TÉCNICAS DE LUMINESCÊNCIA MOLECULAR

Sumário:

Objectivos:

• Descrever a luminescência como processo de transdução energética concorrente com outros

processos de desactivação energética
• Descrever a fluorescência e a fosforescência como processos fotolumiescentes
• Abordar os aspectos químicos que influenciam a fotoluminescência molecular
• Relacionar a intensidade de fotoluminescência com a concentração de um fluoróforo
• Descrever a instrumentação usada em fotoluminescência
• Avaliar as potencialidades dos espectros na análise molecular
• Avaliar as potencialidades da fotolumescência quantitativa
• Abordar algumas aplicações na área biológica da fotoluminescência molecular
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para que serve:

Aplicações comuns:

• microconstituintes biológicos e ambientais

• detecção cromatográfica
• análise ambiental
• análise biológica in situ e citometria de fluxo
• estudos de movimentos macromuleculares
• estudos de fenómenos químicos rápidos

As técnicas de fotoluminescência molecular constituem a primeira alternativa à espectrofotometria

quando os níveis da entidade química a medir são inferiores a 10-5 mol/L
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o que é a luminescência:

Quando se diz que a matéria luminesce?

O fenómeno de luminescência (atómica ou molecular) caracteriza-se pela emissão de luz pela
matéria e decorre como consequência da absorção prévia de alguma forma de energia.

Ex: a energia química associada à reacção

enzimática de oxidação da luciferina é
responsável pela emissão de luz nos
pirilampos

HO S S HO S S

Mg2+
N N COOH N N O

luciferase
+ ATP + O2 AMP + PPi + CO2 + l = 560 nm
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o que é a luminescência:

O tipo de energia absorvida pode ser referido como prefixo na justificação do

processo luminescente:

Fonte de energia
Bioluminescência processo biológico
Electroluminescência campo eléctrico
Fotoluminescência radiação electromagnética
Quimiluminescência reacção química
Radioluminescência partículas carregadas
Sonoluminescência ondas mecânicas
Termoluminescência calor
Triboluminescência pressão ou fricção
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o que sucede na fotoluminescência:

PERDA DE ENERGIA ABSORVIDA

EMISSÃO DE AMORTECIMENTO REACÇÃO

UM FOTÃO NÃO RADIANTE QUÍMICA

redistribuição
energética

EXTRAMOLECULAR INTRAMOLECULAR

TRANSFERÊNCIA COLISÕES CONVERSÃO CRUZAMENTO

RESSONANTE N/ ELÁSTICAS INTERNA ENTRE SISTEMAS
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o que é a luminescência:

h
Isc.

ABSORÇÃO
Multiplicidade = 2x|spin|+1
Estado Estado Estado
fundamental excitado excitado
Singlete Singlete Triplete

S0 S1 T1
Isc. = cruzamento inter-sistemas

• Estado fundamental - dois electrões por orbital, os electrões têm spin oposto e estão
emparelhados.

• Estado excitado singlete - um electrão numa orbital de maior energia o qual tem a orientação
do spin oposto em relação ao electrão que se encontra na orbital de menor energia.

• Estado excitado tripleto - um electrão numa orbital de maior energia o qual tem a mesma
orientação do spin em relação ao electrão que se encontra na orbital de menor energia.
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o que sucede na fotoluminescência:

v’=4
v’=3
v’=2
v’=1 S1
S1
v’=0
T1

v=5
v=4
v=3
v=2
v=1 S0 S0
S0
v=0
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o que sucede na fotoluminescência:

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espectros do antraceno:

Deslocamento de Stokes
Intensidade (unid. arbitrárias)

absorção
emissão

275 325 375 425 475

comprimento de onda (nm)
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espectros do antraceno:

v’=5
v’=4
v’=3
v’=2
v’=1 S1
v’=0

v=5
v=4
v=3
v=2
v=1
S0
v=0
. Regra da imagem no espelho

Os níveis vibracionais nos estados excitados e estados fundamentais são semelhantes.

Um espectro de absorção reflecte os níveis vibracionais do estado electrónico excitado.

