Enzimas

Prof. Dr. Adriano Sartori

Unicsul – SM
Enzimas: como atuam ?

• Catalisadores;
• Classificação;
• Especificidade e mecanismos
de ação;
 Enzimas
1878: Friedrich Wilhelm Kühne cunha
o nome "enzima",
"en" = dentro e "zyme"
= levedura.

Drinking Bacchus by Guido Reni, 1623.

Gemäldegalerie Alte Meister, Dresden,
Germany.
Enzimas são proteínas que agem como catalizadores biológicos:

Composto B (produto)
enzima
Reação
catalisada
pela enzima

Composto A (substrato)

Centro ativo
ou
sítio catalítico Observe que não há consumo
de uma enzima é a porção ou modificação permanente da
da molécula onde ocorre a enzima
atividade catalítica
 Enzimas são catalisadores biológicos:

Equação geral representa o

de uma reação E + S ES P + E estado de
enzimática transição

Que diferenças existem entre catalisadores inorgânicos, como íons

metálicos, e as enzimas ?

• enzimas são mais eficientes: podem acelerar reações até 1014 vezes contra
102 – 103 vezes dos catalisadores inorgânicos;

• enzimas são específicas: catalisam reações envolvendo às vezes apenas um

único tipo de reagente;

• enzimas são estereo-específicas e não produzem sub-produtos reacionais;

• enzimas operam em condições amenas de temperatura, pressão e pH;

• enzimas podem ser altamente reguladas através de fatores extrínsecos à reação,

tanto por ativadores como por inibidores.
 Complexo
Enzima-Substrato
(ES)

Enzima (E) Enzima (E)

Substrato (S)
Produtos (P)
 Em 1926 James B.
Summer purificou e
cristalizou a urease,
mostrando tratar-se de catalase
uma proteína pura, e fez o
mesmo, em 1937, para a
catalase. A prova final foi
feita
por Northrop e Stanley e
m 1930, com o estudo de
três enzimas digestivas,
a pepsina, a tripsina e
a quimotripsina, pelo que
receberam o Prémio
Nobel da Química
em 1946.
 Transferência de elétrons
Classificação das Enzimas: 1. Óxido-redutases
( Reações de óxido-
Se uma molécula se
reduz, há outra que se
redução).
oxida.

considera tipo de 2. Transferases

•grupos aldeído
•gupos acila
(Transferência de grupos
reação e substratos funcionais)
•grupos glucosil
•grupos fosfatos (quinases)

•Transformam polímeros em monômeros.

Atuam sobre:
Nomenclatura oficial das enzimas é 3. Hidrolases •Ligações éster
dada pela Enzyme Comission da (Reações de hidrólise) •Ligações glicosídicas
•Ligações peptídicas
International Union for Biochemistry •Ligações C-N
and Molecular Biology (IUBMB) :
•Entre C e C
4. Liases
•Entre C e O
(Adição a ligações duplas)
•Entre C e N
ATPase (Adenosinatrifosfatase): EC 3.6.1.3
- é uma hidrolase.........................3
- atua num anidrido......................3.6
- o anidrido contém fosfato..........3.6.1 5. Isomerases
- esse anidrido é ATP..................3.6.1.3 (Reações de isomerização)

Números identificam o tipo 6. Ligases •Entre C e O

(Formação de laços •Entre C e S
de reação e o tipo de covalentes com gasto de •Entre C e N
substrato alvo ATP) •Entre C e C
 O heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigênio.
O heme, também presente nos citocromos, é sintetizado nas células aeróbicas
através de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na última etapa,
um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.

+ Fe2+

Heme sintase

Outros derivados porfirínicos não hemínicos importantes são a cobalamina ou

vitamina B12, que contem Co2+ ao invés de ferro, e clorofilas, que contém Mg2+
 Mioglobina

1 heme = 1 O2

Hemoglobina

4 heme = 4 O2
Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção
não proteica, que é essencial para atividade biológica.

metal Distinção entre cofator e coenzima

Grupo depende da força de ligação com a
cofator
prostético apoproteína. Ex: o NAD+ pode ser
coenzima cofator de uma enzima (ligação
fraca) e ser coenzima de outra
Enzima (ligação forte). O mesmo ocorre
holoenzima
com as metais.

