UNIVERSIDADE AGOSTINHO NETO

INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E SAÚDE PÚBLICA

TECNOLOGIA INSTRUMENTAL

ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA E VISÍVEL

Docentes:
Natália Fernandes, Msc.
&
Tatiana Gomes, Lic.

MAIO, 2019
 ESPECTROFOMETRIA ULTRAVIOLETA E VISÍVEL

GRUPO Nº03
ELEMENTOS DO GRUPO
Débora Constância Malungo Ntambu
Délcio Rosário Dala Caxoco
Denlson Jeremias Gabriel Námbua
Dionísia Sebastião Panzo

Docentes: Natália Fernandes, Msc.

&
Tatiana Gomes, Lic.

IIº-Ano/ 3º Semestre
Periodo: Diurno
Curso: Análises Clínicas e Saúde Pública

MAIO, 2019

I
 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Ƹ - a letra grega épsilon é a absortividade molar (com unidades de L/mol*cm)
π – ligação Pi no estado fundamental
π*- ligação Pi no estado excitado
σ - ligações sigma
A0 - Absorbância da amostra original
ASp - Absorbância da amostra contaminada
b- é camnho ótico, ou a distância que a luz deve percorrer através da amostra, em unidades de
cm.
C-concentração molar da espécie absorvente, em unidades de M, ou mol/L.
C0 - é a concentração do analito na amostra original.
Cs - concentração de analito na solução padrão
CSp -é a concentração total de analito na amostra que foi contaminada com uma quantidade
conhecida do analito.
FIA - do inglês flow injection analysis
k - é uma constante de proporcionalidade
K – Kelvin
MODY - do inglês Maturity onset diabetes of the young.
nm-nanometro, metro dividido por bilião.
P - poder da luz após a passagem através de uma amostra (poder transmitido)
P0 - poder radiante inicial da luz
pH- potencial de Hidrogênio
T- transmitância
UV-vis – Ultravioleta visível
V0- volume original da amostra
Vs - volume da solução padrão que foi contaminada na amostra

II
 ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1
2. OBJECTIVOS ................................................................................................................... 2
2.1. Objectivo geral ............................................................................................................. 2
2.2. Objectivos específicos ................................................................................................. 2
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................... 3
3.1. CONCEITOS ............................................................................................................... 3
3.2. HISTÓRIA DA ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL ............. 3
3.3. LEI DE BEER .............................................................................................................. 4
3.3.1. LIMITAÇÕES DA LEI DE BEER ...................................................................... 4
3.4. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL ................................................... 5
3.5. INSTRUMENTOS PARA A ESPECTROFOTOMETRIA DE ULTRAVIOLETA-
VÍSIVEL ................................................................................................................................. 6
3.5.1. INSTRUMENTOS DE FEIXE SIMPLES E DUPLO ....................................... 10
3.5.2. DISPOSITIVOS RELACIONADOS ................................................................. 11
3.6. MÉTODOS DE ESPECTROFOMETRIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL ................ 12
3.7. UTILIZAÇÃO DE ESPECTROFOTÔMETRO ....................................................... 14
3.8. REACÇÕES COLORIMÉTRICAS E SUAS CORRELAÇÕES .............................. 14
3.9. CUIDADOS EM ESPECTROFOTOMETRIA ......................................................... 17
4. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 18
5. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................. 19

III
 1. INTRODUÇÃO
O presente trabalho surgiu no âmbito do curso de licenciatura em Análises Clínicas e Saúde
Pública, lecionada no Instituto Superior de Ciências da Saúde (ISCISA) unidade órgânica da
Universidade Agostinho Neto, cujo objectivo é apresentar aos alunos do IIº ano um dos
métodos laboratoriais usados na análise quantitativa e obter nota para segunda prova de
Tecnologia Instrumental, cadeira lecionada pela Professora Natália Fernandes junto com a
Professora Tatiana Gomes.

O tema em estudo é a “Espectrofotometria Ultravioleta e visível”, e tem como objetivo

demostrar a importância da espectrofometria ultravioleta e visível para o analista clínico.
A espectrofotometria ultravioleta visível ou espectroscopia ultravioleta visível é utilizada
principalmente na análise quantitativa, ela é uma ferramenta valiosa usada de diversas
maneiras por laboratórios clínicas para estudar moléculas de interesse para o diagnóstico e o
tratamento de doenças, dando a conhecer as quantidades dessas moléculas em nosso
organismo (HAGE; CARR, 2012).

A elaboração deste trabalho deu-se em várias fases. Uma primeira fase onde foi feita a
fundamentação teórica, nomeadamente a definição dos conceitos chaves para melhor
entendimento do tema. A seguir falou-se sobre a história, sobre uma lei aplicada, sobre os
princípios gerais, instrumentos, métodos, como é feita a análise espectrofotométrica, algumas
análises colorimétricas e cuidados a ter quando usamos o espectrofotômetro.

Na segunda fase fez-se a conclusão, a referências bibliográficas onde constam os manuais em

que nos baseiamos para pesquisa desse trabalho, e por fim, tem os anexos, que apresentam
algumas imagens.
.

1
 2. OBJECTIVOS

2.1.Objectivo geral
 Desenvolver competências para utilização da espectrofometria ultravioleta e visível.

2.2.Objectivos específicos
 Enunciar a lei aplicada em espectrofometria;
 Falar sobre o local da medição do comprimento de onda em espectrofometria UV-vis;
 Identificar os compostos orgânicos medidos em espectrofometria UV-vis;
 Conhecer os componentes de um espectrofotômetro;
 Descrever os instrumentos usados em espectrofotometria UV-vis;
 Aprender acerca dos métodos de medição;
 Explicar como é utilizado o espectrofotómetro;
 Mostrar como são feitas algumas reações colorimétricas.

2
 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1.CONCEITOS
A espectroscopia refere-se ao campo da ciência que trata da mensuração e da interpretação da
luz que é absolvida ou emitida por uma amostra. Esse tipo de análise, muitas vezes, envolve o
uso de um espectro, que é o padrão que se observa quando a luz é seperada em suas diversas
cores, ou bandas espectrais (ver anexo I).

