INSTITUTO POLITCNICO DE SANTARM

ESCOLA SUPERIOR AGRRIA DE SANTARM

LICENCIATURA BIETPICA DE ENGENHARIA AGRO-ALIMENTAR, RAMO DA QUALIDADE ALIMENTAR

CONTRIBUTO DIFERENCIAO DE LEVEDURAS DE INTERESSE

ENOLGICO POR PERFIS ISOENZIMTICOS

Nuno Pedro Herculano Pimentel

SANTARM 2003

INSTITUTO POLITCNICO DE SANTARM

ESCOLA SUPERIOR AGRRIA DE SANTARM

LICENCIATURA BIETPICA EM ENGENHARIA AGRO-ALIMENTAR, RAMO DA QUALIDADE ALIMENTAR

CONTRIBUTO DIFERENCIAO DE LEVEDURAS DE INTERESSE

ENOLGICO POR PERFIS ISOENZIMTICOS

TRABALHO FIM DE CURSO

para obteno do grau de Licenciado

Nuno Pedro Herculano Pimentel, N. 796 Orientador: Doutora Filomena Cristina Coelho da Luz Duarte (EVNINIAP) Supervisor: Doutora Marlia Oliveira Incio Henriques

SANTARM 2003

Este trabalho foi realizado na Estao Vitivincola Nacional em Dois Portos (INIAPInstituto Nacional de Investigao Agrria e das Pescas) na seco de Microbiologia do Departamento de Enologia, sob a orientao da Investigadora Auxiliar Filomena Cristina Coelho da Luz Duarte.

AGRADECIMENTOS

Na realizao do presente trabalho contei com diversos apoios, os quais me ajudaram e incentivaram. Um muito obrigado a todos os que me apoiaram de uma forma directa ou indirecta. Gostaria de agradecer em especial: Ao Director e Subdirector da Estao Vitivincola Nacional, na pessoa do Investigador principal Eng. Antnio Srgio Curvelo-Garcia e do Eng. Vasco Justino, por terem possibilitado a realizao do estgio, bem como o acesso aos meios disponibilizados pela EVN. Doutora Filomena Duarte, por ter aceite ser orientadora deste trabalho, pela partilha de conhecimentos sem os quais no teria sido possvel a sua realizao, pela forma como orientou e colaborou na anlise dos resultados e resoluo dos problemas que foram surgindo no trabalho experimental. Pelas numerosas crticas e sugestes que me proporcionou com vista melhoria do trabalho. Doutora Marlia Henriques por ter aceite ser supervisora deste trabalho, pelo apoio, suporte e boa disposio, bem como pela constante disponibilidade oferecida na edificao do presente trabalho. Filomena Alemo, pelo constante interesse e predisposio a ajudar demonstrados ao longo de todo o trabalho, pela sua amizade, bem como pela partilha de conhecimentos, paixo pela microbiologia e um sentido humano muito inspiradores no s no decorrer deste trabalho como para as lies da vida futura. Doutora Eva, Eng. Ilda, ao professor Virglio e ao Eng. Paulo Cameira dos Santos, pelas importantes sugestes e discusses, ao longo de toda a realizao do estgio, mas acima de tudo pela amizade.

A todos os colegas estagirios e bolseiros, Ana, Ana Quintino, Ana Mateus, Adelaide, Adelina, Carla, Carla Fortunato, Nilza, Tnia, ao Cristiano, ao Antnio, ao Francisco, ao Joo, ao Jorge, ao Mrio e ao Ricardo, pela sua amizade e pelo encorajamento nos momentos mais crticos deste trabalho. A toda a equipa da EVN, por todo o apoio recebido, por me ter acolhido e me ter feito sentir em casa. tipografia Sogratol, na pessoa do meu amigo Bruno Henriques, o meu apreo e agradecimento pela edio do grafismo da capa e encadernao do presente trabalho. Aos meus pais, sem os quais nunca teria possibilidades de estar aqui, pelo seu total apoio, bem como pela ateno e preocupao demonstradas na realizao do estgio. Aos meus familiares e amigos, com quem pude contar, pelo apoio e fora nas alturas mais crticas da realizao deste trabalho. Susana pelo encorajamento, pelo apoio, e carinho demonstrados, os quais me incutiram um flego extra na fase final da elaborao do presente trabalho.

Resumo

RESUMO

Na indstria alimentar existe uma emergente necessidade de implementar uma metodologia fivel na identificao de leveduras, entre outros microrganismos, presentes nos alimentos, nas diferentes fases do seu processamento. Com o desenvolvimento da biologia molecular, novas metodologias de identificao de leveduras, entre as quais a anlise isoenzimtica, foram disponibilizadas para responder a esta necessidade. O presente trabalho focou a aplicabilidade da anlise isoenzimtica na identificao de algumas espcies de leveduras associadas a ambientes vnicos. Visou-se, com este trabalho, dar continuidade aos estudos anteriores e complementar a base de padres isoenzimticos da Estao Vitivincola Nacional (EVN). No presente trabalho foram analisados os perfis electroforticos de cinco sistemas enzimticos: esterase (EST), lactato desidrogenase (LDH), lcool desidrogenase (ADH), fosfatase cida (ACP) e glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), em leveduras associadas indstria dos vinhos, mais em concreto, ligadas ao processo de vinificao. Foram analisados os perfis electroforticos de 32 estirpes pertencentes a 19 espcies de 12 gneros, os quais foram adicionados aos da base de dados de perfis electroforticos de isoenzimas existente na EVN (Duarte, 2000), perfazendo na sua totalidade 160 estirpes de cerca de 50 espcies de leveduras. Foram obtidos 32 perfis electroforticos distintos de EST, ACP, LDH, G6PD e ADH, para as 32 estirpes estudadas. Da aplicao de mtodos de anlise numrica aos dados electroforticos resultou uma representao grfica na forma de dendrograma, na qual as estirpes se posicionaram isoladas ou em grupos, correspondentes s respectivas espcies. Contudo, algumas estirpes no agruparam com as estirpes tipo da sua espcie, foram elas as estirpes EVN 366, 367, 373 e 385 respectivamente das espcies Candida cantarellii, C. stellata, Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae. Foi utilizada a sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S, mtodo muito utilizado na identificao de espcies de leveduras, no estudo das referidas estirpes. Ocorreu um paralelismo entre os resultados da sequenciao e os resultados da anlise isoenzimtica, para duas das estirpes EVN 366 e 367, os quais apontam muito provavelmente para uma incorrecta classificao das mesmas. No entanto, para as estirpes EVN 373 e 385 no foi verificado aquele paralelismo entre as duas metodologias de identificao, devendo ser testados outros complexos enzimticos para a sua identificao. vii

Resumo

A incluso dos resultados do presente trabalho na base de dados electroforticos de isoenzimas existentes na EVN, permitiu verificar, no geral, uma boa diferenciao entre as cinquenta espcies estudadas. No entanto, os valores de Rm iguais, ou muito prximos, aos existentes na base de dados tero que ser confirmados por comparao num mesmo gel. A anlise isoenzimtica revelou uma elevada resoluo gentica, e um grande potencial na diferenciao das espcies de leveduras estudadas. Contudo so necessrios mais estudos com outros complexos enzimticos para optimizar o processo de identificao na espcie, efectuada com base na anlise electrofortica de perfis isoenzimticos. Esta, aliada sua economia e rapidez, a qual pode ser ainda aumentada por automatizao na anlise electrofortica, assim como por software de anlise dos perfis de bandas, parece ser indicada no rastreio de leveduras presentes ao longo de todo o processo de vinificao, por parte da indstria.

viii

Abstract

ABSTRACT

In the food industry there is an emerging need in implementing a reliable methodology for the identification of the yeast species present in the different food processing stages. The aim of this work was to verify suitability of isoenzyme electrophoretic profiles to identify several wine related yeast species, and to the construction of a isoenzyme database already initiated at Estao Vitivincola Nacional (EVN). Five isoenzyme systems, namely, esterase (EST), lactate dehydrogenase (LDH), alcohol dehydrogenase (ADH), acid phosphatase (ACP) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), of wine yeast strains, belonging to nineteen species and twelve genera, were analysed in the present work. The obtained results were added to the above mentioned isoenzyme patterns database, making up a sum of one hundred and sixty strains approachably belonging to fifty yeast species. Thirty-two distinct electrophoretic isoenzyme patterns were obtained for the thirty-two studied strains. The application of numerical analysis methods to the isoenzymes profiles originated a dendrograma, where the strains were positioned isolated or in clusters, corresponding to their belonging species. Some of the studied strains havent clustered with the respective species type strain, namely EVN 366, 367, 373, 385, respectively belonging to the species Candida cantarellii, C. stellata, Kluyveromyces thermotolerans and Wickerhamiella domercqiae. Another approach was used in their identification 26S rDNA sequence analysis, a methodology frequently used in the yeast species identification. For strains EVN 366 and 367 a parallelism has occurred, between the 26S rDNA sequence results and the electrophoretic isoenzyme results, which points to a misidentification at the species level, however for the strains EVN 373 and 385 there was no agreement between the methodologies tested, and additional enzymes are needed for their identification by the isoenzyme analysis. The results of the present work were added to EVN isoenzyme patterns database, and with only five isoenzyme systems it was possible to differentiate the great majority of the fifty yeast species. However Rm values similar to those present at the existing database need to be confirmed by running the strains at the same gel.

ix

Abstract

It seems that the electrophoretic isoenzyme patterns analysis has revealed a high genetic resolution, and its large potential for distinguishing the yeast species has been confirmed although different enzymes should be assayed for optimizing the identification process, by using this methodology. Its economy allied with its fastness, which can be improved with the automation of electrophoresis process and the use of a analysis software, points out the isoenzyme analysis as a powerful methodology to trace spoilage yeasts, particularly in the wine industry.

ndices

NDICE GERAL
RESUMO ABSTRACT NDICE GERAL NDICE DE FIGURAS NDICE DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUO
1.1 Leveduras presentes nas diferentes etapas de vinificao 1.1.1 Fase pr-fermentativa 1.1.2 Fermentao alcolica 1.1.3 Fase posterior fermentao xi xiii xiv xv 01 02 03 05 08 10 13 14 14 15 15 20 21 21 22 26 27 28 31 31 32 33 33 34 34 xi vii ix

2. CLASSIFICAO DE LEVEDURAS
2.1 Testes clssicos, simplificados e miniturizados 2.2 Mtodos de anlise de constituintes celulares 2.2.1 Espectroscopia por infravermelho 2.2.2 Perfis de cidos gordos 2.2.3 Tcnicas baseadas nos cidos nucleicos 2.2.4 Anlise de protenas 2.2.4.1 Anlise isoenzimtica 2.2.4.1.1 Isoenzimas 2.2.4.1.2 Tcnica de electroforese 2.2.4.1.3 Vantagens da anlise isoenzimtica 2.2.4.1.4 Desvantagens da anlise isoenzimtica 2.2.4.1.5 Sistemas enzimticos em estudo

3. MATERIAL E MTODOS
3.1 Estirpes de leveduras em estudo 3.1.1 Manuteno das leveduras 3.2 Anlise isoenzimtica 3.2.1 Preparao do extracto proteco 3.2.1.1 Cultura e recolha das clulas de leveduras em meio YEPD 3.2.1.2 Obteno do extracto proteco

ndices

3.2.2 Anlise electrofortica das isoenzimas 3.2.2.1 Sistema de electroforese 3.2.2.2 Preparao do gel suporte de poliacrilamida 3.2.2.3 Preparao das amostras para electroforese 3.2.2.4 Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE-nativa) 3.2.2.5 Obteno de perfis isoenzimticos 3.2.2.5.1 Esterase (EST- EC 3.1.1.1) 3.2.2.5.2 Fosfatase cida (ACP- EC 3.1.3.2) 3.2.2.5.3 Lactato desidrogenase (LDH- EC 1.1.1.27) 3.2.2.5.4 Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD- EC 1.1.1.49) 3.2.2.5.5 lcool desidrogenase (ADH- EC 1.1.1.1) 3.2.2.6 Digitalizao dos geis obtidos 3.2.2.7 Determinao de mobilidade electrofortica relativa (Rm) 3.2.2.8 Secagem dos geis obtidos 3.2.2.9 Anlise numrica dos resultados 3.2.2.10 Anlise de reprodutibilidade do mtodo 3.3 Sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S 3.3.1 Estirpes de leveduras analisadas 3.3.2 Condies de cultura 3.3.3 Extraco do DNA 3.3.4 Amplificao de DNA (PCR) 3.3.5 Sequenciao de rDNA (D1/D2) 3.3.6 Comparao dos nucletidos sequenciados 47 42 40

35 35 36 37 37 38 38 39 40 41 42 43 43 44 45 45 45 46 48 50 51 51 55 60

4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Perfis isoenzimticos 4.2 Anlise numrica dos perfis isoenzimticos obtidos 4.3 Sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S

4.4 Comparao com os perfis isoenzimticos das estirpes da base de dados da EVN 65

5. CONCLUSES REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS

70

69

xii

ndices

NDICE DE FIGURAS
2- REVISO BIBLIOGRFICA
Figura 2.1 Reaco de colorao por procedimentos histoqumicos para a maioria das desidrogenases.

