Moerner-Lecture TRADUZIDO

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Espectroscopia, Imagem e Fotocontrole de

Molécula Única: Fundamentos para
Microscopia de super-resolução
Palestra Nobel, 8 de dezembro de 2014
por WE (William E.) Moerner
Departamentos de Química e (por cortesia) de Física Aplicada

Stanford University, Stanford, Califórnia 94305 USA.
ABSTRATO
Os passos iniciais para a detecção óptica e espectroscopia de moléculas únicas em matéria

condensada surgiram do estudo de perfis de absorção óptica não homogênea de impurezas
moleculares em sólidos a baixas temperaturas.
Assinaturas espectrais relacionadas às flutuações do número de moléculas em ressonância levaram

à obtenção do limite de molécula única em 1989 usando espectroscopia de laser de modulação de
frequência. No início dos anos 90, muitos efeitos físicos fascinantes foram observados para
moléculas individuais, e a imagem de moléculas individuais, bem como observações de difusão
espectral, comutação óptica e a capacidade de selecionar diferentes moléculas únicas no mesmo
volume focal simplesmente ajustando o bombeamento a frequência do laser forneceu importantes
precursores da microscopia de super-resolução posterior com moléculas únicas. No regime de
temperatura ambiente, a imagem de cópias únicas da proteína fuorescente verde também revelou
surpresas, especialmente o piscar e a recuperação fotoinduzida de emissores, o que estimulou o
desenvolvimento de marcadores de proteínas fuorescentes fotocomutáveis.
Como cada fuoróforo atua como uma fonte de luz de aproximadamente 1 nm de tamanho, a
observação microscópica e a localização de fuoróforos individuais é um ingrediente chave para a
geração de imagens além do limite de difração óptica. Combinando isso com o controle ativo do
número de moléculas emissoras no volume bombeado,
205
206 Os prêmios Nobel
imagens de super-resolução de Eric Betzig e outros, uma nova fronteira para microscopia
óptica além do limite de difração. Os antecedentes que levaram a essas observações
são descritos e os desenvolvimentos atuais selecionados são resumidos.
1. OS PRIMEIROS DIAS
1.1 Introdução e inspirações iniciais
Quero agradecer ao Comitê Nobel de Química, à Academia Real Sueca de Ciências e

à Fundação Nobel por me selecionarem para este prêmio, reconhecendo o
desenvolvimento da microscopia de fuorescência super-resolvida. Estou realmente
honrado em compartilhar o prêmio com meus dois estimados colegas, Stefan Hell e Eric
Betzig. Minhas contribuições primárias centram-se na primeira detecção óptica e
espectroscopia de moléculas únicas na fase condensada [1], e nas observações de
imagem, piscar e fotocontrole não apenas para moléculas únicas em baixas temperaturas
em sólidos, mas também para variantes úteis de a proteína verde fuorescente à
temperatura ambiente [2]. Esta palestra descreve o contexto dos eventos que levaram a
esses avanços, bem como uma parte dos desenvolvimentos subsequentes, tanto
internacionalmente quanto em meu laboratório.
Em meados da década de 1980, inspirei-me muito cedo em avanços surpreendentes
que estavam ocorrendo em todo o mundo, onde sistemas quânticos em nanoescala
foram detectados e explorados por razões científicas e tecnológicas. Alguns deles foram
(i) a espectroscopia de elétrons únicos ou íons confinados em armadilhas eletromagnéticas
a vácuo [3-5], (ii) microscopia de tunelamento de varredura (STM) [6] e microscopia de
força atômica (AFM) [7], e ( iii) o estudo de correntes iônicas em canais iônicos embebidos
em membrana única [8]. Mas por que ninguém conseguiu a detecção óptica e a
espectroscopia de uma única molécula pequena nas profundezas de um ambiente de
fase condensada mais complexo do que no vácuo, o que permitiria a espectroscopia de
molécula única (SMS)?
Havia um problema. Anos antes, o grande físico teórico e co
fundador da mecânica quântica, Erwin Schrödinger afirmou [9]:
“. . . nunca experimentamos com apenas um elétron ou átomo ou

(pequena) molécula. Em experimentos de pensamento, às vezes supomos
Em primeiro
que sim; isso invariavelmente acarreta consequências ridículas. .. lugar,
é justo afirmar que não estamos experimentando com partículas únicas,
assim como não podemos criar ictiosauria no zoológico”.
E ele não foi o único que se sentiu assim, mesmo na década de 1980. Muitos
cientistas acreditavam que, embora fotoelétrons únicos pudessem ser detectados a partir de
Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 207
fotoionização de uma única molécula no vácuo, detectando opticamente uma única

molécula em uma amostra de fase condensada era impossível. Assim, o aspecto-
chave da parte inicial desta história é explicar como cheguei ao ponto de acreditar
que isso seria possível.
1.2 Espectroscopia de baixa temperatura de moléculas em sólidos: Alargamento não homogêneo
Para explicar os experimentos iniciais de SMS no final da década de 1980, é necessário

revisar brevemente alguns conceitos da espectroscopia óptica de alta resolução de
impurezas moleculares em sólidos, campo de intenso estudo nas décadas que cercam
1970 impulsionado por nomes como EV Shpol 'skii, R. Personov, KK Rebane e outros.
(Referências exaustivas não podem ser incluídas aqui, mas para um texto abrangente
cobrindo muitos aspectos, veja [10].) Começando à temperatura ambiente, vamos
considerar o espectro de absorção óptica de moléculas de terrileno dispersas em baixa
concentração (digamos 10-6 mol/mol ) em um hospedeiro transparente sólido de p-
terfenil (ver Fig. 1). A figura mostra a absorção óptica expressa em densidade óptica
ÿ de espectro
de uma amostra versus o comprimento de ondaque
da luz
se usada
pode obter
para de
a sondagem,
um espectrômetro
o tipo
comercial uv-vis. Uma escala de cores mostra a correspondência com as cores da luz
visível. Começando com comprimentos de onda longos à direita, não há absorção, e à
ÿ Planck
medida que diminui (a energia aumenta de acordo comhE, frequência
= hf com a f),
constante
eventualmente
de
a molécula absorve luz. A seta mostra a primeira transição eletrônica representando a
promoção de um elétron do estado fundamental (maior nível molecular ocupado
FIGURA 1. Espectro (absorção versus comprimento de onda, ou cor) de moléculas de terrileno em

um hospedeiro sólido de p-terfenil na sala T.
orbital) para o primeiro estado excitado (orbital molecular desocupado mais baixo). As
absorções de comprimento de onda mais curtas mostradas envolvem a criação de
vibrações adicionais na molécula. Além disso, comoÿ f(fe=estão
c/ com
inversamente
c a velocidade da ÿluz),
relacionados
se
ÿ bordas
aumenta para a direita, então a frequência
do gráfico
aumenta
são mostradas,
para a esquerda.
na faixaAs
defrequências
centenas denas
THz (1012 ciclos por segundo).
O terrileno (e outros hidrocarbonetos aromáticos semelhantes) é uma molécula

Pi que
relativamente plana e rígida que é mantida gorda pelos
são orbitais
indicadasdapelos
molécula
anéis
e aromáticos
pelas ligações
da molécula. Por causa disso, a primeira transição eletrônica não envolve grandes
distorções da molécula, ou seja, essa transição envolve principalmente os graus de
liberdade eletrônicos, também denominados de distorção Franck-Condon mínima. Agora
vamos resfriar a amostra a temperaturas muito baixas de alguns K acima do zero absoluto
(temperaturas de hélio líquido) e expandir a escala horizontal em aproximadamente 25
vezes. Os espectroscopistas frequentemente alternam entre as exibições de comprimento
de onda e frequência, e a Fig. 2 agora mostra a frequência aumentando à direita, em
unidades de número de onda ou cm inverso; 1 cm–1 corresponde a aproximadamente 30
GHz. Apenas um pequeno pedaço de comprimentos de onda laranja é deixado.
A temperaturas tão baixas, as vibrações da molécula não podem ser excitadas
termicamente, de modo que o aparecimento da primeira transição eletrônica é agora
extremamente estreito. Além disso, as vibrações do sólido (fônons) também são
essencialmente inexistentes, de modo que não podem contribuir para o alargamento
da absorção óptica, e a linha se torna uma linha “zero-fônon”. De fato, no cristal hospedeiro de p-terfenil,
FIGURA 2. Espectro (absorção vs. frequência/número de onda, ou cor) de moléculas de

terrileno em um hospedeiro sólido, p-terfenil, em T baixo (~2K), da Ref. [101 ÿ2].
existem quatro localizações inequivalentes para as moléculas de terrileno no cristal,

portanto, existem quatro “origens”: X1–X4, porque a estrutura do hospedeiro nesses
quatro locais diferentes é bastante diferente. As linhas de absorção tornaram-se
suficientemente estreitas para que as diferentes perturbações provenientes dos diferentes
ambientes locais (pense na pressão local) sejam agora observáveis.
Na verdade, o espectro na Fig. 2 não conta toda a história, porque a largura da linha
de absorção para qualquer um dos quatro locais é muito mais estreita do que o mostrado.
Para resolver completamente a linha de absorção de uma maneira não limitada pelo
aparelho, os espectrocopistas começaram a usar dispositivos de dispersão de banda
estreita, como monocromadores duplos ou, finalmente, lasers sintonizáveis de onda
contínua de frequência única (cw) como fontes de luz, mas uma outra surpresa estava
esperando. A Figura 3(a) mostra a situação das moléculas dopantes de pentaceno em
cristais de p-terfenil a 1,8 K conforme relatado por Orlowski e Zewail em 1979 [11]. Pode-
se esperar que agora a largura de linha seja apenas cerca de 10 MHz ou mais, a largura
esperada para as absorções moleculares limitada apenas pelo tempo de vida do estado
excitado. No entanto, o perfil de absorção é muito mais amplo, cerca de 0,7 cm–1 ou
cerca de 21 GHz! Este excesso de largura foi reconhecido como alargamento não
homogêneo conforme esquematizado na Figura 3(b). As várias moléculas no sólido têm
larguras intrinsecamente estreitas (chamadas de largura homogênea), mas o perfil geral
da linha de absorção representa a faixa de diferentes frequências centrais para as
moléculas provenientes de diferentes ambientes locais (ilustrados na Figura 3(c)) que se
deslocam as energias de absorção ao longo de um intervalo. Essas perturbações surgem
de efeitos como tensões e deformações locais decorrentes de imperfeições do cristal, ou
de outros defeitos, ou possivelmente de campos elétricos locais, e assim por diante, e
vários modelos teóricos foram propostos para os mecanismos de alargamento não homogêneo [12].
FIGURA 3. Alargamento não homogêneo em sólidos a baixas temperaturas. (a) Pentaceno

em espectros de absorção de p terfenil retirados da Ref. [11] (resolução de 0,09 cm-1). (b)
Esquema do efeito de alargamento não homogêneo com largura ÿl . (c) Esquema de diferentes
ambientes locais dando origem a alargamentos não homogêneos.
1.3 O ambiente na IBM Research: Spectral hole-burning para armazenamento óptico
Um objetivo da espectroscopia de alta resolução era medir a verdadeira largura

homogênea do zero-fonon, transição puramente eletrônica de moléculas em sólidos
sem a interferência do alargamento não homogêneo. É por esta razão que muitas
pesquisas nas décadas de 1970 e 1980 foram dedicadas a métodos como o
estreitamento da linha de fuorescência (FLN) [13, 14] e espectroscopias transitórias,
como decaimento por indução livre, nutação óptica e ecos de fótons [15-17]. Embora
todos esses métodos fossem poderosos com vantagens e desvantagens, havia
outro método para avaliar a largura homogênea sob certas circunstâncias, a queima
de buracos espectral persistente, ilustrada na Figura 4. Esse efeito óptico foi
descoberto na década de 1970 por dois grupos russos: por Gorokhovskii et ai. para H2-
fthaocianina em uma matriz Shpol'skii [18], e por Kharlamov et al. para perileno e 9-
aminoacridina em etanol vítreo [19]. A queima de buracos espectral persistente acabou por
ser um efeito bastante comum nas transições ópticas de impurezas em sólidos a baixas
temperaturas. Dada uma linha não homogênea (Figura 4 superior), a irradiação com um
laser de banda estreita excita apenas o subconjunto de moléculas ressonantes com o laser
dentro de uma largura homogênea ÿH. Queima de buracos espectral
FIGURA 4. Ilustração de queima de buracos espectral persistente em linhas não homogêneas

