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CSIROPUBLICAÇÃO

www.publish.csiro.au/journals/rfd Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento, 2004,16, 113–122

Integração de novas tecnologias com embriologia e produção animal

Torben GreveA,Ce Henrik CallesenB

ADepartamento
de Estudos Clínicos, Reprodução, Royal Veterinary and Agricultural University,
Dyrlaegevej 68, DK-1870 Frederiksberg C, Dinamarca.
BDepartamento de Criação e Genética Animal, Biologia Reprodutiva, Instituto Dinamarquês de Agricultura
Ciências, DK-8830 Tjele, Dinamarca.
CPara quem a correspondência deve ser endereçada. e-mail: tg@kvl.dk

Abstrato.A presente revisão descreve uma série de tecnologias selecionadas de embriões de animais de produção, utilizadas em
pesquisas embriológicas e aplicadas na criação e produção animal. Algumas das técnicas são motivadas pelo desejo do criador
de obter animais com valores genéticos mais elevados, enquanto outras são motivadas principalmente pela curiosidade dos
investigadores. A interação entre a pesquisa básica e a aplicação prática nessas áreas ainda é uma característica das pessoas que
contribuem para a Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) e tem sido uma vantagem tanto para
pesquisadores quanto para criadores. Um exemplo de tal interacção é que análises estruturais detalhadas descreveram
diferenças de qualidade entre embriões de várias origens e, após a transferência de embriões, os resultados da gravidez
confirmaram a correlação entre morfologia e viabilidade. Outro exemplo é que a tecnologia de reação em cadeia da polimerase
permitiu a detecção de sequências específicas de Y em embriões masculinos e tornou-se hoje uma ferramenta na produção
animal. Os dados do sequenciamento do genoma dos animais domésticos fornecerão muitas informações novas. Um grande
desafio para os próximos anos será a utilização desta informação num contexto fisiologicamente significativo e a continuação
dos esforços para converter a experiência laboratorial em utilização na prática. Finalmente, é importante obter aceitação social
para uma aplicação mais ampla de muitas das tecnologias, tais comoem vitroprodução de embriões e clonagem.

Palavras-chave extras: aplicação, tecnologia de embriões, animais de criação, investigação.

Introdução Novas tecnologias integradas principalmente

Novas tecnologias integradas com embriologia, criação e produção com embriologia

animal foram desenvolvidas por pelo menos duas razões. Primeiro,
aumentar o conhecimento da biologia celular fundamental do
desenvolvimento de oócitos e embriõesna Vivo, assim comoem vitro
, para, por exemplo, otimizar em vitrosistemas de cultura e, em
segundo lugar, servir como ferramentas confiáveis para descrever
e avaliar a qualidade do oócito e do embrião e, assim, prever a
probabilidade de um oócito ou embrião específico se desenvolver
em uma prole normal. Com base neste conhecimento fundamental,
novos métodos reprodutivos estão sendo desenvolvidos para
utilização na criação e produção animal. A aplicação requer
frequentemente os seus próprios processos de investigação,
desenvolvimento e adaptação para permitir uma integração
adequada de tecnologias em condições práticas que são muitas
vezes muito diferentes das condições laboratoriais sob as quais a
maior parte da investigação embriológica é realizada. Esta revisão
apresentará uma breve visão geral de algumas dessas novas
técnicas, com foco principal nos aspectos práticos das tecnologias.
O artigo destacará os últimos desenvolvimentos importantes para a
criação e genética animal. Serão listadas apenas algumas
referências mais recentes, mas todos devem estar bem conscientes
da base histórica do progresso.