28

3- MATERIAL E MTODOS
Figura 3.1 Representao esquemtica da preparao do extracto proteico. Figura 3.2 Sistema descontnuo de uma dimenso. Figura 3.3 Representao da distribuio das amostras pelos poos do gel de poliacrilamida. Figura 3.4 Revelao das bandas de actividade enzimtica no gel de poliacrilamida, aps separao electrofortica. Figura 3.5 Esquema dos genes do rRNA com indicao da localizao dos primers utilizados e da regio sequenciada.

33 35 37 38 45

4- RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 4.1 Imagens digitalizadas de perfis electroforticos dos cinco complexos enzimticos nas 32 estirpes analisadas. Figura 4.2 Dendrograma representando a semelhana entre a totalidade de estirpes de leveduras analisadas neste trabalho, com base em perfis electroforticos dos cinco complexos isoenzimticos. Figura 4.3 Perfis de bandas do DNA extrado das estirpes em estudo Figura 4.4 Perfis de bandas do produto PCR amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6 Figura 4.5 Perfis de bandas do produto PCR purificado, amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6. Figura 4.6 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 366 e CBS 4878. Figura 4.7 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA da estirpe EVN 367 com as estirpes CBS 157, 10-372, e EJ1. Figura 4.8 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 373 e CBS 6340 Figura 4.9 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 385 e CBS 4351 Figura 4.10 Dendrograma representando as relaes da totalidade de estirpes estudadas (160 estirpes), com base nos perfis electroforticos de EST, ACP, G6PD, LDH e ADH.

51 57

60 61 61 62 63 64 65 66

xiii

ndices

NDICE DE TABELAS
2- REVISO BIBLIOGRFICA
Tabela 2.1 Sistemas enzimticos em estudo.

29

3- MATERIAL E MTODOS
Tabela 3.1 Estirpes de leveduras em estudo no presente trabalho. Tabela 3.2 Preparao do gel suporte de poliacrilamida, condies PAGE-nativa.

31 36

ANEXO III
Tabela A.1 Matriz dos resultados obtidos de todas as estirpes estudas, para tratamento por anlise numrica.

xiv

Lista de abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS

Bisacrilamida Brometo de etdeo DNA D.O. EDTA Fast Blue RR Fast Garnet GBC g Kb NAD+ NADH

Minutos N,N-metiletilenobisacrilmida Brometo de (3,8-diamino-5-etil-6-fenil) fenantridinium cido desoxirribonucleico Densidade ptica cido etilenodiaminotetractico Cloreto de 4-benziolamino-2,5-dimetoxibenzenodiaznio C14 H4 N4 O4 S Acelerao da gravidade Kilobases Dinucletido de nicotinamida e adenina (forma oxidada) Dinucletido de nicotinamida e adenina (forma reduzida) 4,4-difenileno) tetrazlio]

NBT Nitro Blue Tetrazolium [Cloreto de 2,2-di-p-nitrofenil-5,5-difenil-3,3- (3,3-dimetoxipb p/p p/v Peso/Peso Peso/Volume Pares de bases

PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida PMS Metosulfato de fenazina rDNA DNA ribossmico RNA Rm r.p.m. SDS TEMED Tris v/v cido ribonucleico Mobilidade electrofortica relativa Rotaes por minuto Dodecilsulfato de sdio N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamina Tris (hidroximetil) aminometano Volume/Volume

xv

Reviso Bibliogrfica

1. INTRODUO
As leveduras so usadas em muitos processamentos industriais, tendo a produo de bebidas alcolicas e de alimentos como o po, um dos grandes destaques. A utilizao de leveduras advm desde os primrdios da civilizao, por exemplo na Sumria por volta do ano 7000 A.C., era produzida cerveja, na Assria fabricava-se vinho no ano 3500 A.C. e na Roma antiga, existiam, no ano 100 A.C., mais de 250 indstrias de panificao que fabricavam po a partir de massa levedada (Demain et al., 1998). Contudo, so igualmente responsveis por elevadas perdas econmicas devido ao desenvolvimento de leveduras de contaminao em alimentos e bebidas, nos quais resultam a formao de pelculas, turvao e aromas indesejveis. Este facto tem preocupado a indstria alimentar, uma vez que tende-se para um decrscimo no uso de conservantes eficientes contra leveduras (por exemplo o dixido de enxofre e cido benzico), tendo vindo a ser efectuadas numerosas investigaes a nvel da Europa para entender este fenmeno (Malfeito Ferreira, 1996; Demain et al., 1998). Tal reforado por Thomas (1993), no que respeita incidncia de contaminaes de bebidas estar muito frequentemente associada a leveduras. Dada a sua grande distribuio na natureza e particular associao com frutos e vegetais. Colnias de leveduras so comuns em bebidas, assumindo grande destaque em condies de baixo aw, baixo pH, bem como na presena de conservantes como o dixido de enxofre e o cido srbico, em concentraes elevadas de acar e/ou lcool. A contaminao de vinhos por leveduras continua a constituir um problema para os produtores, por um lado devido a exigncias comerciais e, por outro, maior exigncia de qualidade por parte dos consumidores. Devido s restries cada vez maiores aplicao de conservantes no vinho, surge uma necessidade de conhecer os fenmenos e eliminar as causas da degradao do vinho, tantas vezes conducente a elevados prejuzos. Em leveduras associadas ao processo de vinificao bem como sua contaminao, tm sido empregues diversas metodologias na sua identificao e diferenciao, entre as quais a anlise de perfis electroforticos de isoenzimas, a qual tem sido muito aplicada para estes fins, com o intuito de ser uma metodologia de identificao rpida, fivel, de fcil manuseio e baixo custo (Subden et al., 1982; Yamazaki et al., 1983; Poncet et al., 1992). O presente trabalho visou dar continuidade aos estudos de Duarte (2000) complementando a base de dados existente, constituda pelos padres isoenzimticos de 28 espcies de leveduras. Pretendeu-se determinar os padres isoenzimticos de espcies adicionais, relevantes ao processo de 1

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vinificao, que, conjuntamente com os dados anteriores podero ser implementados nos sistemas de controlo de qualidade na produo de vinho. Foi efectuada uma pesquisa bibliogrfica com vista seleco de leveduras encontradas em ambientes vnicos, ou seja, presentes ao longo do processo de fabrico do vinho, nomeadamente na vinha, no mosto, em vinho e nos ambientes vnicos, baseando-se esta recolha de informao em Barnett et al., (1990); Lodder (1970); Kurtzman e Fell (1998). As estirpes de leveduras, as quais se encontram descritas em 3.1, so oriundas da Coleco Portuguesa de Culturas de Leveduras (PYCC), e do Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), sendo na sua maioria estirpes tipo da respectiva espcie, de modo a garantir uma maior fiabilidade dos resultados.

1.1

Leveduras presentes nas diferentes etapas de vinificao

Segue-se uma breve reviso dos estudos efectuados sobre este tema, relacionados com as espcies de leveduras estudadas no presente trabalho. O mosto de uva trata-se de um meio eminentemente fermentescvel. Nele as leveduras encontram os constituintes necessrios para assegurarem as suas funes vitais. Os hidratos de carbono, glucose e frutose, compostos azotados sob diversas formas como amonaco, aminocidos, polipptidos e protenas, os sais minerais (fosfato, sulfato, cloreto, potssio, clcio e magnsio), um pH conveniente devido presena de cidos orgnicos como os cidos tartrico e mlico. O mosto de uva contm igualmente substncias que desempenham um papel de factor de crescimento (vitaminas) e outros factores importantes para a sua sobrevivncia. Outros compostos da uva, como os compostos fenlicos e compostos com aroma so importantes para as caractersticas dos vinhos, mas no desempenham um papel essencial nos fenmenos fermentativos (Ribreau-Gayon et al., 1998). Os fenmenos que ocorrem durante a fermentao alcolica foram objecto de investigao em muitos trabalhos, e verificou-se que durante as fermentaes de mostos, ocorre um desenvolvimento sequencial de vrias espcies de leveduras, associadas com as superfcies das uvas, solo das vinhas e superfcies de equipamento vincola nas adegas. Verificou-se que tanto as estirpes como a sucesso de espcies de leveduras, possuam uma influncia determinante na qualidade do produto final, uma vez que as leveduras durante os processos fermentativos produzem para alm de lcool etlico uma enorme variedade de metabolitos que 2

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contribuem ou afectam a complexidade do aroma e a qualidade do vinho (Fleet e Heard, 1993; Sipiczki et al., 2001).

1.1.1 Fase pr-fermentativa

Existem trs etapas no fabrico do vinho em que podem ocorrer contaminaes microbianas, susceptveis de diminuir a aceitao e a qualidade do produto final (Sponholz, 1993). A primeira etapa remete para a vinha, para o estado sanitrio das uvas, uma vez que podem estar contaminadas com fungos, leveduras, bactrias acticas e bactrias lcticas. A disseminao de leveduras veiculada atravs de insectos, nomeadamente abelhas e vespas, as quais so vectores muito eficientes de leveduras, podendo ser responsveis pela sua introduo dentro da adega ou zonas de distribuio (Thomas, 1993; Lema et al., 1996; Martni et al., 1996). De facto em 1925 Sergent e Rougebief demonstraram que os insectos eram o principal vector de transporte de leveduras, excluindo a hiptese de ser o ar o seu agente de propagao (Ribreau-Gayon e Peynaud, 1960). Em 1999 Mortimer e Polsinelli propuseram que os insectos inoculariam microrganismos para o interior de bagos danificados, e que provavelmente proliferariam no interior do fruto. Os insectos vectores incluem vespas (Vespa), abelhas (Apis), Drosophila, outras moscas, aranhas e borboletas (Lepidoptera). Contudo, os autores no tm a certeza se todos estes insectos possuem a espcie Saccharomyces cerevisiae, mas constataram que grande percentagem de abelhas a possua nos seus corpos durante os meses de Inverno, contudo ainda no conhecem os mecanismos de distribuio das leveduras nos bagos de uvas. Lachance et al. (2001) estudaram comunidades especficas de leveduras disseminadas por insectos em regies da Austrlia. Em abelhas e em moscas isolaram leveduras pertencentes aos gneros Metschnikowia e Wickerhamiella, e mais especificamente Wickerhamiella domercqiae entre outras espcies pertencentes ao ltimo gnero (isolada em abelhas). De salientar que a estirpe tipo pertencente ltima espcie referida, foi isolada de uma cuba de vinho de uma adega situada na frica do Sul, no ano de 1960 por van der Walt e van Kerken (van Uden e Vidal-Leiria, 1970). Metschnikowia pulcherrima uma espcie de leveduras muito associada a flores e frutos (Lodder, 1970), tendo sido isolada de inflorescncias de cultivares de Vitis vinifera por van Zyl e Du Plessis (1961; cit. in Davenport, 1974). Em 1972, Barnett et al., isolaram entre outros 3