Espectrômetro ou espectrofômetro é um instrumento projectado para medir eletronicamente a

quantidade de luz que há em um espectro de uma determinada banda espectral ou de um
grupo de bandas.

Espectroscopia molecular pode ser definida como o exame das interações entre a luz e a
molécula. As moléculas podem absorver, emitir e dispersar luz. Todas essas interações podem
levar a informações químicas. Várias abordagens podem ser aplicadas a essas medições, como
a espectroscopia ultravioleta-vísivel (UV-vis), espectroscopia no infravermelho e a
espectroscopia de luminescência.

A espectroscopia ultravioleta visível (em geral chamada de espectroscopia UV-vis) é um

método comum de análise de moléculas e outros tipos de substâncias químicas. Essa técnica
pode ser definida como um tipo de espectroscopia que se destina a examinar a capacidade que
um analito tem de interagir com o raio ultravioleta ou com a luz vísivel por meio de absorção.

Colorimetria é uma técnica na qual o analito é combinado com um reagente que formará um
produto colorido.

Absorbância (A), é uma medida da absorção que se calcula usando-se o logaritmo de base 10
da Transmitância (HAGE; CARR, 2012).
A= - log(T)=log(P0/P) ou T=10-A

3.2.HISTÓRIA DA ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL

Em 1801, o alemão Johann Wilhelm Ritter decidiu pôr uma amostra de sal de prata na região
escura além do violeta. Qual não foi sua surpresa ao verificar que a reação de redução da prata
se dava com mais facilidade ainda. O inglês William Hyde Wollaston fez nessa época,
independentemente, a mesma descoberta. A conclusão desse experimento é que existe no
espectro solar uma radiação de energia mais alta que a luz violeta; a essa radiação, invisível a
nossos olhos, chamou-se ultravioleta (FILGUEIRAS, 1996).

A espectroscopia vísivel começou com a técnica chamada colorimetria. Plínio, o Velho, foi
um dos primeiros que, conhecidamente, usou colorimetria, por volta do ano 60 d.C., quando
recorreu a um extrato de noz-de-galha para testar a presença de ferro no vinagre. A
colorimetria continua sendo empregada na análise química moderna; exemplos comuns são o
uso de reações baseadas em cores dos testes caseiros para detecção de gravidez ou para o
monitoramento os níveis de colesterol no sangue (HAGE; CARR, 2012).
Nas décadas de 1830 e 1840 foram desenvolvidas métodos para medir as concentrações de
íons metálicos específicos em tubos delgados. Esse método foi desenvolvida em 1846 pelo
3
químico italiano Augustin Jacquelin para analisar Cu2+ na presença de amônio na água,
produzindo Cu(NH3)42+ como um produto colorido. Colorímetros de comparação visual ainda
são muito utilizados para medir uma variedade de substâncias em medições de campo (por
exemplo, químicos ambientes), de modo que as amostras não precisam ser levadas a um
laboratório para serem medidas (HAGE; CARR, 2012).

3.3.LEI DE BEER
A equação que atualmente chamamos de lei de Beer ou Lei de Beer-Lambert resultou de uma
pesquisa realizada por muitos cientistas ao longo de mais de 100 anos. Esse processo
começou em 1729, quando um cientista francês Pierre Bouguer (1698-1758) notou que a
mesma fração relativa de luz era absorvida por cada unidade adicional de distância que a luz
devia percorrer na matéria. A mesma observação foi feita mais tarde pelo físico alemão
Johann Lambert (1728-1777), que em 1760 publicou uma lei de absorção, na qual ele fornecia
uma descrição matemática da relação entre quantidade de luz absorvida e distância de
percurso. Essa mesma relação é representada em nossa versão moderna da lei de Beer-
Lambert pelo fato de que o comprimento do caminho de célula b é diretamente proporcional à
absorbância A, onde A=-log(P/P0).
Outra descoberta importante ocorreu em 1852, quando a descrição da absorção de luz foi
estendida a soluções pelo cientista alemão August Beer (1825-1863). Beer constatou que a
quantidade de luz que fosse absorvida por uma solução aquosa seria proporcional a
quantidade de uma substância química absorvente que estivesse presente na solução. Agora,
representamos esse conceito na lei de Beer-Lambert, mostrando a absorbância A como
proporcional a C, a concentração do analito. Beer também usou uma constante de
proporcionalidade para relacionar o grau de luz absorvida à concentração do analito.
Empregamos a mesma abordagem geral na versão moderna da lei de Beer-Lambert quando
usamos a absortividade molar (Ƹ) como uma constante para relacionar a absorbância medida
de uma amostra com a concentração de um analito e o comprimento do caminho de célula.
A absorbância de uma amostra homogênea pode ser relacionada à concentração de um analito
absorvente diluído por uma expressão chamada lei de Beer-Lambert, ou lei de Beer.
Lei de Beer: A= ƸbC

A lei de Beer é útil à análise química porque fornece uma relação linear entre absorbância
medida A de um analito e a concentração desse analito (C) (HAGE; CARR, 2012).

3.3.1. LIMITAÇÕES DA LEI DE BEER

A grande vantagem de lei de Beer é que ela pode ser usada para relacionar a concentração
com a absorção de luz para qualquer tipo de luz. Deve-se ter em mente, no entanto, que
existem várias suposições incorporadas a essa equação que limitam as circunstâncas de sua
utilização.

O 1º pressuposto na lei de Beer é que todas as espécies absorventes na amostra agem de forma
independente entre si, esse pressuposto torna a lei de Beer válida apenas para amostras
relativamente diluídas (isto é, quase sempre abaixo de 0,01 M).
4
A 2ª suposição incorporada à lei de Beer é que a absorbância da amostra é medida somente
por meio de luz monocromática (isto é, luz que contém apenas um comprimento de onda).
Não existe algo como uma luz perfeitamente monocromática, mas espectrômetros modernos
chegam bem perto de fornecer tal luz em medições de absorbância.

Uma 3ª suposição feita na lei de Beer é a de que toda a luz transmitida através da amostra tem
a mesma distância de percurso. Esse pressuposto exige que o caminho ótico b seja uma
constante para medição de uma determinada amostra.