Apoenzima
parte proteica

ativa
Coenzima Reação com Vitamina

Grupo
Prostético
inativa Biocitina CO2 Biotina
Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico
Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12
FAD, FMN óxido-redução Riboflavina
Coenzimas participam do ciclo NAD+, NADP+ óxido-redução Niacina
catalítico das enzimas
Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina
recebendo ou fornecendo
grupos químicos para a reação Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina
Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico
 Cofatores e Coenzimas
Muitas enzimas utilizam pequenas moléculas
como íons metálicos (Cu2+; Fe3+ Zn2+, ou moléculas
orgânicas conhecidas como coenzimas (NAD+ e FADH2)
 Teoria da catálise
v1
Considere as reações: A + B C
v-1

No equilíbrio da reação, as velocidades das reações se igualam: v1 = v-1

- concentrações de todos os reagentes não se alteram mais
- pode se dizer que a reação terminou

Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reação

- o ponto do equilíbrio é atingido mais rápido

- o ponto do equilíbrio não se altera, ou seja [reagentes]

e de [produtos] no “final” da reação” são as mesmas da
reação não catalisada
- termodinâmica da reação não se altera

Catalisador não é consumido na reação pode atuar em [ ] baixas

 O gráfico mostra a variação de energia ao
Teoria da catálise longo de uma reação.

Energia de ativação ou barreira

energética:
Estado de transição
quantidade de energia
Reação não que é preciso fornercer aos
catalisada reagentes para a reação ocorrer
Energia
de
ativação
Estado de transição ou
Energia

complexo ativado:

Reação forma molecular inter-

Substrato (S)
catalisada mediária entre o reagente e
o produto, existe somente
Produto (P)
no alto da barreira
Progresso da reação energética.
É altamente instável.

Um Catalisador diminui a barreira energética criando percursos alternativos

da reação para formação do estado de transição.
 Enzimas acelaram reações várias ordens de grandeza

Compare esses números !

Velocidade na Velocidade da
ausência de enzima reação catalisada Poder
Enzima catalítico
“Reações/segundo” “Reações/segundo”

Anidrase carbônica 1.3 X 10 –1 1.0 X 106 7.7 X 106

Triosefosfato isomerase 4.3 X 10 –6 4.300 1.0 X 109
Carboxipeptidase A 3.0 X 10 –9 578 1.9X 1011
AMP nucleosidase 1.0 X 10 –11 60 6.0 X 1012
Nuclease de estafilococos 1.7 X 10 -13 95 5.6 X 1014

Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa

o ciclo da reação em um segundo
Número moles de S catalisado por segundo
de = moles de enzima
turnover
Enzimas são específicas para o reconhecimento de seus substratos.

Emil Fisher, na década de 1950, propôs

Modelo Chave-Fechadura o modelo chave-fechadura para expli-
car o reconhecimento (especificidade) do
substrato pela enzima. Nesse modelo, o
Formas rígidas sítio ativo da enzima é pre-formado e
tem a forma complementar à molécula
do Substrato, de modo que outras
moléculas não teriam acesso a ela.

No entanto, o modelo chave-fechadura

não explica a interação das enzimas com
inibidores e análogos dos substratos.
Modelo Chave-Fechadura
Na década de 1970, Daniel Kosland
E e S se deformam, para
propôs o modelo de encaixe induzido,
otimizar o encaixe
no qual o contacto com a molécula do
substrato induz mudanças conformacio-
nais na enzima, que otimizam as intera-
ções com os resíduos do sítio ativo.
Esse é o modelo aceito hoje em dia.
 Fatores que afetam a atividade enzimática:

1. Condições do meio que afetam estabilidade protéica

• pH
• temperatura

2. Tempo da reação

3. Concentração dos reagentes

• a enzima
• o substrato
• co-fatore(s)

Vários são os fatores que afetam o funcionamento das enzimas como catalisadores.
Alguns desses fatores são decorrentes da natureza proteica das enzimas, como o
efeito do pH e da temperatura. Para se estudar o efeito isolado de um dos fatores
acima, é necessário que todos os outros fatores sejam mantidos fixos.
 Fatores que controlam a atividade enzimática:

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo

O pH ótimo de uma enzima

% atividade enzimática máxima

reflete variações no estado de

ionização de resíduos de
aminoácidos do sítio ativo. A
enzima está pelo menos
parcialmente desnaturada em
pHs afastados do pH ótimo.
Quando o substrato é uma
molécula ionizável, o pH ótimo
da enzima também reflete o seu
estado de ionização .