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gneros da microbiota associada a uvas provenientes da regio de Bordus, o gnero Rhodotorula e a espcie Kloeckera apiculata. Rosini et al. (1982) associaram as espcies Metschnikowia pulcherrima e Kloeckera apiculata com a microbiota proveniente das uvas que mais relevncia tinham nas fases pr-fermentativas e de incio de fermentao. Populaes de leveduras das espcies Candida albicans, C. edax, C. humicola, C. sake, Hanseniaspora osmophila, Lodderomyces elongisporus, Pichia membranifaciens, Rhodotorula glutinis, R. minuta e Saccharomyces cerevisiae, foram isoladas da superfcie de uvas por Parish e Carrol (1985), e verificaram que estas populaes apresentavam uma distribuio regular em castas de Vitis muscadinea (Vitis rotundifolia). J em mostos de uva em fases pr-fermentativas, Castelli e Georgantas (1970) isolaram, em 15 amostras provenientes das regies Thessaloniki e Florina (norte da Grcia), estirpes de leveduras das espcies Candida pulcherrima e Torulopsis bacillaris, sendo Saccharomyces rosei e Kloeckera apiculata as espcies de leveduras mais predominantes. Noutro pas mediterrneo, Pardo et al. (1989) verificou que no processo de vinificao de mostos nas fases pr-fermentativas, provenientes de uma regio vitivincola de Espanha, as espcies mais frequentemente isoladas foram Candida pulcherrima, C. stellata, Kloeckera apis, K. Japonica, Pichia fermentans, P. kluyveri, Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii. Num estudo extensivo a 4 anos de vindimas sucessivas (1986-1990) na Eslovquia, Stollarova (1992) identificou 1126 estirpes de leveduras isoladas de mosto de uva, e verificou que as espcies mais abundantes foram Metschnikowia pulcherrima e Hanseniaspora uvarum, as quais faziam parte, em conjunto com Saccharomyces cerevisiae, S. rosei e Candida vini, das populaes de leveduras permanentemente encontradas nas uvas. Peynaud e Domerq (1959) isolaram 2023 estirpes de leveduras, em uvas e mostos provenientes de vinhas da regio de Gironde. Encontraram frequentemente associadas a uvas brancas Torulopsis bacillaris e Saccharomyces oviformis, as quais representavam 90 % das espcies de leveduras isoladas em mostos, e verificaram que Torulopsis bacillaris encontrava-se especialmente em regies com uma elevada incidncia de Botrytis cinerea (podrido nobre). Tambm isolaram entre outras espcies, estirpes de levedura Candida pulcherrima, Saccharomyces veronae, Pichia membranifaciens, Pichia fermentans, Saccharomyces fructuum e Debaryomyces hansenii. Em ms condies de vindima, como o caso das vindimas com precipitao, foi constatado por Longo et al. (1991), que as espcies Candida lusitanae, C. rugosa, C. stellata, 4

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C. vini, Dekkera intermedia e Pichia carsonii sofriam um incremento muito significativo, e no se encontravam presentes nos mostos de vindimas efectuadas em condies climatricas mais secas. Vindimas em condies difceis, geralmente proporcionam infeces nas uvas por Botrytis cinerea. A proliferao de B. cinerea induz, no bago, um aumento das concentraes de acares redutores por exsudao, uma degradao das fontes de azoto, juntamente com a produo de um cido exgeno uva (cido galacturnico), tal repercute-se na microbiota existente na pelcula do bago (Donche, 1993). Goto et al. (1984) visaram esse efeito, num estudo comparativo de populaes de leveduras provenientes de uvas infectadas por Botrytis cinerea e de uvas ss. Isolaram Zygosaccharomyces baillii e leveduras pertencentes ao gnero Candida as quais predominavam em relao s leveduras apiculadas, nomeadamente Hanseniaspora uvarum e outras espcies pertencentes ao gnero Kloeckera. Verificaram que as leveduras no fermentativas Pichia carsonii e Candida valida tinham a menor expresso das populaes de leveduras, quer em uvas ss quer em uvas infectadas. Em bagos danificados as espcies de leveduras referidas por Guerzoni e Marchetti (1987), mais frequentemente associadas a bagos com doenas, foram Hanseniaspora uvarum, Torulopsis stellata, Metschnikowia pulcherrima e Saccharomycopsis vini, constataram, quando comparados com os bagos sos, que nos bagos que sofriam doenas eram onde as populaes de leveduras se multiplicavam mais activamente. Os autores avanaram a hiptese da disperso das leveduras ser efectuada de um modo entomfilo, veiculada por insectos pertencentes ao gnero Drosophila.

1.1.2 Fermentao alcolica

Desde cedo ocorreu o estudo dos fenmenos fermentativos por parte dos investigadores. Em 1959, Peynaud e Domerq estudaram a sucesso de leveduras em fermentaes de mostos de uva branca provenientes da regio de Gironde e denotaram a presena de Torulopsis bacillaris no incio e durante a primeira fase fermentativa. Com menor frequncia isolaram Saccharomyces veronae, S. fructuum, S. elegans, S. steineri e S. uvarum. Noutra regio de Frana (Sane-et-loire), Brchot et al. (1962) num estudo de dois anos sucessivos (1958-1960), isolaram, num mosto de Beaujolais em final de fermentao, estirpes

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de leveduras Torulopsis bacillaris, T. stellata, Candida mycoderma, C. melinii, Saccharomyces exiguus e S. veronae. Num estudo ecolgico da microbiota presente no decurso da fermentao de mostos provenientes de regies perifricas da Checoslovquia (Skalica-Zhorie, Bohme e SaaleUnstrut), Minarik no ano de 1971, isolou estirpes das espcies Candida pulcherrima, C. melinii, C. mycoderma, Kloeckera apiculata e leveduras formadoras de esporos Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, S. oviformis, S. bayanus, S. veronae, S. uvarum, S. carlsbergensis, S. chevalieri, S. steineri, Torulopsis rosei, Pichia membranifaciens e Hansenula anomala, em regies perifricas. Aps o final do processo fermentativo, foram isoladas estirpes, pertencentes ao gnero Saccharomyces, das espcies S. cerevisiae var. ellipsoideus, S. oviformis e S. willianus, assim como denotada a presena de estirpes de Pichia membranifaciens e de Candida mycoderma, as quais foram frisadas como agentes potenciais de formao de vu superfcie nos vinhos produzidos a partir de castas de uma das regies estudadas (SkalicaZhorie). De referir que uma das espcies detectadas no trabalho mencionado anteriormente, Metschnikowia pulcherrima, apontada designadamente por Park e Bertrand (1974), como a responsvel pelo surgimento do defeito ester taint no vinho, esta levedura caracteriza-se pela formao elevada de acetato de etilo (60-140 mg/L). De um modo geral segundo os autores as leveduras pertencentes aos gneros Candida e Metschnikowia tm uma produo baixa de lcoois superiores e de steres. No decorrer da fermentao, as leveduras apiculadas como Hanseniaspora uvarum, e a sua forma imperfeita Kloeckera apiculata, so conhecidas por produzirem quantidades limitadas de lcool etlico (4-6 %, v/v) (Gao e Fleet, 1988) acompanhadas de quantidades importantes de compostos secundrios como cido actico, steres e glicerol (Romano et al., 1992). Existe, contudo, alguma controvrsia segundo diversos autores em torno do seu contributo real no produto final. Para Lafon-Lafourcade (1983; cit. in Venturin et al., 1994) representam um factor indesejvel devida formao excessiva de acetato de etilo, e outros steres causadores de sabores desagradveis, enquanto que Mateo et al. (1991) atribuem-lhes a produo de aromas frutados particulares. A espcie Candida stellata, tem sido detectada em inmeros trabalhos, alguns referidos anteriormente, e Fleet et al. (1984) verificaram, ao examinarem os nveis de leveduras presentes 6

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naturalmente durante a vinificao de dois vinhos tintos e dois vinhos brancos da regio de Bordus, que as populaes de T. stellata eram somente suplantadas em nmero pelas populaes de Saccharomyces cerevisiae. Monitorizaram esta levedura no decurso da fermentao dos mostos e constataram um crescimento significativo, e a sua presena at fase final da fermentao alcolica, o que sugere que se trata de uma levedura que possui uma contribuio mais elevada na fermentao, do que anteriormente se pensava. Esta levedura consegue tolerar 10 a 12 % (v/v) de lcool etlico. A sua presena prolongada nos mostos em fermentao e a sua capacidade de produzir elevadas quantidades de cido actico, lactato de etilo e metil-2-propanol, pode influenciar a qualidade organolptica do vinho. Para alm das espcies acima referidas outros estudos revelaram a presena de uma grande diversidade de espcies de leveduras, Parish e Carrol (1985) detectaram a presena de populaes de Lodderomyces elongisporus, Candida sake e Pichia besseii, em mostos em fermentao, estando L. elongisporus presente em baixas incidncias, sendo detectada at ao segundo dia de fermentao. Na regio espanhola Utiel-Requena, Pardo et al. (1989) monitorizaram, em mostos no sulfitados, o crescimento de populaes de microrganismos. Nas fases iniciais da fermentao, isolaram Candida stellata, C. pulcherrima, Kloeckera apis, e Kluyveromyces thermotolerans, e verificaram a presena de leveduras de contaminao como Kloeckera japonica, Pichia guilliermondii e Saccharomycodes ludwigii. Num estudo fermentativo de Kluyveromyces thermotolerans, em mostos provenientes da ilha de Maiorca (levedura bastante frequente na regio), Mora et al. (1990), verificaram que os nveis de pH eram mais baixos nos vinhos com esta levedura, assim como uma acidez voltil semelhante dos restantes vinhos, inoculados com Saccharomyces cerevisiae. De referir que leveduras pertencentes ao gnero Kluyveromyces foram tambm isoladas em mostos de uva, num estudo da microbiota proveniente da regio de El Peneds, efectuado por Nadal et al. (1996). Noutros estudos, na ilha de Maiorca, foram isoladas em mostos em fermentao estirpes de Candida stellata, Kloeckera apiculata, C. pulcherrima, C. stealolytica e Saccharomyces cerevisiae, assim como estirpes pertencentes a Hansenula anomala e Pichia membranifaciens, por Mora e Mullet (1991). No mesmo pas, uma grande variedade de espcies de leveduras foi isolada por Longo et al. (1991), em mostos de uva em fermentao, provenientes de duas regies vitivincolas Albario e Valdeorras, nomeadamente Pichia farinosa, Debaryomyces hansenii, Rhodotorula mucilaginosa, Candida pulcherrima, C. guilermondii, C. glabrata, C. lusitaneae e C. rugosa, 7

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comuns s duas regies. Na Zona de Albario isolaram Cryptococcus albidus, Candida stellata, Hansenula anomala e Hansenula silvicola, e na regio Valdeorras isolaram C. vini, Dekkera intermediae e Sporobolomyces roseus. No decurso de uma fermentao espontnea, foram isoladas cerca de 270 estirpes de leveduras por Hidalgo e Flores (1994), em mostos de uva provenientes de Espanha. Verificaram que as espcies Saccharomyces exiguus, Hansenula anomala, Kluyveromyces thermotolerans e Torulaspora delbrueckii, apresentavam baixas incidncias de toxinas killer. Incidindo-se na vinificao do vinho fortificado Xerez, Maiquez (1995) ao efectuar um estudo da microbiota existente no mosto, proveniente de uvas da sua regio de produo (Jerez de la Frontera), detectou a variao de algumas estirpes durante a fermentao, com destaque para as estirpes de Saccharomyces fermentati e Saccharomyces exiguus, que foram isoladas em praticamente todo o processo fermentativo. As estirpes do gnero Saccharomyces formadoras de vu superfcie apresentaram uma seleco manifesta com o lcool etlico, e estavam presentes em todos os isolamentos efectuados no final da fermentao, variando as percentagens de trs espcies consoante os vus em estudo (Saccharomyces cheresiensis, S. rouxii e S. beticus).

1.1.3 Fase posterior fermentao

Nas superfcies de adegas e de equipamentos vincolas, Peynaud e Domercq (1959) isolaram 132 estirpes de leveduras de contaminao, pertencentes s espcies Saccharomyces oviformis, S. ellipsoideus, S. elegans, S. chevalieri, Candida mycoderma, Brettanomyces vini, B. schanderlii e leveduras pertencentes ao gnero Pichia, denotando que C. mycoderma se encontrava muito difundida pelas superfcies da adega, mas que estava presente em maior nmero em barricas de envelhecimento de vinhos, linhas de engarrafamento, e no solo de caves de envelhecimento. Em vinhos que sofreram uma refermentao foram isoladas, pelos mesmos autores, leveduras pertencentes s espcies Saccharomyces ellipsoideus, S. oviformis, S. chevalieri, S. carlsbergensis, S. heterogenicus, S. acidifaciens, S. elegans, Saccharomycodes ludwigii e Brettanomyces shanderlii.