Uma quarta suposição é que a concentração da espécie absorvente é constante em todo o

comprimento do caminho da luz através da amostra. Existem outras suposições inerentes à lei
de Beer (HAGE; CARR, 2012).

3.4.ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL

Uma luz na faixa ultravioleta ou visível tem a mesma quantidade de energia encontrada entre
os níveis de energia de alguns eletrões em moléculas. Se a energia dessa luz corresponde
exatamente à diferença em um dos níveis de energia, o eletrão se move de um orbital em um
estado de energia mais baixo para um orbital vazio em um estado de energia mais alto, se a
molécula absorver a luz (HAGE; CARR, 2012).

A absorção tanto do raio ultravioleta quanto da luz vísivel, em especial na faixa de 200-780
nm (ver anexo II), costuma envolver transições eletrônicas em moléculas por eletrões π ou
eletrões não ligantes (n) enquanto passam para um estado de eletrões excitados, π*. Por essa
razão, moléculas orgânicas somente com ligações simples e eletrões σ, mas sem eletrões π ou
elétrons não ligantes (n), tendem a não absorver nessa região do espectro UV-vis. Isso
significa que os hidrocarbonetos saturados não podem ser medidos por espectroscopia UV-vis
de rotina, porque contêm somente ligações simples e eletrões σ. No entanto, uma molécula
como colesterol, que contêm uma série de ligações duplas carbono-carbono e átomos de
oxigênios (que possuem eletrões não ligantes), tem uma absorbância intensa acima de 200 nm
(HAGE: CARR, 2012).

Cores Intervalos de nm
Ultravioleta (não visível) <380
Violeta 380-450
Azul 450-500
Verde 500-570
Amarela 570-590
Alaranjada 590-620
Vermelha 620-780

Tabela 01: Intervalos de comprimentos de onda (OLIVEIRA, 2012).

A porção de uma molécula que tem propriedades que lhe permitem absorver luz é conhecida
como cromóforo. Um cromóforo comum em uma molécula orgânica conterá ligações π (como
aquelas em ligações duplas ou triplas), e muitas vezes terá conjugação estendida (isto é, um

5
grande número de ligações sequencias duplas ou simples), que tendem a absorver o raio
ultravioleta ou luz vísivel com eficiência. Esse processo de absorção pode ser descrito pela lei
de Beer. A figura 1 mostra algumas absortividades molares comuns de cromóforos sejam
medidos em concentrações µM ou inferiores quando se usam um comprimento de onda de
detecção e um caminho ótico adequados à amostra (HAGE; CARR, 2012).

Figura 1- Exemplos de cromóforos em espectrofotometria ultravioleta visível.

Fonte: HAGE; CARR. 2012.

A absorção de luz na faixa ultravioleta ou visível também é possível no caso de iões metálicos
de transições eletrônicas que envolvem eletrões de camadas d ou f. Verifica-se esse elemento
lantanídeo e actinídeo na tabela periódca. Espécies quimicas capazes de se submeter à
absorção por transferência de carga também são bastantes importantes em muitos métodos de
ensaio por causa de sua grande absortividade molar e facilidade de medição por
espectroscopia UV-vis. Esse tipo de absorção de luz ocorre em muitos complexos inorgâncos
(HAGE; CARR, 2012).

3.5. INSTRUMENTOS PARA A ESPECTROFOTOMETRIA DE

ULTRAVIOLETA-VÍSIVEL
Componentes de sistema comuns. O instrumento usado para examinar a absorção de luz e
espectrofotometria UV-vis é conhecido como espectrofotômetro de absorbância UV-vis. Um
espectrofotômetro de absorção tem quatro componentes básicos: uma fonte de luz, um meio
de selecionar um determinado tipo de luz para análise, um recepiente de amostra e um
detector. Um de espectrofotômetro absorção UV-vis tem todos esses componentes, mas cada
um deles pode ser capaz de lidar com o raio ultravoleta ou a luz vísivel.

6
Fonte de luz: Uma fonte de luz comum para a luz visível é uma lâmpada de tungsténio, como
a ilustrada na figura 2. Nesse dispositivo, um filamento de tungsténio aquecido libera um
amplo espectro de luz com intensidade e comprimento de onda máximos que dependem da
temperatura do fio. Esse tipo de emissão de luz é conhecido como radiação de corpo negro. O
tungstênio é usado na lâmpada porque pode ser aquecido a uma temperatura mais alta do que
qualquer outro metal se que ocorra fusão, tornando possível a obtenção de comprimentos de
onda de emissão ampla e intensa com esse material. A uma temperatura normal de
funcionamento (2.000 a 3.000 K), o comprimento de onda de emissão máxima é de cerca de
1. 000 nm para uma lâmpada de tungstênio, com uma faixa utilizável que abrange de 320 a
2.500 nm.

Figura 2- Concepção geral de uma lâmpada de tungstênio, na lâmpada tungstênio/halogênio

inclui um pouco de I2 na câmara que envolve o filamento de tungstênio.
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

Uma forma modificada do esquema anterior é a lâmpada de tungstênio/halogênio. Nesse

dispositivo, uma pequena quantidade de iodo também está presente no interior da lâmpada de
tungstênio. À medida que o tungstênio esquenta, pequenas quantidades de átomos de
tunsgstênio sublimarão da superficie e cobrirão o interior da lâmpada com um sólido cinza. A
presença do iodo, porém, fará os átomos em fase gasosa do tungstênio reagirem para formar
iodeto de tungstênio(II), WI2.
W+I2 WI2

wI2 é estável a baixas temperaturas, mas, se uma molécula de WI2 atinge o filamento de
tungstênio quente, ela se decompõe e coloca o tungstênio de volta no filamento (os átomos de
iodo também se recombinam para formar I2 como parte do processo). Dessa forma, cria-se
uma lâmpada mais estável que pode ser operada a uma temperatura mais elevada (até 3.600
K) e com emissão de luz mais intensa. A lâmpada pode emitir luz com comprimentos de onda
de até cerca de 3.000 nm. Ambas as lâmpadas, de tungstênio e de tungstênio/halogênio, são
principalmente utilizadas na região visível do espectro, e emitem quase toda a sua radiação
como luz infravermelha ou visível. O resultado é que um tipo diferente de fonte de luz é
necessário para o trabalho na região ultravioleta em espectroscopia UV-vis.
A lâmpada de hidrogênio e a lâmpada de deutério são duas outras fontes de luz que podem ser
usadas em espectroscopia UV-vis. Ambas se compõem de dois eletrodos inertes através dos

