Espectroscopia de

Fluorescência
Ana Paula - Diego Henrique - Mateus Xavier

Físico-Química C
Profª Dr. Manoel Gustavo Petrucelli Homem
Introdução
● Toda a vez que uma molécula absorve energia radiante, esta energia
tende a ser dissipada na forma de calor, que é consumido via colisões.
● No entanto, para certas moléculas quando expostas a energias radiantes
mais intensas (geralmente UV) ocorre um fenômeno adicional:

Parte da energia é perdida via colisões, outra parte excita os elétrons para
níveis mais elevados, que ao retornar ao estado fundamental, vão emitir luz
(luminescência).
Mas antes...

Fonte: Repositório PUC-RIO

Diagrama de Jablonski
Fosforescência
Excitação eletrônica e decaimento

FOSFORESCÊNCIA

FLUORESCÊNCIA FLUORESCÊNCIA DELAY

Fluorescência x Fosforescência
● Na fluorescência, a emissão de luz ocorre quase imediatamente após a
absorção de fótons de alta energia.
● Na fosforescência, a emissão de luz contínua por um período prolongado
de tempo após a remoção da fonte de excitação.
● Ao emitir um fóton um material fluorescente emite luz por um tempo de
10-8 a 10-9 segundos enquanto um material fosforescente pode emitir luz
por um tempo de 10-6 , 10-4 ou até mesmo 1 minuto.
 (nanosegundos) ou (milissegundos até horas).

Decaimento da fosforescência e fluorescência após a fonte excitadora ter cessado (adaptado

de Atkins, 1999)
Qual a real diferença?
● Se durante o processo de emissão não ocorre mudança de
multiplicidade de spin, a emissão é fluorescente.
● A molécula pode efetuar um cruzamento intersistema, uma transição
não radiativa entre estados de diferentes multiplicidade.
● Assim, se há inversão de spin (ex: singlete → triplete) a emissão é
fosforescente.
● As transições entre estados singleto e tripleto podem ocorrer na
presença de acoplamento spin – órbita.
● O mecanismo é importante quando a molécula tem átomos pesados
(maior acoplamento spin – órbita).
Espectroscopia de Fluorescência
● A espectroscopia de fluorescência é uma técnica analítica que estuda a
luz emitida por uma amostra após a absorção de radiação
eletromagnética.
● Um fluorímetro contém:
○ Uma lâmpada que excita a amostra e produz sua emissão
○ Sistema de detecção: duas fotomultiplicadoras (uma para medir a
quantidade de luz que chega na amostra e uma para medir a
fluorescência)
○ Filtros de interferência: elemento seletor de comprimento de
onda
Configuração típica

Fonte: Wikipédia
Deslocamento de Stokes
● O fóton de emissão fluorescente carrega menos energia que o fóton de
excitação, devido às possíveis perdas de energia nas transições dos
estados vibracionais do estado eletrônico excitado.
● Cada molécula fluorescente possui um comprimento de onda de
excitação e um comprimento de onda de emissão característico, sendo a
distância entre eles chamada de deslocamento de Stokes.
Fonte: Revista Brasileira de
Ensino de Física
Limitações
● Fluorimetria requer baixas concentrações para dar respostas lineares.
● Elevadas concentrações produzem desvio de linearidade.
○ Quando a concentração é muito alta, o detector pode atingir sua
capacidade máxima de leitura.
○ O quenching é um fenômeno no qual as altas concentrações podem
levar à interação entre as moléculas excitadas, resultando na
diminuição da intensidade da fluorescência.
Fonte: Instrutherm
 Onde vemos esses fenômenos?

Lâmpadas Fluorescentes
Visualizando o fenômeno na prática
DAPI, ou 4',6'-diamino-2-fenil-indol
Melhoras de resultado de imagem

É um marcador fluorescente que

se liga fortemente a regiões de
DNA ricas em adenina-timina
Células-tronco coradas com DAPI
Referências
● PAVONI, J. F. et al. Uma montagem experimental para a medida de
fluorescência. Revista Brasileira de Ensino de Física, v. 36, n. 4, dez. 2014.
● Moodle USP: e-Disciplinas. Fluorimetria. Disponível em:
<https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4611034/mod_resource/content/1/
fluorimetria-%2015032019.pdf> Acesso em: 4 fev. 2024..
● Fluorescência e fosforescência - Sala de Demonstrações de Física - UFMG.
Disponível em: <http://demonstracoes.fisica.ufmg.br/artigos/ver/109/20.-
Fluorescencia-e-fosforescencia#:~:text=A%20emiss%C3%A3o%20de%20luz
%20nesse> Acesso em: 2 fev. 2024.
● AZEVEDO, A. L.; SOUSA, A. K. S.; CASTRO, T. J. Espectroscopia óptica de baixo
custo: uma estratégia para a introdução de conceitos de física quântica no
ensino médio. Revista Brasileira de Ensino de Física, v. 41, n. 4, 2019.
● NOGUEIRA, G. T.; HERNANDES, J. A. Laboratório de Física IV baseado em
experimentos de baixo custo: relato de uma experiência de ensino remoto
devido à pandemia de COVID-19. Revista Brasileira de Ensino de Física, v. 43,
2021.
Referências
● Moodle USP: e-Disciplinas. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Disponível
em: <https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/7262404/mod_resource/content/
1/%5BJoseph_R.__Lakowicz%5D_Principles_of_Fluorescence.pdf>. Acesso em: 9
fev. 2024.
● Moodle USP: e-Disciplinas. Espectroscopia de Luminescência Molecular.
Disponível em:
<https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4822266/mod_resource/content/1/
teoria-espectroscopia%20de%20fluorescencia.pdf>. Acesso em: 3 fev. 2024.
● Unicamp <https://sites.ifi.unicamp.br/graduacao/files/2020/04/Aula-8_
%C3%81tomos-multieletronicos_1sem2020.pdf>. Acesso em: 09 fev.2024.