de dopantes em sólidos a baixas temperaturas. (a) Antes da queima, a linha não homogênea
tem um perfil de absorção “suave”. (b) Quando um laser de banda estreita irradia frequências
selecionadas em certos materiais, mergulhos espectrais ou “buracos” podem ser gerados.
ocorre quando mudanças físicas ou químicas causadas pela luz são produzidas apenas
naquelas moléculas ressonantes com a luz, levando essas moléculas para alguma outra parte
do espaço de frequência ou comprimento de onda. Isso deixa para trás um mergulho ou
“buraco espectral” no perfil de absorção geral de aproximadamente 2 ÿH. É importante
ressaltar que os cientistas da IBM Research perceberam que a queima de buracos pode ser
usada para gravação óptica de informações no domínio da frequência óptica, daí o termo
"armazenamento óptico no domínio da frequência" [20]. Para mais detalhes sobre queima de
buracos espectral veja a Ref. [21].
Em 1981, entrei para um dos grandes laboratórios de pesquisa corporativa da época, a
IBM Research, para trabalhar em materiais e mecanismos para armazenamento de queima
de buracos espectral. Era uma época em que uma ideia nova com potencial de aplicação
poderia ser estudada em grande detalhe em um centro de pesquisa corporativo, desde as
questões científicas fundamentais até o desenvolvimento dos materiais necessários, até o
projeto de engenharia potencial do sistema. A queima de buracos espectral persistente era
de interesse porque permitiria que muitos bits de informação fossem armazenados no mesmo
ponto no domínio da frequência óptica simplesmente escolhendo escrever um buraco ou não
escrever um buraco no perfil de linha não homogêneo. Como para vários sistemas a razão
ÿI /ÿH era da ordem de 1000 ou mais em baixas temperaturas, foi previsto um grande aumento
na capacidade de armazenamento óptico. Os mecanismos para o processo podem ser
fotoquímicos [22] onde a luz induz uma mudança fotoquímica, ou fotofísicos (não fotoquímicos),
onde apenas os sistemas de dois níveis do hospedeiro próximo precisam ser alterados [23,
24], e muito esforço centrado na geração de novos sistemas de materiais. Infelizmente, no
final, a necessidade de baixas temperaturas e a incrível taxa de crescimento composto do
desempenho do armazenamento magnético espremeram essa ideia da aplicação prática,
embora aplicações de processamento de sinal de microondas [25] ainda estejam sendo
exploradas usando efeitos de queima de buracos.
1.4 Estrutura fina estatística em linhas não homogêneas
Felizmente, também era importante na IBM examinar os limites fundamentais das novas
tecnologias de armazenamento óptico, e isso foi particularmente interessante para mim. Em
1985, trabalhei com Marc Levenson nas deficiências dos mecanismos de queima de buracos
de um fóton (linha) [26]. À medida que os buracos espectrais são escritos em velocidades
cada vez mais altas, a profundidade real do buraco ficará menor até que tenha uma
profundidade fracionária igual à eficiência quântica de um ciclo para a formação de buracos
espectrais. Além do ruído de disparo devido às flutuações do número de Poisson da luz de
sondagem, percebemos que uma limitação adicional particularmente interessante na relação
sinal-ruído de um buraco espectral pode resultar do número finito de
moléculas que contribuem para o perfil de absorção próximo ao buraco. A questão surgiu:
existe uma rugosidade espectral estática na linha não homogênea que resulta de flutuações
estatísticas de números ou da discrição de moléculas individuais?
Isso definiria um limite último para o menor buraco espectral que pudesse ser detectado. A
idéia básica é ilustrada a partir de considerações familiares de probabilidade na Figura 5.
Supondo que 50 bolas sejam lançadas aleatoriamente em 10 caixas, é bastante improvável
que exatamente 5 bolas caiam em cada caixa (Fig. 5(a)). Em vez disso, um resultado muito
mais provável de um único experimento é mostrado na Figura 5(b): os números que chegam
em cada caixa terão um valor médio de 5 em todas as caixas, mas os números reais se
espalharão acima e abaixo desse valor. Este é o efeito familiar de flutuação do número,
equivalente à escala do erro padrão da média, onde o tamanho rms das flutuações sobre a
média será escalado como N é o número médio em cada bin, ou 5 neste caso. O teorema
, onde N
do limite central se aplica aqui, uma vez que as moléculas são consideradas independentes.
Agora, para ver como essa ideia se relaciona com a espectroscopia de alta resolução
de linhas não homogêneas a baixas temperaturas, simplesmente pensamos no eixo
horizontal como frequência óptica (ou comprimento de onda) e imaginamos que ÿI é
extremamente grande para que a linha não homogênea apareça localmente gordura na escala da página.
Cada caixa é um bin de largura ÿH, a largura homogênea de uma linha de absorção óptica,
e as moléculas escolhem frequências quando a amostra é formada de forma aleatória. Dez
o espectro resultante deve ter uma rugosidade espectral ou escala de estrutura fina como N
, queser
ecules! Isso também pode surge
vistoda
nadiscrição
simulaçãododa
mol individual
Figura 5(c), onde a (perfeitamente
FIGURA 5. Ilustração de flutuações numéricas para probabilidade e para espectroscopia. (uma)

Uma maneira improvável de jogar aleatoriamente 50 bolas em 10 caixas. (b) Um caso mais
provável. (c) Simulação de uma linha não homogênea em uma amostra para o caso de
probabilidade gaussiana uniforme de selecionar frequências de absorção, sendo N o número
total simulado nesta figura.
suave) a forma gaussiana foi assumida para a probabilidade das moléculas somarem frequências
de ressonância específicas. Em números muito pequenos de moléculas totais, as variações na
absorção são óbvias, e em concentrações cada vez maiores, o efeito parece suavizar, como foi
provavelmente o caso nos espectros iniciais de pentaceno em p-terfenil na Figura 3(a) [11]. (Além
disso, a resolução espectral era muito baixa para ver esse efeito nos primeiros experimentos). em
absorção vs comprimento de onda ou frequência óptica. Chamamos esse efeito de “estrutura fina
estatística” (SFS), e é importante perceber que o tamanho relativo de SFS fica menor em alta
concentração, pois
(1/ N H ), enquanto o tamanho da raiz quadrada média absoluta (rms) da estrutura fne H .
crescido à medida
Surpreendentemente,
que N não era relatado,
antes
então
do final
essedaera
década
um primeiro
de 1980,
objetivo.
a observação de SFS havia
Em 1987, meu pós-doutorando Tom Carter e eu observamos SFS pela primeira vez [27, 28],
usando uma poderosa técnica de absorção óptica de fundo zero, espectroscopia de modulação de
frequência a laser (FM) [29, 30], explicada abaixo. A escolha da amostra foi crítica: nós realmente
tentamos por muitos meses ver o efeito das moléculas dopantes de perileno em uma fina película de
poli(cloreto de vinila), mas cada vez que escaneávamos o espectro e víamos uma dica da estrutura,
ele mudava para nas próximas
FIGURA 6. Observação da Statistical Fine Structure (SFS) (direita) para pentaceno em p-

ter fenil (estrutura esquemática) com Tom Carter (foto). Dados após Ref. [28].
Varredura! Isso foi devido à queima de buracos fotofísicos para este sistema causada
pelo laser de sondagem. A certa altura, frustrado pela necessidade de um sistema sem
queima de buracos, consultei Michael Fayer em Stanford, que sugeriu moléculas dopantes
de pentaceno em um cristal de p-terfenil (Figura 6, à esquerda). No fim de semana,
simplesmente derreti um pouco de p-terfenil misturado com uma pequena partícula de
pentaceno em uma chapa quente entre lâminas de vidro, coloquei no criostato e
imediatamente vimos o sinal SFS! A Figura 6, à direita, mostra uma pequena fatia de 5
GHz da linha não homogênea do local O1 centrada aproximadamente em 506 THz. SFS
é a incrível estrutura espectral que se repete lindamente quando a varredura é repetida
(painel superior). O SFS é claramente incomum, pois seu tamanho não depende do
número total de moléculas ressonantes, mas sim da raiz quadrada do número, e surge
diretamente da discrição das moléculas individuais. (Acontece que a queima de buracos
não estava completamente ausente neste sistema, mas apenas muito menos provável -
com irradiação de laser estendida, buracos espectrais poderiam ser queimados diretamente no SFS.)
2. DETECÇÃO DE MOLÉCULA ÚNICA, TROSCOPIA ESPECÍFICA E IMAGEM EM BAIXO

TEMPERATURAS
2.1 FMS e um argumento de escala abriram o caminho para a primeira detecção de molécula
única e espectroscopia em fases condensadas
O outro aspecto crucial do experimento SFS foi o método de detecção óptica

ultrassensível usado, espectroscopia FM a laser (FMS) [29, 31]. O FMS foi inventado
por Gary C. Bjorklund na IBM em 1980, e ele me ensinou esse método para poder
usá-lo na detecção de buracos espectrais. Conforme ilustrado na Figura 7, um laser
sintonizável de frequência única na frequência Cÿ passa
eletro-óptico
por umemodulador
adquire modulação
de fase
de frequência em uma modulação rf fre M, geralmente na ordem de 100 MHz. No
ÿ domínio
mostrado. Essas bandas
da frequência,
laterais estão
aparecem
fora de
duas
fase,
bandas
de modo
laterais
que,de
sequency
não forem
como
perturbadas pela amostra, um detector rápido que mede naturalmente o envelope da
onda de luz não produz sinal em No entanto, quando uma característica espectral
ÿ M. do laser
estreita (estreita na escala de M ) está presente, o desequilíbrio nas
leva
bandas
à modulação
laterais
ÿ de
de amplitude na fotocorrente detectada na qual é facilmente
rf lock-in. Em
detectada
outras palavras,
por técnicas
a
amostra converte o feixe FM em um feixe AM quando uma característica estreita está
ÿ M presente, e todo o experimento se comporta aproximadamente como rádio FM a
506 THz (embora com baixo índice de modulação). Uma característica chave do FMS
é que ele detecta apenas os desvios da absorção do valor médio, mais precisamente,
o sinal é proporcional ( o coeficiente de absorção.
para ÿÿ ( C + ÿ M )ÿ ÿÿ C
ÿ
ÿ M ) com uma
principal razão pela qual a detecção de SFS pode ser facilmente realizada com FMS.
Não havia necessidade de fazer uma amostra heroica com concentração ultrabaixa
para ver SFS, porque o sinal de SFS medido por FMS é realmente maior com
concentrações mais altas de moléculas!
No entanto, com a detecção do SFS em mãos, tornou-se possível para mim

acreditar que a detecção de uma única molécula seria possível. Este ponto-chave pode
ser entendido por um argumento de escala simples: Quando SFS devido a ~1000 mol
ecules é detectável (aproximadamente o caso na Fig. 6), isso significa que o sinal FMS
medido (amplitude rms) é do mesmo tamanho que ~32 moléculas (isto é, (1000)1/2).
Mas isso significa que, em termos de melhorar a relação sinal-ruído (SNR) do aparelho
FMS, só foi necessário trabalhar 32 vezes mais para observar uma única molécula, não
1000 vezes mais! Essa realização, combinada com dois fatos adicionais: (i) a
espectroscopia de absorção FM foi insensível a qualquer fundo de espalhamento
Rayleigh ou Raman de amostras imperfeitas e (ii) FMS permite sensibilidade de
detecção limitada quântica, levou eu e meu pós-doutorando Lothar Kador (Fig. 8) para
empurrar a espectroscopia FM para o limite de uma única molécula. Também é verdade
que a eficiência quântica particularmente baixa para a queima de buracos espectral fez
do pentaceno em p-terfenil uma excelente primeira escolha para detecção de uma única molécula.
Os primeiros experimentos de SMS em 1989 utilizaram uma das duas poderosas
técnicas de absorção de FMS de dupla modulação, laser FMS com modulação
secundária de campo elétrico Stark (FM-Stark) ou FMS com modulação secundária
de deformação ultrassônica (FM-US) [1, 32]. A modulação secundária foi necessária
para remover os efeitos da modulação de amplitude residual produzida pela fase imperfeita
FIGURA 7. Espectroscopia de modulação de frequência a laser para detecção de sinais