7
quais uma alta voltagem é imposta a um bulbo de quartzo que está preenchido com H2 ou D2
a baixa pressão. A presença de alta voltagem resulta na excitação de H2 ou de D2, e em sua
dissociação em átomos H ou D com emissão de luz. Esse tipo de luz fornece uma fonte
continua de radiação na região ultravioleta por meio de luz que é emitida quando um elétron
cai de um nivel de energia não quantizado para o orbital n=2 do que havia sido um ião
hidrogênio de fase gasosa. Lâmpadas de hidrogênio e deutério fornece uma radiação
ultravioleta como uma faixa continua que se estende desde cerca de 180 a 370 nm. A lâmpada
de deutério é mais comum em laboratórios modernos porque produz uma emissão de luz mais
intensa do que a de hidrogênio.

Meio de seleccionar um determinado tipo de luz: O seletor de comprimento de onda (ou

monocromador) em um instrumento de absorbância consiste em geral em uma fenda estreita
através da qual a luz, entra em um dispositivo para separar a luz em seus vários comprimentos
de onda e em outra fenda estreita através da qual se permite que uma parte especifica da luz
saia e passe para amostra e para o detector. Instrumento para medição de absorção em
espectroscopia UV-vis costumam usar um prisma ou uma grade para separar a luz. A
utilização de um prisma para esse fim é demonstrada na figura 3. Prismas usados na região
visivel são feitos de vidro. A diferença no índice refrativo do vidro em função do
comprimento de onda cria a separação da luz em suas várias cores. Quanto maior essa
mudança de ângulo no comprimento de onda, mais eficaz será a separação da luz com
comprimentos de onda nessa faixa do espectro.

Figura 3- Uso de um prisma (à esquerda) ou de uma grade de reflexão (à direta) para separar a
luz contendo vários comprimentos de onda.
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

Existem dois tipos de grade que serve como monocromadores (grade de transmissão e grade
de reflexão).

A grade de transmissão é aquela em que se produz difração fazendo-se com que a luz passe
através de uma grade composta por uma série de pequenas fendas que criam interferência
construtiva e destrutiva da luz. Diferentes comprimentos de onda de luz têm diferentes
ângulos em que eles vão produzir uma interferência construtiva, tornando possivel, assim,
selecionar esses comprimentos de onda para uso em medições de absorbância.

Uma grade de reflexão é mais comum em instrumentos modernos. Esse tipo usa uma
superficie polida e reflexiva que tem uma série de degraus paralelos e espaçados cortados em
sua superficie, como também ilustra a figura 3. Quando um feixe de luz é refletido em sua
superficie, novamente se criam padrões de interferência construtiva e destrutiva em que
8
determinados ângulos têm interferência construtiva para determinados comprimentos de onda.
Alterar a orientação e o ângulo de amostra de uma grade, seja de transmissão, seja de
reflexão, pode permitir que os comprimentos de onda desejados de luz com interferência
construtiva atinjam uma fenda de saída e passem para amostra e detector para uso em
medições de absorbância.

Recepiente de amostra: O recepiente da amostra em espectroscopia UV-vis é em geral uma

cubeta na qual se coloca uma amostra ou uma solução-padrão. A cubeta deve ser transparente
para os comprimentos de onda de luz a serem utilizados na medição e ter uma geometria bem
definida. As cubetas para trabalhar com a luz na região visível costumam ser feitas de vidro
ou de plástico transparente. Para lidar com raios ultravioleta, cubetas de quartzo ou de sílica
fundida são necessárias, porque o vidro e muitos tipos de plástico absorvem esse tipo de luz.
Muitos espectrômetros modernos usa cubetas com uma seção transversal quadrada e um
comprimento de caminho ótico de 1,00 cm. Entretanto, alguns instrumentos usam cubetas
parecidas com tubos de ensaio cilíndricos com caminho ótico mais longo (HAGE; CARR,
2012).

Figura 4- Cubeta.
Fonte: https://www.infoescola.com/wp-content/uploads/2011/06/cubeta.jpg
Detectores: Muitos detectores usados para monitorar raios ultravioleta ou luz visível fazem
uso de efeito fotoelétrico, que ocorre quando a luz incide sobre certas substâncias e provoca a
ejeção de um eletrão a partir da superfície. Tal efeito pode ser usado em um fototubo ou em
tubo fotomultiplicador para detectar a luz (veja um exemplo disso na figura 5). Ambos os
dispositivos são projectados de modo que a luz possa penetrar neles e atingir uma substância
fotoativa. O resultado é a produção de eletrões e de uma corrente que é proporcional em
tamanho ao número de fotões que atingiram a superfície fotoativa. A absorção de um maior
número de fotões pela amostra resultará em um fluxo menor atingindo o fototubo e uma
medição reduzida de corrente (HAGE; CARR, 2012).

9
Figura 5- Componentes de um fototubo.
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

Espectrofotômetros variam em relação ao visual externo, mas têm o mesmo princípio,

podendo ser equipamento isolado ou parte de um analisador. No espectrofotômetro, uma fonte
fornece o feixe de luz que passa por um monocromador equipado com um prisma de difração
que dispersa a luz em um espectro. Uma fenda estreita isola um raio de luz monocromático
(de apenas um comprimento de onda) que é selecionado pelo operador segundo a análise que
será executada. A luz monocromática é dirigida para cubeta que contém a solução colorida. A
luz que passa através de solução é detectada por uma célula fotoelétrica, que converte em uma
corrente elétrica que é medida e convertida em leitura digital (ver anexo III e IV)
(ESTRIDGE; REYNOLDS, 2011).