Morfologia
Imagens em tempo real para estudos de cinética de
desenvolvimento
Observações freqüentes em microscópio estereoscópico e óptico
podem ser usadas para avaliar o padrão de desenvolvimento de oócitos
e embriões sem interferir em seu desenvolvimento normal (van Soome
outros. 1997; Holme outros. 1998; Lonergane outros. 1999).Isso é
obviamente tedioso e demorado, mas com sistemas semiautomáticos de
registro de lapso de tempo tornou-se possível estimar a cinética do
desenvolvimento embrionário inicial de uma maneira melhor e mais fácil
(por exemplo, Peippoe outros. 2001; Holme outros. 2002). Neste último
estudo (Holme outros. 2002), diferenças claras na cinética foram
observadas entrena Vivo- eem vitro- embriões derivados cultivadosem
vitro, porque o segundo, terceiro e quarto ciclos celulares pós-
fertilização foram mais curtos para ona Vivoembriões derivados. Sabe-se
que o tempo de clivagem inicial está correlacionado com a qualidade
medida pela taxa de gravidez e criotolerância deem vitro- embriões
produzidos (Lonergane outros. 1999, 2003) e, portanto, estudos cinéticos
podem ser usados para prever a viabilidade embrionária. Estudos
cinéticos também podem ser usados para encontrar diferenças entre
homens e mulheres.

©IETS 2004 10.1071/RD03084 1031-3613/04/010113

114 Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento
embriões femininos em termos deem vitrovelocidade de
desenvolvimento (Peippoe outros. 2001), mas estes estudos ainda
requerem condições laboratoriais e equipamentos técnicos bastante
avançados e ainda não foram adaptados para uso generalizado.
Microscopia confocal de varredura a laser
Os estudos ultraestruturais continuam a ser uma pedra angular
na embriologia contemporânea (por exemplo, Maddox-Hyttel e
Boerjan 2002). Uma nova forma de microscopia, nomeadamente a
microscopia confocal de varredura a laser, resulta em cortes ópticos
de alta resolução e reconstruções tridimensionais de espécimes,
feitas pelo empilhamento de séries de cortes coletados. Esta
tecnologia tornou-se, nos últimos anos, uma ferramenta valiosa
para o estudo, em particular, da localização e colocalização de
proteínas em tecidos e células, incluindo oócitos e embriões. A
relação espacial entre organelas citoplasmáticas e configurações de
cromatina durante, por exemplo, a meiose do oócito foi descrita,
assim como a ocorrência de apoptose em embriões foi quantificada
(Squirrelle outros. 2001; Averye outros. 2002; Gjørrete outros. 2003;
Laurincike outros. 2003). Além disso, os elementos do citoesqueleto
foram investigados (Longe outros. 1998). Um desenvolvimento
adicional é a introdução da microscopia laser confocal multifotônica
(Squirrell 2002), permitindo a visualização de seções ópticas em
células e tecidos vivos, como, por exemplo, a localização de
mitocôndrias como um preditor da qualidade do oócito e do
embrião (Squirrelle outros.2003). O número crescente de manchas
intravitais combinado com os avanços na microscopia multifotônica
e nas condições para o cultivo de oócitos e embriões no
microscópio lançará luz sobre muitos aspectos da biologia do
desenvolvimento nos próximos anos. Deve-se enfatizar que, em
primeiro lugar, a tecnologia comum de microscópio confocal a laser
é invasiva e não compatível com a sobrevivência adicional de
oócitos ou embriões e que, em segundo lugar, o uso da tecnologia
multifotônica ainda é restrito para fins científicos.
Função celular
Metabolismo embrionário medido por microssensores
Estudos metabólicos de oócitos e embriões têm sido úteis, primeiro
para compreender as necessidades nutricionais mais básicas de oócitos
e embriões em diferentes estágios de desenvolvimento e, assim, para
desenvolver meios paraem vitroculturas que sejam fisiologicamente
mais aceitáveis para os embriões e, em segundo lugar, para avaliar a
qualidade e a viabilidade dos embriões (para uma revisão, ver Donnay
2002). Este último aspecto ainda precisa de melhorias consideráveis e
um grande obstáculo é desenvolver um método não invasivo confiável e
praticamente utilizável em oócitos ou embriões únicos. Em 1996,
Thompsone outros.(1996) desenvolveu uma técnica microfluorescente
não invasiva para medir a taxa de captação de oxigênio e Overström
(1996) resumiu seus próprios estudos com o uso de eletrodos de
microoxigênio com detecção de gás específicos para avaliar a qualidade
de embriões bovinos produzidosna Vivo medido pelas taxas de gravidez.