fracos de absorção e dispersão. Foto: Gary C. Björklund. Da Ref. [33].
FIGURA 8. Primeira detecção óptica e espectroscopia de absorção de moléculas simples em

matéria condensada. (a–c) Acúmulo de forma de linha esperada para espectroscopia FM-Stark. (d)
Varreduras múltiplas mostrando uma única molécula em 592,423 nm. (e) Varreduras médias
comparadas à forma de linha. (f) Longe das asas da linha, nenhuma molécula. (g) Mais próximo
do centro da linha não homogênea; SFS. Foto: Lothar Kador. Da Ref. [1].
modulador [33]. A Figura 8 (especificamente, traço d) mostra exemplos do espectro de

absorção óptica de uma única molécula de pentaceno em p-terfenil usando o método FM-
Stark, onde a frequência central do laser foi simplesmente sintonizada nas asas da linha não
homogênea em para selecionar a faixa de concentração de um único mol sem cultivar uma
nova amostra com dopagem reduzida.
Embora essa observação inicial e dados semelhantes do método FM-US tenham servido
para estimular muito mais trabalhos, havia uma limitação importante no uso geral dos
métodos FM para SMS. Como foi mostrado nos primeiros artigos sobre FMS [29, 31],
características de absorção extremamente fracas tão pequenas quanto 10-7 em tamanho
relativo podem ser detectadas em um tempo médio de 1 s, mas somente se grandes
potências de laser na ordem de vários mW pode ser entregue ao detector para forçar o ruído
de disparo de fótons a dominar o ruído de Johnson do detector. No entanto, em SMS, o feixe
de laser deve ser focado em um pequeno ponto para maximizar a probabilidade de transição
óptica, assim a potência no feixe de laser deve ser mantida abaixo do valor que causaria o
alargamento da saturação da forma de linha de uma única molécula, o que é difícil evitar
para uma linha tão estreita em baixas temperaturas. Como resultado, os dados da Fig. 8
tiveram que ser adquiridos com potências abaixo de 100 µW no detector, o que é uma razão
pela qual a SNR foi apenas da ordem de 5. (A outra razão foi a
uso de amostras clivadas relativamente espessas, que produziram uma população de

moléculas fora de foco mais fracas no volume sondado. Este problema foi facilmente
superado posteriormente.) Em experimentos posteriores de Lothar [34], a modulação de
frequência da própria linha de absorção (em vez do laser) foi produzida por um campo
elétrico oscilante (Stark) sozinho, e este método também foi usado para detectar a
absorção de uma única molécula em temperaturas de hélio líquido. Embora bem-
sucedidos, esses métodos de transmissão são limitados pelo ruído de disparo quântico
do feixe de laser, que é relativamente grande na baixa intensidade do laser necessária
para evitar a saturação.
2.2 Marco crucial: detecção de absorção de molécula única por fuorescência
Os experimentos de absorção óptica com pentaceno em p-terfenil mostraram que esse

material tem queima de buracos espectral suficientemente ineficiente para torná-lo um
sistema modelo útil para estudos de uma única molécula. Em 1990, Michel Orrit e Jacky
Bernard demonstraram que a detecção da absorção óptica pela detecção da fuorescência
emitida produz uma relação sinal-ruído superior se a emissão for coletada de forma
eficiente e as fontes de espalhamento forem minimizadas [35]. Devido à sua relativa
simplicidade, experimentos subsequentes usaram quase exclusivamente esse método,
que também é chamado de “espectroscopia de excitação de fuorescência”. É uma
aplicação do método de fase gasosa de fuorescência induzida por laser, pioneiro de R.
N. Zare em 1968 [36] para sólidos. Na excitação de fuorescência, um laser de frequência
única de banda estreita sintonizável é escaneado sobre o perfil de absorção da molécula
única, e a presença de absorção é detectada medindo a fuorescência emitida (Figura 9)
para comprimentos de onda longos, longe do comprimento de onda do próprio laser.
O método é muitas vezes limitado ao fundo, e requer o crescimento de falsificações
sublimadas cristalinas ultrafinas para reduzir os sinais de dispersão que podem surgir
do cristal p-terfenil, mas não sofre com a difícil troca entre SNR e alargamento óptico de
FMS . Este foi um grande avanço para a espectroscopia de uma única molécula, e se
houvesse um quarto ganhador do Prêmio Nobel, Michel Orrit deveria tê-lo recebido.
Com a capacidade de detectar moléculas únicas em cristais e polímeros, no início

dos anos 90 muitos pesquisadores em todo o mundo entraram em campo para aproveitar
as linhas de absorção óptica extremamente estreitas e a remoção da média do conjunto,
duas das maiores Motivações para o estudo de moléculas únicas. As investigações
foram algumas vezes dirigidas a observações específicas de efeitos particulares como o
efeito Stark [37], a dinâmica de sistemas de dois níveis [38], ou efeitos de polarização
[39], para citar alguns. Outras vezes, os experimentos eram feitos simplesmente para
observar, porque surpresas seriam esperadas quando um novo
FIGURA 9. Detecção de molécula única e espectroscopia de absorção registrando a

fuorescência emitida. A, B, a linha não homogênea, C, em concentração muito baixa, os
pontos representam os aumentos na emissão quando moléculas únicas entram em
ressonância com o laser sintonizável. Foto: Michel Orrit. Da Ref. [35].
regime é explorado pela primeira vez. O grande corpo de trabalho feito é muito grande para
ser revisto aqui, e o leitor é encaminhado para textos selecionados [21, 40] e artigos de
revisão selecionados [41–47] para obter mais informações. Meu talentoso grupo de pós-
doutorandos e colaboradores completou uma ampla gama de experimentos, incluindo
medições da largura limitada da vida útil, defasagem dependente da temperatura e efeitos
de saturação óptica [48, 49], correlações antiagrupamento de fótons [50], espectroscopia vibracional [51-
53], ressonância magnética de um único spin molecular [54] e espectroscopia de campo
próximo [55]. Alguns experimentos têm relevância particular para microscopia de super-
resolução e serão discutidos a seguir.
2.3 Espectroscopia e imagem de molécula única
Com a sensibilidade de uma única molécula que se tornou disponível no início da década de
1990, surgiu uma imagem mais detalhada do alargamento não homogêneo. A Figura 10(a)
mostra uma varredura sobre o perfil de absorção óptica não homogêneo para pentaceno em
p-terfenil; compare a Fig. 3(a). Enquanto as moléculas se sobrepõem perto do centro da
linha em 592,321 nm (0 GHz), nas asas da linha, perfis Lorentzianos isolados são observados
à medida que cada molécula entra em ressonância com o laser ajustável. A situação é muito
parecida com sintonizar seu rádio AM para
Encontre uma estação longe das grandes cidades: você sintoniza e sintoniza,
principalmente ouvindo estática, até entrar em ressonância com uma estação, então o
sinal sobe acima da estática. É óbvio que com uma amostra de concentração mais baixa,
moléculas únicas no centro da linha não homogênea também podem ser estudadas, e o
perfil da linha é apenas gaussiano próximo ao centro – existem grandes caudas não
gaussianas bem distantes do centro . Esses belos espectros forneceram grande parte da
base para os primeiros experimentos. Por exemplo, em baixa intensidade de
bombeamento, a largura de linha homogênea limitada ao tempo de vida de 7,8+/–0,2
MHz foi observada diretamente (Figura 10(b)) [56]. Esta largura de linha é o valor mínimo
permitido pelo tempo de vida do estado excitado S1 de 24 ns, em excelente concordância
com medições anteriores de eco de fótons em grandes conjuntos [15, 57]. Essas linhas
estreitas de absorção de uma única molécula são maravilhosas para o espectroscopista:
muitos estudos detalhados do ambiente local podem ser realizados, porque as linhas
estreitas são muito mais sensíveis às perturbações locais do que as características espectrais amplas.
Indo além dos estudos espectrais apenas, uma imagem híbrida de uma única
molécula foi obtida por Pat Ambrose em meu laboratório adquirindo espectros em função
da posição do ponto focal do laser na amostra [48]. A varredura espacial foi realizada de
maneira semelhante à microscopia confocal, varrendo o ponto focal do feixe de laser
incidente através da amostra em uma dimensão espacial. A Figura 10(c) mostra uma
"pseudo-imagem" tridimensional de moléculas únicas de
FIGURA 10. (a,b) Espectroscopia de molécula única e (c,d,) imagem. Fotos: W. Pat
Am brose (superior), Urs P. Wild (inferior). De Refs. (a) [49], (b) [56], (c) [48], (d) [58].
pentaceno em p-terfenilo. O eixo z da imagem é o sinal de emissão (desviado para o

vermelho), o eixo horizontal é a dessintonização da frequência do laser (faixa de 300 MHz)
e o eixo que entra na página é uma dimensão espacial transversal produzida pela varredura
ÿ espectrais
do ponto focal do laser (alcance de 40m). No domínio dasão
frequência,
totalmente
as resolvidas
características
porque a
largura da linha do laser de ~3 MHz é menor que a largura da linha molecular. No entanto,
considerando esta imagem ao longo da dimensão espacial, a única molécula está na verdade
servindo como uma nanossonda altamente localizada do próprio diâmetro do feixe de laser
ÿ molécula
(aqui ~5 m, devido à má qualidade do foco produzido pela lente em hélio líquido)pode
[48]. ser
A
considerada como uma sonda do tamanho de um nanômetro do ponto focal, que é
aproximadamente equivalente a uma medida da função de dispersão do ponto (PSF) do
sistema de imagem. Este é o primeiro exemplo de uma imagem espacial de uma única
molécula PSF, discutida em mais detalhes abaixo. Logo depois, o laboratório Wild na Suíça
[58] obteve imagens bidimensionais da forma de um ponto de uma única molécula como
mostrado na Figura 10(d) em contraste reverso.
2.4 Surpresas - difusão espectral e controle óptico
Durante os primeiros estudos de SMS sobre pentaceno em p-terfenil, um fenômeno

inesperado apareceu: mudanças de frequência de ressonância de moléculas individuais
de pentaceno em um cristal a 1,5 K [48, 56], mencionado brevemente anteriormente [35].
Chamamos esse efeito de “difusão espectral” devido à sua estreita relação com o
comportamento similar de deslocamento espectral há muito postulado para transições
ópticas de impurezas em sistemas amorfos [59]. Aqui, difusão espectral significa mudanças
na freqüência central (ressonância) de uma única molécula devido a mudanças de
configuração no hospedeiro próximo que afetam a freqüência da transição eletrônica via acoplamento hóspede-hospe
Por exemplo, a Fig. 11(a) mostra uma sequência de espectros de excitação de fuorescência
de uma única molécula de pentaceno em p-terfenil tomado tão rápido quanto permitido pela
SNR disponível, a cada 3 s. O deslocamento espectral ou salto desta molécula de uma
frequência de ressonância para outra de varredura para varredura é claramente evidente.
Agora, se a frequência do laser é mantida fixa perto da absorção molecular, então a molécula
parece piscar enquanto entra e sai da ressonância (Fig. 11(b), em dois níveis de potência).
Devido à falta de dependência de energia da taxa, esses processos espontâneos sugeriram
que existem sistemas de dois níveis disponíveis na matriz hospedeira que podem sofrer
transições termicamente induzidas mesmo nessas baixas temperaturas. Uma possível fonte
para os estados de tunelamento neste sistema de linha cristalina pode ser librações de
torção discretas do anel fenil central das moléculas de p-terfenil próximas em torno do eixo
molecular. As moléculas de p-terfenil em uma parede de domínio entre dois gêmeos ou
defeitos próximos da rede podem ter
barreiras reduzidas para tais movimentos de tunelamento do anel central. Um estudo