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Foi verificada em 1969, por Gandini, a predominncia de leveduras de contaminao Candida mycoderma e Pichia membranifaciens, e em menores propores Trichosporon pullulans e Hansenula anomala, na microbiota isolada em vinhos Asti engarrafados que apresentavam turbidez. O autor associou a origem de contaminao com as superfcies da adega, depsitos e equipamentos vincolas, especialmente em linhas de enchimento e engarrafamento. Tambm numa linha de enchimento, incidiu um estudo efectuado por Minarik (1982), tendo este isolado das superfcies da respectiva linha, predominantemente estirpes das espcies Torulopsis stellata, e de Candida vini, e ainda estirpes de C. pulcherrima, Saccharomyces baillii var. baillii e de S. cerevisiae. Efectuou igualmente estudos em mostos concentrados pela aco do calor, nos quais recuperou estirpes de T. stellata e de T. domercqii. Ainda associadas com linhas de engarrafamento de vinhos, Malfeito-Ferreira (1996), refere a deteco de estirpes de Lodderomyces elongisporus, assim como detectadas em mostos de uva concentrados, tendo alcanado a sua identificao atravs de perfis de cidos gordos. Na regio de Moravia, em diversas caves de envelhecimento, Kyselakova (1994, 1995), observou a ocorrncia de leveduras, e recuperou estirpes de leveduras Saccharomyces cerevisiae, S. oviformis, S. carslbergensis e S. willianus. Das leveduras no pertencentes ao gnero Saccharomyces, isolou Metschnikowia pulcherrima, Candida krusei, C. zeylanoides, C. mycoderma, Kloeckera apiculata, Torulopsis stellata e T. bacillaris. Verificou que o gnero Candida representava 42,3 %, Saccharomyces 34,6 %, Kloeckera 15,4 % e Torulopsis 7,7 % da microbiota total isolada nas caves de envelhecimento.

2. CLASSIFICAO DE LEVEDURAS
As leveduras constituem um grupo de fungos unicelulares taxonomicamente heterogneo e de elevada complexidade (Ribreau-Gayon et al., 1998). O domnio das 9

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leveduras compreende representantes de Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycetes (Fungi Imperfeti). Foi demonstrado que as leveduras imperfeitas (deuteromicetas) podem estar relacionadas tanto com as leveduras ascomicetas, como com as leveduras basidiomicetas. A classificao atribuda por Hansen no sculo XIX, distinguiu os isolados de leveduras provenientes da indstria cervejeira com base na morfologia das clulas e ascsporos, caractersticas de crescimento em meios de cultura lquidos, temperaturas ptimas de crescimento e a sua capacidade de fermentar diferentes tipos de acares. Com as descobertas de leveduras com novas caractersticas, os taxonomistas foram alargando a lista de caracteres fenotpicos descritas por Hansen, como a forma e dimenso das clulas, a estrutura da parede celular e septos, o modo de reproduo vegetativa, a presena ou ausncia de estdios sexuais, as propriedades dos ascos e basdios, a morfologia dos ascsporos e basidisporos, o padro das geraes alternadas, ploidia das fases vegetativas, formao de pigmentos, a oxidao de cerca de 40 fontes de carbono, a utilizao de azoto e formas azotadas, crescimento a diversas temperaturas, liquefaco de gelatina, tolerncia a elevadas concentraes de glucose, resistncia ciclohexamida e a estrutura da coenzima Q envolvida no transporte de electres (van der Walt, 1987). Em leveduras a taxonomia tem suscitado numerosos estudos, cujos resultados foram reagrupados em obras sucessivas, edificando progressivamente a classificao que conhecemos hoje em dia (van der Walt, 1987; Ribreau-Gayon et al., 1998). Assim, caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bem como algumas caractersticas moleculares, as quais so determinadas sob condies padronizadas, constituem a principal base de classificao de leveduras apresentada nos mais recentes tratados de taxonomia (Kurtzman e Fell, 1998; Barnett et al., 2000) A taxonomia de leveduras, como dos restantes microrganismos, compreende a sua classificao e identificao. A classificao permite agrupar os organismos em taxa, em funo das suas similaridades e/ou das suas relaes com um ancestral comum. O taxon base trata-se da espcie, a qual pode ser definida, como uma populao de estirpes que apresentam em comum um certo nmero de caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, genticas e ecolgicas, as quais constituem a descrio estandardizada da espcie. A identificao consiste em efectuar uma comparao de um organismo desconhecido com outros j classificados e denominados que apresentem caractersticas semelhantes (Ribreau-Gayon et al., 1998). Uma vez definidas, as espcies individuais podem ser arranjadas em gneros e famlias, com base nas semelhanas totais, de modo a formar um sistema hierrquico. Contudo, embora a identificao das espcies seja o principal objectivo de todos os esquemas de classificao 10

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microbiolgica, a separao e reconhecimento exacto das subespcies ocorrentes numa espcie, tem assumido uma grande importncia em todos os ramos da microbiologia, como por exemplo na microbiologia enolgica e microbiologia clnica (Towner e Cockayne, 1993). A fragilidade da identificao pelos mtodos microbiolgicos convencionais foi posta em evidncia pelos mtodos de anlise de genoma. Segundo Poncet et al. (1992) a classificao de leveduras baseada nos caracteres fenotpicos, como as caractersticas morfolgicas e fisiolgicas ou as reaces bioqumicas, nem sempre revelaram ser satisfatrias, especialmente na delimitao de organismos relacionados com um parentesco prximo. Devido grande variabilidade da assimilao e fermentao de fontes de carbono por parte das estirpes, as espcies do grupo Saccharomyces sensu stricto proporcionam um bom exemplo desta problemtica. Acrescente-se que na taxonomia tradicional de leveduras, nem sempre satisfatria a diferenciao de espcies, com base nos critrios atrs referidos, em parte devido a muitas separaes se basearem na presena ou ausncia de uma determinada caracterstica, a qual muitas vezes controlada por um nico gene susceptvel de mutao (Lewicka et al., 1995; Kmmerle et al., 1998). Os primeiros estudos de comparao de DNA e RNA de estirpes do gnero Saccharomyces, efectuados por Bicknell e Douglas (1970), permitiram a diferenciao de trs gneros, Zygosaccharomyces, Torulaspora e Kluyveromyces. Yarrow e Meyer (1978) combinaram o gnero Candida com o Torulopsis, separados originalmente pela presena ou ausncia de pseudomiclio, ao descobrir respectivamente, que a formao de pseudomiclio poderia variar entre as estirpes pertencentes s mesmas espcies. De um modo semelhante Kurtzman (1984) props a unio dos gneros Pichia e Hansenula, separados pela capacidade de assimilar nitratos, quando estudos de reassociao DNA-DNA efectuados a trs estirpes pertencentes a espcies que apresentavam similaridades fenotpicas (H. minuta, H. nonfermentans, P. lindneri), revelaram 75 % de semelhana entre P. lindneri e H. minuta, e 50 % de semelhana da espcie H. nonfermentans com H. minuta e P. lindneri. Para uma classificao ser fivel, necessita ser suportada por semelhanas filogenticas e considerar as semelhanas e dissemelhanas a nvel do genoma. A utilizao de tcnicas oriundas dos progressos a nvel da biologia molecular, como a comparao de perfis de isoenzimas, protena total, ou nas tcnicas de anlise de cidos nucleicos (perfis de restrio de DNA mitocondrial, anlise de caritipo por electroforese em campo pulsado, tcnicas baseadas na Reaco em Cadeia de Polimerase, PCR- Polymerase Chain Reaction, ou sequenciao de DNA ribossmico), tornou ento possvel a obteno de mais informao e maior preciso, 11

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acerca dos relacionamentos descritos entre as espcies. E o que se iniciou como uma matria subjectiva e intuitiva, modificou-se radicalmente com a aplicao das tcnicas moleculares, que levaram reviso de alguns esquemas de classificao aceites, obtendo-se igualmente um enorme impacto na sistemtica, com o reconhecimento de novos relacionamentos entre os microrganismos e alterando radicalmente a delimitao de espcies e gneros (Kreger-van Rij, 1984; Deak e Beuchat, 1986; Poncet et al., 1992; Towner e Cockayne, 1993). Em indstrias alimentares, existe a necessidade emergente de implementar mtodos fiveis de identificao de microrganismos de degradao dos alimentos, nomeadamente na implementao de uma metodologia que efectue uma monitorizao das diversas etapas de processamento, para controlar o nvel de higienizao das superfcies e equipamentos, bem como no rastreio de possveis fontes de contaminao em todo o processo (Baleiras-Couto et al., 1996b). Nesse sentido a indstria alimentar necessita da utilizao de um mtodo de identificao rpido, fivel, simples e de baixo custo, o qual consiga a identificao e diferenciao dos microrganismos de contaminao (Baleiras-Couto et al., 1995; Kmmerle et al., 1998). Na indstria alimentar as tcnicas rpidas de identificao e caracterizao da microbiota de alimentos e bebidas teve um desenvolvimento muito direccionado na indstria de vinhos e semelhana do que acontece com bactrias de foro clnico, as tecnologias de biologia molecular parecem vir a ocupar um lugar primordial na identificao da microbiota existente. Estas tcnicas incluem diversas metodologias moleculares (RFLP, DNA-fingerprinting e tcnicas baseadas no PCR), anlise de cidos gordos de cadeia longa, e de isoenzimas (Thomas, 1993; Malfeito-Ferreira, 1996; Loureiro, 2000).

2.1 Testes clssicos, simplificados e miniturizados

As metodologias convencionais para identificao de leveduras tratam-se de um processo complexo, laborioso e um enorme dispndio de tempo, as quais podem levar a resultados ambguos como foi referido anteriormente. Devido a este facto, as metodologias clssicas tm vindo a perder espao de manobra na indstria, tendo mesmo vindo a perder importncia como padro.

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Uma linha de desenvolvimento de tcnicas de identificao de leveduras levou para uma miniturizao de testes de identificao, na tentativa de desenvolver tcnicas mais rpidas e simples. Deste modo desenvolveram-se vrios testes de identificao baseados em reaces metablicas, como API 20C e ATRB 22C (API bio Merieux) (Thomas, 1993; Heelan et al., 1998; Smith et al., 1999). O sistema de galerias API 20C baseia-se em 19 testes de assimilao, e foi concebido para a identificao de espcies de leveduras do foro clnico. Subden et al. (1980) aplicaram este mtodo no estudo de leveduras presentes no vinho, utilizando para tal 72 estirpes de leveduras. Nos resultados obtidos, no conseguiram assegurar 100 % de eficcia na identificao, e denotaram a necessidade da criao prvia de uma base de dados adequada, com base nas capacidades de assimilao e fermentao das leveduras em estudo. MalfeitoFerreira (1996), refere que na criao da base de dados, o conjunto de leveduras que servem de base interpretao dos resultados, condiciona em grande medida a utilidade dos mtodos miniturizados e simplificados. Outra limitao destes testes, apontada por Thomas (1993), tratase dos tempos de resposta obtidos serem muito lentos para possibilitar uma interveno, e remediar uma contaminao eminente no processo de fabrico. Para fins de monitorizao das tecnologias de processamento da indstria alimentar, Deak (1986; cit. in Deak e Beuchat, 1996) props uma chave de identificao simplificada, com base em consideraes ecolgicas, direccionada para espcies de leveduras associadas com os alimentos. Foram elaboradas actualizaes posteriores desta chave, com a denominao de SIM (Simplified Identification Method Mtodo Simplificado de Identificao). Este mtodo consiste em utilizar uma chave dicotmica, que direcciona para o tipo de testes bioqumicos utilizados. Na ltima reviso do SIM, proposta por Deak e Beuchat (1996), so utilizados ao todo 30 testes bioqumicos, na sua maioria testes convencionais de assimilao de fontes de carbono e azoto.