Um espectro de emissão reflecte os níveis vibracionais do estado electrónico fundamental.

O espectro de fluorescência de emissão é a imagem espelhada do espectro de absorção.

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fundamentos da fluorimetria e da fosforimetria

FOTOLUMINESCÊNCIA MOLECULAR:

FLUORIMETRIA – técnica analítica instrumental baseada na fotoluminescência molecular rápida que

decorre de transições electrónicas entre estados de singlete electrónico de modo quantificado e
proporcional à concentração.

FOSFORIMETRIA – técnica analítica instrumental baseada na fotoluminescência molecular lenta que

decorre de transições electrónicas entre estados de triplete excitado – singlete fundamental de modo
quantificado e proporcional à concentração.
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espectros do antraceno:

Como se pode avaliar a eficácia de luminescência de uma molécula?

RENDIMENTO QUÂNTICO:

IL
F= IA
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Transmitância na Lei de Beer ?

I0 I =I0 - IA I/I0 = 10 -.b.c
ou I = I010 -.b.c

ou IA=I0 - I IA = I0 – I010 -.b.c

lembrar que: IL
IL
F= IA IL =  I0 (1 - 10 -.b.c
)
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rendimento de luminescência e estrutura molecular:

- a intensidade de luminescência depende do tipo de transição:

n p* p p*
emax 10 – 1 000 1 000 - 10 000 L/mol.cm
Tempo de vida 10-7 - 10 -5 10 -9 - 10 –7
Cruz. entre sistemas elevado fluorescênc.

- possuir elevado grau de insaturação:

PIRENO VITAMINA A
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rendimento de luminescência e estrutura molecular:

- possuir rigidez estrutural:

(O impedimento estérico pode contribuir):

ausência de halogéneos:

EFEITO DE ATOMO PESADO – os halogéneos facilitam a ocorrência

de transições n p*. Quando presentes no solvente favorecem o

amortecimento dinâmico da fluorescência
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a instrumentação:

Na instrumentação usada em fluorimetria e fosforimetria, para além da geometria de detecção (90º

relativamente ao feixe incidente) destacam-se os seguintes componentes:

- fonte de elevada potência (F)

- 2 monocromadores com largura
F M C
efectiva de banda variável (M)
- um contador de fotões (CF)
- célula de sílica fundida (C)
- detector de elevada sensibilidade:
fotomultiplicador ou CCD (D)
M

D
CF
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fonte de radiação policromática:

lâmpadas de xenon a elevada pressão ou de descarga eléctrica

em vapor de mercúrio na instrumentação equipada com filtros.

PRECAUÇÕES:

• nunca olhar directamente para a lâmpada

• não deixar cair na sua substituição

• não deixar dedadas na lâmpada

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as células para fluorimetria:

Não é vulgar o emprego de células de

quartzo em medidas de fluorescência As células, de sílica fundida
pois este é naturalmente fluorescente ou plástico possuem 2 faces
devido às impurezas que contém. transparentes contíguas

IL
I0
Tal como na espectrofotometria de UV/VIS existem diferentes tipos de células disponíveis no mercado:
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Como se obtém um espectro de absorção e um de emissão num espectrofluorimetro?

M C
F

Variar o de
luminescência
(emissão)
M

Variar o de D
absorção
(excitação)
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aplicações de caracter quantitativo:

DETERMINAÇÃO FOTOLUMINESCENTE DE ESPÉCIES ORGÂNICAS:

a) Hidrocarbonetos poliaromáticos:

Ex: os Benzopirenos são compostos

cancerígenos normalmente determinados
por fluorimetria

b) Vitaminas – vitamina A (all-trans retinol) e a Vit. B 2 (riboflavina) são naturalmente fluorescentes.

Também a vitamina B1 após oxidação a tiocromo.

c) Pigmentos naturais – estruturas lineares como antocianinas, licopeno, carotenos e estruturas em anel
como as porfirinas.

d) O quinino é vulgarmente determinado for fluorimetria pelas industrias de bebidas.