Índice

1.0.Introdução ......................................................................................................................................... 3
1.1.Objectivos. ........................................................................................................................................ 3
2.0.Fluorescência ou Flourimetria ........................................................................................................... 4
3.0.Processos de Relaxação..................................................................................................................... 7
4.0.Relação entre os Espectros de Excitação e de Fluorescência .......................................................... 10
5.0.Instrumentação para fluorescência .................................................................................................. 11
6.0.Conclusão ........................................................................................................................................ 13
6.0.Bibliografia ..................................................................................................................................... 14
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1.0.Introdução
Durante a realização do trabalho, que tem como tema a espectroscopia de fluorescência
molecular, constatou si que a espectroscopia é o estudo da interacção da radiação com a
matéria, consistindo na absorção, emissão ou espalhamento da radiação por átomos ou
moléculas. Em que por sua vez envolve a mecânica quântica mostra que uma molécula só
pode ter energias num conjunto discreto de valores. Estas quantidades são chamadas níveis de
energia da molécula.

1.1.Objectivos.
Gerais

 Conhecer a teoria da espectroscopia da fluorescência molecular e da fluorometria

Específicos:

 Identificar os processos que ocorrem na fluorescência e na espectroscopia.

 Interpretar os métodos da espectroscopia e da fluorescência.
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2.0.Fluorescência ou Flourimetria
Para WEDLER (2001 P 634) A fluorescência entende se a emissão espontânea de luz, que só
se da em quanto as moléculas que a apresentam forem excitadas por absorção da luz. De
modo semelhante ao que acontece com os espectros de RAMAN, a fluorescência observa se
na direcção perpendicular a direcção da radiação e excitante. De um modo geral verfica se
que, relativamente ao espectro de absorção, o espectro da fluorescência esta deslocado para
baixos números de ondas.

Figura1

Segundo (HOLLAS, 2004). A espectroscopia é o estudo da interacção da radiação com a

matéria, consistindo na absorção, emissão ou espalhamento da radiação por átomos ou
moléculas. A luz é uma radiação electromagnética, numa faixa restrita de comprimentos de
onda ( ~ 180 nm, ultravioleta, a ~ 900 nm, infravermelho). As ondas electromagnéticas são
caracterizadas por uma frequência (ν) e um Comprimento de onda (λ), sendo essas grandezas
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físicas relacionadas pela equação λν = c, onde c é a velocidade da luz para um determinado

meio.

2.1.Espectroscopia de fluorescência

Afluorescência é um processo de fotoluminescência no qual os átomos ou moléculas são

excitados por absorção de radiação eletromagnética.

A fluorescência e a fosforescência resultam da absorção da radiação electromagnética e da

dissipação de energia por emissão de radiação (a). Em (b), a absorção pode causar a excitação
do analito para os estados 1 ou 2. Uma vez excitado, o excesso de energia pode ser perdido
por emissão de um fóton (luminescência, mostrada por uma linha sólida) ou por processos
não-radiativos (linhas interrompidas).

A emissão ocorre em todos os ângulos, e os comprimentos de onda emitidos (c)

correspondem às diferenças de energia entre os níveis. A principal diferença entre a
fluorescência e fosforescência está na escala de tempo da emissão, com a fluorescência sendo
muito rápida e a fosforescência mais lenta.

Segundo VOGEL (analise química quantitativa, 6ª edição) A fluorescente é o resultado da

absorção de energia radiante e emissão de parte dessa energia na forma de luz. A luz emitida,
tem, quase sempre, comprimento de onda maior do que a luz absorvida. (lei de stokes). Na
fluorescência, a absorção e a emissão ocorrem em um tempo curto porem mensurável da
ordem de 10-12 a 10-9 s. se ocorrer um retardamento(> 10-8s ) porque a transição é proibida, o
fenómeno é conhecido como fosforescência. O retardamento pode ser de fracções de segundo
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ou de várias semanas. A fluorescência e fosforescência são casos particulares da

fotoluminescencia, um termo geral aplicado ao fenómeno de absorção e remissão de luz.

O tipo de fotoluminescencia mais usada hoje em dia em química analítica é a flourimetria,

que si distingue das demais forma de fotoluminescencia pelo facto da molécula excitada
retornar ao estado fundamental imediatamente pois a excitação. Quando uma molécula
absorve um fotão de radiação ultravioleta, ela sofre uma transição um estado electrónico
excitado e um dos seus electrões são promovidos para um orbital de energia mais alta.
Existem dois tipos de importante de transições para as moléculas orgânicas.

a) n → 𝜋*, em que um electrão de um orbital não ligante é promovido a um orbital 𝜋

antiligante.
b) 𝜋 → 𝜋*, Em que um electrão de um orbital 𝜋 ligante é promovido a um orbital 𝜋
antiligante.

