Emissão Fluorescência
Prof. Dr. Anderson de Jesus Gomes
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
2
Emissão de luz
• Luminescência
• Fluorescência
• Fosforescência
• Quimioluminescência
• Bioluminescência
3
Emissão de luz
Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém
da absorção de fótons. Inclui a Fluorescência e a Fosforescência.
Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a
energia de excitação é proveniente de uma reação química.
Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência
onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por
exemplo.
4
Quimiluminescência (Luminol)
Catalisador = Ferro da Hemoglobina
5
Bioluminescência
6
Absorção de um fóton e excitação de um elétron
Inicialmente, os elétrons em átomos ou moléculas estão energeticamente em um
nível “normal” de energia denominado de estado básico ou estado fundamental
(“ground state”). A absorção de um fóton por uma molécula excita um elétron,
levando ele de um estado de baixa energia (não excitado) para um estado
excitado.
7
Absorção
• Absorção – a luz é absorvida por um átomo, íon ou molécula indo para um
estado energético mais elevado.
Emissão
Emissão – a emissão de um fóton pelo átomo, íon ou molécula, retornando para
um estado energético mais baixo
9
Diagrama de Jablonski
Molecules 2012, 17(12), 14067-14090; doi:10.3390/molecules171214067
Sistemas Fotoluminescentes
Dentro dos Sistemas Fotoluminiscentes temos duas subdivisões
dependendo do estado excitado envolvido no processo:
Fluorescência: Se o estado envolvido é singleto (o spin do eletron mantém a
sua posição). É um processo rápido t = 10-9-10-7 segundos com elevada
intensidade nos picos de absorção.
Fosforescência: A orientação do eletron que foi promovido é invertida e temos
um tripleto. É um processo lento t = 10-3-10-2 segundos, com fraca intensidade
nos picos de absorção.
11
Diagrama de Jablonsky
Singleto e Tripleto
Multiplicidade = 2S + 1
As designações singleto e tripleto referem-se à multiplicidade de spin do estado eletrônico
(dada por 2S+1, onde S é a soma dos spins de todos os elétrons. O spin do primeiro elétron
é designado, arbitrariamente, como +½ o segundo, como -½. O valor de S é zero para cada
par de elétrons, logo a multiplicidade é 1 (singleto). No caso de dois elétrons
desemparelhados, S = 1 e a multiplicidade é 3 (tripleto).
Franck-Condon
O princípio do estado de Frank-Condon
considera que, uma vez que o tempo
necessário para que ocorra uma transição
eletrônica é muito menor do que o tempo de
movimentação dos núcleos, a transição
vibrônica mais provável é aquela que não
envolve a mudança nas coordenadas
nucleares.
Frank-Condon = transição vertical EP
Deslocamento Stokes
Quando o fóton emissor tem menos energia do que o fóton absorvido, esta
diferença da energia é chamada de deslocamento Stokes.
Estados eletronicamente excitados
Blue Excitation
Absorption
Internal Conversion
femtoseconds
S2 excited state
Absorbance energy
S1 excited state
Fluorescence Nonradiative
nanoseconds dissipation
Ground State
Electrons 16
Processos fotofísicos: Fosforescência
Processos fotofísicos
18
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
• O rendimento quântico de fluorescencia (φF) de uma substância é a razão do
numero de fótons emitidos por fluorescência e o numero de fótons absorvidos;
varia de Zero a Um:
• Zero: Quando a espécie não fluoresce
• Entre zero e um: Quando a espécie fluoresce
Φf + Φic + Φisc + Φp = 1
φF= 0 não fluoresce
φF ≠ 0 fluoresce
19
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Tipo de Radiação (λ)
• A fluorescência raramente resulta da absorção de radiação de comprimento de
onda inferior a 250 nm.
• Rara ocorrência de fenômenos de fluorescência provenientes da
• transição σ*→σ,
• Fluorescencia proveniente de mecanismos menos energéticos
• como π*→ π
20
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Temperatura
O rendimento quântico da maioria das moléculas diminui com o aumento da
temperatura, porque aumentam as colisões.