teórico das trajetórias de difusão espectral por Jim Skinner e colaboradores [60-62]
postulou defeitos específicos que podem produzir esse comportamento, atestando o poder
do SMS em sondar detalhes do nanoambiente local e a importância do conhecimento
teórico para compreensão adicional. Desvios espectrais de formas de linha de uma única
molécula foram observados não apenas para certos hospedeiros cristalinos, mas também
para essencialmente todos os polímeros estudados, e mesmo para matrizes policristalinas
de Shpol'skii [63]. Este é um exemplo dramático da heterogeneidade que foi descoberta
pelos estudos de uma única molécula.
Com meu pós-doutorado Tomas Basché, mudanças na frequência de absorção
também foram observadas para moléculas dopantes de perileno em poli(etileno), nas
quais a taxa do processo aumentou claramente com o aumento da intensidade do laser
[64, 65], Figura 11 (c). Esse efeito de fotocomutação pode ser chamado de “queima de
buracos espectral” por analogia com a literatura anterior sobre queima de buracos [21];
entretanto, como apenas uma molécula está em ressonância com o laser, a linha de
absorção simplesmente desaparece. Os subtraços (a), (b) e (c) mostram três varreduras
sucessivas de uma molécula de perileno. Após o traço (c) o laser foi sintonizado em
ressonância com a molécula, e nesta maior potência de irradiação, eventualmente o sinal
de fuorescência caiu, ou seja, a molécula aparentemente se desligou. O traço (d) foi então
FIGURA 11. (a,b) Difusão espectral e (c) desvios espectrais induzidos pela luz. De Refs.
[48], [56], [64], respectivamente. Fotos: (L) Jim Skinner, (R) Tomas Basché.
adquirido, o que mostrou que a frequência de ressonância da molécula aparentemente se

deslocou em mais de +/–1,25 GHz como resultado da mudança induzida pela luz no ambiente
próximo. Surpreendentemente, esse efeito foi reversível para uma boa fração das moléculas:
uma nova varredura alguns minutos depois (traço (e)) mostrou que a molécula voltou à
frequência de absorção original! Após o traço (g) a molécula foi fotocomutada novamente e
toda a sequência pôde ser repetida muitas vezes, permitindo-nos medir a cinética de Poisson
deste processo a partir do tempo de espera antes de um deslocamento espectral [65].
Vários sistemas de molécula única mostraram comportamento de deslocamento induzido

pela luz em baixa temperatura, por exemplo, terrileno em poli(etileno) [66], e terrileno em
uma matriz Shpol'skii [67]. A modificação óptica de espectros de moléculas únicas não
apenas forneceu uma janela única para a fotofísica e a dinâmica de baixa temperatura do
estado amorfo, esse efeito pressagia outra área de interesse atual à temperatura ambiente:
a fotocomutação de moléculas únicas entre formas emissivas e escuras é um ferramenta
poderosa atualmente sendo usada para obter imagens de super-resolução (vide infra).
3. INTERLÚDIO - POR QUE ESTUDAR MOLÉCULAS ÚNICAS?
Antes de continuar com os estudos de temperatura ambiente, é útil relatar algumas das
principais motivações e vantagens dessa abordagem. A espectroscopia de molécula única
(SMS) permite que exatamente uma molécula escondida no fundo de um cristal, polímero,
líquido ou célula seja observada por meio de excitação óptica da molécula de interesse. Isso
representa detecção e espectroscopia no nível de sensibilidade final de ~ 1,66 × 10–24
moles da molécula de interesse (1,66 yoctomol), ou uma quantidade de mols igual ao inverso
do número de Avogadro. A detecção de uma única molécula deve ser feita na presença de
trilhões de solventes ou moléculas hospedeiras.
Para conseguir isso, um feixe de luz (normalmente um laser) é usado para bombear uma
transição eletrônica de uma molécula ressonante com o comprimento de onda óptico, e é a
interação dessa radiação óptica com a molécula que permite que a única molécula seja
detectada. Experimentos bem-sucedidos devem atender aos requisitos de (a) garantir que
apenas uma molécula esteja em ressonância no volume sondado pelo laser e (b) fornecer
uma relação sinal-ruído (SNR) para o sinal de molécula única que é maior do que a unidade
por um tempo médio razoável.
Por que os estudos de uma única molécula são agora considerados como uma parte
crítica da moderna físico-química, física química e biofísica (Figura 12)? Ao remover a média
do conjunto, agora é possível medir diretamente as distribuições de comportamento para
explorar a heterogeneidade oculta. Essa heterogeneidade pode ser estática,
FIGURA 12. Motivações e impacto, com capas de revistas selecionadas do laboratório Moerner.
decorrentes de diferenças na forma como a molécula única interage com o ambiente

próximo (complexo). Ou pode ocorrer no domínio do tempo, surgindo dos estados
internos de uma molécula e as transições entre eles, e o SMS então permite a medição
de vias cinéticas ocultas e a detecção de intermediários raros de vida curta. Como os
rótulos típicos de moléculas únicas têm como pequenas fontes de luz de
aproximadamente 1 a 2 nm de tamanho e podem relatar seu ambiente local imediato,
os estudos de moléculas únicas fornecem uma nova janela para interações em
nanoescala com acesso intrínseco a mudanças dependentes do tempo. A transferência
de energia ressonante de Förster (FRET) com moléculas únicas permite a detecção
de mudanças conformacionais na escala de ~ 5 nm [68]. Como a molécula única
interage com a luz principalmente através do campo eletromagnético local e do
momento dipolar de transição molecular, campos locais aprimorados em estruturas
nanofotônicas metálicas podem ser sondados [69, 70]. O uso de uma única molécula
como fonte de luz de tamanho nm é uma propriedade chave usada na microscopia de
super-resolução, descrita em mais detalhes abaixo após os estudos de SMS à temperatura ambiente sere
Finalmente, moléculas únicas encontraram aplicação comercial, tanto no
sequenciamento de DNA quanto na microscopia além do limite de difração. O impacto
de poder estudar opticamente o menor componente individual em um sistema
complexo é profundo e amplo.
4. ESTUDOS DE TEMPERATURA AMBIENTE DE MOLÉCULAS ÚNICAS
Logo após os primeiros experimentos em baixa temperatura, começaram os estudos de

moléculas únicas à temperatura ambiente. Uma seleção de marcos-chave é descrita na Tabela
1, tanto quanto é do meu conhecimento.
Os primeiros passos surgiram do desenvolvimento da “espectroscopia de correlação de
fuorescência” (FCS) [72, 73], um grande corpo de trabalho que foi amplamente revisado em
[88-90]. O método depende das flutuações na emissão de um ponto fortemente focado na
solução resultante da passagem de moléculas que se difundem através de um feixe de laser.
A análise de autocorrelação da fuorescência fornece uma janela para uma variedade de efeitos
dinâmicos em escalas de tempo menores que o tempo de trânsito na ordem de 1 a 10 ms. A
razão de contraste da autocorrelação se degrada em altas concentrações, mas melhora em
baixas, e em 1990 as funções de correlação foram registradas a partir de concentrações tão
baixas que muito menos de uma molécula estava no volume da sonda [77]. As passagens de
muitas moléculas únicas devem ser
TABELA 1. Marcos de temperatura ambiente de detecção e imagem de molécula única.
Solução: funções de Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

correlação (FCS): Magde, Elson, Webb 1972 [71-74]; Ehrenberg,
Rigler 1974 [75]; Aragão, Pecora 1976 [76]; . . .
Autocorrelação detectada a partir de 1 fuoróforo ou

menos no volume: Rigler, Widengren 1990 [77]
Solução: rajadas únicas Explosões de emissor multicromóforo (ficoeritrina): Peck,

Stryer, Glaser, Mathies 1989 [78]
Explosões únicas de fuorescência de 1 fuoróforo: Shera,

Seitzinger, Davis, Keller, Soper 1990 [79]; Nie, Zare 1994
[80]; . . .
Solução e superfície Anticorpo único com rótulos múltiplos (~80–100):
Hirschfeld 1976 [81]
NSOM de campo próximo, SNOM Imagem de um único fuoróforo: Betzig, Chicester

1993 [82]; Ambrose, Goodwin, Martin, Keller 1994
Imagem
[83]; Xie, Dunn 1994 [84]
Imagem confocal Macklin, Trautman, Harris, Brus 1996 [85]; . . .
Widefeld, imagem In vitro, miosina única em actina: Funatsu, Harada,

de fuoróforo único Tokunaga, Saito, Yanagida 1995 [86]
Membrana celular, rastreamento de lipídio único com

super localização: Schmidt, Schütz, Baumgartner,
Gruber, Schindler 1996 [87]
média; é impossível estudar apenas uma molécula de cada vez por um longo período com
FCS.
Também em 1990, o laboratório Keller em Los Alamos usou um fluxo hidrodinâmico

cuidadosamente projetado para reduzir o volume produzindo sinais de fundo interferentes e
detectou diretamente as explosões de fuorescência individuais à medida que moléculas
individuais de rodamina 6G passavam pelo foco [79]. Este foi um passo fundamental na
redução de fundos, mas há um grande valor em poder observar a mesma molécula única por
longos períodos, medindo a intensidade do sinal, tempo de vida, polarização, flutuações e
assim por diante, tudo em função do tempo e com o propósito expresso de detectar
diretamente qualquer heterogeneidade de molécula para molécula.
Hirschfeld relatou a detecção de um único anticorpo com 80-100 fuoróforos em um breve
relatório muito anterior em 1976 [81], mas o fotobranqueamento e o aparato óptico disponível
na época limitavam o trabalho adicional.
Um marco importante na geração de imagens de moléculas únicas à temperatura
ambiente ocorreu em 1993, quando a microscopia óptica de varredura de campo próximo
(NSOM) foi usada para diminuir o volume bombeado e, portanto, potenciais interferências de fundo [82–
84]. Posteriormente, foi demonstrado que com a preparação cuidadosa da amostra e detecção
ideal, moléculas únicas podem ser fotografadas com técnicas de campo distante, como
microscopia confocal [85], epifuorescência de campo amplo e microscopia de fuorescência
de reflexão interna total [86]. De particular importância para aplicações de biologia celular,
em 1996 Schmidt et al. explorou a difusão de lipídios marcados simples em uma superfície
celular [87]. A explosão de métodos que permitem a detecção e imagem de uma única
molécula levou a uma riqueza de pesquisas interessantes nesta área, com avanços
numerosos demais para uma revisão abrangente [91-93], e dois conjuntos de anais da
conferência Nobel apareceram [94, 95]. ].
4.1 Noções básicas de detecção de molécula única e imagem à temperatura ambiente
Por questões de concretude, é útil neste ponto resumir brevemente a estratégia básica de
detecção usada em estudos modernos de uma única molécula à temperatura ambiente. A
Figura 13 ilustra algumas das ideias-chave para o caso da imagem celular, mas o método
funciona para qualquer tipo de amostra, desde que o experimento seja projetado para reduzir
estritamente o fundo e maximizar a emissão detectada de uma única molécula. Vários livros
e revisões podem ser consultados para detalhes adicionais [96-99]. Normalmente, marcadores
de fuoróforos orgânicos (como TMR: tetrametil rho damina, corantes de cianina como Cy3,
corantes Alexa, etc.) ou marcadores de proteína fluorescente são anexados à biomolécula de
interesse, que pode ser uma proteína, lipídio, açúcar ou um oligonucleotídeo . A luz de
bombeamento normalmente excita os níveis de energia do fuoróforo conforme esboçado no
canto superior direito, na maioria das vezes um singlet-singlet permitido
FIGURA 13. Visão geral da detecção de molécula única e imagem à temperatura ambiente.
Da Ref. [139].
transição. O relaxamento vibracional pode ocorrer antes que a fuorescência seja emitida desviada para
o vermelho para comprimentos de onda mais longos, um recurso útil que ajuda no processo de detecção
– normalmente, filtros de passagem longa são usados para bloquear qualquer luz de bomba espalhada.
O cruzamento intersistema pode ocorrer para estados tripletos, mas geralmente os fuoróforos
são escolhidos para minimizar o tempo em estados escuros, exceto quando é necessário piscar.
Não importa qual microscópio é usado, podemos, sem perda de generalidade, pensar em um
volume de bombeamento limitado por difração, que irradia a amostra em um substrato
tipicamente transparente. De nota é o limite de difração bem conhecido aqui: com óptica de
ÿ microscópio.
campo distante, o ponto focal não pode ser menor que /(2 NA) com NA a abertura numérica do
No visível este limite corresponde a cerca de 250 nm, e o contraste entre o tamanho do ponto
focal e o tamanho das etiquetas de fuorescência (alguns nm) é dramático. No entanto, se a
concentração de moléculas marcadas for mantida baixa, apenas uma molécula é bombeada, e
a fluorescência emitida informa sobre essa molécula marcada em comparação com a