3.5.1. INSTRUMENTOS DE FEIXE SIMPLES E DUPLO

Dois tipos comuns de dispositivo de espectroscopia UV-vis são os instrumentos de feixe
simples e de feixe duplo. Como o próprio nome indica, um instrumento de feixe simples tem
um único caminho para que a luz percorra através do instrumento, como mostra a figura 6. A
luz nesse instrumento se origina da fonte, um comprimento de onda é selecionado por meio de
monocromador, essa luz é transmitida pela amostra em uma cubeta e a intensidade da luz
remanescente é medida por um detector, visto que transmitância a absorbânca são definidas
em termos da relação da intensidade de luz que passa através da amostra dividida pela
intensidade de luz que está entrando na amostra, deve haver uma forma de medir ambas as
quantidades nesse dispositivo. Em um instrumento de feixe simples, o dispositivo é, primeiro,
ajustado de modo a gerar uma leitura de 0 por cento de transmitância quando o obturador é
fechado e nenhuma luz atinge a amostra (a corrente escura). O instrumento é em seguida
ajustado para uma leitura de 100 por cento de transmitância (ou A=0) quando uma solução
(branco), que não contém analito, está disponível. Em seguida, a amostra é introduzida e seu
percentual de transmitância (% T) ou absorbância é medido. Com instrumentos mais antigos
de feixe simples, deve-se redefinir a corrente escura e a corrente 100 por cento T sempre que
o comprimento de onda é alterado. Nos instrumentos modernos de feixe simples, um
computador lembra as configurações durante a coleta de todo um espectro. Um possível
problema é que intensidade de luz ou resposta do detector pode sofrer alteração entre os
momentos em que o instrumento é ajustado e a amostra é analisada. Tal alteração, se não for
corregida, pode gerar um erro sistemático no resultado final (HAGE; CARR, 2012).

10
Figura 6- Espectrofotômetro de feixe simples.
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

Um instrumento de feixe duplo em espectroscopia é um dispositivo no qual o feixe original de

luz se divide de tal forma que metade dela passa através de uma solução de referência (ou
branco), enquanto a outra metade passa pela amostra (HAGE; CARR, 2012).

Figura 7- Espectrofotômetro de duplo feixe.

Fonte: HAGE; CARR, 2012.
Esse tipo de instrumento mostrado na figura 7 ajuda a minimizar os erros causados por
qualquer desvio na intensidade da lâmpada ou na resposta de detector. Se a intensidade da
lâmpada ou a resposta de detector for alterada, essa mudança afetará tanto o sinal da amostra
quanto o da referência, enquanto a razão desses sinais permanecerá inalterada.

3.5.2. DISPOSITIVOS RELACIONADOS

Outra estrutura de espectrofotômetro UV-vis é a baseada em um detector de arranjo de diodo
(figura 8). esse dispositivo difere de um espectrofotômetro padrão na medida em que o
monocromador possui uma fenda de entrada, mas nenhuma fenda de saída, o que permte que
a luz de muitos comprimentos de onda entre na amostra e seja detectada simultaneamente por
um conjunto de detectores de diodo de pequeno porte. Nesse arranjo, cada diodo monitora
uma pequena faixa de comprimento de onda que foram separados após terem passado através
da amostra. O processo permite a medição simultânea do espectro inteiro de uma amostra.
Esses são instrumentos de feixe simples com um computador que lembram o sinal em todos
os comprimentos de onda da corrente escura e o sinal de 100 por cento T, bem como monitora
a luz em cada um dos fotodiodos no detector múltiplo.

11
Figura 8- Concepção geral de um detetor de arranjo de diodo na espectroscopia.
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

A análise por injeção em fluxo (FIA, do inglês flow injection analysis) é uma forma útil de
usar espectroscopia UV-vis para realizar um grande número de análises de rotina em um curto
período de tempo. Nessa abordagem, amostras são injectadas em sequência em um fluxo
contínuo de reagente, que então reage com o conteúdo das amostras para produzir um produto
colorido. Após o desenvolvimento da cor, o fluxo contínuo passa através de um
espectrofotômetro que faz parte do sistema FIA (veja figura 9). A absorbância da solução que
resulta da reacção do analito com o reagente corante é medida, permitindo que se determine a
concentração do analito. As análises mais desejáveis de FIA são aquelas em que o produto
colorido se forma rapidamente, de modo que apenas alguns segundos decorrem entre a
injeção da amostra no fluxo de reagente e a medição de sua absorbância. A FIA é muito usado
em laboratório em que os mesmos analitos são monitorados com regularidade e em um grande
número de amostras. Um bom exemplo é o uso da FIA e de dispositivos relacionados
baseados em fluxo para determinar a concentração de colesterol em amostras de sangue em
um laboratório clínico (HAGE; CARR, 2012).

Figura 9- Exemplo de um sistema para realizar análise por injeção em fluxo (FIA).
Fonte: HAGE; CARR, 2012.

3.6.MÉTODOS DE ESPECTROFOMETRIA ULTRAVIOLETA VISÍVEL

Medições diretas. O uso mais comum de espectrofotometria na análise química está na
medição direta de analitos por meio da colorimetria. O termo colorimetria é com frequência
usado para descrever o uso de espectrometria na região visível do espectro, onde se pode
observar visualmente a cor de uma amostra. Essa abordagem também pode ser usada na forma
de medições direitas feitas por instrumentos na região ultravioleta. Nessa técnica, a
concentração de um analito é determinada pela comparação da absorbância de uma
concentração desconhecida de uma substância com a absorbância de uma concentração
conhecida do mesmo material. A lei de Beer é, então, utilizada para relacionar a absorbância
medida de uma substância à sua concentração.
12
Se a absorbância molar do analito é conhecida e uma amostra tem uma absorbância de fundo
conhecida ou insignificante, a concentração do analito pode ser determinada diretamente pela
lei de Beer. Embora tal método de ponto único seja simples de executar, muitas vezes está
sujeito a erros, caso a amostra e o padrão não estejam ambos na região de resposta linear da
lei de Beer ou caso haja diferenças nas condições, como o pH da solução ou pequenas
variações no comprimento de onda de detecção que tenham sido usadas para examinar essas
soluções.