↑ Temperatura ↓ Fluorescência
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Presença de Oxigênio
Diminui a intensidade de emissão de uma solução fluorescente.
↑ [Oxigênio] ↓ Fluorescência
22
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Concentração
Espectros de fluorescência do antraceno em diclorometano em várias
concentrações: 10-3 a 10-7 mol L-1.
23
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Concentração
Espectro de fluorescência do pireno, em solução de diclorometano: 1x10-5 mol L-1
(linha azul); 1x10-3 mol L-1 (linha preta).
24
Concentração
• Formação de dímeros no estado eletrônico fundamental,
• Formação de dímeros no estado eletrônico excitado, ao qual se dá o nome de
excímero,
• Transferência não-radiativa de energia,
• Transferência radiativa de energia.
25
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Rigidez de Moléculas
A rigidez na estrutura molecular restringe a liberdade vibracional, minimizando
significativamente os relaxamentos vibracionais, aumentando a fluorescência
.
Fluoreno Bifenil
↑ Rigidez ↑Fluorescência
26
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Geometria de Moléculas
Moléculas Planares aumentam a fluorescência pois favorece a interacção e
conjugação entre os elétrons π.
↑ Geometria Planar
↑ Fluorescência
27
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Tipo de Moléculas
Também podem apresentar fluorescência os compostos que contêm grupos
carbonilo alifáticos e aliciclicos, ou duplas ligações altamente conjugadas.
Beta-caroteno
Indocianina verde
28
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Hidrocarbonetos Aromáticos
A maioria dos hidrocarbonetos aromáticos são fluorescentes em solução, sendo o
rendimento quântico tanto maior quanto maior for o numero de anéis e o seu grau
de condensação.
Benzeno Naftaleno Antraceno
Pireno
29
Benzopireno
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Transições n → π*
Nos compostos heterociclicos com átomos de Nitrogênio a transição electrônica é
de mais baixa energia e envolve uma transição do tipo n → π*, que se transforma
num estado de tripele e evita a fluorescência.
Piridina Pirolina Furano Tiofeno
30
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
A presença de grupos:
• Hidroxi (-OH),
• Metoxi (-OR),
• Amina (-NR2),
• Cianeto (-CN)
Apresenta tendência a amplificar a fluorescência.
•
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Em halogênios verifica-se um diminuição da sua intensidade com o aumento do
numero atômico do halogênio o que aumenta a velocidade do processo de
conversão inter-sistemas para o estado triplete. Também podemos observar
quebra de ligações que podem ou não absorver a energia de excitação.
Fluorobenzeno Clorobenzeno Bromobenzeno Iodobenzeno
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Anéis substituídos
Quando temos anéis benzênicos substituídos ocorre o deslocamento do máximo
de absorção e portanto dos níveis de fluorescência.
33
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Substituição na carbonila
A substituição de grupos carboxilo e carbonilo no grupo aromático impede
parcialmente a fluorescência.
34
Metais
Os ions metálicos de transição não costumam formar quelatos fluorescentes, visto
que muitos deles são paramagnéticos. Este fato aumenta a velocidade de
conversão inter-sistemas para o estado tripleto.