sintonização espectral que seleciona moléculas diferentes em baixas temperaturas, aqui a
diluição por força bruta mantém as moléculas separadas.
Mesmo sem métodos de super-resolução que resolvam emissores densos além do limite
de difração (discutido abaixo), muitos estudos de molécula única foram e continuarão a ser
realizados onde moléculas individuais separadas são fotografadas e observadas ao longo do
tempo. Simplesmente seguir o movimento das moléculas individuais fornece informações sobre
o comportamento das moléculas. Figura 14
FIGURA 14. Imagem selecionada de molécula única e estudos de rastreamento em temperatura ambiente.
De Refs. (a) [158]; (b) [104]; (c) [108]. Fotos (LR): Marija Vrljic, Stefanie Nishimura, Christopher (Kit)
Werley, So Yeon Kim.
ilustra vários exemplos selecionados de experimentos desse tipo no laboratório Moerner do

início dos anos 2000. A Figura 14(a) mostra uma imagem de proteínas MHCII únicas (principais
complexos de histocompatibilidade do tipo II) ancoradas na membrana plasmática de uma
célula CHO (ovário de hamster chinês). Um peptídeo antigênico de alta afinidade foi marcado
com um único fuoróforo para iluminar as moléculas MHCII, e um vídeo de fuorescência em
tempo real do movimento dessas moléculas mostra a incrível dança dos MHCII que ocorre na
superfície das células vivas. As propriedades difusas do movimento e a influência do colesterol

foram estudadas por meus alunos em colaboração com Harden McConnell [100-103].
Para dar um exemplo de ciência dos materiais, a Figura 14(b) mostra uma imagem de
fuorescência de moléculas únicas de terrileno em um cristal de p-terfenil revestido por spin [104].
Uma inspeção minuciosa da imagem mostra que algumas moléculas são pequenos anéis,
enquanto outras são pontos não estruturados. Os anéis podem ser entendidos como os
dipolos orientados z esperados [105], que estão localizados em regiões cristalinas bem
ordenadas da amostra. Mas mais informações podem ser encontradas observando as imagens
em função do tempo, veja as Informações de Apoio da Ref. [104]. Surpreendentemente,
mesmo neste cristal à temperatura ambiente, os pontos não estruturados se movem, com
difusão altamente tendenciosa ao longo de linhas horizontais e verticais na amostra. Essas
moléculas isoladas provavelmente estão se movendo nas rachaduras da amostra;
assim, os movimentos de uma única molécula podem ser usados para visualizar os defeitos
no cristal.
Como exemplo final do poder do rastreamento de uma única molécula, há mais de uma
década, a emissão brilhante e vermelha de moléculas únicas de proteína fuorescente amarela
aprimorada (EYFP) levou ao seu uso como um rótulo para fusões. a proteínas interacelulares
no laboratório de Moerner em colaboração com o laboratório de oratória de Lucy Shapiro e
Harley McAdams [1051 ÿ2]. O organismo primário de interesse foi o Caulobacter crescentus,
porque as células deste organismo apresentam divisão assimétrica no ciclo celular: uma
célula filha tem um fagello enquanto a outra tem um pedúnculo com uma extremidade
pegajosa. Isso significa que as células têm um programa genético que faz com que diferentes
grupos de proteínas apareçam nas duas células filhas diferentes, e entender esse processo
contribuiria para o problema geral de compreensão do desenvolvimento [106, 107]. O efeito
básico surge da padronização espacial das proteínas reguladoras, o que leva a muitas
questões interessantes: como as proteínas realmente produzem padrões, como esses padrões
levam a diferentes fenótipos nas células filhas e assim por diante. A Figura 13(c) mostra o
que observamos para fusões simples de EYFP à proteína citoesquelética MreB em células
vivas [108]. Uma população de moléculas MreB estava se difundindo como esperado no
citoplasma. No entanto, em uma longa escala de tempo, imagens de lapso de tempo
mostraram moléculas únicas em movimento claro direcionado ao longo de trilhas lineares em
um padrão circunferencial ao redor da borda da célula. A figura mostra rastros de moléculas
únicas em células diferentes, e enquanto essa observação foi inicialmente pensada para
envolver a esteira de flamentes, esse comportamento provavelmente está associado a
moléculas MreB interagindo com a maquinaria de síntese da parede celular [109].
4.2 Em direção à super-resolução: a ideia-chave nº 1 é a superlocalização de emissores de

molécula única
Estamos agora em uma boa posição para abordar a microscopia de super-resolução com
moléculas únicas diretamente. Como é bem conhecido, a microscopia de fuorescência
biológica se beneficia de uma variedade de técnicas de marcação que iluminam diferentes
estruturas nas células, mas o preço muitas vezes pago pelo uso da luz visível é a resolução
espacial relativamente baixa em comparação com a microscopia de raios X ou eletrônica.
Aqui, “resolução” é usada no sentido preciso para significar a capacidade de distinguir dois
objetos que estão próximos. O problema básico mencionado brevemente acima é que em
microscópios convencionais de campo distante, o limite de difração fundamental de Abbe (DL)
ÿ óptico
[110] restringe a resolução a um valor de aproximadamente o comprimento de onda dividido
por duas vezes a abertura numérica (NA) da imagem. sistema, /(2 NA). ÿ
Uma vez que os maiores valores de NA para imersão de última geração e altamente corrigida
as objetivas do microscópio estão na faixa de cerca de 1,3 a 1,6, a resolução espacial da

imagem óptica foi limitada a cerca de ~ 200 a 250 nm para luz visível de comprimento de
onda de ~ 500 nm.
Na verdade, a luz de rótulos moleculares fluorescentes únicos com cerca de 1 a 2 nm
de tamanho fornece uma maneira de contornar esse problema, ou seja, uma maneira de
fornecer “super-resolução”, ou resolução muito melhor do que o limite de difração.
(Microscopia de depleção de emissão estimulada (STED [111]) e microscopia de
iluminação estruturada (SIM [112]) são outros métodos que ultrapassam o DL, mas não
requerem moléculas únicas e são discutidos por Stefan Hell e Eric Betzig em outro lugar.)
ajuda? O esboço na Figura 13 ilustrou o problema típico de imagem à temperatura
ambiente: a única molécula é muito menor do que o ponto de laser focalizado, mas, se
apenas uma molécula for bombeada, as informações relacionadas a uma molécula
individual e seu “nanoambiente” local podem ser extraído pela detecção dos fótons dessa
molécula sozinha [45]. Em termos de resolução espacial, no entanto, quando a imagem é
formada, o “pico” observado de uma única fonte de luz em nanoescala mapeia a função
de espalhamento de ponto limitado por difração (PSF) do microscópio, porque a molécula
é uma absorvedor de luz em nanoescala, muito menor que o tamanho do PSF.
(Rigorosamente, a única molécula emissora não é estritamente uma fonte pontual, mas
sim um emissor dipolo [113], mas essa sutileza não é importante para esta discussão.)
Se muitos emissores estão decorando uma estrutura, os PSFs se sobrepõem para formar
uma imagem borrada que é fundamentalmente “fora de foco”.
FIGURA 15. Os conceitos centrais por trás da superlocalização de emissores de uma única molécula.
Este problema foi resolvido de forma direta por Betzig em 2006 [114], simplesmente
impedindo que todas as moléculas emitissem ao mesmo tempo e realizando imagens
sequenciais (ver Seção 4.4 abaixo). Por simplicidade pedagógica, descreverei as ideias
básicas em sua forma mais simples para enfatizar que o problema pode ser resolvido de
maneira geral. Basta seguir dois passos principais: primeiro, deve-se ser capaz de adquirir a
imagem de uma única molécula e localizar sua posição com precisão muito melhor do que a
largura do PSF, um processo que pode ser chamado de “superlocalização”. A segunda
etapa, controle ativo da concentração emissora, será então descrita na Seção 4.4.
A Figura 15 ilustra os conceitos básicos de superlocalização de moléculas únicas. Para

fazer uma analogia, qualquer pessoa pode caminhar até o topo do cone de cinzas no centro
de Crater Lake, Oregon (Fig, 15(a)) e ler as coordenadas GPS da posição da montanha.
Essa ideia é aplicada efetivamente a emissores de uma única molécula: simplesmente
medindo a forma do PSF, a posição de seu centro pode ser determinada com muito mais
precisão do que a largura do PSF. Por exemplo, com uma imagem de campo amplo de
moléculas únicas na Fig, 15(b), os pontos limitados por difração são evidentes. É essencial
espalhar cada ponto detectado em vários pixels da câmera, conforme mostrado na Fig. 15(c).
Dez, ilustrados por uma seção transversal 1D na Fig. 15(d), os vários pixels detectam
diferentes números de fótons de acordo com a forma do PSF. Formalmente, a PSF é uma
função de Airy, mas pode ser aproximada por uma função gaussiana por simplicidade,
especialmente na presença de fundo. Os números de fótons detectados nos vários pixels
fornecem amostras da função, que podem ser ft matematicamente. Enquanto a largura deste
ft ainda é limitada por difração com largura wÿ, a estimativa da posição central ÿ segue uma
distribuição de erro muito mais estreita com desvio padrão que é geralmente chamado de
“precisão de localização”. A precisão com que uma única molécula pode ser localizada
ÿ , digitalizando o PSF
depende fundamentalmente do processo de Poisson de detecção de fótons, então a variável
mais importante é o número total de fótons detectados acima do N de fundo, com uma
dependência mais fraca do tamanho do detector pixels e fundo [115–117]. A dependência
principal de é apenas o limite de Abbe dividido pela raiz quadrada do número de fótons
ÿ
detectados. Essa forma funcional faz sentido, pois cada fóton detectado é uma estimativa da
posição molecular, portanto, para N medições, a precisão melhora conforme o esperado. A
superlocalização significa que, se forem detectados 100 fótons, a precisão pode se aproximar
de 20 nm e assim por diante. Claramente, então, os emissores com o maior número de
fótons emitidos antes do fotobranqueamento são preferíveis.
Ajustar imagens para encontrar a posição central de um objeto não é um conceito

novo na ciência, tendo sido aplicado à análise de dados experimentais há algum tempo [121].
De fato, Heisenberg sabia em 1930 que a melhoria da resolução melhorava
TABELA 2. Aplicações iniciais de superlocalização de objetos únicos em imagens biológicas.
Encontre o centroide de um LDL (partículas de lipoproteína de baixa densidade com muitos

grande objeto fuorescente rótulos) na superfície celular: Barak, Webb 1982 [118]
Contagem de 190 nm acionada por motor de cinesina de

rastreamento com precisão de poucos nanômetros: Gelles, Schnapp,
Sheetz 1988 [119]
Encontre a posição de um Membrana celular, rastreamento de lipídio único com precisão

único fuoróforo de 30 nm:
Schmidt, Schütz, Baumgartner, Gruber, Schindler 1996 [87]
Partícula de vírus única em HeLa Cell com precisão de