Usando uma abordagem semelhante em
T. Greve e H. Callesen
embriões bovinos únicos, Shikue outros. (2001) encontraram uma forte
correlação entre a qualidade do embrião e o consumo de oxigênio.
Recentemente, Lopese outros. (2004) apresentaram uma técnica de
microssensor para medir a pressão parcial de oxigênio no entorno doem
vitro- embrião bovino produzido. No futuro, será tentada a transferência
de embriões com diferentes taxas de consumo de oxigênio e será
relacionada à taxa de gravidez. Em outras espécies (camundongo,
humano), o consumo de glicose e a absorção de aminoácidos também
são usados como preditores da viabilidade embrionária (Donnay 2002),
assim como outras substâncias (por exemplo, NH4, H+) pode ser medido
de forma não invasiva pela tecnologia de eletrodo de varredura.
Anomalias cromossômicas estimadas por fluorescência
no localhibridização
Já em 1987, Kinge outros.(1987) propôs uma relação inversa
entre qualidade embrionária e anomalias cromossômicas. O
interesse pela área foi renovado com o surgimento deem vitro
produção de embriões e técnicas de clonagem que produzem
embriões, fetos e descendentes aparentemente diferentes dos seus
na Vivohomólogos (por exemplo, Renard e outros. 2002; Gallie
outros. 2003) e a questão é se as aberrações cromossómicas
contribuem para estas diferenças (Young e Fairburn 2000; Slimane-
Bureau e King 2002). Fluorescênciano locala hibridização (FISH),
uma técnica para a localização de sequências específicas de DNA ou
RNA em células e tecidos por marcação fluorescente, é adequada
para análise cromossômica da maioria das células de um embrião,
enquanto a cariotipagem convencional só permite a avaliação de
células em metáfase II. Fluorescênciano locala análise de
hibridização com sondas específicas para os cromossomos 6 e 7
demonstrou que aproximadamente 75% dos dias 7-8em vitro
embriões bovinos produzidos eram mixoploides em comparação
com 25% de seusna Vivo- contrapartes derivadas (Viuffe outros.
1999, 2002). O método utilizado para maturação oocitária parece
ser um fator que contribui para o aumento da incidência de
aberrações cromossômicas encontradas emem vitro- embriões
produzidos (Dielemane outros. 2002). Embriões de transferência
nuclear bovina também apresentam uma incidência
significativamente maior de mixoploidia (71%) e embriões
totalmente poliplóides foram relatados após transferência nuclear
(5,4%; Booth e outros. 2003). A tecnologia FISH pode ser utilizada
para avaliar a viabilidade embrionária numa biópsia do mesmo
embrião e, assim, obter algumas indicações preliminares da sua
qualidade, porque se espera que embriões que possuam uma
elevada proporção de células poliplóides possam ser menos viáveis
após a transferência. Pode-se acrescentar que a hibridização
genômica comparativa foi desenvolvida em humanos para medir
todos os 23 cromossomos (Speichere outros.1996).
Apoptose estimada por marcação terminal de dUTP-
digoxigenina mediada por desoxirribonucleotidil transferase
terminal
Estudos de apoptose, uma forma regulada e programada de
morte celular, envolvem uma combinação de biologia molecular
Novas tecnologias em embriologia e produção animal
(a técnica terminal de marcação final de dUTP-digoxigenina
mediada por desoxirribonucleotidil transferase (TUNEL)) e
microscopia (microscopia confocal a laser). A função precisa da
apoptose ainda precisa ser elucidada, mas, segundo Betts e King
(2001), pode ser a forma do embrião eliminar células indesejadas e,
assim, manter um equilíbrio adequado entre sua massa celular
interna e as células do trofectoderma. Em embriões bovinos, o
índice apoptótico é significativamente maior emem vitro- embriões
produzidos em comparação comna Vivoembriões derivados (Gjørret
e outros.2003; Maddox-Hyttele outros. 2003), assim comoem vitro
embriões suínos produzidos têm uma maior incidência de apoptose
em comparação com embriões de transferência nuclear (Haoe
outros. 2003). Apoptose emem vitroA produção de embriões
bovinos e a transferência nuclear parecem começar em torno dos
estágios de nove a 16 células e seis células, respectivamente (Byrne
e outros. 1999; Gjørrete outros. 2002). O meio de cultura, a duração
do período de cultura e a tensão de oxigênio parecem influenciar a
extensão da apoptose (Byrnee outros. 1999; Neubere outros. 2002).