A excitação do tipo 𝜋 → 𝜋*, provoca fluorescência significativa. A excitação do tipo n→ 𝜋*,

produz fluorescência pouco intensa. As transições electrónicas de bandas de transferência de
carga também provocam fluorescência intensa. A energia electrónica, entre tanto, não é o
único tipo de energia afectado quando uma molécula absorve um foton da radiação ultra
violeta. As moléculas orgânicas tem um grande número de vibrações e cada uma delas
contribuem com uma serie de níveis vibracionais, quase igualmente espaçados para cada
estado electrónico. Os vários estados de energia disponíveis para uma molécula podem ser
representados por meio de um diagrama de níveis de energia.

Para que uma molécula emita uma radiação por fluorescência ela deve ser, primeiro capaz de
absorver radiação. Nem todas as moléculas que absorvem no ultra violeta ou no visível são
fluorescentes e é útil quantificar a fluorescência de uma dada molécula. O rendimento
quântico é definido como a fração da radiação incidente que é remetida como fluorescência de
um determinado comprimento de onda.

numero de fotoes emitido quantidade da luz emitida

ɸf (≤1) = numero de fotoes absorvido = quantidade da luz absorvida

Algumas das moléculas excitadas podem perder o excesso de energia por dissociação de uma
ligação, o que leva a uma reacção fotoquímica, ou podem retornar ao estado fundamental por
outros mecanismos. O rendimento quântico será, então, menor do que a unidade e pode
chegar a ser extremamente pequena. O valor de ɸf é uma propriedade da molécula
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determinada principalmente por sua estrutura. Em geral um valor alto de ɸf esta associado
com moléculas que possuem um sistema extenso de ligações duplas conjugadas em uma
estrutura relativamente rígida devido a formado de anéis. Um exemplo disso é a intensa
fluorescência de moléculas orgânicas como o anteceno, a fluorescência e outras estruturas
aromáticas com anéis condensados. O numero de espécies inorgânicas simples que são
fluorescentes é mais limitado. São exemplos de compostos de lantanideos e actinideos, alguns
2+
compostos organometalicos e compostos como o ião triz (bipiridil) ruteneo (II) Ru (bpy) 3

que tem rendimento quântico igual a 0,1. No caso de metais, esta limitação pode ser superada
pela formação de um complexo com ligante orgânico apropriado. Muitos dos complexos dos
metal formado com o agente de complexarão 8-hidroxquinolina são fluorescentes.

3.0.Processos de Relaxação
Apresenta um diagrama parcial de níveis de energia para uma espécie molecular hipotética.

Três níveis electrónicos de energia são mostrados, E0, E1 e E2; E0 é o estado fundamental e
E1 e E2 são estados excitados. Cada um dos estados electrónicos é apresentado com quatro
níveis vibracionais excitados.
A irradiação dessa espécie com a radiação de banda de l1 a l5 (Figura 23-12a) resulta na
população momentânea dos cinco níveis vibracionais do primeiro estado electrónico excitado,
E1. De forma similar, quando as moléculas são irradiadas com uma banda de radiação mais
energética constituída por comprimentos de onda mais curtos de l1_ a l5_, os cinco níveis
vibracionais de maior energia electrónica E2 tornam-se momentaneamente populados.
Uma vez excitada para E1 ou E2, muitos processos que causam a perda do excesso de energia
da molécula podem ocorrer. Dois dos mecanismos mais importantes, relaxação não-radiativa
e emissão fluorescente são ilustrados na,
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Os dois métodos de relaxação não-radiativa que competem com a fluorescência são ilustrados
na Figura 27-1b.

A relaxação vibracional, indicada pelas setas curtas onduladas entre os níveis de energia
vibracionais, ocorre durante as colisões entre as moléculas excitadas e as moléculas do
solvente. A relaxação não-radiativa entre os níveis vibracionais mais baixos de um estado
eletrônico e os níveis vibracionais mais altos de outro estado eletrônico também pode ocorrer.
Esse tipo de relaxação, algumas vezes denominado conversão interna, é apontado pelas duas
setas onduladas longas na Figura 27-1b.

A conversão interna é muito menos eficiente do que a relaxação vibracional de forma que o

tempo de vida médio de estado eletrônico excitado está entre 10_9 e 10_6 s. O mecanismo
exato pelo qual esses dois processos de relaxação ocorrem está, no momento, sob
investigação, porém, o resultado líquido é um pequeno aumento na temperatura do meio.
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A Figura 27-1c ilustra o processo de relaxação que se deseja: o processo fluorescente. Quase
sempre, a fluorescência é observada a partir do estado excitado eletrônico mais baixo E1 para
o estado fundamental E0.Também, geralmente, a fluorescência ocorre somente do nível
vibracional mais baixo de E1 para vários níveis vibracionais de E0. Isto porque os processos
de conversão interna e a relaxação vibracional são muito rápidos quando comparados com a
fluorescência.