40 nm:
Seisenberger, . . . Bräuchle 2001 [120]
um sobre a raiz quadrada do número de fótons detectados [122]. Para ser mais concreto, esta discussão
será restrita a imagens biológicas, e a Tabela 2 lista algumas das primeiras aplicações de meu conhecimento.
Os primeiros casos aplicaram a ideia a objetos maiores que o limite de difração, como uma partícula de LDL
[118] ou uma conta fuo rescente [119], e então a localização determinada é apenas a posição do centróide
do objeto grande. Mais interessante para a presente discussão é o caso quando um único fuoróforo está
emitindo, e esse tipo de superlocalização foi usado pela primeira vez para rastrear lipídios únicos com precisão
de 30 nm por Schmidt et al. [87].
Um exemplo celular subsequente abordou o rastreamento de partículas de vírus únicos no processo de
entrada celular [120]. Como outro exemplo de um estudo in vitro, a digitalização do PSF para moléculas
únicas de miosina marcadas de forma fluorescente Cy3 foi usada para extrair informações de posição até
alguns nm por Yildiz et al. [123], e uma nova sigla foi proposta (FIONA, for Fluorescence Imaging with One
Nanometer Accuracy). O conhecimento de que a mesma molécula está emitindo todos os fótons detectados
significa que uma correlação N-fótons está sendo medida; desde que os fótons sejam independentes, a
mesma análise se aplica. Quando estados de fótons mais complexos puderem ser usados no futuro, a
situação mudará.
4.3 Surpresas para moléculas únicas de proteínas fuorescentes: piscar e fotocontrole
Outra tendência empolgante na década de 1990 foi o advento de proteínas fluorescentes verdes expressas
geneticamente, uma área de grande importância para a biologia molecular e celular que acabou por ganhar
o Prêmio Nobel de Química para Osamu Shimomura, Martin Chalfe e Roger Y. Tsien em 2008 [ 124]. De fato,
tendo acabado de deixar a IBM em 1995 para a Universidade da Califórnia, em San Diego, pude
ampliar meus interesses em moléculas únicas para incluir estudos de biologia e temperatura
ambiente. Meu pós-doutorado, Robert Dickson, e eu trabalhamos pela primeira vez para
conseguir a imobilização parcial de pequenas moléculas orgânicas em ambientes aquosos
usando os poros cheios de água de géis de poli(acrilamida) [125]. Dez em 1996, observando
os eventos de movimento rápido com proteínas fuorescentes, tive a oportunidade de obter
amostras de uma nova proteína mutante fuorescente amarela (YFP) de Andy Cubitt no
laboratório de Roger Tsien. Ao contrário do GFP, que tem duas bandas de absorção e sofre
transferência de prótons no estado excitado da banda de comprimento de onda mais curto
para a forma de comprimento de onda mais longo antes da emissão [126], o YFP foi projetado
para estabilizar a forma de comprimento de onda longo e poderia ser bombeado com um das
nossas linhas de laser de íon Ar+ a 488 nm. Robert Dickson e eu então começamos a ver se
podíamos detectar e criar imagens de cópias únicas do YFP à temperatura ambiente. Usando
microscopia de fuorescência de reflexão interna total (TIRF), Rob foi capaz de registrar as
primeiras imagens de proteínas fuorescentes individuais em um gel em 1997 [2] como mostrado na Figura 16(a).
Esses primeiros experimentos também renderam o primeiro exemplo de um interruptor
óptico de molécula única à temperatura ambiente [2] e os primeiros detalhes do caráter
fotofísico de variantes de GFP no nível de cópia única. Os experimentos, na verdade, utilizaram
duas variantes GFP red-shifted (S65G/S72A/T203Y denotado “T203Y” e S65G/
S72A/T203F denotado “T203F”) que diferem apenas pela presença de uma hidroxila
FIGURA 16. Imagem (b), piscando (b) e fotorecuperação induzida por luz ou comutação
(c,d) para YFP único. Foto: Rob Dickson. Da Ref. [2].
grupo próximo ao cromóforo, ambos bastante semelhantes à proteína fuorescente amarela

aprimorada amplamente utilizada EYFP (S65G/V68L/S72A/T203Y). Em particular,
apareceu um fascinante e inesperado comportamento de piscar, discernível apenas no
nível de uma única molécula (veja o plano de fundo da Fig.16(b) para uma série de
imagens de fuorescência de uma molécula, por exemplo). Esse comportamento de piscar
provavelmente resulta de transformações entre pelo menos dois estados do cromóforo (A
e I, Fig. 16d), dos quais apenas um (A) é capaz de ser excitado pelo laser de bombeamento
de 488 nm e produzir fuorescência. Além disso, um estado escuro N de vida muito mais
longa foi observado após irradiação prolongada. Termicamente estável no escuro por
muitos minutos, esse estado escuro de longa duração não foi realmente fotobranqueado
permanentemente, mas descobrimos que um pouco de luz de uma lâmpada a 405 nm
regeneraria o estado fuorescente original, conforme mostrado na sequência de imagens
na Fig. 16(c). Isso significa que a proteína pode ser usada como um marcador emissor até
entrar no estado escuro de longa duração, e então pode ser foto-restaurada de volta à
forma emissiva com a luz de 405 nm, uma reversão do fotobranqueamento aparente.
Quando Rob e eu observamos essa restauração piscante e induzida pela luz para cópias
únicas do YFP, o pensamento na época era a possibilidade de que a troca de fotos
pudesse ser usada para armazenamento óptico, e uma patente foi concedida.
A capacidade de controlar opticamente os estados emissores de proteínas
fuorescentes expandiu-se rapidamente, à medida que outros pesquisadores ao redor do
mundo projetaram muitas novas proteínas fuorescentes fotocomutáveis (como Kaede
[127], PA-GFP [128], EosFP [129] e DRONPA [130] ]). Essas moléculas interessantes
com nomes coloridos logo desempenhariam um papel crítico na ideia-chave final que
levou à microscopia de super-resolução.
4.4 Ideia-chave nº 2: Controle ativo da concentração emissora e imagem sequencial
A superlocalização funciona bem quando as moléculas são separadas espacialmente,

mas o que pode ser feito quando elas se sobrepõem no mesmo volume? Como a
resolução espacial dessas imagens borradas pode ser melhorada? Vale a pena lembrar
que a espectroscopia de baixa temperatura e alta resolução descrita na Seção 2 acima
forneceu uma pista potencial para este problema: mesmo dentro do mesmo ponto limitado
de difração, muitas moléculas diferentes podem ser facilmente selecionadas separadamente
simplesmente ajustando o laser - a frequência de ressonância era uma variável de controle
que efetivamente ligava e desligava as moléculas para que não interferissem. Mas
simplesmente não estávamos pensando em resolução espacial no início dos anos 1990,
porque tínhamos bastante resolução espectral! Ao mesmo tempo, em meados da década
de 1990, avançava-se em direção a métodos gerais de resolução do problema de
resolução espacial, conforme resumido na Tabela 3.
TABELA 3. Passos para a super-resolução com emissores de molécula única. Para siglas, consulte
[139].
Use alguma variável de controle adicional para separar os pontos DL na

Proposta chave dimensão espacial – sintonização espectral sugerida: E. Betzig 1995 [131]
Baixa T Afinação espectral usada para alcançar super-resolução 3D:
40 nm lateral, 100 nm axial para várias moléculas únicas
A. van Oijen, J. Köhler, J. Schmidt, M. Müller, GJ Brakenhof 1998 [132, 133]
Sala T Imagens multicoloridas de sondas fluorescentes únicas: TD Lacoste, X.

Michalet, F. Pinaud, DS Chemla, AP Alivisatos, S. Weiss 2000 [1331 /2]
Distinguir dois corantes por tempo de vida de fuorescência:
M Heilemann, DP Herten, R Heintzmann, C Cremer, C Müller, P

Tinnefeld, KD Weston, J. Wolfrum, M. Sauer 2002 [134]
Use fotobranqueamento de fuores sobrepostos:
CAMARÃO: MP Gordon, T. Ha, PR Selvin 2004 [135]
NALMS: X. Qu, D. Wu, L. Mets, NF Scherer 2004 [136]
Duas sondas de cores diferentes:
SHREC: LS Churchman, Z. Oekten, RS Rock, JF Dawson, JF

Spudich 2005 [137]
Piscando de pontos quânticos semicondutores:
KA Lidke, B. Rieger, TM Jovin, R. Heintzmann 2005 [138]
Em 1995, depois de passar anos desenvolvendo imagens ópticas de campo próximo no Bell Labs,
Eric Betzig escreveu um artigo seminal observando que uma variável de controle que distingue
moléculas ao longo de outra dimensão poderia ser usada para microscopia de super-resolução, e ele
sugeriu o uso de muitas moléculas com cores diferentes, como nos estudos de baixa temperatura [131].
Posteriormente, em 1998, Antoine van Oijen et al. demonstraram experimentalmente essa ideia
diretamente: eles usaram a sintonização espectral em baixas temperaturas para resolver espacialmente
um conjunto de moléculas únicas em três dimensões, com resolução lateral de 40 nm e axial de 100
nm, muito abaixo do limite de difração óptica [132, 133]. Claro, as aplicações biológicas só poderiam se
tornar generalizadas se o problema pudesse ser resolvido à temperatura ambiente, e os pesquisadores
continuaram a experimentar novas ideias para resolver moléculas próximas.
Imagens multicoloridas de contas de cores diferentes ou pontos quânticos foram usadas para super-
resolver um punhado de emissores próximos [1331 ÿ2]. Outra estratégia

envolveu o uso das diferenças de tempo de vida de fuorescência entre as sondas

para separá-las [134], demonstrado para dois corantes espaçados de 30 nm. Outras
estratégias usaram fotobranqueamento natural – eventualmente todas as moléculas
irão branquear, exceto uma. Adicionando ainda mais à coleção explosiva de siglas,
essa ideia básica foi demonstrada por Gordon et al. para marcadores Cy3 no DNA
[135] (SHRImP, para imagem de alta resolução de molécula única com
fotobranqueamento) e por Qu et al. usando sondas de PNA marcadas com Cy3 no
DNA [136] (NALMS, para microscopia de fuorescência de molécula única localizada
Múltipla Nanometer). Ao visualizar separadamente dois fuoróforos (Cy3 e Cy5) ligados
a duas moléculas de calmodu lin diferentes que se ligam às “pernas” da mesma
molécula única de miosina V, foram alcançadas medições de distância com precisão
de ~ 10 nm, e um outro acrônimo foi gerado [137, 140] (SHREC, para Colocalização
de Alta Resolução de Molécula Única de Sondas Fuorescentes). Lidke et ai. mostrou
que um certo grau de super-resolução além do limite de difração também pode ser
alcançado com o piscar de pontos quânticos de semicondutores fuorescentes [138].
O palco estava agora montado para que vários conceitos fossem reunidos para
produzir um método geral para microscopia de super-resolução com moléculas únicas,
e a Idéia-chave #2 é ilustrada na Figura 17. Uma estrutura foi rotulada com muitos
rótulos fuorescentes, como mostrado à esquerda, e quando todos podem emitir
simultaneamente, a imagem borrada resulta porque os muitos PSFs se sobrepõem. A
ideia chave é simplesmente não permitir que todas as moléculas emitam ao mesmo
tempo! Suponhamos que exista algum mecanismo que permita aos emissores fazer parte de
FIGURA 17. O controle ativo da concentração de emissão leva à cópia de micros de