2.2 Mtodos de anlise de constituintes celulares 2.2.1 Espectroscopia por infravermelho

Kmmerle et al. (1998), propem um mtodo de identificao de leveduras por espectroscopia de infravermelho FT-IR (Fourier-transformed infrared), esta tcnica envolve a observao das vibraes de molculas excitadas por um feixe de infravermelhos, do qual 13

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resulta um espectro de infravermelhos, que representa um fingerprinting caracterstico. Naumann (1985) props a utilizao da espectroscopia de infravermelho na identificao de microrganismos, uma vez que os espectros observados eram altamente especficos (Naumann et al., 1991; Kirschner et al., 2001), pois eram compostos pelos acontecimentos vibrteis de diversos componentes celulares, tais como por exemplo, DNA, RNA, protenas, e componentes da membrana e parede celular (Timmins et al., 1998). Para efectuar a implementao desta metodologia analtica, necessrio a criao de uma biblioteca de espectros de referncia com base em estirpes e espcies bem caracterizadas. A esta biblioteca de espectros de referncia comparado o espectro da estirpe em estudo, obtendo-se a identificao da estirpe, caso o espectro revele semelhanas com o espectro de referncia, portanto de uma extrema importncia a representatividade e robustez dos espectros referncia de forma a fornecerem respostas credveis, garantindo a fiabilidade do mtodo. Esta metodologia analtica bastante rpida por necessitar de poucas quantidade de biomassa dos organismos em anlise, o que reduz de um modo significativo o tempo de crescimento celular, assim a sua velocidade aliada a uma resoluo elevada, de ser uma metodologia de fcil aplicao, no necessitar de muitas manipulaes de amostras assim como da utilizao de muitos reagentes, e a capacidade de analisar muitas centenas de amostras por dia, tornam esta metodologia muito propensa para a indstria alimentar, e com um enorme potencial na rpida diferenciao, classificao e identificao, no rastreio rpido de microrganismos, nomeadamente leveduras de contaminao de alimentos (Naumann et al., 1991; Timmins et al., 1998; Kirschner et al., 2001). Kmmerle et al., 1998 efectuaram um estudo abrangendo 332 estirpes de leveduras provenientes das coleces de culturas internacionais, dos gneros Issatchenkia, Pichia, Candida, Hanseniaspora, Dekkera, Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Debaryomyces, Zygosaccharomyces, Wickerhamiella, Schizosaccharomyces entre outros, com as quais foi construda a base dos espectros de referncia. Aps a sua construo foram analisados 722 isolados, sendo que 97 isolados foram correctamente identificados por FT-IR. Os resultados obtidos atravs da utilizao desta metodologia analtica, apontam para as limitaes do FT-IR, para fins taxonmicos (Kmmerle et al., 1998; Oberreuter et al., 2002), contudo segundo Kmmerle et al. (1998), este facto no inviabiliza a sua eficcia como sistema de identificao.

2.2.2 Perfis de cidos gordos

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A anlise de perfis de cidos gordos de cadeia longa consiste numa extraco dos cidos gordos com a utilizao de uma reaco de saponificao, e sua determinao, mediante a utilizao de tcnicas como a cromatografia em fase gasosa, espectometria de massa e cromatografia gs-lquido, GLC Gas Liquid Chromatography (Tredoux et al., 1987; Guarro et al., 1999; Peltroche-Llacsahuanga et al., 2000). Tredoux et al. (1987) utilizaram a GLC na determinao da composio em cidos gordos de cadeia longa, em 104 estirpes de leveduras pertencentes a 39 espcies. Os autores conseguiram efectuar a sua separao em trs grandes grupos, consoante as composies de cido oleico, linoleico, linolnico, palmtico e palmitoleico. Contudo, estes agrupamentos no exprimiram os relacionamentos filogenticos entre as estirpes. A anlise de perfis de cidos gordos de cadeia longa, tem contudo vindo a provar ser um mtodo que pode ser aplicado no rastreio de contaminaes nas indstrias alimentares, com curtos tempos de resposta (cerca de 3 dias). Malfeito-Ferreira (1996) efectuou um estudo exaustivo das potencialidades deste mtodo, e conseguiu avaliar os tipos de leveduras de contaminao mais frequentes, e separ-las consoante a sua perigosidade e estabelecer indicadores zimolgicos relevantes.

2.2.3 Tcnicas baseadas nos cidos nucleicos

At ao final dos anos 60, a principal maneira de identificar e classificar as espcies, era com base nos mtodos fenotpicos. Contudo caractersticas fenotpicas como a assimilao e fermentao de muitos compostos so controladas por um ou muito poucos genes (Lindegren e Lindegren, 1949; Winge e Roberts, 1949; cit. in Kurzman, 1998). Com o desenvolvimento dos mtodos de anlise dos cidos nucleicos surgiu a oportunidade de definir as espcies com base nas semelhanas da totalidade do genoma (Kurtzman, 1998). Assim, tm sido desenvolvidas modernas metodologias, baseadas em tcnicas de biologia molecular, de modo a simplificar a identificao, mais especificamente metodologias de anlise de DNA, as quais possuem a vantagem de serem independentes da expresso do genoma (Ness, 1993; cit. in Baleiras-Couto et al., 1995; Kurtzman, 1998). Mais concretamente para leveduras enolgicas, mtodos baseados na anlise de cidos nucleicos, como a anlise de enzimas de restrio de DNA genmico e DNA mitocondrial em campo pulsado, bem como mtodos baseados na reaco de PCR, forneceram melhorias na velocidade e resoluo das suas determinaes taxonmicas 15

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(Yamamoto et al., 1991; Masneuf e Dubourdieu, 1994; Quesada e Cenis, 1995; Baleiras-Couto et al., 1995, 1996a, 1996b; Constant et al., 1997; Esteve-Zarzoso et al., 1999, 2001). Uma das tcnicas usadas na diferenciao de organismos designada por RFLP, (Restricton Fragment Length Polymorphism), e que, segundo Ferreira e Grattapaglia (1995), o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da cadeia dupla de DNA. Aps a extraco de DNA dos indivduos, este tratado com enzimas de restrio, que efectuam cortes num elevado nmero de locais (stios de restrio), resultando uma enorme quantidade de fragmentos de DNA. Em seguida estes fragmentos de tamanhos distintos so separados por electroforese. Devido a um arrastamento contnuo promovido pelos fragmentos no gel, no possvel visualizar diferenas, pelo que se efectua uma transferncia, para uma membrana colocada sobre o gel (Ferreira e Grattapaglia, 1995), e adiciona-se uma sonda marcada de 0,5 a 2,0 kb que hibrida com os fragmentos homlogos existentes na membrana (Southern, 1975; cit. in Neto, 1994). De seguida submete-se a membrana a um filme de raios X (autoradiografia), ou outro tipo de revelao dependendo do marcador, o que permite revelar as bandas constituintes dos marcadores RFLP. Assim, posies diferentes devem-se a fragmentos de distintos tamanhos, o que permite a distino de indivduos (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Referindo diversos autores, Baleiras-Couto (1995) aponta para as grandes desvantagens desta tcnica, que so devido a ser bastante laboriosa, dispendiosa de tempo, e assim como necessitar de elevadas quantidades de DNA ou RNA relativamente purificado, o que faz desta tcnica, pouco apropriada na rotina de identificao.

A tcnica de Reaco em Cadeia de Polimerase, PCR Polymerase Chain Reaction, trata-se de uma tcnica poderosa, que envolve a sntese enzimtica in vitro de milhes de cpias de um segmento especfico de DNA na presena de DNA polimerase. A reaco de PCR baseia-se no emparelhamento e extenso enzimtica de um par de oligonucletidos utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequncia da cadeia dupla de DNA alvo da amplificao. Os primers so sintetizados artificialmente com o objectivo de serem complementares com sequncias especficas que flanqueiam a regio alvo. Um ciclo de PCR envolve trs etapas desnaturao, emparelhamento e extenso. Na primeira etapa, a cadeia dupla de DNA alvo desnaturada por aumento de temperatura, seguindo-se a etapa de emparelhamento, na qual, mediante uma reduo drstica de temperatura, promove-se uma hibridao de DNA-DNA de cada primer com as sequncias 16

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complementares que rodeiam a regio alvo. Segue-se a fase de extenso, na qual promove-se um novo aumento de temperatura, para possibilitar que a enzima DNA polimerase realize a extenso a partir de cada terminal 3 dos primers. Por ltimo, aumenta-se a temperatura e o ciclo repete-se por algumas dezenas de vezes (Ferreira e Grattapaglia, 1995). O PCR e as tcnicas baseadas na amplificao de DNA so muito utilizadas, no somente por necessitarem de pequenas quantidades de DNA, como por serem bastante rpidas e de fcil execuo (Baleiras-Couto, 1995). A tcnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) consiste na criao de padres mediante a amplificao, por reaco PCR, de segmentos casuais de DNA com primers nicos, ou sequncias aleatrias de nucletidos, sendo depois separados por electroforese (Baleiras-Couto, 1995). Segundo diversos autores os primers possuem sequncias arbitrrias, contudo a sua amplificao tecnicamente no ocorre de forma aleatria, mas sim em locais especficos do genoma. Desta forma, mediante a utilizao desta tcnica, criam-se impresses digitais dos gentipos, simples e reprodutveis, as quais permitem a sua identificao (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Em ensaios experimentais a leveduras de contaminao, efectuados por Baleiras-Couto et al. (1995), as tcnicas RAPD e anlise de perfis de restrio de rDNA provaram ser ferramentas poderosas na identificao de leveduras, ao nvel da espcie. Contudo os dados obtidos atravs de RAPD so algo complexos, pelo que os autores aconselharam o seu tratamento atravs do mtodo de anlise de componentes principais. Um dos problemas da anlise de RAPD, a amplificao, a qual tem de ser efectuada sob condies muito restritas, pois extremamente sensvel a alteraes na temperatura de emparelhamento, que pode induzir uma variabilidade dos perfis de bandas obtidos, e por conseguinte levar a se tratar de uma metodologia de muito difcil reprodutibilidade (Quesada e Cenis, 1995; van der Vossen e Hofstra, 1996; Olive e Bean, 1999). O MSP-PCR ou PCR fingerprinting, baseia-se tambm no PCR, e trata-se da mais recente inovao das tcnicas de anlise de DNA. Consiste na amplificao de fragmentos usando como primers oligonucletidos com sequncias de DNA repetitivas, tambm designados por primers microsatlite. O PCR fingerprinting permite efectuar uma discriminao ao nvel da espcie e da estirpe, possui a vantagem de ser mais reprodutvel que o RAPD, devido ao facto da temperatura a que se efectua o emparelhamento das bases, ser superior (van der Vossen e Hofstra, 1996). Esta tcnica tem sido utilizada em diversas investigaes do genoma, Baleiras-Couto et al. (1996a) ao estudarem estirpes de 17

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Saccharomyces cerevisiae, no conseguiram efectuar a discriminao ao nvel da estirpe mediante a utilizao de uma s das tcnicas usadas (RAPD, o PCR fingerprinting, e anlise de enzimas de restrio em rDNA amplificado: regies ITS e NTS). Os autores referem por isso, a necessidade de combinar os resultados de identificao obtidas por mais de uma tcnica analtica dos cidos nucleicos. Uma vez que o RAPD e o PCR fingerprinting so tcnicas de identificao rpidas e de relativo fcil maneio, podem ser efectuados mltiplos testes, que possibilitem a identificao ao nvel da estirpe. A comparao de RNA ribossmico (rRNA) e do seu DNA ribossmico (rDNA) correspondente, tem sido aplicada a um nvel extensivo nos ltimos anos para estimar os relacionamentos entre diversos organismos. O seu interesse provm de duas propriedades: 1) dos ribossomas se encontrarem presentes em todos os organismos, e parecerem partilhar uma origem de linha evolutiva comum; 2) e de ser consensual de que algumas sequncias de rRNA / rDNA se encontrarem suficientemente conservadas, e de serem homlogas entre todos os organismos, servindo de ponto de referncia para o alinhamento das regies menos conservadas, permitindo a avaliao de evoluo (Kurtzman, 1994). Assim, aceite como o melhor foco de estudo para inferir as relaes filogenticas dos organismos, uma vez que a variabilidade nele contida reflecte a divergncia evolutiva da espcie (Vandamme et al., 1996). Em seres eucariontes, o rRNA ocorre em diversas classes de tamanho: a grande subunidade (25S-28S), a subunidade pequena (18S) e a subunidade 5,8S; para cada uma das classes de tamanho de DNA ribossmico foi examinada a um nvel filogentico a extenso da informao presente (Kurtzman, 1994). O autor refere que para fungos bem como outros organismos, foram fornecidos por White et al. (1990) e Kaltenboeck et al. (1992), protocolos para a sequenciao de rDNA mediante a utilizao de primers oligonucletidos especficos e sua amplificao atravs da reaco de PCR. A metodologia da sequenciao tem por base a cpia de DNA in vitro pela DNA polimerase, e a insero das quatro bases (dNTPs- A, G, T, C). Acontece que juntamente com essas bases so adicionadas bases homlogas didesoxiribonucleotidos trifosfato (ddNTP), as quais se ligam no local da base correspondente. Os ddNTP actuam como terminais de transcrio, dado que no possuem o local de ligao da base seguinte, e originam-se desta forma fragmentos de oligonucletidos com os mais diferentes tamanhos, em que a base terminal a ddNTP, a qual pode estar marcada com um fluorforo especfico e assim ser detectada e identificada por um sequenciador automtico de DNA, e a construo do mapa gentico vai sendo transcrita (Towner e Cockayne, 1993).