Portanto, um espectro de fluorescência consiste normalmente em uma única banda com

muitas linhas próximas que representam as transições do estado vibracional mais baixo de E1
para os muitos níveis vibracionais diferentes de E0.
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4.0.Relação entre os Espectros de Excitação e de Fluorescência

Em razão do fato de as diferenças de energia entre os estados excitados vibracionais serem as
mesmas para ambos os estados fundamental e excitado, o espectro de absorção, ou espectro
de excitação, e o espectro de fluorescência para um composto freqüentemente se mostram
como imagens aproximadamente especulares (de espelho) um do outro com sobreposição
ocorrendo próximo à transição de origem (nível vibracional 0 de E1 para o nível vibracional 0
de E0). Esse efeito é demonstrado pelo espectro do antraceno exposto na Figura 27-2.
Há muitas excepções a essa regra da imagem especular, particularmente quando os estados
excitado e fundamental apresentam geometrias moleculares diferentes ou quando as bandas de
fluorescências se originam de partes diferentes da molécula.

4.1.Análise quantitativa
A intensidade total de fluorescência, F, é dada pela equação F = Iaɸf, onde Ia é a intensidade
da luz absorvida e ɸf é o rendimento quântico de fluorescência. Como o I0 = Ia + It, onde I0 é a
intensidade da luz incidente e It é a intensidade da luz transmitida,

F = ( I0 - It)ɸf

E como It = I0 -e-εcl (lei beer)

F = I0(I - e-εcl) ɸf

No caso de soluções que absorvem pouco, e-εcl é pequeno a equação torna se F = 2,3I0 e-εcl ɸf
de modo que para soluções muito diluídas (≤ alguns μg.g-1), a intensidade total de
fluorescência, F, é proporcional a concentração da amostra e intensidade da energia de
excitação. é instrutivo comparar a sensibilidade que pode ser alcançada pelos métodos de
absorção e fluorescência. A precisão total com que se pode medir a absorção em uma célula
de 1cm, não é maior do que 0,001unidade.

A selectividade pode ser também maior com os métodos de fluorescência, porque nem todas
as espécies que absorvem florescem e porque o analista pode seleccionar dois comprimentos
de onda (excitação e emissão), contra apenas um dos método de absorção. Esta selectividade
inerente pode, entre tanto, ser inadequada e tem de ser frequentemente, realizada por
separação química, por exemplo, com extracção com solvente. É possível também melhorar a
selectividade com técnicas que usam derivação, isto é, fazendo a medida de um componente
da amostra com um espectro derivado em lugar de espectro original de emissão de
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fluorescência. Assim ombros poucos intensos de espectro original convertem se em pico

facilmente quantificados no espectro derivativo.

A fluorescência é afectada pelo PH da solução, pela natureza do solvente, pela concentração

dos reagentes adicionado na determinação de iões inorgânicos e as vezes, pela temperatura. O
tempo necessário para que a fluorescência chegue ao máximo depende muito da reacção que
produz a espécie fluorescente.

Um aspecto muito importante da inibição da química analítica é que a fluorescência de um

analito pode ser inibida por algum composto presente na amostra.

5.0.Instrumentação para fluorescência

Os instrumentos para a medida da fluorescência são conhecido como flouremetros ou
espetroflourimetro.

Imagem

Como a intensidade da fluorescência é proporcional a intensidade da irradiação, a fonte de luz

deve ser bastante estável, a menos que as flutuações possam ser compensadas. Por isso, os
instrumentos de feixe duplo são normalmente preferidos. Usa se um galvanómetro para
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manter o balanço e as leituras são feitos no potenciómetro que mantém o equilíbrio entre a
fotocelula. Com as fotocelulas tem respostas espectral semelhante as flutuações da
intensidade da lâmpada são reduzidas ao mínimo.

Os fluormetros mais simples são instrumentos manuais mais simples, que operam em um
único comprimento de onda de cada vez. Apesar disso, eles são perfeitamente adequados para
o trabalho qualitativo, usualmente, feito em único comprimento de onda.

Instrumentos típicos para fluorescência, um fluorímetro de filtro é mostrado em (a). Observe

que as emissões são medidas em ângulo recto em relação à fonte da lâmpada de arco de
mercúrio. A radiação fluorescente é emitida em todas as direcções e a geometria de 90º evita a
observação da fonte pelo detector.
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6.0.Conclusão
A pois ter feito o trabalho constatou-se que a espectroscopia sendo o estudo da interacção e
radiação da matéria consistindo na absorção, emissão ou espalhamento da radiação por
átomos ou moléculas. A luz é uma radiação electromagnética, numa faixa restrita de
comprimentos de onda. Em que estes por sua vez envolvem as espécies de química analítica, a
espectroscopia de fluorescência não é considerada uma ferramenta importante para a análise
estrutural ou qualitativa, pois as moléculas com pequenas variações estruturais
frequentemente apresentam espectros de fluorescência similares. Também, as bandas de
fluorescência em solução são relativamente largas à temperatura ambiente. Contudo, a
fluorescência tem demonstrado ser uma ferramenta valiosa na identificação.
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6.0.Bibliografia
WEDLER. Gerd, manual de química física. 4ª Edição 1997,

VOGEL, I. Artur, analise química quantitativa, 6ª edição

SKOOG, West. Holler. Crouch. Fundamentos de química analítica. 8ª edição

(HOLLAS, 2004), apostila de química física.