Método de adição de padrão. Outra abordagem aplicável à espectroscopia UV-vis para

medição de analitos é método de adição de padrão. Trata-se de uma técnica usada para
determinar a concentração de um analito em uma amostra que tem uma matriz ou condições
de solução (como pH e força iônica) difíceis de reproduzir em uma solução-padrão. Para
assegurar que esses parâmetros sejam os mesmos no padrão e na solução desconhecida, o
material-padrão é adicionado diretamente a uma fração da amostra que foi contaminada com o
padrão são medidos e usados para calcular a concentração de analito na amostra original.
A derivação a seguir pode ser aplicada para ilustrar como esse método funciona. Primeiro,
precisamos supor que o sinal que mediremos para a amostra ou o padrão será proporcional à
concentração do analito em cada um. Podemos representar essa ideia de medições de
absorbância por meio das seguintes relações,
Absorbância da amostra original: A0 = k C0 1
Absorbância da amostra contaminada: ASp = k CSp 2

Onde C0 é a concentração do analito na amostra original, CSp é a concentração total de analito

na amostra que foi contaminada com uma quantidade conhecida do analito e k é uma
constante de proporcionalidade, (Observação: k=Ƹb, para uma medida de absorbância com
base na lei de Beer.) Supomos que a constante k seja a mesma para a amostra original e
também para a amostra contaminada, o que deve ser verdadeiro se elas contêm a mesma
matriz e trabalhamos na faixa linear da lei de Beer. Também supomos, nesse caso, que não
haja absorção de fundo da amostra ou de sua matriz.

Além das absorbâncias medidas da amostra original e da amostra contaminada, também

conhecemos nesse método (1) o volume original da amostra (V0), (2) o volume da solução
padrão que foi contaminada na amostra (Vs) e (3) a concentração de analito na solução padrão
(Cs). Essas informações podem ser combinadas para determinar o valor de C0, que é o
objectivo do método de adição de padrão. Para isso, dividimos a Equação 1 pela equação 2
para calcular a razão A0/ASp e fazer a substituição com base no fato de que CSp = (C0 V0 + CS
Vs)/(V0 +Vs)
𝐴0 𝐶0(𝑉0 + 𝑉𝑠)
=
𝐴𝑠𝑝 𝐶0𝑉0 + 𝐶𝑠𝑉𝑠
Com essa equação combinada, podemos usar a razão medida A0/Asp para calcular o valor de
C0, pois conhece os valores de todos os outros termos da expressão.

13
 3.7. UTILIZAÇÃO DE ESPECTROFOTÔMETRO
 Ligar o espectrofotômetro e esperar 30 min para aquecimento e estabilização dos
circuitos.
 Ajustar o comprimento de onda (nm).
 Colocar a estrutura escura (cubeta). Feche a tampa e aperte 0%T (zerar selecionando o
T). Escolher o T entre os indicadores A e T. Com isso você calibrou o 0% da
Transmitância.
 Preencha uma das cubetas com água destilada ou o solvente usado puro.
 Colocar a cubeta com o branco no compartimento de amostras.
 Ajustar o branco apertando 0A/100%T. Ou dependendo do modelo, apenas zerar
selecionando o A.
 A amostra deve ser preparada com a quebra da mesma por métodos mecânicos,
químicos ou físicos.
 A amostra é solubilizada no solvente escolhido em um balão volumétrico limpo e
seco. Importante: o solvente na maioria das vezes é água Destilada, porém, quando
tratar-se de amostras apolares que precisam ser diluídas em solventes orgânicos
NUNCA utilize Alcenos, alcinos, cetonas ou qualquer outro que tenha ligações C=C
Ou C=O ou ligações triplas.
 A amostra deve ser filtrada em uma membrana de 0,2 μm, por que a solução deve
estar totalmente límpida a fim de diminuir ao máximo o erro causado por partículas
em suspensão. A cubeta contendo o branco é retirada do equipamento e sua absorção
anotada. Após esse processo a solução de interesse é lida, e dessa absorbância é
subtraído a leitura do branco (MUNDO DA BABSI, 2015).

A estrutura externa do espectrofotômetro varia de acordo ao modelo, por isso antes de usar
um espectrofotômetro é melhor ler o manual de instrução do instrumento.
3.8.REACÇÕES COLORIMÉTRICAS E SUAS CORRELAÇÕES

Com alguma freqüência é necessário quantificar substâncias em misturas complexas, ou que

não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda, assim, utiliza-se os
chamados métodos colorimétricos. Neles uma determinada substância entra em contato com
um reagente específico produzindo então uma cor (ver anexo V), cuja intensidade, é
diretamente proporcional à concentração da substância na mistura original (GORDON, 1995).

Neste contexto, ao longo das pesquisas na área da Bioquímica, várias reações foram
desenvolvidas das quais detectam, especificamente, a presença de biomoléculas em soluções
desenvolvendo cores variadas. Assim, tais reações puderam ser utilizadas para a determinação
qualitativa e quantitativa de biomoléculas em diversas amostras, sendo então aplicadas às
análises clínicas para diagnósticos de diabetes, lipidemias, colesterolemias, proteinúrias e
produtos nitrogenados como ácido úrico, uréia e amônia, enzimas como amilase, lípase,
fosfatase alcalina, fosfatase ácida, aminotransferases, lactato desidrogenas entre outras, além
de íons como cálcio, sódio e potássio (OLIVEIRA, 2012).

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 Determinação de glicose pelo método da O-toluidina: Nesse método a glicose reage com a
o-toluidina (orto-toluil) em meio ácido e a quente, resultando glicosamina e base de Schiff
correspondentes. Esta reacção desenvolve cor azul que é proporcional à quantidade da glicose
até 200 mg/dL presente na amostra que pode ser soro, plasma, urina ou liquor. Os valores
normais do soro ou plasma é de 75 a 100 mg/dL, sangue total de 80 a 120 mg/dL, urina zero
(ausente) e a leitura espectrofotométrica é feita entre 600 a 650 nm (CISTERNAS et al.,
2005).

A dosagem de glicose é amplamente utilizada na determinação da glicemia. Esta dosagem

torna-se extremamente importante no diagnóstico de doenças como a diabetes mellitus (tipo 1
e tipo 2), diabetes mellitus gestacional, diabetes tipo MODY (do inglês, Maturity onset
diabetes of the young) (SBEM, 2004).