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Fell (1993; cit. in Kurtzman, 1994) utilizou 3 primers numa tcnica baseada no PCR, para identificar leveduras. A mistura da reaco incluiu DNA genmico, dois primers externos para a regio D1/D2 da subunidade grande de rDNA, e um primer interno o qual revelou ser especfico para a espcie. Os primers externos permitiram a amplificao de uma cadeia nucleotdica com 600 pb da regio D1/D2, mas na presena do terceiro primer, o produto da reaco resultou uma cadeia com um comprimento menor e facilmente detectvel numa corrida electrofortica em gel de agarose. Constatou-se que em seres eucariontes esta regio apresentava uma elevada variao de espcie para espcie, tendo sido muito utilizada para estudos taxonmicos de espcies de leveduras (Kurtzman, 1994; Kurtzman e Blanz, 1998; Stender et al., 2001). Em 1997 Kurtzman e Robnett efectuaram um estudo filogentico exaustivo, com base na anlise de sequncias parciais da regio D1/D2 de rDNA da subunidade grande (26S), em 204 espcies de leveduras ascomicetas com bastante significado do ponto de vista clnico, das quais 21 espcies revelaram ser sinnimas, nomeadamente as espcies Pichia mexicana e Candida veronae revelaram possuir a mesma sequncia nucleotdica. Em 1998, Kurtzman e Robnett, empregando a mesma metodologia publicaram um estudo de aproximadamente 500 espcies de leveduras ascomicetas. Os autores compararam os resultados das classificaes filogenticas atribudas por James et al. (1997), baseados na anlise de sequncias de rRNA 18S efectuadas ao grupo de leveduras com afinidade ao gnero Saccharomyces. O estudo incluiu todas as espcies conhecidas de leveduras ascomicetas, e a anlise dos resultados permitiu uma avaliao dos relacionamentos filogenticos entre as espcies, com base nesta metodologia foi possvel diferenciar a generalidade das espcies em estudo. Fell et al. (2000) efectuaram um estudo em leveduras basidiomicetas, no qual empregaram anlise da sequncia nucleotdica de fragmentos amplificados da regio D1/D2 da subunidade 26S, e regies ITS1 e ITS2, foram focadas 337 estirpes representantes de 230 espcies pertencentes a 18 gneros anamrficos e 24 gneros telemrficos. Este estudo revelou que a maioria das espcies podia ser identificada com base na anlise de fragmentos nucleotdicos da regio D1/D2, embora fosse requerida a anlise com base nas regies ITS1 e ITS2, para efectuar a distino de espcies com um relacionamento muito prximo.

2.2.4 Anlise de protenas

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A anlise de perfis electroforticos de protenas uma metodologia importante no estudo da variabilidade gentica. O princpio subjacente a esta metodologia o de que a funo e estrutura das protenas so determinadas pela sequncia de aminocidos (a qual constitui a estrutura primria), os quais so codificados pelo DNA. Alteraes na estrutura primria vo influenciar a estrutura secundria e terciria da protena, contribuindo para diferenas nas suas propriedades fsico-qumicas, como a forma, a carga elctrica, a hidrofobicidade e ponto isoelctrico, entre outras (Hames, 1990). Inserindo o conceito introduzido por Phaff (1984; cit. in Duarte, 2000), o de que a diversificao gentica funo do tempo, ou seja que organismos que apresentem uma similitude elevada ao nvel do genoma, e por conseguinte uma elevada similitude ao nvel macromolecular, partilham uma linha evolutiva comum divergente h menor tempo. Acontecendo o oposto para organismos que se tenham separado do mesmo tronco evolutivo mais tempo, ou seja, que exibem maiores diferenas ao nvel do gentipo e do fentipo, nomeadamente de protenas. Ao estudarem-se as sequncias de aminocidos de protenas provenientes de diferentes organismos pode-se verificar o nmero de semelhanas e dissemelhanas entre estes, e deste modo inferir os seus relacionamentos filogenticos. Van Vuuren e van der Meer (1987) analisaram os perfis electroforticos de protenas solveis totais, de 29 estirpes de leveduras enolgicas pertencentes ao gnero Saccharomyces, identificadas por testes convencionais como S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum e S. carlsbergensis. Os autores constataram a proximidade de parentesco entre as estirpes e verificaram uma incorrecta classificao para S. carlsbergensis e S. uvarum, uma vez que, com base na anlise de protenas totais ambas as espcies apresentaram perfis idnticos aos de S. cerevisiae. A anlise de protenas totais provou ser uma metodologia til na caracterizao de espcies prximas filogeneticamente. Vancanneyt et al. (1991) analisaram os perfis electroforticos de protena total em 112 estirpes de leveduras pertencentes a 20 gneros. No sentido de obterem perfis de bandas reprodutveis os autores efectuaram a extraco de protena total sob condies estandardizadas, durante a fase exponencial de crescimento das estirpes. A combinao desta tcnica com a anlise numrica permitiu deduzir relacionamentos taxonmicos a nvel interespecfico das espcies estudadas. Uma metodologia de anlise de protenas bastante utilizada como tcnica de delimitao de espcies de leveduras, a determinao de perfis electroforticos de isoenzimas (Towner e Cockayne, 1993), e que ser abordada de seguida.

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2.2.4.1

Anlise Isoenzimtica

2.2.4.1.1 Isoenzimas
O termo isoenzima define um grupo de mltiplas formas moleculares da mesma enzima. Estas formas possuem as mesmas funes catalticas, mas sequncias de aminocidos diferentes, podendo diferir tambm na sua estrutura secundria, terciria e quaternria. Os mecanismos que induzem alteraes na sequncia de aminocidos e assim da estrutura primria da enzima so designados por genticos, e ocorrem com a transcrio e traduo do ADN codificante da enzima. Os mecanismos que introduzem alteraes ps transcrio e traduo da enzima so designados por epigenticos. Nos mecanismos genticos as isoenzimas podem ser derivadas de: diferentes alelos de um mesmo locus; de genes diferentes, os quais codificam protenas independentes, as quais podem actuar em diferentes compartimentos celulares; podem ser polimricas com subunidades idnticas, codificadas por um nico locus; ou polimricas com subunidades codificadas por mais do que um locus, formando homopolmeros e/ou heteropolmeros (Acquaah, 1992). Outra situao de polimorfismo advm de erros no processo . ( de transcrio, ao nvel do RNA-transferncia, ou na traduo, RNA-sntese, (Eiras-Dias, 1994). Nos mecanismos epigenticos pode-se induzir igualmente o polimorfismo enzimtico, mediante alteraes da cadeia polipeptdica por reaces de fosforilao, agregao, desaminao, acilao e delees parciais de oligopptidos, os quais alteram assim a estrutura primria e deste modo as restantes estruturas da enzima. Outro mecanismo epigentico trata-se da alterao da configurao estrutural das protenas no que respeita sua estrutura secundria e terciria, resultando em isoenzimas conformacionais (Selander et al., 1986; Acquaah, 1992; Bonde et al., 1993; Morris et al., 1993).

2.2.4.1.2 Tcnica de electroforese

O nome electroforese tem origem do Grego, e designa o transporte atravs da electricidade. As primeiras electroforeses com protenas solveis foram efectuadas nos anos que precederam a segunda Guerra Mundial (Pasteur et al., 1987). Nos ltimos 20-30 anos o desenvolvimento de tcnicas baseadas na electroforese de protenas, como o caso das isoenzimas, vieram a constituir uma metodologia muito importante na anlise da variabilidade 21

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gentica, visto que, situam-se entre os mtodos fenotpicos que maior expresso pode inferir do genoma (Sampaio, 1998) As isoenzimas, sob a aco de um campo elctrico, migram a uma velocidade dependente do seu tamanho, forma e carga da protena. Nesta conjectura pode ser introduzido o conceito de densidade de carga elctrica que corresponde carga elctrica por unidade de massa ou tamanho. No caso das isoenzimas de diferentes cargas e tamanhos, se estas forem sujeitas a electroforese num meio suporte com propriedades de crivagem, as que possurem maior densidade de carga elctrica, possuem velocidades de migrao superiores s de menor densidade de carga (Hames, 1990; Acquaah, 1992; Towner e Cockayne, 1993). So as mobilidades relativas de cada complexo isoenzimtico que so utilizadas na caracterizao de organismos, obtendo-se perfis electroforticos de isoenzimas (Selander et al., 1986). O dispositivo de electroforese constitudo por um suporte de electroforese, no qual so colocadas as amostras, e nas duas extremidades opostas do gel so colocadas solues de tampo de electroforese, as quais banham os elctrodos (Pasteur et al., 1987). Na escolha dos suportes empregues na electroforese o investigador tem que ter em linha de conta factores como os custos, a durao da electroforese, a facilidade de maneio, e para o caso do gel de amido, a possibilidade de ser cortado em fatias e permitir a revelao de mltiplos complexos isoenzimticos, com uma economia de mo-de-obra (Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992). A matriz do gel de poliacrilamida consiste numa mistura de acrilamida e de bisacrilamida, a qual cria uma malha tridimensional. A soluo de acrilamida polimerizada mediante a adio de um catalisador, e as propriedades do gel de resoluo so determinadas pela concentrao total de acrilamida e da quantidade relativa de bis-acrilamida (Towner e Cockayne, 1993). Com concentraes superiores de acrilamida, obtm-se menores porosidades no gel, e as protenas de cadeia longa iro sofrer um efeito de crivo molecular, o que permite intervir no processo de electroforese, em relao migrao das protenas e ao tamanho dos poros (Pasteur et al., 1987). As vantagens da utilizao da acrilamida, consiste em ser quimicamente inerte, e estvel a uma gama elevada de pH, temperaturas, e foras inicas, no ser adsorvente, ser transparente e finalmente adequar-se melhor ao fraccionamento de tamanhos de protenas, uma vez que os geis de poliacrilamida possuem uma elevada gama de porosidades, o que no sucede com os de amido (Hames, 1990; Acquaah, 1992). Segundo Selander et al. (1986), tm sido realizados diversos estudos, que demonstraram a sensibilidade da electroforese, a qual permite a deteco de uma grande proporo de substituies de aminocidos nas cadeias protecas (80 a 90 %). Contudo, nem todas estas 22