A técnica TUNEL é uma tecnologia altamente invasiva que não pode
ser utilizada em embriões destinados a transferência. Além disso,
não se sabe se e como a taxa de apoptose está relacionada com a
taxa de gravidez.
Expressão e função gênica
Os rápidos avanços nas técnicas de reação em cadeia da polimerase
(PCR) (transcrição reversa (RT)-PCR e exibição diferencial (DD)-RT-PCR)
tiveram uma grande influência na compreensão do desenvolvimento
embrionário normal, por exemplo, ativação do genoma embrionário
(Viuffe outros. 1996; Watsone outros. 1999) e detecção de níveis de
mRNA em oócitos (Brevini-Gandolfie outros. 1999; Bilodeau-Goeseels e
Panich 2002; Knijne outros. 2002) ena Vivo- eem vitro- embriões
produzidos (Offenberge outros. 2000; Bertolinie outros. 2002b; Lazzarie
outros. 2002; Niemanne outros. 2002; Rizose outros. 2002b; Robertoe
outros. 2002). Também se tornou cada vez mais evidente que os
embriões clonados exibem um padrão de expressão genética mais
desviante do que em vitro- embriões produzidos (Wrenzyckie outros.
2001; Lazzari e outros. 2002). As contribuições relativas para este
desenvolvimento embrionário desviante pelas diferentes etapas doem
vitroou os procedimentos de clonagem estão sendo expandidos ainda
mais (por exemplo, Roberte outros. 2000). Estes estudos documentaram
colectivamente que os genes de importância para o desenvolvimento
são expressos de forma diferente quando os embriões são produzidos
num ambiente artificial e que estes desvios podem ser utilizados para
avaliar a qualidade de um determinado sistema de cultura. Também foi
documentado que embriões com um padrão de expressão genética
desviante apresentam maior sensibilidade à criopreservação como um
indicador de pior qualidade (Lonergane outros. 2003).
A tecnologia de microarranjos é um método em rápida expansão
para estudos de perfis de expressão em larga escala de, por
exemplo, embriões durante o período de pré-implantação (para
revisões, ver Thieffry 1999; Greenfield 2000). Níveis de expressão
Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento 115
pode ser medido simultaneamente para centenas ou milhares
de genes, dependendo do número de sequências genéticas
colocadas nas matrizes. As perspectivas são enormes e um
número crescente de artigos fornece indicações sobre os níveis
de expressão dos genes localizados nas matrizes (revisado por
Granjeaude outros. 1999; homem livree outros. 2000). A
tecnologia de microarranjos tem sido usada para estudar a
maturação de oócitos em bovinos (Dalbiès-Tran e Mermillod
2003) e na análise de embriões pré-implantação em humanos
(Dobsone outros. 2002).
A complexidade deste campo é óbvia e a plena
exploração aguarda novas experiências e uma maior
compreensão da função genética, que depende do advento
da proteómica para resolver quais proteínas são codificadas
pelos genes e pelas suas transcrições.