35
Fluoróforos típicos
36
Fluorescência - espectros
37
Supressão de Fluorescência
Stern-Volmer
38
Exemplo
A fluorescência do sulfato de quinino é suprimida por altas concentrações de íon
cloreto. Os sinais de fluorescência F mostrados a seguir foram obtidos como uma
função da concentração do íon cloreto. Construa uma planilha eletrônica e
determine a constante de supressão Kq
IF [Cl-] [Cl-] F0/F
180,0 0,0000 0,0000 1,0000
87,5 0,0050 0,0050 2,0571
58,0 0,0100 0,0100 3,1034
43,2 0,0150 0,0150 4,1667
35,0 0,0200 0,0200 5,1429
28,5 0,0250 0,0250 6,3158
24,5 0,0300 0,0300 7,3469
19,1 0,0400 0,0400 9,4241
15,7 0,0500 0,0500 11,4650 39
14.0000
Y = 209,95x + 1,0092
12.0000 R2 = 0,9999
10.0000
8.0000
F0/F
6.0000
4.0000
2.0000
0.0000
0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600
[Cl]
Kq = 209,95 mol-1 L
40
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
41
Espectrofluorímetro
42
Sistema de excitação
Lâmpadas de arco de mercúrio ou de xenônio
Xenônio:
Produz um espectro continuo entre 250 e 600 nm tendo um máximo a 470 nm
43
Lâmpada de mercúrio
Produz um espectro de linhas de comprimento de onda 365, 398 nm, …, 734 nm
(lâmpada de altas pressões). Para lâmpadas baixas pressões risca a 254 nm.
44
Monocromadores
Dois monocromadores (1 de excitação e 1 de emissão)
1. A radiação do primeiro é separada: parte passa por um fotomultiplicador e outra
parte pela amostra.
2. A radiação resultante após dispersão pelo segundo monocromador é detectada
por um segundo fotomultiplicador.
45
Detector
Fotomultiplicadora
Aplica-se potencial elétrico crescente
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
48
Para obtermos um espectro de fluorescência temos de calibrar o aparelho com o
comprimento de onda λ correspondente à maior absorção da amostra.
49
Cela e Compartimentos
Cela cilíndricas ou retangulares, de vidro ou de sílica.
50
Cuidado
Devem ser tomados os maiores cuidados na execução das análises devido á
possibilidade da existência de contaminações de substâncias fluorescentes em
teores não detectável por outros métodos.
Mãos = gordura fluoresce !!!
51
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
52
Vantagens
• Elevada sensibilidade
• Limite de detecção 1µM
53
Desvantagens
• Elevado custo inicial de instalação
• Reprodutibilidade
• Calibração da resposta
• Sensibilidade (Impurezas)
54
Desvantagens
Contaminação do solvente ou da cubeta
DOI: 10.1039/C5AN01786F 55
Desvantagens
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Limitações da Fluorescência
• Nem todos os compostos fluorescem
• Fluoróforo precisa ter:
• Anel Aromático
• Ter conjugações estendidas
• Pelo menos um grupo doador de elétrons –OH, -NH2 ligado ao anel
aromático
• Um grupo retirador de elétrons pode diminuir ou destruir a fluorescência
57
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
58
Aplicações da Fluorescência
Fluorimetria é um método muito sensível e especifico e aplica-se a análises de:
§ Espécies e Produtos orgânicos
§ Alimentos
§ Produtos farmacêuticos
§ Amostras clínicas e produtos naturais
§ Anions
59
Água tônica
60
Microscopia de fluorescencia
61
Microscopia confocal
• Microscopia confocal
62
Fluoróforos
63
Diferenciação entre células vivas e mortas
Fluorescência (marcação de estruturas celulares e identificação de estruturas
vivas)
64
Medidas de cálcio
65
Quantum dots
66
Fluorescencia in vivo
67
Terapia Fotodinâmica
Terapia Fotodinâmica
Tópicos Abordados
Princípio da
técnica
Exercícios Instrumento
Técnica
Instrumental
Preparo da
Aplicações
amostra
Vantagens e
desvantagens
70
Exercício
Explique a diferença entre um espectro de fluorescência de emissão e um
espectro de fluorescência de excitação.
71
Exercício
Defina os seguintes termos:
(a) fluorescência,
(b) fosforescência,
(c) fluorescência ressonante,
(d) estado singleto,
(e) estado tripleto.
(f) relaxação vibracional.
(g) conversão interna,
(h) conversão externa,
(i) cruzamento intersistema.
(j) pré-dissociação.