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substituies alteram a carga elctrica global da isoenzima, as quais devido a isso no conseguem ser diferenciadas por electroforese (Bonde et al., 1993). Neste trabalho foi utilizada para a separao das protenas a electroforese de gel de poliacrilamida em condies nativas (PAGE-nativa), a qual permite a separao de protenas em funo simultaneamente do seu peso molecular e da sua carga, ou seja, que a sua separao efectuada mediante a densidade de carga elctrica. (Hames, 1990). A anlise de perfis electroforticos de isoenzimas, tem por base a deteco de diferenas entre as sequncias de aminocidos encontradas em enzimas de diferentes organismos, as quais se tratam de um reflexo da sua divergncia gentica. As substituies de aminocidos podem ser detectadas atravs das extenses das suas migraes electroforticas, visualizadas por diferentes perfis de bandas, tambm designados zimogramas (Yamazaki et al., 1998). Esta metodologia tem sido aplicada no estudo dos fluxos gnicos e na determinao da variabilidade gentica de populaes nos seus habitats naturais, no esclarecimento de relaes taxonmicas de leveduras bem como noutros grupos de organismos (Kreger-van Rij, 1984; Acquaah, 1992; Ferreira e Grattapaglia, 1995). Essa tcnica tem permitido a delimitao de espcies de leveduras, fazendo mesmo parte da descrio formal de algumas delas, o estudo de populaes, designadamente em problemas epidemiolgicos e ainda o estabelecimento de relaes anamorfo/ teleomorfo, em gneros to diversos como Saccharomyces, Pichia, Dekkera, Kluyveromyces e Candida (Yamazaki e Komagata, 1982; Yamazaki et al., 1983; Sidenberg e Lachance, 1983; Holzschu et al., 1985; Smith et al., 1990; Arnaviellhe et al., 1996; Naumov et al., 1997; Duarte et al., 1999; Duarte, 2000; Sampaio et al., 2001). Subden et al. (1982) analisaram a variabilidade gentica de 18 estirpes de leveduras usadas em vinificao, por perfis electroforticos de cinco complexos enzimticos. Obtiveram padres distintos para os cinco complexos enzimticos estudados, e que permitiram a sua diferenciao. Yamazaki et al. (1983), analisaram os perfis electroforticos de 10 complexos enzimticos em 36 estirpes do gnero Saccharomyces, das quais 13 estirpes de S. cerevisiae, 3 estirpes de S. bayanus, 3 estirpes de S. uvarum, 2 estirpes de S. fermentati, 2 estirpes de S. baillii, 2 estirpes de S. rouxii, e uma estirpe de cada uma das espcies S. chevalieri, S. delbrueckii, S. diastaticus, S. exiguus, S. florentinus, S. italicus, S. rosei, S. saitoanus, S. telluris, S. bisporus e S. unisporus. A anlise numrica dos perfis obtidos de todos os complexos enzimticos estudados revelou algum polimorfismo isoenzimtico para as estirpes do grupo Saccharomyces sensu stricto (van der Walt), as quais se tratavam das estirpes das 23

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espcies S. cerevisiae, S. diastaticus, S. italicus, S. chevalieri, S. bayanus e duas das estirpes S. uvarum. A anlise comprovou contudo que as espcies referidas eram sinnimos, comprovando que o grupo Saccharomyces sensu stricto era constitudo por populaes ou variantes fisiolgicas da mesma espcie (Barnett et al., 1979; cit. in Yamazaki et al., 1983). Tal sucedeu de igual modo para as estirpes das espcies S. delbrueckii, S. fermentati, S. rosei e S. saitoanus, as quais foram, posteriormente, classificadas como Torulaspora delbrueckii. Os autores obtiveram a diferenciao das restantes estirpes do gnero Saccharomyces (S. exiguus, S. telluris e S. unisporus), bem como das estirpes das espcies S. baillii, S. bisporus, S. florentinus e S. rouxii, que foram colocadas no gnero Zygosaccharomyces. Obteve-se uma divergncia para uma estirpe de S. uvarum, a qual no revelou possuir relacionamentos com nenhuma das estirpes estudadas. Poncet et al. (1992) estudaram perfis electroforticos de onze sistemas enzimticos em 12 estirpes de Saccharomyces cerevisiae usadas em vinificao. Os autores verificaram a existncia de um polimorfismo evidente para a maioria dos sistemas enzimticos estudados, contudo obtiveram perfis isoenzimticos distintos correspondentes a cada estirpe. A anlise numrica dos resultados permitiu concluir que todas as estirpes estudadas tratavam-se de variantes fisiolgicas de um mesmo taxon. Foi verificada uma heterogeneidade de um igual modo, por Lewicka et al. (1995), no grupo Saccharomyces sensu strico, ao investigarem com base nos perfis electroforticos, em gel de amido, de sete sistemas enzimticos, os relacionamentos entre 52 estirpes pertencentes ao gnero Saccharomyces, das quais 50 pertencentes ao grupo Saccharomyces sensu strico, nomeadamente as espcies S. cerevisiae, S. pastorianus, S. bayanus e S. paradoxus. A anlise dos resultados permitiu inferir que o grupo Saccharomyces sensu stricto era distinto das espcies S. kluyveri e S. servazii. Duarte et al. (1999) obtiveram alguma heterogeneidade ao analisarem os perfis electroforticos de quatro complexos enzimticos (EST, LDH, G6PD e ACP) de 35 estirpes (S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus e S. paradoxus). Apesar de algum polimorfismo foi verificada a formao de grupos correspondentes s quatro espcies, os quais se apresentavam claramente separados, e verificou uma divergncia superior entre o agrupamento de S. paradoxus e S. cerevisiae, contrariamente a outros estudos neste grupo com metodologias genticas, como a sequenciao de rDNA. Assim confirmou-se a importncia da anlise de perfis electroforticos de isoenzimas na classificao, identificao, bem como na clarificao dos relacionamentos taxonmicos entre as leveduras, nomeadamente para o gnero Saccharomyces e o grupo Saccharomyces

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sensu stricto. Esta revelou tambm possuir uma correlao prxima com a reassociao DNADNA (Yamazaki et al., 1983, 1998; Poncet et al., 1992). Num estudo taxonmico em populaes do gnero Kluyveromyces (K. lactis, K. marxianus, K. thermotolerans, K. waltii), Sidenberg e Lachance (1986), aplicaram a anlise de perfis isoenzimticos para discriminar os diversos graus de variabilidade intraspecfica, e determinar os seus relacionamentos, com base em cinco sistemas isoenzimticos. Em geral, exceptuando algumas estirpes discrepantes, que se verificou serem identificaes incorrectas, os resultados conduziram formao de agrupamentos correspondentes s diferentes espcies em estudo. Smith et al. (1990) estudaram a variabilidade entre os gneros Dekkera, Brettanomyces e Eeniella. Para tal, analisaram os perfis isoenzimticos de cinco enzimas, de 39 estirpes das espcies Dekkera anomala, D. bruxellensis, D. abstinens, e dos seus estados anamorfos Brettanomyces anomalus, B. bruxellensis e B. intermedia, assim como B. claussenii, B. custersianus, B. custersii, B. intermedius, B. lambicus, B. naardenensis e Eeniella nana. A anlise numrica dos perfis isoenzimticos obtidos, conjuntamente com reassociaes de DNA, permitiu a reviso da delimitao das espcies e o estabelecimento das relaes entre estados anamorfo/ telemorfo e entre os 3 gneros. Muitos autores referem que o polimorfismo enzimtico induzido por mecanismos epigenticos, se trata de uma fonte de erro na anlise da variabilidade gentica com a anlise de perfis electroforticos de isoenzimas (Selander, 1986). Para evitar fontes de erro adicionais deve existir uma preocupao em estandardizar as condies de crescimento dos organismos em estudo (Towner e Cockayne, 1993). Santos et al. (1999), efectuaram o estudo da estabilidade dos perfis isoenzimticos, tendo para tal analisado os perfis electroforticos de cinco sistemas enzimticos, em estirpes de diferentes espcies: Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Pichia anomala, Schizosaccharomyces pombe e Rhodotorula mucilaginosa, foram tambm consideradas diferentes fases de crescimento celular (fase exponencial e estacionria), em meio sinttico rico e mosto de uva corrigido. Verificaram que as condies de crescimento influenciaram de modo diferente os perfis electroforticos de estirpes diferentes, tendo sido a estirpe de Schizosaccharomyces pombe a mais influenciada. A anlise da globalidade dos resultados revelou que os sistemas enzimticos tambm eram afectados de modo desigual (ADH, foi mais estvel e LDH mais influenciada), e que dentro das mesmas condies de crescimento os perfis mostraram-se reprodutveis. A anlise numrica dos resultados mostrou uma elevada semelhana entre os perfis obtidos para cada estirpe nas diferentes condies de 25

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crescimentos celular. Os autores frisam a necessidade de durante a anlise dos perfis de bandas obtidos, de se considerar somente as bandas principais (as quais esto constantemente presentes), e no considerar as bandas secundrias para a diferenciao das estirpes.

2.2.4.1.3 Vantagens da anlise isoenzimtica

Uma das vantagens da utilizao desta metodologia que a extenso da resoluo gentica fornecida, tem tido um grande paralelismo com identificaes efectuadas por mtodos de anlise de referncia, como a reassociao de DNA-DNA; conseguindo mesmo a distino de espcies com relacionamentos muito prximos em termos da sua filogenia. Por isso, mesmo nos nossos dias, com mtodos de anlise de cidos nucleicos que envolvam PCR e primers especficos de espcies de DNA, a anlise isoenzimtica continua a ser muito empregue na identificao (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Esta trata-se de uma metodologia com um poder de resoluo semelhante ao obtido por outras metodologias, mas a qual muito menos dispendiosa, pois envolve equipamentos de baixo custo, reagentes baratos quando comparados com os kits de reagentes e primers usados na reaco PCR, e fcil tecnicamente (Bonde et al., 1993; Ferreira e Grattapaglia, 1995; Yamazaki et al., 1998). Esta metodologia pode ainda ser automatizada na anlise electrofortica bem como por software de anlise dos perfis de bandas, e constituio de bases de dados, o que possibilita um incremento na rapidez de identificao

2.2.4.1.4 Desvantagens da anlise isoenzimtica

A anlise isoenzimtica trata-se de um mtodo fenotpico, o qual infere o genoma mediante o polimorfismo isoenzimtico, revelado pelas diferentes mobilidades electroforticas das bandas de actividade enzimtica, as quais formam perfis de bandas isoenzimticas designados por zimogramas. Como tal, esta metodologia estima a variabilidade gentica de apenas a fraco do DNA codificante da enzima, a qual trata-se de uma pequena parte, incorrendo assim uma subestima das divergncias genticas ocorrentes entre os organismos focados no estudo com esta metodologia. Uma das fontes de erro, relaciona-se com os mecanismos responsveis pela ocorrncia de isoenzimas aps a sua transcrio e traduo, designados por mecanismos epigenticos, que podem alterar as estruturas secundrias e 26

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tercirias, no correspondendo assim a alteraes de estrutura primria, a qual codificada pelo genoma. Outro cuidado especial que deve advir na utilizao desta tcnica, deve ser as condies de crescimento dos organismos em estudo, as quais devem ser optimizadas e bem controladas, pois afectam a actividade e quantidade das enzimas detectadas (Towner e Cockayne, 1993). Outra limitao apontada para esta metodologia quando comparada com tcnicas imunolgicas ou metodologias de anlise de cidos nucleicos baseadas em reaces de PCR, trata-se de necessitar uma grande quantidade de biomassa (Doebbeling et al., 1993; Bonde et al., 1993), bem como de um nmero elevado de solues que tm de ser preparadas diariamente (Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992).

2.2.4.1.5 Sistemas enzimticos em estudo

Aps o final da electroforese, para que as protenas possam ser visualizadas, necessrio recorrerem-se a procedimentos de colorao histoqumica especfica para detectar a presena das enzimas, e assim obter os perfis das bandas de actividade enzimtica. Atravs destes procedimentos, as enzimas catalisam reaces especficas que originam compostos corados que permitem a sua visualizao no gel. Quando os compostos da soluo de revelao de actividade enzimtica (substrato, coenzimas, ies, e outros) entram em contacto com as isoenzimas estas catalisam uma reaco que origina um produto corado que precipita no local em que se posiciona a isoenzima, impedindo assim a difuso da banda no gel (Pasteur et al., 1987). Para a revelao de enzimas como as fosfatases e a maioria das esterases so utilizados derivados de -naftilo; como resultado da actividade hidroltica liberta-se o -naftol, o qual combina-se com compostos diazo (Fast Garnet GBC, Fast Blue RR), e formando deste modo precipitados corados. A maioria das desidrogenases catalisa a transferncia de um tomo de hidrognio do seu substrato para uma coenzima (NAD+ ou NADP+), este tomo, conforme se pode visualizar no esquema presente na figura 2.1, pode ser transferido por uma reaco em cadeia, mediada pelo PMS, na qual o receptor final trata-se de um sal de tetrazlio, como o Nitro Blue Tetrazolium (NBT), o qual d assim origem a um precipitado de cor azul o formazano (Pasteur et al., 1987).