Sistemas de cultura
Condições de cultura
As condições físicas fornecidas aos oócitos e embriões durante a
sua cultura são importantes. Os embriões de animais domésticos
parecem atingir uma taxa de desenvolvimento mais elevada
quando têm a possibilidade de crescer em grupos de
aproximadamente 10-20 (Gil e outros. 2003) e/ou são fornecidos
com microcondições especiais em plástico pequeno (sistema poço
do poço (WOW); Vajtae outros.2000a), vidro (sistema vidro-oviduto
(GO); Thouase outros.2003) ou compartimentos de ágar (Peura
2003). No WOW, um desenvolvimento consistente e elevado em
blastocistos deem vitro-foi demonstrado embriões bovinos
produzidos (Vajtae outros. 2000a). Isto também foi observado
quando embriões clonados foram produzidos usando a abordagem
zona-livre em bovinos (Vajtae outros. 2001, 2003) e porco (Booth e
outros. 2001).
Uma técnica interessante paraem vitrocultura é baseada na
tecnologia de microfluidos e Beebee outros. (2002) obtiveram maiores
taxas de blastocistos e menores taxas de degeneração de embriões
murinos com tais equipamentos. A técnica também se mostrou eficiente
para embriões suínos (Clarke outros. 2003; Walterse outros. 2003). Em
última análise, poderá conduzir não só a um método mais fácil deem
vitroprodução de embriões, mas também facilitar estudos sobre, por
exemplo, necessidades de substrato.
Desenvolvimento pós-eclosão
Avaliação de um sistema específico paraem vitro-produção ou
clonagem de embriões sem utilização dena Vivoa transferência de
embriões seria necessária e um período prolongadoem vitroperíodo
de cultura pode ser uma solução. Usando esta abordagem, Vajtae
outros. (2000b) e Brandãoe outros.(2004) demonstraram novos
progressos com oem vitrocultura de embriões bovinos em túneis de
gel de ágar. Neste último relato, foi obtido o desenvolvimento inicial
pós-espécie com alongamento do embrião, bem como a formação
de epiblasto e hipoblasto. Este importante novo passo no processo
prolongadoem vitroa cultura agora aguarda mais estudos
morfológicos.
116 Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento
Novas tecnologias integradas principalmente com a produção
animal
Criopreservação
A vitrificação parece ser um método de criopreservação vantajoso
para o armazenamento a longo prazo, em particular, deem vitro-
embriões produzidos e clonados em comparação com o método
tradicional de congelamento lento (para revisões, ver Massip 2001;
Dobrinsky 2002). Vários novos métodos e diferentes equipamentos
foram desenvolvidos para vitrificação, incluindo o canudo aberto
(OPS; Vajtae outros.1997), a microgotícula (Yang e Leibo 1999) ou o
crioloop (Lanee outros. 1999) ou suas modificações (Isachenkoe
outros. 2003). Existem hoje muitos relatos sobre a vitrificação de
ovócitos, bem como dena Vivo, em vitroe embriões clonados
produzindo descendentes viáveis após a transferência, incluindo
oócitos de vaca (Vajtae outros. 1998), embriões de porco (Berthelote
outros.2003; Misumie outros. 2003), embriões de ovelhas (Okadae
outros. 2002) e ovócitos de cavalo (Maclellan e outros. 2002).
Em vitroprodução de embriões
Hoje, esta tecnologia é uma importante ferramenta de investigação em
embriologia de animais domésticos e está estabelecida e utilizada até
certo ponto na prática (por exemplo, Hasler 1998, 2000; Bousquete
outros. 1999; Gallie outros. 2003; Mertone outros. 2003). Os
desenvolvimentos técnicos recentes são poucos, mas a injeção
intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) tem sido usada em
animais domésticos com algum sucesso (Kolbe e Holtz 2000; Choie
outros. 2002; Horiuchie outros. 2002), embora certamente não seja tão
amplamente utilizado como no campo humano, onde a má qualidade do
esperma é um problema.
Em vitroa produção de embriões tem seus problemas inerentes,
tanto em relação aos embriões (Rizose outros. 2002a) e a chamada
síndrome da prole grande, inicialmente descrita por Walkere outros.
(1996) em ovinos e posteriormente em bovinos (Kruip e den Daas
1997; Hasler 2000; Jacobsene outros. 2000; Wagtendonk-de Leeuwe
outros. 2000; McEvoye outros. 2001). É evidente que até que estes
problemas sejam resolvidos adequadamente, o uso desta
tecnologia na produção animal deverá ser bem controlado. Deve
acrescentar-se que relatórios recentes indicam que a síndrome da
prole grande parece ter uma extensão reduzida (por exemplo,
Wagtendonk-de Leeuwe outros. 2000).