(k) dissociação.
(1) rendimento quântico,
(m) quimiluminescência.
72
Exercício
Por que a espectrofluorimetria é potencialmente mais sensível do que a
espectrofotometria?
73
Exercício
Em quais compostos mostrados abaixo você espera um maior rendimento quântico
de fluorescência? Explique
Fenolftaleína Fluoresceína
o,o’-dihidroxiazobenzeno
74
Exercício
Por que alguns compostos absorventes fluorescem e outros não?
75
Exercício
Discuta as maiores causas da espectrometria de fosforescência molecular não ser
tão usada como a espectrometria de fluorescência molecular.
76
Exercício
A forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) é uma coenzima
importante e altamente fluorescente. Ela tem um máximo de absorção a 465 nm.
Soluções-padrão de NADH forneceram os seguintes valores de intensidade de
fluorescência:
Conc. NADH, umol/L Intnsidade relativa
0,100 2.24
0.200 4,52
0.300 6,63
0,400 9,01
0.500 10,94
0,600 13,71
0,700 15,49
0,800 17,91
77
Exercício (continuação)
(a) Construa uma planilha eletrônica e use-a para construir uma curva de
calibração para NADH.
(b) Encontre a inclinação e o intercepto por quadrados mínimos para o gráfico
de (a)
(c) Calcule o desvio padrão da inclinação e o desvio padrão da regressão para a
curva.
(d) Uma amostra desconhecida apresenta uma intensidade de fluorescência
relativa
de 12.16. Use a planilha para calcular a concentração de NADH.
(e) Calcule o desvio padrão relativo para o resultado da parte (d).
(f) Calcule o desvio padrão relativo para o resultado da parte (d) se a média de
três medidas foi 7.95.
78
Exercício
Um comprimido anti-malárico. contendo quinino, possui uma massa de 1.664 g foi
dissolvido com HCI 0.10 mol L-1 em quantidade suficiente para fornecer 500 mL
de solução. Uma alíquota de 20.00 mL foi então diluída para 100.0 mL com o
ácido. A intensidade da fluorescência para a amostra diluída, em 347.5 nm.
forneceu uma leitura de 245 em uma escala arbitrária. Uma solução-padrão de
100 ppm de quinino registrou o valor de 125. quando medida em idênticas
condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no comprimido original.
79
Exercício
um comprimido de 4.236 g foi dissolvido em HCl 0,10 mol L-1 suficiente para
fornecer 1,000 L. A diluição de uma alíquota de 20,00 mL para 100 mL resultou
em uma solução que forneceu uma leitura de 448 em 347,5 nm. Uma segunda
alíquota de 20,00 mL foi misturada com 10,0 mL de uma solução de 50 ppm de
quinino após diluição a 100 ml. A intensidade da fluorescência dessa solução foi
525. Calcule a porcentagem de quinino no comprimido.
80
Exercício
Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H2O2. A intensidade da
quimi-luminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro
(II) entre 10-10e l0-8 mol L-1.
Exatamente 1,00 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 mL de uma
solução de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 mL
de uma solução diluída de H2O2 e 1,00 mL de uma solução alcalina de luminol. A
quimi-luminescência da mistura foi integrada durante um período de 10.0 s e
apresentou o valor de 14,3. A uma segunda alíquota de 2,00 mL da amostra foi
adicionado 1,00 mL de uma solução de Fe(II) 3,58x10-5 mol L-1. seguida pelo
mesmo volume de H2O2, e luminol. A intensidade integrada foi 33,3. Encontre a
concentração de Fe (II) na amostra.
81
Exercício
O quinino é uma das moléculas fluorescentes mais bem-conhecidas e as
sensibilidades dos fluorímetros são frequentemente especificadas em termos do
limite de detecção para essa molécula. A estrutura do quinino é dada abaixo. Diga
qual parte da molécula tem maior probabilidade de comportar-se como cromóforo
e como centro fluorescente.
82
