com fase líquida)
Ionização por electrospray

• Pressão atmosférica
Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
 APCI (Cromatografia com fase líquida)
Ionização química por pressão atmosférica

• Pressão atmosférica
• Complementar a ESI
 Alguns exemplos:

Analisador de • Quadrupolo
• Ion trap

massas • Tempo de voo (Time-of-flight - TOF)

• Orbitrap
Resolução unitária e os de • Ressonância ciclotrônica de íons com transformada de
alta resolução Fourier (Fourier-transform ion cyclotron resonance - FT-ICR)

E os híbridos:
• Triplo-quadrupolo
• Quadrupolo e Tempo de voo - Q-ToF
• Ion trap e tempo de voo - IT-To
• Quadrupolo e Ion trap - Qq-IT
• Ion trap e Orbitrap - IT-Orbitrap
• Ion trap e Ressonância ciclotrônica de íons com transformada
de Fourier - IT- FTICR
 Quadrupolo
Resolução unitária

https://www.youtube.com/watch?v=6_mavZ_WKoU&t=107s
https://www.ms-museum.org/quadrupole-mass-analyzer Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
 Ion Trap
Resolução unitária

https://www.ms-museum.org/ion-trap-internal-ionization Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
 Tempo-de-voo
Resolução máxima 60.000

https://www.youtube.com/watch?v=3arO41_edeg&t=70s
Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
Orbitrap
Resolução máxima 400.000*

Analisador e Detector ao mesmo tempo!

Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
ICR
Resolução máxima 10.000.000

https://www.youtube.com/watch?v=7EHngA4S3Ws
Híbridos
Orbitrap
Ion
Trap ToF
Quadrupolo
linear

Quadrupolo

Eclipse Tribird
Xevo G2-XS QTof
Quadrupole Time-of-Flight
Quais os efeitos da resolução?

Baixa resolução: Alta resolução:

Quadrupolo (ou QqQ) ToF (4 casas)
Ion Trap Orbitrap (5 casas)
FT-ICR (9 casas)
Detectores
ChapaFotográfica
Multiplicador de
elétrons

Gaiola de Faraday

Detector multicanal

Lanças, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009
Como é o espectro?
ENERGIA
PARA
COLISÃO

ION PRECURSOR
M+H; M+Na, M-H ION PRODUTO

O m/z que vemos no espectro é o MS1 e os fragmentos

serão o MSn, podendo ser MS2, MS3 ou quantos mais for
possível de ter fragmentação do íon precursor (MS1).
Como é o espectro?
→ SIMILAR A UM CROMATOGRAMA
→ CADA ÍON (SINAL) PODERÁ TER UM ESPECTRO DE FRAGMENTAÇÃO

[M-H]⁻ = 765 Da → Saponina

-Hex (162Da)

Jujubogenina

Jujubogenina - H₂O = Lactona de Ebelin

-Pen (132Da)
Adutos
Importante notar que além do ganho ou
perda de próton, alguns adutos podem estar
presente em nossas análises.
Esses adutos NÃO são da amostra!
Eles são formados na ionização devido a
presença do solvente da fase móvel.
A importância deles está para entendermos
a fragmentação do nosso íon.

https://fiehnlab.ucdavis.edu/staff/kind/metabolomics/ms-adduct-calculator
INTERVALO
10 MINUTOS
 Aplicações na
pesquisa de produtos
naturais
Nossas experiências

Espécies amazônicas
Saracura-mirá
Juazeiro
• planta nativa do
nordeste brasileiro

Fotos de Alan
Limão bravo
(Siparuna spp)

Mais aplicações …
Nossas experiências
Hyptis monticola
• espécie endêmica de regiões
Floresta (Mata) Atlântica e do
Cerrado

Breu branco e
breu preto Fotos de Alan e Aline

• oleoresina
• espécie amazônica

Lantana spp
espécies vegetais da
Lippia spp
Floresta Atlântica e
Solanum spp Amazônica
Struthanthus spp
 Saracura-mirá:
estudada por nosso grupo há mais de 10 anos

Nome científico:
Ampelozyziphus amazonicus Ducke
(Rhamnaceae)

Uso tradicional:
profilático contra a malária, tônico,
estimulante, afrodisíaco e depurativo.

Comunidades Quilombolas
Comunidades da região de Oriximiná,
Pará.
Fotos de Suzana Leitão
Cervejinha de índio
 A química da espécie
Saponinas: Saponinas da saracura-mirá:
•Glicosídeos de alto peso molecular (600 a 2000 Da) • Núcleo damarânico
•Produzem espuma abundante e persistente • Glicosídeos de Jujubogenina e Ampelozigenina (31C)
quando agitados em solução aquosa à ação
surfactante
→ Único trabalho da literatura que relata a
composição química do lenho (preservação
da espécie).
→ 95 saponinas anotadas: 22 já tinham sido
descritas por Figueiredo et al.(2016) e 73
foram propostas pela primeira vez na espécie.