Ultrassonografia
Determinação de gênero
Aplicação bem-sucedida dena Vivoa determinação do sexo do
feto de bovinos e equinos é possível por meio de ultrassonografia
transretal por volta do dia 50-60 com precisão muito alta (Curran e
Ginther 1991). Esta tecnologia é utilizada rotineiramente por vários
profissionais e equipas de transferência de embriões e parece ser
muito útil, por exemplo, na definição do preço de uma receptora
grávida.
T. Greve e H. Callesen
Superovulação
A ultrassonografia transretal de ovários bovinos e a detecção do
padrão ondulatório de crescimento folicular e atresia têm sido
muito úteis na tecnologia de embriões bovinos (para revisões, ver
Pierson e Adams 1999; Ginther 2000). A ultrassonografia transretal
ajudou a explicar por que o tratamento superestimulatório deve ser
iniciado no momento da emergência da onda folicular e por que a
resposta e o número de ovulações e embriões viáveis podem ser
regulados pela manipulação da emergência das ondas, seja por
ablação folicular (Bergfelte outros. 1997; Mertone outros. 2003) ou
por tratamento hormonal (Kohrame outros. 1998; Bóe outros.
2002).
Desenvolvimento do conceito
Em alguns estudos ultrassonográficos em bovinos, foram
demonstradas diferenças distintas entrena Vivo- eem vitro-produziu
embriões, particularmente durante as primeiras 4-5 semanas de
gravidez (Bertolinie outros. 2002a). No entanto, em outros estudos,
nenhuma diferença distinta foi encontrada no comprimento cabeça-
nádega entrena Vivoe embriões clonados durante os primeiros 60
dias de gravidez (HG Pedersene outros. 2002; observações
pessoais).
Recuperação de oócitos do animal vivo
A coleta de óvulos (OPU) ou recuperação transvaginal de oócitos
(TVOR) de oócitos foliculares é usada rotineiramente em bovinos e
equinos e, portanto, está estabelecida na prática pecuária atual (por
exemplo, Hasler 1998; Bousquete outros. 1999; Gallie outros. 2003;
Mertone outros. 2003). Em termos de investigação, a OPU e a TVOR
demonstraram ser valiosas em vários estudos (por exemplo, para
estudar a tensão de oxigénio no fluido folicular bovino; Berg e outros.
2003).
Em alguns países, o uso prático de OPU ou TVOR é limitado devido a
preocupações de que o animal doador sofra consequências tanto a curto
como a longo prazo. No entanto, relatórios recentes comprovaram que,
tanto em bovinos como em equinos, as técnicas não causam danos
constantes ao animal doador (Petyim e outros. 2001; Chavatte-Palmere
outros. 2002; McEvoye outros. 2002; Boghe outros.2003; Chastant
Maillarde outros. 2003).
Citometria de fluxo de esperma
Para classificação de esperma
A triagem de esperma para sexagem de sêmen de animais domésticos é,
hoje, uma realidade prática pelo uso do citômetro de fluxo de alta velocidade
baseado na diferença relativa no conteúdo de cromatina dos espermatozóides
portadores de X e Y (Johnson 2000; Guthriee outros. 2002; Seidel e Garner
2002). É possível obter uma precisão de aproximadamente 90% e uma taxa de
gravidez de aproximadamente 70% a 80% daquela com esperma não
selecionado. Além disso, os bezerros nascidos após a triagem do esperma
parecem normais (Tubmane outros. 2003). Numa análise económica, Seidel
(2003) argumentou que pode haver vantagens consideráveis tanto para os
criadores de gado leiteiro como para os criadores de gado de corte que
utilizam esperma.
Novas tecnologias em embriologia e produção animal
Ordenação. Finalmente, deve acrescentar-se que alguns dos problemas
de bem-estar animal no gado (matar vitelos machos jovens de baixo
valor) e a castração para evitar problemas de odor no abate de porcos
machos podem ser resolvidos através da utilização desta tecnologia.
