ANÁLISE

INSTRUMENTAL I

ESPECTROMETRIA
DE LUMINESCÊNCIA MOLECULAR
 1- TERMINOLOGIAS E CONCEITOS

INCANDESCÊNCIA
Fonte de excitação: CALOR

FLUORESCÊNCIA
FOTOLUMINESCÊNCIA
Fonte de excitação: FÓTONS/LUZ FOSFORESCÊNCIA
LUMINESCÊNCIA
DISTINTAS FONTES DE
EXCITAÇÃO/ENERGIA QUIMIOLUMINESCÊNCIA
Fonte de excitação: REAÇÃO QUÍMICA

BIOLUMINESCÊNCIA
Fonte de excitação: REAÇÃO QUÍMICA
EM ORGANISMO VIVO
 1- TERMINOLOGIAS E CONCEITOS

LUMINESCÊNCIA
Fenômeno de emissão de radiação eletromagnética (luz) por uma
substância, quando submetido a diferentes causas de excitação
que não seja variação de temperatura (calor).
Se a excitação da substância for causada por aquecimento (calor)
ao rubro o fenômeno de emissão é denominado incandescência.
Os principais tipos de luminescência são:
 Fotoluminescência (Fluorescência e Fosforescência);
 Quimioluminescência.
 Bioluminescência.
Fluorescência - A luminescência instantânea (cerca de 1 ns) da
matéria após excitação com radiação UV ou visível.
Fosforescência - A luminescência retardada da matéria após
excitação com energia de uma radiação UV ou visível.
Quimioluminescência -A luminescência promovida por uma
reação química.
 6.1- Luminescência Molecular

Quando o sistema luminescente é uma molécula, as bandas de

fluorescência (ou fosforescência) ocorrem tipicamente em um
intervalo de comprimento de onda maior que a linha de
ressonância (deslocamento Stokes).
Para compreendermos as razões desse comportamento, bem como
das características dos espectros de fluorescência molecular e
fosforescência, considere os diagramas de energias das figuras
mostradas a seguir.
Caracterização dos Níveis de Energia do Último Diagrama
♦ Linhas horizontais grossas ⇒ estados eletrônicos
- estado fundamental: S0 (normalmente singlete)
- excitados: S1 e S2 (singletes) e T1 (triplete)
♦ Linhas horizontais finas ⇒ estados vibracionais
- associados ao estado fundamental: S0
- associados aos estados excitados: S e S e T
♦ Flechas verticais retas ⇒ indicam
processos associados a absorção ou
emissão de radiação (fluorescência ou
fosforescência).
♦ Flechas verticais sinuosas ⇒ processos
não-radiativos (relaxação vibracional,
conversão interna, etc).
Excitação Molecular
Conforme o diagrama, excitação da molécula pode ser feita pela
absorção de radiação UV-Vis cujas bandas são centradas em:
· λ1 ⇒ promove a transição eletrônica: S0 → S1
· λ2 ⇒ provoca a transição eletrônica: S0 → S2
Contudo, a molécula pode ser levada para qualquer um dos estados
excitados vibracionais ilustrados na figura.
É digno de nota salientar que a excitação da molécula para o estado
triplete não foi mostrada no diagrama, pois essa transição não ocorre
de modo significativo. De fato, esse processo envolve uma mudança
de spin, cuja probabilidade de ocorrer é tão baixa que a transição é
considerada proibida de acordo com a Mecânica Quântica.

Velocidades de Absorção e Emissão

 Absorção de fótons ⇒ processo extremamente rápido (10-14 a 10-15 s)
 Fluorescência ⇒ ocorre em 10-9 a 10-7 s
 Fosforescência ⇒ requer tempos na faixa de: 10-4 a 10s ou mais
Processos de Desativação
A molécula pode voltar ao estado fundamental devolvendo a energia
ganha na absorção por meio de:
 um processo radiativo: fotoluminescência que compreende a
fluorescência e a fosforescência;

 um processo não-radiativo:
- relaxação vibracional;
- conversão interna;
- conversão externa;
- cruzamento intersistema