super-resolução. Ref. [155].
o tempo e emitindo fótons, e de, ou escuro, outra parte do tempo. O experimentador usa
esse mecanismo para controlar ativamente a concentração de moléculas emissoras a um
nível muito baixo, de modo que os PSFs não se sobreponham. Dez usando superlocalização
em uma imagem adquirida das moléculas, as posições dessas são determinadas e
registradas. Dez dessas moléculas são desativadas ou fotobranqueadas, e outro subconjunto
é ativado, superlocalizado, etc. beacons”, e a imagem subjacente é reconstruída de maneira
pontilhista para mostrar os detalhes anteriormente ocultos além do limite de difração,
conforme mostrado à direita. Efetivamente, então, as posições moleculares de ping
sobrepostas são determinadas por multiplexação no domínio do tempo.
Ouvi pela primeira vez sobre essa ideia de Eric Betzig e seu principal colaborador,
Harald Hess, em abril de 2006 na Conferência Frontiers in Live Cell Imaging no campus
principal do NIH em Bethesda, Maryland. Eles usaram as proteínas fuorescentes PA-GFP de
George Patterson e Jennifer Lippincott-Schwartz [128] e outras proteínas fuorescentes
fotocomutáveis como um mecanismo de controle ativo, denominando o método PALM (para
Microscopia de Localização Fotoativada) [114]. A fotoativação induzida por luz de fusões
mutantes de GFP é usada para ativar aleatoriamente apenas algumas moléculas únicas de
cada vez em seções de células fixas ou células fixas. Em seu experimento de tour de force,
PSFs individuais foram registrados em detalhes para encontrar suas posições em ~ 20 nm,
depois foram fotobranqueados para que outros pudessem ser ativados e assim por diante
até que muitos milhares de posições de PSF fossem determinados e uma super-resolução
reconstrução foi produzida.
Muito rapidamente após a reunião do NIH, um grupo de pesquisadores demonstrou
imagens de super-resolução com moléculas únicas usando mecanismos de controle ativo
adicionais e siglas adicionais. O laboratório de Xiaowei Zhuang utilizou fotoscomutação
controlada de fuoróforos de pequenas moléculas para demonstrações de super-resolução
[141] (STORM, para STochastic Optical Reconstruc tion Microscopy). Seu método original
usava um par de emissores Cy3-Cy5 nas proximidades que mostra uma nova propriedade:
a restauração da emissão fotobranqueada de Cy5 pode ser alcançada por um breve
bombeamento da molécula Cy3. Dessa forma, a emissão de um único Cy5 no DNA ou em
um anticorpo é ativada pelo bombeamento de Cy3 e por fotobranqueamento, repetidas
vezes, para medir sua posição com precisão várias vezes. Após muitas dessas determinações,
a precisão da localização pode se aproximar de ~20 nm de precisão, e anticorpos marcados
(marcados com >1 Cy3, <<1 Cy5) foram usados para localizar proteínas RecA ligadas ao
DNA. Samuel Hess et ai. publicou uma abordagem semelhante à de Betzig com um acrônimo
denominado F-PALM (Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy) [142], que
também utilizou um GFP fotoactivável com localização PSF para obter superresolução.
Também em 2006, uma abordagem alternativa foi relatada pelo laboratório de Robin
Hochstrasser com base na ligação acumulada de sondas difusíveis, que são extintas em
solução, mas desativadas nas proximidades da superfície do objeto a ser fotografado
[143] (denominado PAINT, para Acumulação de Pontos para Imagens em Topografia em
Nanoescala). O método baseia-se no comportamento fotofísico de certas moléculas que
acendem quando ligadas ou restringidas, e eles demonstraram a ideia com o estado de
transferência de carga intermolecular torcida (TICT) do Nilo Red [144]. O PAINT tem a
vantagem de que o objeto a ser fotografado não precisa ser rotulado e que muitos
fuoróforos individuais são usados para a imagem, relaxando assim a exigência do número
total de fótons detectados de cada molécula.
Outros mecanismos de controle ativo apareceram rapidamente, como dSTORM [145]

(STORM direto), GSDIM (Ground-State Depletion with Intermittent Return) [146], piscando
como na microscopia BLINK [147], SPDM (Spectral Precision Determination Microscopy)
[ 148], e a lista continua. Em 2008, Julie Biteen em meu laboratório usou o mecanismo de
fotorrecuperação EYFP descrito acima para realizar imagens de super-resolução em
bactérias [149], mas como não criamos uma nova sigla para isso, o trabalho não recebeu
tanta atenção. Portanto, para adicionar jocosamente um novo acrônimo ao campo que é
independente de mecanismo, meu laboratório usa informalmente o acrônimo SMACM,
que significa Microscopia de Controle Ativo de Molécula Simples. De qualquer forma, a
ideia-chave subjacente é muito geral, e o PALM liderou o caminho. Existem métodos
fotoquímicos para ativação de um único róforo [150] e até métodos enzimáticos para
ativação que podem ser controlados pela concentração do substrato e pela taxa enzimática
[151]. O experimentador deve escolher ativamente usar algum método para controlar a
concentração emissora. É claro que a imagem ainda é sequencial no tempo, portanto,
essa abordagem é melhor para estruturas quase estáticas ou células fixas, mas um
progresso significativo foi feito no aumento da velocidade da imagem [152]. Revisões
selecionadas podem ser consultadas para detalhes adicionais dos desafios e progressos
modernos [153–161].
4.5 Aplicações e desenvolvimentos de microscopia de super-resolução do Laboratório Moerner
Desde o início dos anos 2000, meu laboratório no Departamento de Química de Stanford
tem uma colaboração frutífera com o laboratório de microbiologia e biologia do
desenvolvimento de Lucy Shapiro para usar imagens avançadas de moléculas únicas
para explorar padrões reguladores de localização de proteínas em uma bactéria
particularmente interessante, Caulobacter crescentus. Como as bactérias são muito
pequenas, com apenas alguns mícrons de comprimento e submícrons de diâmetro, o
tamanho de todo o organismo está próximo do limite de difração óptica e a microscopia de super-resolução po
com grande vantagem. Assim, como mencionado na última seção, em 2007 começamos
a imagem de super-resolução de molécula única em bactérias e aproveitamos a
recuperação fotoinduzida e/ou piscar de EYFP único que descobrimos em 1997 [2] como
um mecanismo de controle ativo . A Figura 18 ilustra como os dados brutos realmente
aparecem: A Fig. 18(a) mostra uma imagem de transmissão de luz branca de um campo
de células, e a Fig. 18(b) mostra um único quadro de fuorescência após a descoloração inicial.
A partir de muitos quadros de 10 a 50 ms, como esses, a superlocalização é realizada
para extrair localizações de moléculas únicas e as reconstruções de super-resolução
podem ser geradas.
A Figura 19 ilustra algumas das imagens de super-resolução de três de nossos
estudos de Caulobacter nos últimos anos. A linha superior mostra o que seria observado
com imagens de fuorescência convencionais limitadas por difração, e a linha inferior
mostra imagens de super-resolução SMACM das mesmas células. Em cada coluna, uma
proteína alvo diferente foi fundida ao EYFP. A coluna 1 mostra os resultados de imagem
do meu pós-doutorado na época, Julie Biteen, sobre a proteína do citoesqueleto MreB que
parece formar uma estrutura quase helicoidal [149]. (Trabalhos posteriores notaram que a
forma helicoidal é provavelmente um artefato da construção de proteína fuorescente que
foi usada [162]. A imagem de super-resolução naturalmente fornece maior resolução que
permite que tais efeitos sejam observados, portanto, cuidados adicionais devem ser
tomados agora para proteger contra a perturbação da rotulagem e para desenvolver rótulos melhorados.)
A coluna 2 mostra os resultados da proteína ParA gerados por uma colaboração entre
Je rod Ptacin do laboratório de Lucy e meu pós-doc, Steven Lee [163]. Envolvido no
processo de segregação cromossômica, o ParA localiza-se em uma estreita estrutura
linear ao longo do eixo da célula, que retrocede durante a translocação da origem
cromossômica do polo antigo para o novo polo. Por fim, coluna
FIGURA 18. Dados brutos mostrando o piscar de fusões de EYFP simples para uma proteína alvo em
bactérias Caulobacter. (a) Imagem de transmissão de luz branca. (b) Quadro único de 10 ms de imagem
de fuo rescência, barra de escala de 5 mm.
3 mostra dados de células fixas para a proteína de ligação a nucleóides HU2, do trabalho
de Steven Lee e do estudante de pós-graduação Mike Tompson [164]. Como o HU2 se
liga não especificamente a muitos locais no cromossomo, as localizações aqui fornecem
informações úteis sobre a distribuição do DNA dentro da célula que pode ser analisada
com estatísticas de pontos espaciais. No geral, essas imagens mostram como a imagem
de super-resolução é importante para fornecer detalhes que não podiam ser observados
antes, e a imagem de super-resolução é amplamente usada para bactérias atualmente
[165-167].
Claro, imagens de super-resolução em células eucarióticas também são uma grande
área de interesse atual. Na Figura 20, incluo um exemplo do meu laboratório utilizando
um novo método de obtenção de controle ativo, que pode ser chamado de PAINT
específico do alvo, possibilitado por uma colaboração com o laboratório de química
sintética de Justin Du Bois em Stanford [168]. Alison Ondrus, pós-doutoranda no
laboratório Du Bois, foi capaz de sintetizar a potente molécula de neurotoxina mostrada
na Figura 20, a toxina saxi (STX), com um rótulo fuorescente ligado covalentemente,
como Cy5. Dado esse ligante fluorescente que se liga e bloqueia os canais de sódio
dependentes de voltagem (NaV) , foi então possível para meu aluno de pós-graduação,
Hsiao-lu Lee, e um acadêmico visitante, Shigeki Iwanaga, cultivar células PC12 em uma
superfície de lamínula, induzi-los a diferenciar-se em células neurais, e então
simplesmente fornecer o STX Cy5 para a solução acima das células. Os ligantes em
solução não são facilmente visualizados devido ao seu movimento rápido. A difusão traz o STX-Cy5 para a s
FIGURA 19. Imagens de super-resolução de três proteínas diferentes em Caulobacter:

MreB [149], ParA [163], HU2 [164]. Fotos LR: Julie Biteen, Steven Lee, Mike Tompson.
onde a molécula se liga aos canais NaV e fornece um ponto fluorescente brilhante para
super-localização. O marcador então fotobranqueia e se dissocia da célula, permitindo que
novos ligantes se liguem. Ao gravar um filme fluorescente, muitas localizações de moléculas
únicas podem ser continuamente gravadas e agrupadas para formar uma reconstrução de
super-resolução das localizações dos canais na membrana celular. A Figura 20 mostra dados
registrados de projeções axonais, onde os painéis à direita comparam reconstruções
limitadas por difração e super-resolução. Ao agrupar todas as localizações em um intervalo
de 6,25 s, a sequência de imagens à esquerda mostra como a célula muda ao longo do
tempo, com várias extensões neuríticas de subdifração crescendo e retraindo. Também foi
possível gravar imagens dependentes do tempo em uma escala de tempo de 500 ms por
média deslizante de vagão (ver SI da Ref. [168].) Assim, com este método, um grau razoável
de comportamento dependente do tempo pode ser observado, bem além do limite de difração.
Outra aplicação recente de PALM/SMACM para células eucarióticas envolveu imagens

de estruturas agregadas de proteína Huntingtina (Htt) nas células. A proteína Htt leva à
doença neurodegenerativa de Huntington quando a sequência de repetição de poli(glutamina)
é expandida. Imagens de super-resolução das estruturas agregadas foram fotografadas in
vitro pelo meu aluno de pós-graduação Whitney Duim [169, 170]. Em uma colaboração com
o laboratório de Judith Frydman em Stanford, meu pós-doutorado Stefen Sahl e o estudante
de pós-graduação Lucien Weiss cultivaram células de modelo neuronal PC12m transfectadas
com a forma mutante do exon 1 da proteína Htt fundida com EYFP e imagens da fuorescência
de células fixas e vivas em vários pontos de tempo
FIGURA 20. Exemplo de imagem celular de super-resolução usando um ligante de saxitoxina

fuorescente que se liga a canais iônicos na superfície da célula. Barra na sequência esquerda: 5
mícrons. Da Ref. [168]. Fotos: Hsiao-lu Lee, Shigeki Iwanaga.
pós-transfecção [171]. Um fator crítico para o sucesso desses experimentos foi o