Para determinação de qualidade
O citômetro de fluxo pode ser usado para prever as características de
um ejaculado com maior precisão do que os métodos tradicionais de
avaliação de sêmen. Desta forma, a utilização de ejaculados para
inseminação artificial tanto em bovinos como em suínos pode ser
otimizada, conforme descrito por Christensen (2002). As medições
objetivas do citômetro de fluxo podem ser usadas para estabelecer
padrões internacionais para avaliação rotineira do sêmen.
Recentemente, a tecnologia também tem sido usada para avaliar a
estrutura da cromatina do esperma no chamado ensaio da estrutura da
cromatina do esperma (SCSA; Evenson e Jost 2000) e foi encontrada uma
relação entre o dano à cromatina e tanto ona Vivo- eem vitro-capacidade
fertilizante dos touros (Boe-Hansene outros. 2003). Outros sistemas
computadorizados de análise de sêmen, como a análise de sêmen
assistida por computador (CASA), estão disponíveis e foram abordados
anteriormente (Verstegene outros. 2002).
Genotipagem de embriões
A determinação do sexo do embrião usando PCR de sequências
específicas do Y tem sido usada na prática há vários anos, com base
em uma biópsia do embrião feita por corte manual ou usando
micromanipulação (por exemplo, Thibier e Nibart 1995; Roschlau e
outros. 1997; buquêe outros. 1999; Peppoe outros. 2001; Hasler e
outros. 2002). Vários outros genes únicos de interesse podem ser
analisados, alguns dos quais codificam doenças hereditárias, como
malformação vertebral complexa (CVM) em bovinos (Agerholm e
outros. 2001). Com o mapeamento do genoma bovino e suíno e a
rápida expansão da tecnologia de matrizes, podem ser esperados
mais progressos neste campo.
Na criação e produção animal, há grande interesse em usar
informações sobre genes únicos (e ainda mais para genes múltiplos) que
codificam várias características de produção (por exemplo, Rathjee
outros.1997; Wilkiee outros. 1999; Jorge 2001). Isto é usado mais em
animais do que em embriões, não apenas devido à necessidade de
instalações avançadas e experiência completa para realizar biópsias de
embriões.por si só, mas também devido à limitação do tamanho da
biópsia para DNA suficiente para identificar todos os genes de interesse.
Até que estes problemas práticos sejam resolvidos, esta tecnologia terá
utilização limitada em embriões.
Clonagem e células-tronco
O cenário para a era da clonagem em animais domésticos foi montado
após o artigo de 1986 emNaturezano qual Willadsen (1986) descreveu a
clonagem de ovelhas pela transferência nuclear de blastômeros. A
capacidade de estabelecer células semelhantes a células-tronco de
ovelhas ao longo de muitas passagens (Campbelle outros. 1996) levou ao
nascimento de 'Dolly' (Wilmute outros. 1997) após transferência nuclear
de células somáticas (SCNT). Isto acelerou ainda mais a investigação e a
utilização prática da clonagem no mercado interno.
Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento 117
animais e, hoje, descendentes clonados nascem em diversas
espécies de animais de fazenda (por exemplo, Lie outros. 2000;
Boqueste outros.2002; Dinnyese outros. 2002; Forsberge outros.
2002; E aí carae outros. 2002a, 2002b; Keefere outros. 2002; Miyosie
outros. 2003; Poçose outros. 2003). A maioria desses estudos
utilizou equipamentos micromanipuladores, mas a clonagem sem o
uso de micromanipuladores foi introduzida em bovinos (clonagem
artesanal (HMC); Vajtae outros.2001, 2003; Obacke outros.2003) e
suínos (Boothe outros. 2001), baseado em embriões zona-livres
(Peurae outros. 1998; Peura 2003). As taxas de gravidez e os
problemas observados com esta tecnologia parecem ser muito
semelhantes aos observados com a técnica clássica (HG Pedersen e
outros. 2002, observações pessoais).