Para o diagnóstico do diabetes, devem ser seguidos métodos e critérios específicos dos quais
irão determinar glicemia casual, glicemia de jejum, glicemia pós-prandial, glicosúria entre
outros sinais clínicos (OLIVEIRA, 2012).

Determinação de Lipídios Totais: Os lipídios totais incluem os triacilgliceróis, colesterol e

seus ésteres, ácidos graxos não esterificados, fosfolipídeos, hormônios esteroidais e vitaminas
lipossolúveis (CHAMPE et al., 2006).

O material que é utilizado é o soro do qual é aquecido em banho-maria fervente em presença

de ácido sulfúrico concentrado. O reativo de fosfo-vanilina reage com uma fração de soluça
sulfúrica, para formar um composto de coloração rósea, cuja intensidade de cor é proporcional
à concentração de lipídios totais da amostra, sendo os valores normais de referência de 20 a
30 anos de idade de 400 a 700 mg/dL e acima dos 30 até 900 mg/dL e a leitura
espectrofotométrica deve ser feita entre 500 a 550 nm (CISTERNAS et al., 2005).

Determinação de Uréia A uréia constitui 45% do nitrogênio não-protéico no sangue. É

sintetizada no fígado a partir do dióxido de carbono e amônia, sendo esta proveniente da
desaminação dos aminoácidos, em todos os tecidos, como produto final do catabolismo
protéico (MOTTA, 2000).

Após sua síntese hepática, a uréia é transportada pelo plasma até os rins, onde é rapidamente
filtrada pelos glomérulos, é excretada na urina, embora mais de 40% seja reabsorvida por
difusão passiva durante a passagem do filtrado pelos túbulos. O nível no plasma é
notadamente afetado pela função renal, pelo conteúdo protéico da dieta e pelo teor de
proteólise. O fundamento da determinação da uréia basea-se na hidrólise ácida da
diacetilmonoxima à diacetil, a qual reage diretamente com a uréia na presença de
tiosemicarbazida (que intensifica a cor) e íons de cádmio (que estabiliza a cor). Assim, forma
um derivado diazídico de coloração rósea, cuja intensidade é diretamente proporcional à
concentração de uréia presente na amostra. Os valores normais para soro ou plasma de 15 a 40
mg/dL e na urina até 50mg/dL (LABTEST, 1999).

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Determinação de ácido úrico: No homem o ácido úrico é o principal produto do catabolismo
das purinas, bases nitrogenadas adenina e guanosina, sendo formado principalmente no
fígado, a partir da xantina pela ação da enzima xantina oxidase ( GARCIA; KANAAN, 2008).

O teor de urato encontrado no plasma, que está ao redor de 6m/dL, representa o equilíbrio
entre a produção (700 mg/dia) e a excreção pela urina (500 mg/dia) e fezes (200 mg/dia). O
ácido úrico é transportado pelo plasma até os rins, onde é filtrado pelos glomérulos. Quase
todo o ácido úrico é reabsorvido pelos túbulos proximais e pequenas quantidades são
secretadas pelos túbulos distais e excretadas na urina. Os triglicerídeos, os corpos cetônicos e
o lactato competem com o urato na excreção renal. Parte do urato é excretado pelo trato
gastrointestinal e degradado pelas enzimas bacterianas (MOTTA, 2009).

É pequena a contribuição dos ácidos nucléicos da dieta nos níveis de ácido úrico circulante,
pois aqueles são degradados no intestino pela xantina oxidase da mucosa e somente, em
quantidades mínimas, são absorvidos e canalizados para os processos metabólicos
intracelulares (CHAMPE, et al., 2006).

O fundamento da determinação de ácido úrico basea-se na oxidação do ácido à alantoína e

dióxido de carbono pela ação do ácido fosfotúngstico em meio alcalino. Ao mesmo tempo, o
ácido fosfotúngstico é reduzido a azul de tungstênio, produzindo uma coloração cuja
intensidade é diretamente proporcional à concentração do ácido úrico presente na amostra. A
leitura espectrofotométrica de 680 a 730 nm e os valores normais para o homem é 2,5 a 7
mg/dL de soro ou plasma e para a mulher é 1,5 a 6 mg/dL (MOTTA, 2009).

Determinação de Amônia A amônia é produzida pela desaminação oxidativa dos

aminoácidos provenientes do catabolismo protéico. Entretanto, a maior parte a amônia é
absorvida do trato gastrointestinal, onde é formada pela degradação bacteriana das proteínas
da dieta e desdobramento da uréia presente nas secreções intestinais. Embora a amônia, em
baixas concentrações, seja um metabólito normal no sangue, em teores elevados torna-se
neurotóxica. A maior parte da mesma é detoxificada pelas células hepáticas em uréia, e nesta
forma, excretada. Parte da amônia é incorporada, temporariamente, à glutamina, que nos rins
sofre ação da glutaminase, sendo então excretada também na urina (RHOADES E TANNE,
2005).

Em enfermidades hepáticas severas, a amônia não é removida da circulação e os níveis

sanguíneos se elevam. Diferentemente de outras substâncias nitrogenadas não protéicas, os
teores plasmáticos da amônia não dependem do funcionamento dos rins, mas da função
hepática, assim, não servindo de parâmetro para a função renal (MOTTA, 2009).

O método enzimático é um dos vários métodos que permite determinar a concentração de

amônia no plasma. Este método emprega a enzima glutamato desidrogenase na reação da
amônia com o alfa-cetoglutarato, na presença de NADPH. Sob condições apropriadas, a
redução da absorbância em 340 nm é proporcional à concentração da amônia. Em adultos
normais, o nitrogênio amoniacal varia de 35 a 120 μg/dL ou 43 a 146 μg/dL de amônia
(MOTTA, 2000).
16
3.9.CUIDADOS EM ESPECTROFOTOMETRIA

 É imprescindível que o equipamento seja calibrado e manuseado de acordo com as

instruções do fabricante, por ele já traz a margem de erro que o aparelho tem;
 Evitar erros de leitura certificar-se de que o equipamento esteja fechado. Antes da
leitura a luz do ambiente pode interferir no resultado;
 Manter sempre limpo e fechado a fim de evitar o acumulo de partículas de poeira que
interferem na análise.
 Só podem ser analisados por espectrofotometria de absorção compostos que absorvem
luz.