Fluxo de
trabalho:
núcleo
Anotação de
damarânico
substâncias
usando os dados
de LC-MS/MS

→ 22 saponinas anotadas
Mais LC-MS/MS e saponinas

Fluxo de trabalho:
Anotação de substâncias
usando os dados de
LC-MS/MS

→ Espécie da mesma família da

Saracura-mirá: Rhamnaceae 44 saponinas foram
→ Sua casca, rica em saponinas, é anotadas:
amplamente utilizada na medicina 40 descritas pela
popular e como insumo para a primeira vez na
produção de cosméticos espécie
→ Estudo das folhas: visando a
preservação da espécie
 Siparuna spp:
Várias espécies desse gênero foram e são
objeto de estudo do nosso grupo

Uso tradicional:
espécies de Siparuna são utilizadas na
medicina popular brasileira para o • 3,3′,4′-tri-O-methyl-quercetin,
• 3,7,3′,4′-tetra-O-methyl-quercetin
tratamento de gripes e resfriados. (retusina)
• 3,7-di-O-methyl-kaempferol
(kumatakenina)

Potencial anti-SARS CoV-2 e

anti-influenza ???
LC-MS/MS → Confirmação das substâncias nas frações e
das substâncias isoladas juntamente com RMN.
25 extratos de folhas :
S. cristata, fingerprint potencial anti- flavonoides,
S. decipiens, DI-ESI (±) influenza e anotação alcaloides e
S. glycycarpa, IT-MS das substâncias nos dímeros de
S. reginae e extratos mais ativos. procianidina
S. sarmentosa
Breu branco e Breu preto
Oleoresinas produzidas por
espécies da família Burseraceae.

Uso tradicional:
a fumaça é inalada e atua como
analgésico para dores de cabeça.

Comunidades Quilombolas
Comunidades da região de Oriximiná,
Pará.

Fotos de Rayane Albino, Suzana Leitão e Danilo Oliveira

 Breu branco X Breu preto

UPLC-APCI-MS → separação de 43 triterpenoides

GC-EI-MS → anotação de ursa-9(11),12-dien-3-ol
como um marcador potencial para oleorresinas de
breu preto

UPLC-APCI-MS

GC-EI-MS
 • Monticolidos A-F.
• Flores, folhas e galhos
LC-ESI-IT-MS
coletados em diferentes
estações do ano.
Com o objetivo de encontrar fontes naturais
Flores de Hyptis monticola e as
com potencial antidiabético, 15 extratos de
folhas de Lippia origanoides
plantas medicinais brasileiras das Florestas
resultaram em promissora
Atlântica e Amazônica foram testados contra
atividade anti-ɑ-glicosidase.
a enzima ɑ-glicosidase
UHPLC-ESI(+)3D-IT-MS/MS

Anotação das substâncias nos

extratos mais ativos
 Questões?
Comentários?
 Central Analítica do Departamento de
Produtos Naturais e Alimentos (CA-DPNA)
SITE
Faculdade de Farmácia
https://centraldpna.wixsite.com/cadpna

Unidade multiusuária para análises

cromatográficas por HPLC, LC-MS e CG-MS. E-MAIL
centraldpna@gmail.com
Análises gratuitas para instituições de pesquisa
públicas e, também, prestações de serviço.
INSTAGRAM
@cadpna

Nossa localização
CCS, bloco A, segundo andar,
sala 32, Ilha do Fundão - RJ
CENTRAL ANALÍTICA DO DEPARTAMENTO DE PRODUTOS
NATURAIS E ALIMENTOS (CA-DPNA)
Nossos contatos
FACEBOOK
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INSTAGRAM
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Nossa localização
CCS, bloco A, segundo andar, sala 10, Ilha do
Fundão - RJ
Dra. Simony Mendonça Me. Marcos V. Toledo e Silva
sy2802@gmail.com mvtoledosilva@gmail.com
Bacharel em Farmácia Bacharel em Farmácia
Mestrado em Plantas Medicinais, Aromáticas e Condimentares - UFLA Mestrado em Produtos Naturais e Bioativos - UFRJ
Doutorado em Química de Produtos Naturais - IPPN/UFRJ Doutorando em Ciências Farmacêuticas - FF/UFRJ

Me. Brendo Araujo

Bela. Thamirys Fonseca brendoo.bc@gmail.com
fs.thamirys@gmail.com Licenciado em Biologia
Bacharel em Farmácia Mestre em Biotecnologia Vegetal e Bioprocessos - PBV/UFRJ
Mestranda em Biotecnologia Vegetal e Bioprocessos - PBV/UFRJ Doutorando em Biotecnologia Vegetal e Bioprocessos - PBV/UFRJ