A capacidade de induzir modificações genéticas adicionando ou
eliminando certos genes por recombinação homóloga das células
doadoras antes do SCNT é uma importante ferramenta de pesquisa
e pode ser usada na medicina agrícola, bem como na medicina
humana (para revisões, ver Zuelke 1999; Niemann e Kues 2000;
Machátye outros. 2002; Prathere outros. 2003).
A clonagem utilizando células transgênicas substituiu, em geral, a
tecnologia de injeção pró-nuclear, pelo menos em espécies domésticas.
Outras abordagens são possíveis, sendo uma delas a transfecção dos
espermatozóides antes da inseminação (Lavitranoe outros. 1989; Parede
2002).
A transferência de embriões clonados, bem comoem vitroOs
embriões produzidos podem resultar em problemas graves na gravidez,
no parto e no recém-nascido, designados por síndrome da prole grande
(de Sousae outros. 2001; Chavatte-Palmere outros. 2002; E aí carae
outros. 2002a, 2002b; Renarde outros. 2002; Poçose outros. 2003). A
eficiência, medida em termos de descendentes vivos, ainda não
ultrapassa 10% em nenhuma das espécies domésticas e, assim, torna
esta nova tecnologia menos atrativa para uso rotineiro na produção
animal. A expressão genética aberrante, incluindo genes impressos
(Young e Fairburn 2000), pode contribuir para esta falta de
desenvolvimento normal. Além disso, alterações epigenéticas em
embriões clonados e descendentes estão sendo estudadas como um
possível fator que contribui para a alta incidência de perdas de
conceptos observada após a transferência de embriões SCNT (Vignone
outros. 2002; Wilmute outros. 2002; Cezare outros. 2003; Hane outros.
2003; Reike outros. 2003).
Os mecanismos que levam à reprogramação epigenética “normal” da
célula doadora pelo oócito permanecem desconhecidos, mas a
tecnologia de clonagem fornece, no entanto, uma forma de estudar
estes mecanismos. Como tal, esta tecnologia será importante para a
futura investigação em embriologia e células estaminais em animais
domésticos e em humanos (Denning e Priddle 2003).
Observações finais
Na presente revisão, tentamos resumir alguns trabalhos anteriores e
atuais pertinentes à tecnologia de embriões de animais domésticos. É
uma ampla gama de tecnologias básicas (por exemplo, biologia
molecular, bioquímica) e aplicadas (ultrassonografia, criobiologia) que se
fundem e fornecem meios aprimorados para
118 Reprodução, Fertilidade e Desenvolvimento
avaliar a qualidade do embrião, aumentar a qualidade dos meios de
cultura paraem vitroprodução de embriões, melhorar a clonagem por
transferência nuclear, produzir descendentes sexuados, melhorar a
nossa compreensão da perda fetal e melhorar os esquemas de
reprodução. A passagem da investigação embriológica para a prática
nem sempre é fácil; factores como a eficiência e a normalidade são
considerados de forma bastante diferente na prática, onde a opinião dos
consumidores é de grande importância.
Pode-se perguntar: o que virá a seguir em termos de
tecnologias? Não há dúvida de que os rápidos
desenvolvimentos nas áreas genómica e pós-genómica irão
fornecer-nos mais ferramentas em embriologia, bem como na
criação e produção animal. Ainda são necessárias informações
estruturais e funcionais detalhadas sobre os embriões. A
interpretação desta informação está a tornar-se cada vez mais
complexa e é óbvio que existe uma necessidade urgente de
colocar isto num contexto fisiológico adequado. As
consequências para a prole, nomeadamente em termos de
saúde e bem-estar, e para os consumidores dos produtos
provenientes destes animais, terão de ser abordadas com ainda
maior consciência no futuro. Assim, os cientistas que trabalham
na tecnologia de embriões animais devem fornecer
informações científicas objectivas e participar no diálogo com a
sociedade e o sistema político, a fim de obter aceitação para
uma aplicação mais ampla destas tecnologias controversas.
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