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

 Fatores que controlam a atividade enzimática:

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo
• Variações de temperatura: temperatura ótima

Desnaturação
% atividade enzimática máxima

100- térmica da
Temperatura proteína
ótima

Pouca energia
50- para a reação
acontecer Ao contrário da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimática versus
pH, a enzima só está
0-
desnaturada em
temperaturas acima da
temperatura ótima.
 Fatores que controlam a atividade enzimática:
2. Tempo da reação O gráfico abaixo ilustra como as
concentrações de E, S e P variam ao
longo do tempo da reação.
3. Concentração:
• da enzima
• do substrato
• de co-fatore(s)

concentração
A [substrato] cai na mesma razão em que a
[produto] aumenta em função do tempo.

A enzima existe sob duas formas: enzima

livre E e complexo enzima-substrato ES. No
início da reação, a [E] livre cai e a do
complexo [ES] aumenta e atinge um
máximo, em que não há mais [E] livre no
meio. Nessa situação (indicada no retângulo
cinza), diz-se que a enzima está saturada (só
existe no complexo ES). A velocidade da
reação é a máxima.
tempo
 Enzimas:
Regulação da Atividade Enzimática
Enzimas: Cinética Enzimática?

• Regulação enzimática;
• Inibidores;
• Alosteria.
Na década de 1950:

Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar como

a concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação v, conforme se observa
no gráfico abaixo.
A velocidade da reação apresenta três regiões de comportamento diferente, a medida
que se aumenta a concentração do substrato:

-parte a: v aumenta proporcionalmente

com aumentos de S.
-parte b: v aumenta não proporcional-
mente com aumentos de S.
-parte c: v não aumenta mais, tendendo
a um valor máximo (Vmax),
sendo independente da [S]

O gráfico mostra um conjunto de reações

que estão acontecendo simultâneamente,
conforme as equações abaixo:
Para se chegar à equação da hipérbole quadrada do gráfico V x S, o gráfico de
Michaelis Menten, considera-se que o conjunto
de reações está em equilíbrio, ou seja, a [ES]
é constante e o sistema tem a sua velocidade
máxima, Vmax.

Quando [ES] é constante, as velocidades de

formação (Vf) e de desdobramento (Vd) do
complexo ES são iguais:
Vf formação ES = Vd desdobramento ES
Aplicando a Lei de Ação das Massas para definir Vf e Vd, temos:
Igualando-se Vf = Vd e resolvendo para V, chega-se
Vf = k1 [ES] à Equação de Michaelis-Menten:
[E]+[S]
sendo KM = k-1+ k2
Vd= k-1 [E]+[S] + k2 [E]+[P]
k1
[ES] [ES]
Constante de Michaelis-Menten
 A constante de Michaelis-Menten (KM) é um parâmetro cinético que traz
informações sobre a afinidade que a enzima tem pelo substrato.

O KM é numéricamente igual à [substrato] que

produz metade da Vmax .
Substituindo na equação v por Vmax/2, vemos:

Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S]

2 2 KM + [S]
Vmax. KM + Vmax.[S] = 2Vmax.[S]
KM = k-1+ k2 Vmax. KM = Vmax.[S] KM = [S]
k1
Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:
1. E tem baixa afinidade por S 2. E tem alta afinidade por S

Quando Vd é mais alta do que Vf Quando Vf é mais alta do que Vd

k-1+ k2 = grande KM alto k-1+ k2 = pequeno
KM baixo
k1 = pequeno k1 = grande
 A velocidade da reação
somente é proporcional à
[E]
quando a enzima está
saturada, ou seja, reação é
de ordem zero (independe)
em relação a [S]

Eficiência catalítica

Kcat/KM
- k2 ou kcat (constante catalítica) mede o “poder
catalítico” da enzima Parâmetro mais adequado
v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1) para comparações cinéticas
[ES] [Etotal]

Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax
Ressaca
 Reparem que a velocidade de consumo de
metanol pela enzima álcool desidrogenase é bem
menor se comparado ao etanol!!!!!

Cerca de 100 vezes Concluímos que o Km do

menor!! etanol é menor do que o
Km para o metanol
 Metanol: Tratamento
A enzima que transforma o metanol é a mesma que tem como
substrato o etanol, a enzima desidrogenase alcoólica hepática, por isso
o uso do etanol tem sido um tratamento eficaz, pois o etanol possui
alta afinidade pela enzima álcool-desidrogenase, ocorrendo inibição
por competição e também porque o etanol liga-se muito facilmente ao
ácido fórmico, principal metabólito do metanol, excretando-o mais
facilmente. Para ter o efeito desejado, o paciente tem que ser levado
ao efeito de embriaguez, aproximadamente 4 doses de 45 ml de
uísque.
Atualmente considera-se o uso do 4-metilpirazol ou fomepizol
que é igualmente um inibidor enzimático da desidrogenase alcoólica
mas com uma posologia mais simples.
HIV
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade
de S e da própria E ?
Lembrar que em geral não ocorrem variações bruscas de pH e de temperatura.