fotobranqueamento direcionado do corpo de inclusão extremamente brilhante (IB)
antes da imagem de molécula única do EYFP piscante. Desta forma, foi possível
observar pequenas espécies agregadas no corpo celular como mostrado na Figura
21(a), com reconstruções de super-resolução de contraste reverso mostrando que
estas são pequenas estruturas fibrilares. Em projeções semelhantes a axonais das
células (Figura 21 (b)), várias espécies de pequenos agregados também são
observadas com detalhes de super-resolução. Não é totalmente conhecido no
momento se essas pequenas espécies agregadas são ou não tóxicas ou o produto
do processamento celular para removê-las, mas ser capaz de visualizar e quantificar
tais estruturas é um começo importante para entender o mecanismo da doença, e
este método está sendo aplicado a outros distúrbios neurodegenerativos.
Para encerrar este breve resumo de imagens de super-resolução com moléculas
únicas, quero mencionar alguns dos desafios pendentes e direções atuais de
desenvolvimento, usando as ilustrações na Figura 22. Uma área é a necessidade de
melhores fuoróforos, especificamente moléculas com a capacidade de ser ligado (e
desligado) à vontade, com mais fótons emitidos do que os disponíveis em proteínas
fluorescentes, por exemplo. Moléculas orgânicas pequenas geralmente oferecem dez
vezes mais fótons totais emitidos do que proteínas fluorescentes e podem ser menos
perturbadoras, então combinar tais moléculas com um mecanismo fotoquímico ou
fotofísico para ativação seria preferível. (Claro, também é necessário
FIGURA 21. Imagem de super-resolução de agregados fibrilares Htt em células. (a) Corpo celular,
com barra de escala de 550 nm nas imagens inferiores. (b) Processos axonais. Barra de escala 5
mícrons nas imagens superiores, 500 nm abaixo. Fotos: Stefen Sahl, Lucien Weiss. Da Ref. [171].
para direcionar tais moléculas para biomoléculas apropriadas, e muito esforço está
acontecendo nessa área também.) O lado esquerdo da Figura 22 mostra uma espirolactama
rhoda mine rhoda que foi modificada por Prabin Rai no laboratório de meu colaborador
sintético, Robert Twieg na Kent State University, para sofrer ativação fotoinduzida pela
abertura do anel lactâmico com luz azul em vez de luz ultravioleta [172]. Usando um derivado
de N-hidroxissuccinimida, minha estudante de pós-graduação Marissa Lee ligou
covalentemente essas moléculas à superfície de células vivas de Caulobacter e, em seguida,
gravou imagens de super-resolução da superfície celular.
As imagens na parte inferior mostram que este método produz excelentes reconstruções
com muitas localizações, e as hastes bacterianas do tamanho de subdifração de comprimentos
variados são facilmente observadas e quantificadas.
Outra área de intenso interesse atual é a extensão da microscopia de super-resolução
além de duas dimensões transversais espaciais para três dimensões, x, y e z. Embora alguns
pesquisadores tenham buscado imagens astigmáticas [173], imagens multiplanares [174,
175] ou outras abordagens, meu laboratório concentrou-se em métodos avançados de
processamento óptico de Fourier no plano pupilar [176] para codificar a posição z de
moléculas únicas na forma do próprio PSF. Nosso primeiro passo nesta área foi em
colaboração com Rafael Piestun da Universidade do Colorado para demonstrar que a função
de propagação de ponto de dupla hélice (DH-PSF) pode ser usada para microscopia de
molécula única [177]. O lado direito da Figura 22, painel superior, mostra que a operação DH-
PSF converte o ponto único usual de um
FIGURA 22. Novos fuoróforos fotocomutáveis aplicados a imagens bacterianas (esquerda)

e imagens 3D baseadas no DH-PSF (direita). Foto: Marisa Lee. Da Ref. [172].
uma única molécula em dois pontos que giram em torno um do outro, dependendo da
posição z da molécula na amostra. O ângulo da linha entre os dois pontos codifica a
posição z simultaneamente para todas as moléculas no quadro em uma profundidade de
campo de 2 mícrons. Essa abordagem tem informações de Fisher superiores e, portanto,
melhor precisão de localização do que outras abordagens [178], e usamos o DH-PSF em
duas cores para co-imagem duas fusões de proteínas fuorescentes diferentes em
Caulobacter [179] [159]. A metade inferior da Figura 22 mostra a aplicação do método DH-
PSF para imagens de superfície 3D de Caulobacter
marcado pela rodamina espirolactama [172]. Ainda há muito a ser feito, à medida que
novos projetos de função de dispersão de pontos continuam a aparecer [180-182], com o
objetivo contínuo de extrair o máximo de informações de cada minúsculo emissor de
molécula única da maneira mais eficiente.
5. OBSERVAÇÕES E AGRADECIMENTOS FINAIS
Nesta contribuição, os primeiros passos que levaram à primeira detecção de molécula

única e espectroscopia [27][1] foram descritos. Os experimentos de imagens de baixa
temperatura no início da década de 1990 produziram muitos efeitos físicos novos, como
difusão espectral e comutação ativada por luz, que reapareceram nos estudos posteriores
de temperatura ambiente em formas diferentes, mas relacionadas. À temperatura
ambiente, o surpreendente piscar e a fotocomutação de uma única molécula para
moléculas variantes de GFP únicas forneceram um caminho para o controle ativo
necessário para a microscopia de super-resolução PALM e seus parentes. Hoje, a cópia
de micros de super-resolução é uma aplicação poderosa de moléculas únicas que tem
amplo impacto em muitos campos da ciência (Figura 23), e novas e surpreendentes
descobertas continuam, como a observação de bandas de actina em axônios [183]. Tudo
isso ocorreu devido não apenas aos meus esforços, mas também devido em grande parte
à pesquisa inteligente e perspicaz realizada por muitos pesquisadores ao redor do mundo,
numerosos demais para serem mencionados aqui. Além da microscopia de super-
resolução, apenas observar moléculas únicas e seus comportamentos continua a levar a
avanços científicos tentadores, seja simplesmente rastrear movimentos de moléculas
únicas [184], ou inferir interações e conformações biomoleculares com FRET [185, 186]
ou extrato fotodinâmica de moléculas isoladas presas [187] [188], ou determinação de
mecanismos enzimáticos [189]. O futuro da espectroscopia de molécula única e da
imagem de super-resolução é muito brilhante.
Fui extremamente afortunado durante todo o período de minha carreira de pesquisa
por ter tido o privilégio de trabalhar com uma equipe de estudantes e pesquisadores de
pós-doutorado brilhantes e excepcionais. Os ex-alunos do Moerner Lab estão listados na
Figura 24, e agradeço calorosamente a todos eles por seu trabalho árduo e insights.
Também sou extremamente grato aos meus alunos e pós-doutorandos atuais, retratados perto de
FIGURA 23. Impacto da espectroscopia e imagem de molécula única, com exemplos

selecionados. Imagem 3D multicolorida de proteínas intracelulares e superfície celular cortesia
de Matthew Lew (foto); veja Ref. [179].
o Rodin Sculpture Garden no Halloween na Figura 25, junto com nosso logotipo “No
Ensemble Averaging” de Sam Lord. Esses cientistas talentosos continuam a impulsionar o
campo da espectroscopia de uma única molécula, captura, imagem e super-resolução para
o futuro. A figura explica por que gostamos de nos referir a uma molécula como um
“guacamole” de material! Minha educação e pesquisa desde meus anos de faculdade foram
beneficiadas por inúmeros colaboradores e colegas maravilhosos listados na Figura 26, e eu
realmente gostei de ser aluno de muitos deles. Estou certo de que alguns foram deixados de
fora, pelo que peço desculpas. É claro que tenho uma dívida pessoal e profissional especial
para com meus mentores espetaculares, as instituições que me acolheram e as várias
agências de financiamento, administradores e funcionários que apoiaram meu trabalho listado
na Figura 27. Finalmente, na Figura 28 , Agradeço sincera e profundamente à minha família
e aos meus amigos íntimos que me ouviram e me aconselharam em muitos desafios ao
longo dos anos. Meus pais sacrificaram muito por mim e me deram amor e apoio contínuos
por toda a vida, e eu apreciei muito os votos de melhoras e o incentivo de todos os membros
de minha família.
Meu filho Daniel, um pensador curioso e profundo, sempre me ouve e continua a me

surpreender, e ele fornece uma inspiração contínua para o futuro. Minha esposa, Sharon,
tem sido uma fonte indispensável de amor, companheirismo, paciência e encorajamento
para mim durante todo o nosso casamento, e não posso agradecer o suficiente.
FIGURA 24. Ex-alunos do laboratório Moerner.
FIGURA 25. A Equipe Atual de Guacamole!

FIGURA 26. Tanques para meus colaboradores/colegas!
FIGURA 27. Tanques para meus mentores, lares, fontes de financiamento.

FIGURA 28. Tanques para minha família e amigos.
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Foto de retrato de William Esco (WE) Moerner pelo fotógrafo Alexander Mahmoud.

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Espectroscopia, Imagem e Fotocontrole de

por WE (William E.) Moerner

Departamentos de Química e (por cortesia) de Física Aplicada

Os passos iniciais para a detecção óptica e espectroscopia de moléculas únicas em matéria

Assinaturas espectrais relacionadas às flutuações do número de moléculas em ressonância levaram

206 Os prêmios Nobel

1.1 Introdução e inspirações iniciais

Quero agradecer ao Comitê Nobel de Química, à Academia Real Sueca de Ciências e

“. . . nunca experimentamos com apenas um elétron ou átomo ou

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 207

fotoionização de uma única molécula no vácuo, detectando opticamente uma única

1.2 Espectroscopia de baixa temperatura de moléculas em sólidos: Alargamento não homogêneo

Para explicar os experimentos iniciais de SMS no final da década de 1980, é necessário

FIGURA 1. Espectro (absorção versus comprimento de onda, ou cor) de moléculas de terrileno em

208 Os prêmios Nobel

O terrileno (e outros hidrocarbonetos aromáticos semelhantes) é uma molécula

FIGURA 2. Espectro (absorção vs. frequência/número de onda, ou cor) de moléculas de

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 209

existem quatro localizações inequivalentes para as moléculas de terrileno no cristal,

FIGURA 3. Alargamento não homogêneo em sólidos a baixas temperaturas. (a) Pentaceno

210 Os prêmios Nobel

1.3 O ambiente na IBM Research: Spectral hole-burning para armazenamento óptico

Um objetivo da espectroscopia de alta resolução era medir a verdadeira largura

FIGURA 4. Ilustração de queima de buracos espectral persistente em linhas não homogêneas

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 211

1.4 Estrutura fina estatística em linhas não homogêneas

212 Os prêmios Nobel

FIGURA 5. Ilustração de flutuações numéricas para probabilidade e para espectroscopia. (uma)

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 213

de ressonância específicas. Em números muito pequenos de moléculas totais, as variações na

ele mudava para nas próximas

FIGURA 6. Observação da Statistical Fine Structure (SFS) (direita) para pentaceno em p-

214 Os prêmios Nobel

2. DETECÇÃO DE MOLÉCULA ÚNICA, TROSCOPIA ESPECÍFICA E IMAGEM EM BAIXO

única e espectroscopia em fases condensadas

O outro aspecto crucial do experimento SFS foi o método de detecção óptica

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 215

No entanto, com a detecção do SFS em mãos, tornou-se possível para mim

FIGURA 7. Espectroscopia de modulação de frequência a laser para detecção de sinais

216 Os prêmios Nobel

FIGURA 8. Primeira detecção óptica e espectroscopia de absorção de moléculas simples em

modulador [33]. A Figura 8 (especificamente, traço d) mostra exemplos do espectro de

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 217

uso de amostras clivadas relativamente espessas, que produziram uma população de

2.2 Marco crucial: detecção de absorção de molécula única por fuorescência

Os experimentos de absorção óptica com pentaceno em p-terfenil mostraram que esse

Com a capacidade de detectar moléculas únicas em cristais e polímeros, no início

218 Os prêmios Nobel

FIGURA 9. Detecção de molécula única e espectroscopia de absorção registrando a

2.3 Espectroscopia e imagem de molécula única

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 219

220 Os prêmios Nobel

pentaceno em p-terfenilo. O eixo z da imagem é o sinal de emissão (desviado para o

2.4 Surpresas - difusão espectral e controle óptico

Durante os primeiros estudos de SMS sobre pentaceno em p-terfenil, um fenômeno

Espectroscopia, imagem e fotocontrole de molécula única 221

barreiras reduzidas para tais movimentos de tunelamento do anel central. Um estudo

222 Os prêmios Nobel

adquirido, o que mostrou que a frequência de ressonância da molécula aparentemente se

Vários sistemas de molécula única mostraram comportamento de deslocamento induzido

3. INTERLÚDIO - POR QUE ESTUDAR MOLÉCULAS ÚNICAS?