 É preciso ter cuidado ao manusear as cubetas, mesmo uma ligeira impressão digital
pode interferir nos resultados. É muito importante não tocar na superfície óptica da
cubeta, pois óleos de sua pele, partículas de tecidos de limpeza, poeira e outros
contaminantes podem afetar as leituras. A utilização e limpeza corretas são a base de
qualquer análise espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
 As cubetas não devem ser secas por aquecimento em uma estufa ou chama porque isso
pode provocar danos físicos e/ou mudar o caminho óptico (MONDRAGON, 2018).

17
 4. CONCLUSÃO
Depois das pesquisas feitas sobre espectrofotometria ultravioleta visível concluimos que a lei
aplicada em espectrofotometria é a lei de Beer que é usada para relacionar a concentração
com absorção de luz. Absorção de luz na faixa ultravioleta ocorre entre 200-380 nm e na faixa
visível ocorrem entre 380-780 nm envolvendo transiçõess electróncas, os compostos
orgânicos saturados não podem ser medidos na região ultravioleta visível porque contem
ligações simples e electrões sigmas, já os compostos contendo ligações duplas e triplas com
eletrões π e sigmas podem ser medidas nessa região.
Os componentes básicos do espectrômetro de absorção são fonte de luz, monocromador,
cubeta, e detector. A fonte de luz pode ser de tunsgestênio para radiação visível e de
hidrogênio ou deutério para radiação ultravioleta. A cubeta pode ser de vidro e de plástico
transparente para radiação visível e de quartzo e silica fundida.
Os dispositivos de espectroscopia comum são dois o de feixe simples e de feixe duplo. O
dispositivo de feixe simples tem um único caminho para que a luz percorra através do
instrumento, já o de feixe duplo divide a luz de tal forma que a metade passa atravéz da
solução branca e a outra métade passa pela amostra. Os dispositivos relacionados são o
detector de arranjo de diodo e análise de injeção de fluxo.
Os métodos utilizados são de medição direita que é feita por meio da colorimetria, e o método
de adição padrão que serve para determinar a concentração de um analito em uma amostra de
solução díficil de reproduzir.
Esta técnica tornou-se fundamental para a determinação de diagnósticos laboratoriais. Neste
contexto, inúmeras doenças puderam ser diagnosticadas pelo uso de técnicas colorimétricas
específicas, possibilitando também compreender melhor a fisiopatologia dessas enfermidades.
A rotina laboratorial de espectrofotometria possibilitou o desenvolvimento e o aprimoramento
de métodos de determinação de biomoléculas.

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 5. BIBLIOGRAFIA
CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A.; FERRIER, D.R. Bioquímica Ilustrada. 3ª edição. Porto
Alegre: ArtMed, 2006.

CISTERNAS, J.R.; VARGAS, J.; MONTE, O. Fundamentos de Bioquímica Experimental.

São Paulo: Editora Atheneu, 2005.

ESTRIDGE, B. H.; REYNOLDS, A. P. Técnicas básicas de laboratório clínico. 5ª edição.

Porto Alegre: Artmed, 2011.
FILGUEIRAS, C. A. L. A espectroscopia e a química da descoberta de novos elementos
ao limiar da teoria quântica. 3ª edição. 1996. Disponível em:
<http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc03/historia.pdf>. Acesso em 26 de Abril de 2019.

GARCIA, M.A.T.; KANAAN, S. Bioquímica Clínica. São Paulo: Editora Atheneu,

Universidade Federal Fluminense, 2008.

GORDON, D.B. Spectroscopic Techniques. in Principles and Tecnhiques in Pratical

Biochemistry. K. Cambridge: Cambridge University Press, 1996.
HAGE, D. S.; CARR, J. D. Química Analítica e Análise Quantitava. Pearson, São Paulo,
2012.

LABTEST Diagnóstica. Uréia CE – instruções de uso. Minas Gerais, 1999.

MONDRAGON. Espectrofotometria - Leis, Tipos, Usos e Aplicações. 2018. Disponível

em: https://www.mondragon.com.br/blog/espectrofotometria-leis-tipos-usos-e-aplicacoes/.
Acesso em 06 de Maio de 2019.

MOTTA, V. T. Bioquímica Clínica – métodos e interpretações. 2ª edição. Rio de Janeiro:

Editora Médica Missau, 2000.

MOTTA, V. T. Bioquímica Clínica para Laboratório – princípios e interpretações. 5ª

edição. Rio de Janeiro: MedBook, 2009.

MUNDO DA BABSI. Tutorial: Como usar o Espectrofotômetro e como criar uma curva
de calibração Abs no Excel. 2015. Disponível em:
https://littlebabsi.wordpress.com/2015/06/10/tutorial-como-usar-o-espectrofotometro-e-como-
criar-uma-curva-de-calibracao-abs-no-excel/. Acesso em 08 de Maio de 2019.

OLIVEIRA, M. V. P. Aplicações de Bioquímicos quantitativos em ciências Biológicas e da

saúde. 2012.
RHOADES, R.A.; TANNER, G.A. Fisiologia Médica. 2ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2005.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE ENDOCRINOLOGIA E METABOLOGIA. Diabetes

Mellitus: classificação e diagnóstico. Projeto Diretrizes. Associação Médica Brasileira e
Conselho Federal de Medicina.
19
ANEXOS
Anexo I - Esquema da dispersão da luz solar em um prisma e decomposição da luz em cores
distintas e raios escuros (bandas espectrais).

Fonte: https//:scope.pari..edu/
Anexo II - Espectro eletromagnético

Fonte: https://littlebabsi.wordpress.com/2015/06/10/tutorial-como-usar-o-espectrofotometro-
e-como-criar-uma-curva-de-calibracao-abs-no-excel/
Anexo III- Componentes principais do espectrofômetro

Fonte: Estridge; Reynolds, 2011.

A
Anexo IV- Espectrofotômetro ( estrutura externa).

Fonte: https://www.infoescola.com/materiais-de-laboratorio/espectrofotometro/
Anexo V - Colorimetria.

Fonte: Colorimetria.pdf