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo e não-competitivo.

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
Agora vamos falar de:
 Inibidores irreversíveis:
Compostos orgânicos clorados ou fosforados são bons exemplos de inibidores enzimáticos irreversíveis,
pois reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível. Uma das enzimas
altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do
neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos.

Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion. Tanto a
acetilcolinesterase de insetos como de mamíferos são igualmente inibidas por essas drogas. Contribue
para a toxicidade desses inseticidas a longa meia vida que esses apresentam no ambiente.

Inseticidas
organofosforados
dose letal: 3-13 mg/Kg, oral

meia vida – 23 anos

Acetilcolinesterase complexada com sarin ou “gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral), um
organofosforado altamente tóxico e volátil, que reage com o resíduo de Ser ativo da enzima.
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo e não-competitivo.

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores
Agora vamos falar de:
 • o inibidor é análogo estrutural do substrato e
Inibição competitiva compete com ele pela ligação ao sítio ativo
• com aumento da [substrato], ocorre diminue da
inibição caracterizando uma competição entre S e I
I S • não há alteração da Vmax
S S • há um aumento de KM por um fator a, que
permite o cálculo da constante de inibição, Ki
S P
E IS SS

S S I

S
 S S Inibição não-competitiva

E S
I I
P • inibidor não é análogo estutural do
I substrato - não se liga ao sítio ativo
S • inibidor se liga à E e ao ES
S S • aumento da [substrato] não diminue a
I I E
E inibição - não há competição
S I • Km aumenta e Vmax diminuí
I
S S
 Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na
disponibilidade de S e da própria E ?

A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

1. Inibidores:
• irreversíveis: não protéicos e protéicos
• reversíveis: competitivo e não-competitivo.

2. Alosteria:
• ativadores e inibidores

Agora vamos falar de:

Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo ao se liga
um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da
ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo,
ativando-o ou inibindo-o. Observe nas figuras.

Ativador alostérico Inibidor alostérico

Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km Gráfico V x S

(Michaelis-Menten) é
Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax uma curva sigmóide
Ativador Alostérico
Inibidor Alostérico
 Alosteria: Regulação do
Processo Enzimático

Da mesma maneira a falta do produto final (end product)

ou produto derivado de outra via enzimática podem ativar a
Via enzimática novamente!!!!
 A aspartato transcarbamoilase fornece N-carbamoil-aspartato para a rota de
síntese de pirimidinas. É uma enzima alostérica tipo K, inibida por CTP e ativada
por ATP, sendo composta por 6 unidades regulatórias e 6 catalíticas.

Carbamoil + aspartato N- Carbamoil + H2 PO-4

PO4
2- aspartato

pirimidinas

Sem efetores ativa

alostéricos
A ligação de CTP às
subunidades regulatórias “fecha” CTP CTP
o acesso aos sítios ativos nas
subunidades catalíticas.

inativa
 Considerações Finais

As enzimas, quase todas elas proteínas são agrupadas em 6 classes

de mecanismos;

A especificidade de uma enzima pelo substrato depende do caráter

geométrico e eletrônico de seu sítio ativo;

Muitas enzimas realizam a catálise com a ajuda de cofatores

(inorgânicos) e coenzimas (orgânicas). Muitas coenzimas são
derivadas de vitaminas;

As enzimas catalisam as reações por meio da redução da energia

livre de ativação;
 Considerações Finais!!!

A equação de Michaelis-Menten descreve a relação entre a

velocidade inicial da reação e a concentração de substrato nas
condições de estado de equilíbrio;

KM é a velocidade na qual a velocidade da reação é a metade da

velocidade máxima. O valor de Kcat/KM indica a eficiência catalítica
de uma enzima;

Dados cinéticos podem ser representados graficamente na forma de

duplos-recíprocos para as determinações de KM e Vmax;

Há inibidores irreversíveis que se ligam covalentemente as enzimas

e inibidores reversíveis: competitivo e não competitivo;

A atividade das enzimas pode ser regulada por efetores alostéricos.