Concentração

Potência a emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de

excitação que é absorvido pelo sistema

F = emissão de fluorescência
Po = potência do feixe incidente
P = potência após ter percorrido um comprimento b do meio
K’ = constante que depende da eficiência quântica da fluorescência

P
Lei de Beer  10bc
P
0
F  K´P (1  10bc )
0
 Concentração

A expansão do termo exponencial resulta em uma Série de Maclaurin :

(2,303bc) 2 (2,303bc)3
F  K´P [2,303bc   ...]
0 2! 3!

ε.b.c = A < 0,05: 2,303 ε.b.c é muito maior que os outros termos:

F  K´P [2,303bc]
0

P0 constante

F  Kc
 Concentração

Soluções diluídas: fluorescência proporcional à concentração

Desvios da linearidade:
- 2,303εbc > 0,05: outros termos são significativos
- auto-supressão
- auto-absorção
 Auto-supressão

Auto-supressão

Colisões entre moléculas Transferência de energia

excitadas não radiativa

 com a concentração
 ocorrência de colisões
 Auto-supressão

Antraceno em diclorometano
 Auto-absorção

Auto-absorção

 de emissão se superpõe a Fluorescência:

um pico de absorção emissão atravessa
a solução e é reabsorvida
por outras moléculas
fluorescentes

10-6

10-3

Antraceno em diclorometano
 Supressão de fluorescência

do inglês, Quenching

efeito que diminui a intensidade de fluorescência
o mecanismo pode envolver o estado excitado ou o fundamental do fluoróforo

Supressão dinâmica

Transferência de energia Contato entre supressor

não radiativa da espécie e espécie excitada
excitada para
outras moléculas

Supressão colisional

Rendimento quântico e
o tempo de vida
 Supressão de fluorescência

Supressão estática

Formação de um complexo
Tempo de vida
não fluorescente entre
não é afetado
supressor e fluoróforo no
estado fundamental
Espectros de excitação, fluorescência e fosforescência

Fenantreno
 Como medir a fluorescência?

Instrumentação similar à UV-VIS

Separar a radiação emitida daquela incidente utilizada para excitar a amostra
Fluorescência ocorre em todas as direções, mas é melhor observada quando medida à 90o
em relação ao feixe incidente
Configuração típica
 Configuração típica

Transmite a radiação que excita a

fluorescência, mas exclui ou limita a
radiação do  de emissão fluorescente.
 Ângulo reto  minimiza as
Configuração típica
contribuições do espalhamento e
da radiação intensa da fonte.

Transmite a radiação que excita a

fluorescência, mas exclui ou limita a
radiação do  de emissão fluorescente.
Isola a emissão da
fluorescência
 Componentes
FONTES DE RADIAÇÃO:
-lâmpadas de mercúrio (mais comum para fluorímetros), deutério, tungstênio e xenônio (para
espectrofluorímetros)
-diodos emissores de luz (450-475nm)
-lasers

SELETORES DE :
-filtros de absorção ou interferência
-monocromadores de rede

CÉLULAS DE MEDIDA:
-cilíndricas/retangulares
-vidro/sílica/quartzo

DETECTORES:
-fotomultiplicadoras
 Fluorímetro e espectrofluorímetro

Espectrofluorímetro – 2 monocromadores

Fluorímetro – apenas filtros

 Aplicações

Determinação de espécies inorgânicas

direta: formação de complexo fluorescente
supressão de fluorescência

Determinação de espécies orgânicas

produtos de plantas, esteróides, vitaminas

Sensores ópticos para a determinação de metais pesados

Reagente fluorescente sofre supressão na presença de metais pesados

Sensor para oxigênio usando fibra-óptica

Medidas de oxigênio parcialmente dissolvido
 Exercício

Um comprimido anti-malárico, contendo quinino, possui uma massa de 1,664 g, e foi

dissolvido com HCl 0,10 mol L-1 em quantidade suficiente para fornecer 500 mL de solução.
Uma alíquota de 20,00 mL foi então diluída para 100,0 mL com o ácido. A intensidade da
fluorescência para a amostra diluída, em 347,5 nm, forneceu uma leitura de 245 em uma
escala arbitrária. Uma solução-padrão de 100 ppm de quinino registrou o valor de 125,
quando medida em idênticas condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no
comprimido original.
 Fosforescência

Fosforescência geralmente ocorre em um comprimento de onda maior que a

fluorescência (ET < ES)

Diferença entre os comprimentos de onda dos dois processos é uma medida da

diferença de energia entre os estados singlete e triplete

Determinação de espécies bioquímicas como ácidos nucleicos, aminoácidos e enzimas

Necessário medidas à baixas temperaturas

Atualmente: pesquisas para medidas a temperatura ambiente

 Quimiluminescência
Reação química produz espécies em estados eletronicamente excitados, que emite luz
ao retornar para o estado fundamental.
Método altamente seletivo, simples e extremamente sensível.
Reação:
A + B → C* + D
C* → C + hν
onde C* representa o estado excitado da espécie C

Quimiluminescência x Bioluminescência

Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação

é proveniente de uma reação química (ao invés da absorção de fótons, em fluorescência)

Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência onde a

reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo
 Medida de quimiluminescência

A instrumentação para medida de quimiluminescência é muito simples e pode consistir

de somente um recipiente para a reação e um detector.

Geralmente não é necessário um dispositivo para seleção de comprimentos de onda,

uma vez que a única fonte de radiação é a reação química.

Sinal obtido:

Após a mistura de reagentes

Aplicações – análise de gases
Aplicações – espécies inorgânicas em fase
líquida
 Exercício

Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H2O2. A intensidade da

quimiluminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro (II)
entre 10-10 e 10-8 mol L-1.
Exatamente 1,00 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 mL de uma solução
de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 mL de uma solução
diluída de H2O2 e 1,00 mL de uma solução alcalina de luminol. A quimiluminescência da
mistura foi integrada durante um período de 10,0 s e apresentou o valor de 14,3.
A uma segunda alíquota de 2,00 mL da amostra foi adicionado 1,00 mL de uma solução
de Fe(II) 3,58x10-5 mol L-1, seguida pelo mesmo volume de H2O2 e luminol. A intensidade
integrada foi 33,3. Encontre a concentração de Fe(II) na amostra.