O mecanismo pelo qual a molécula libera a energia é aquele que

minimiza tempo de vida do estado excitado. Assim, se a
fluorescência for mais rápida que os processos não-radiativos então
ela irá ocorrer. Caso contrário, a fluorescência não ocorre ou é pouco
intensa.
 A- Relaxação vibracional

É significativa em solução, pois essas condições favorecem maiores

interações entre a molécula excitada e a do solvente.
Nesse caso, a energia vibracional em excesso é perdida
imediatamente tendo em vista a alta eficiência desse processo. De
fato, o tempo de vida médio estimado de uma molécula excitada
vibracionalmente é da ordem de 10-12 s.

Consequências da relaxação vibracional

♦ prevalece sobre a desativação por fluorescência, pois seu tempo
de vida é menor que o de um estado excitado eletronicamente;
♦ a fluorescência, quando ocorre, envolve uma transição a partir do
nível vibracional mais baixo de um estado eletrônico excitado;
♦ as bandas de fluorescência são deslocada para λ´s maiores que os
associados às bandas de absorção (deslocamento Stokes).
 B- Conversão Interna
Embora essa desativação não seja bem-compreendida, ela parece
ser particularmente eficaz quando dois níveis eletrônicos possuem
energias próximas o suficiente para promover uma superposição de
níveis de energia vibracionais
É importante ressaltar que a conversão interna é um evento
geralmente mais provável que a desativação por fluorescência a
partir de um estado eletrônico excitado mais alto (S2, S3, etc).
Consequências da Conversão Interna
• A excitação em λ2 promove uma fluorescência cuja banda é
centrada em λ3, excluindo a banda que resultaria de S0← S2.
• De fato, a molécula excitada passa de S2 para o nível vibracional
mais baixo de S1 por relaxações vibracionais, uma conversão
interna e depois relaxações subseqüentes. Um exemplo típico
desse comportamento pode ser dado pelo quinino, cujos
espectros de excitação e fluorescência são mostrados a seguir.
A conversão interna pode causar a pré-dissociação da molécula. De
fato, isto pode ocorrer quando a molécula retorna para um estado
eletrônico de menor energia, cuja energia vibracional associada é alta
o suficiente para quebrar uma ligação.
 C- Conversão Externa

Consiste na interação e transferência de energia entre a molécula

excitada e a do solvente ou a de outros solutos.
É digno de nota salientar a relevância desse tipo de desativação,
haja vista o efeito expressivo do solvente sobre a intensidade de
fluorescência.
 D- Cruzamento Intersistema

Este tipo de desativação ocorre por meio de uma inversão do spin

de um elétron excitado levando a molécula do estado singlete para
o estado triplete.
Como ilustrado no diagrama, essa processo é favorecido quando
ocorre superposição entre estados vibracionais dos dois estados
eletrônicos, a exemplo do que ocorre em S1 T1.

OBS.:
A desativação por cruzamento intersistema ocorre com maior
facilidade quando a molécula contém átomo pesado (Br, I, etc).
Neste caso, as interações spin-órbita propiciam condições mais
favoráveis para uma mudança de spin.
 Fosforescência

Esse fenômeno ocorre com maior intensidade quando a desativação

por cruzamento intersistema é favorecida. Contudo, existe a
possibilidade desse tipo de emissão ser inibido devido à competição
de conversões externa e interna envolvendo T1 e S0, como se pode
observar no diagrama. Com efeito, essa competição é tão
significativa que a fosforescência é observada com maior facilidade
a baixas temperaturas e em meios muito viscosos.
 6.2- Eficiência e Rendimento Quântico (Ø)
 Éa razão entre o número de moléculas que sofrem fotoluminescência
e o número de total de moléculas excitadas.
Ø
Potência radiante do feixe de excitação absorvido (Po – P)

Onde kx representa a constante de velocidade referente ao processo X, ou seja:

¨ kf ⇒ fluorescência ou fosforescência;
¨ ki ⇒ cruzamento intersistema;
¨ kce ⇒ conversão externa;
¨ kci ⇒ conversão interna;
¨ kd ⇒ dissociação;
¨ kpd ⇒ pré-dissociação;
 6.3- Fatores que afetam a Fotoluminescência
A) Influência da Estrutura Química
Via de regra, a fluorescência de compostos aromáticos > a
fluorescência de alifáticos, alicíclicos carbonílicos ou aqueles com
ligações duplas altamente conjugadas.
Com efeito, a maioria dos hidrocarbonetos aromáticos não-
substituídos fluoresce em solução, a exemplo do que ocorre com o
fenantreno cujo espectro de fluorescência é mostrado na figura a
seguir. Nesses compostos, ᴓ aumenta com o número de anéis e seu
grau de condensação.

Figura - Espectros do fenanteno:

E: excitação, E: fluorescência e
F: fosforescência
Por outro lado, compostos heterocíclicos simples como a priridina,
furano, tiofeno e o pirrol (veja as estruturas abaixo) não fluorescem.

Entretanto, compostos heterocíclicos condensados com anéis

benzênicos exibem fluorescência devido ao aumento da absortividade
associada ao pico de absorção, o que diminui o tempo de vida do
estado eletrônico excitado singlete.
A título de exemplo podemos citar:
B) Influência da Rigidez Estrutural
C) Influência do Solvente
D) Influência da Temperatura
6.4- Relação entre Concentração e Fluorescência

F = Ф ( Po – P)

Lei de Beer A =ε bc

log P =- ε bc
Po

F = Ф Po 1– 1
ε b c
10

A expressão 1 – 10-ebc pode ser expandida em uma série de

Maclaurin como:
Quando εbc =A < 0,05, os termos de ordem maior e igual a 2 podem ser desprezados

onde K é um coeficiente de proporcionalidade que depende:

- da absortividade (e) associada ao pico de absorção;
- do rendimento quântico (f) da fluorescência;
- da potência do feixe incidente (P0) da radiação excitadora;
- do percurso óptico (b).
 6.5- Desvios da linearidade

À medida que a concentração do analito aumenta, dois fatores

podem provocar um desvio da linearidade na relação entre F e c, a
saber:
 auto-supressão ⇒ resulta da transferência de energia não-
radiativa entre moléculas excitadas decorrente de colisões, cuja
probabilidade tende a aumentar com o aumento da
concentração do fluoróforo;

 auto-absorção ⇒ esse tipo de interferência ocorre quando há

uma
superposição entre o l da radiação emitida com o do pico de
absorção. Neste caso, a intensidade da fluorescência diminui à
medida que a radiação emitida por certos fluoróforos atravessa a
solução e é reabsorvida por moléculas fluorescentes.
 6.7- Análise Quantitativa

Os métodos fotoluminescentes quantitativos têm oferecido

resultados
satisfatórios, sobretudo por apresentar sensibilidade e faixas
dinâmicas melhores que os métodos baseados em medidas de
absorção UV-Vis.

F=Kc

As curvas analíticas fluorimétricas são construídas com base na

relação e num planejamento experimental que minimize problemas
de desvios da linearidade decorrentes da auto-supressão e auto-
absorção.
 6.8- Instrumentação

Os fluorímetros são semelhantes ao fotômetros de absorção, tendo em vista

que usam filtros para selecionar tanto a radiação para excitação como a da
emissão fluorescente. Por outro lado, os espectrofluorímetros, embora
similares aos especrofotômetros, podem ser de dois tipos, a saber:
• O primeiro utiliza um filtro para selecionar a radiação excitadora e um
monocromador para produzir os espectros de emissão de fluorescência.
• Os espectrofluorímetros do segundo tipo são sempre equipados com dois
monocromadores, sendo um deles usado para variar o comprimento de
onda durante a obtenção dos espectros de excitação. O outro permite
registrar os espectros de fluorescência ao variar o comprimento de onda.
Os espectrofluorímetros do segundo tipo são considerados autênticos e
podem ser representados pelo modelo exemplificado na figura a seguir.