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Substrato
NAD+ ou NADP+ PMSH

Produto
NADH ou NADPH PMS

NBT NBTH= Formazano Figura 2.1 Reaco de colorao por procedimentos histoqumicos para a maioria das desidrogenases (adaptado Pasteur et al., 1987)

Os complexos isoenzimticos em estudo neste trabalho foram esterase (EST), lactato desidrogenase (LDH), lcool desidrogenase (ADH), fosfatase cida (ACP) e glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), e encontram-se abaixo indicados na tabela.2.1.
Tabela 2.1 Sistemas enzimticos em estudo (adaptado de Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992).

Abreviatura Nmero E.C.1) Classe Esterase EST E.C. 3.1.1.1 hidrolases Lactato desidrogenase LDH E.C. 1.1.1.27 oxidoreductases lcool desidrogenase ADH E.C. 1.1.1.1 oxidoreductases Fosfatase cida ACP E.C. 3.1.3.2 hidrolases Glucose-6-fosfato desidrogenase G6PD E.C. 1.1.1.49 oxidoreductases Enzimas
1) Nmero da Comisso Internacional de Enzimas

As esterases pertencem classe das hidrolases, e catalisam a hidrlise de steres carboxlicos levando formao de alcois e cidos gordos respectivos (Pasteur et al., 1987; Acquaah, 1992). A lactato desidrogenase pertence classe das oxidoredutases, subclasse das desidrogenases, e est envolvida na via glicoltica, catalisa a oxidao do lactato em piruvato, com reduo de NAD+ a NADH (Acquaah, 1992). A lcool desidrogenase pertence classe das oxidoreductases, subclasse das desidrogenases, e catalisa a oxidao de etanol a acetaldedo na presena de NAD+, o qual se reduz a NADH (Pasteur et al., 1987). Em Saccharomyces cerevisiae a ADH possui quatro isoenzimas, ADH I, II, III e IV (Lutsdorf e Megnet, 1968; Ciriacy, 1975; Paquin e Williamson, 1986; Walton et al., 1986; cit. in Bisson, 1993). ADH I, citoplasmtica e est envolvida na produo de etanol mediante a fermentao anaerbica da glucose. ADH II encontra-se igualmente no citoplasma, reprimida por elevadas concentraes de glucose e est envolvida 28

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no consumo do etanol, contudo acredita-se que em certas circunstncias, pode substituir a ADH I e desempenhar um papel fermentativo. ADH III trata-se de uma enzima mitocondrial, a qual igualmente reprimida pela glucose e possui actividade durante o crescimento em etanol (Gancedo e Serrano, 1989; Bisson, 1993). A sobreexpresso de ADH III no compensa as perdas de ADH I e II, para o crescimento fermentativo (Blumberg et al., 1987; cit. in Bisson, 1993). Mais recentemente foi descoberta uma nova lcool desidrogenase, ADH IV, a qual, quando sobreexprimida, confere resistncia antimicina A, suprimindo a perda de ADH I em condies fermentativas (Paquin e Williamson, 1986; Walton et al., 1986, cit. in Bisson, 1993). Segundo Gancedo e Serrano (1989) uma taxa deficitria de actividade da ADH promove uma sobreproduo de glicerol, os autores verificaram esse facto numa estirpe de Torulopsis magnoliae, a qual convertia 40% dos acares em glicerol. Llaguno et al. (1970) num estudo s leveduras formadoras de vu superfcie do vinho xerez, constataram que a actividade de ADH aumentava com o aumento da concentrao de etanol. As fosfatases cidas pertencem classe das hidrolases, englobam um grupo no especfico de fosfo-hidrolases que tm actividade a baixo pH (Jaaska, 1983; cit. in Acquaah, 1992), promovem a hidrlise de monosteres ortofosfricos, com a produo do lcool respectivo e do cido fosfrico (Pasteur, et al., 1987). A glucose-6-fosfato desidrogenase pertence classe das oxidoreductases, subclasse das desidrogenases. Trata-se da primeira enzima interveniente na etapa oxidativa do ciclo das pentoses-fosfato, e catalisa a oxidao de D-glucose-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona, com formao de NADPH (Gancedo e Serrano, 1989; Acquaah, 1992).

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3. MATERIAL E MTODOS
3.1 Estirpes de leveduras em estudo
As estirpes de leveduras utilizadas neste estudo so provenientes da Coleco Portuguesa de Culturas de Leveduras, Universidade Nova de Lisboa e do Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, Holanda. Foram estudadas 32 estirpes de leveduras pertencentes a 19 espcies de 12 gneros. Na tabela seguinte (tabela 3.1) apresentam-se as estirpes, a sua classificao original, o nmero de diversas coleces de culturas e a sua provenincia.

Tabela 3.1 Estirpes de leveduras em estudo no presente trabalho Espcie Candida cantarellii Torulopsis cantarellii T Torulopsis vinacea Candida stellata Saccharomyces stellatus T Saccharomyces bacillaris NT Candida vanderwaltii Torulopsis vanderwaltii T Pichia mexicana Candida veronae T Pichia fluxuum Mycoderma vini NT Saccharomyces mycoderma Kluyveromyces thermotolerans Zygosaccharomyces thermotolerans T Saccharomyces veronae Kluyveromyces thermotolerans Metschnikowia pulcherrima Designao das estirpes Epteto original N EVN N PYCC N CBS 365 T 1) 3661) 387 T 2) 3671) 368 T 1) 369 T 1) 370 NT 1) 3711) 372 T 1) 3731) 3741) 3073 T 3863 4878 T 5383 157 T 843 5524 T 5815 T 639 NT 633 6340 T 2917 Origem do isolamento Mosto de uva Mosto de uva Uvas Uvas Equipamento de adega Mosto de uva Vinho com azedia ----Conserva de ameixa var. mirabelle Drosophila Solo

3044 3671 T 3664 T 2597 NT 3339 4135 T 2908 4675

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Reviso Bibliogrfica Metschnikowia pulcherrima T Asporomyces uvae Candida pulcherrima Pichia carsonii Pichia carsonii T Debaryomyces vini T Pichia vini T Saccharomyces exiguus Saccharomyces exiguus NT Torula holmii Torulopsis holmii Tabela 3.1 (continuao) Designao das estirpes Origem do isolamento Epteto original N EVN N PYCC N CBS Wickerhamiella domercqiae Depsito de vinho Torulopsis domercqiae T 384 T 1) 3067 T 4351 T T 1) Torulopsis saccharum 385 3203 4733 gua de lavagem de cana de acar Lodderomyces elongisporus Saccharomyces elongisporus T 386 T 1) 4136 T 2605 T Sumo de laranja concentrado Debaryomyces hansenii var. fabryii Debaryomyces fabryii T 388 T 2) 789 T Micose interdigital Dekkera naardenensis 6042 T Limonada Dekkera naardenensis T 389 T 2) Hanseniaspora guilliermondii 3902) 2591 Filo-traqueia de abelha Kloeckera apis Hanseniaspora occidentalis 3912) 282 Solo Pseudosaccharomyces javanicus T Hanseniaspora osmophila 3922) 106 Casca de rvore Pseudosaccharomyces corticis T Hanseniaspora uvarum 314 T Uva muscatel Kloeckeraspora uvarum T 394 T 2) T 2) Pseudosaccharomyces apiculatus 393 104 ----Saccharomycodes ludwigii Saccharomycodes ludwigii T 395 T 2) 821 T ----Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe T 396 T 2) 356 T ----T estirpe tipo NT estirpe neotipo EVN, Coleco de Microrganismos da Estao Vitivincola Nacional, Dois Portos, Portugal. PYCC, Portuguese Yeast Culture Collection, Univ. Nova de Lisboa, Mte. Caparica, Portugal. CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, Holanda. 1) Proveniente da PYCC 2) Proveniente da CBS Espcie
NT

375 T 1) 3761) 3771) 378 T 1) 3791) 3801) 381 NT 1) 3821) 3831)

4830 T 2726 3018 2757 T 3799 3800 2543 NT 2544 3179

5833 T 2245

Uvas de Vitis labrusca Uvas Superfcie de uma alga (M. pyrifera) Seiva de Carvalho preto Sedimento de vinho engarrafado gua de azeitonas ----Manteiga Saliva humana

2285 T 810 5254 379 NT 135 2671

3.1.1 Manuteno das leveduras

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As estirpes de leveduras foram mantidas temperatura ambiente, em tubos com meio slido inclinado YEPD [extracto de levedura 0,5 % (p/v); peptona 1,0 % (p/v); glucose 2,0 % (p/v); adicionado de 2,0 % (p/v), de agar].

3.2 Anlise Isoenzimtica 3.2.1 Preparao do extracto proteco

A preparao do extracto proteco, est representada no esquema seguinte presente na figura 3.1, encontrando-se mais pormenorizadamente descrita nos pontos 3.2.1.1 e 3.2.1.2.

Cultura
(YEPD, 25C, 170 r.p.m.) Centrifugao
(4C; 7000g; 5') Lavagem (2 x) (Tris-HCl, pH=7; 4C)

Clulas
Congelao (-20C)

Rebentamento
(Tris-HCl, pH 6,8; 4C; Esferas de vidro 0,5 mm ; Bead-Beater 5/ 7 min.) Centrifugao (4C; 14000 g; 30')

Extracto proteco
(Sobrenadante) 32

Armazenamento
Congelao (-80C)

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Figura 3.1 Representao esquemtica da preparao do extracto proteico.

3.2.1.1 Cultura e recolha das clulas de leveduras em meio YEPD

As clulas de leveduras foram cultivadas em bales Erlenmeyer de 250 ml, com aproximadamente 100 ml de meio lquido YEPD, a uma temperatura de 25 C (estufa Aralab 4500 Fitoclima) e uma agitao orbital a 170 r.p.m. (Aralab B 300 E), at atingirem uma densidade ptica (D.O.) de 10, a um comprimento de onda de 640 nm. Atingida a D.O. pretendida, efectuava-se uma primeira centrifugao para recolher as clulas, em copos de 250 ml, durante 5 min. a 7000 g, a 4C (centrfuga Sorvall RC-5B). Seguiu-se a operao de lavagem das clulas, na qual eram adicionados 20 ml de soluo Tris-HCl (3,2 mM; pH 7,0), e nova centrifugao a 7000g, durante 5 min., a 4C. A operao de lavagem foi efectuada duas vezes, e o depsito de clulas dividido por dois eppendorfs aps o qual sofreu uma centrifugao final (7000 g; 5'), foi-lhes retirado o sobrenadante, e as clulas foram conservadas a 20 C at sua posterior utilizao (Duarte, 2000).

3.2.1.2 Obteno do extracto proteco

As amostras que se encontravam conservadas a 20 C, foram retiradas e colocadas no gelo para descongelao. Prosseguiu-se com a adio de esferas de vidro (1,2 g; 0,5 mm ), e de tampo de extraco (1 ml de Tris-HCl 0,06 M; pH 6,8). Mediante a utilizao de um homogeneizador celular (Mini Beadbeater- Biospel Products), promoveu-se a lise das clulas. O Mini Beadbeater foi programado para uma agitao de 30 segundos a 5000 r.p.m., espaados por 4 minutos, nos quais as amostras permaneceram no gelo, de forma a baixar a temperatura que se eleva durante a agitao. Repetiu-se este procedimento durante dois minutos, seguido de 33

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uma observao ao microscpio ptico. Aps ter sido determinado, por intermdio de uma visualizao ao microscpio ptico, que aproximadamente cerca de 70 % das clulas rebentaram, terminou-se este procedimento, assim como no caso em que findados os 7 minutos de agitao no homogeneizador celular, no foi atingida a percentagem designada. A suspenso anterior foi centrifugada (14 000 g, 10'), a 4 C, para se efectuar uma separao das clulas inteiras, e outros componentes no solveis. Foi transferido o lquido sobrenadante para novo tubo eppendorf, sofreu uma centrifugao final (14 000 g, 20'), a 4C, na qual foi obtido o extracto utilizado na anlise isoenzimtica. Dividiu-se o sobrenadante do extracto proteco em alquotas de 75 l, as quais foram conservadas a -80 C para posterior anlise isoenzimtica (Duarte, 2000).

3.2.2 Anlise electrofortica das isoenzimas 3.2.2.1 Sistema de electroforese

Para a anlise isoenzimtica foi utilizada a electroforese em suporte vertical (sistema Mighty Small II, SE250, da Hoefer/ Pharmacia), acoplado a um sistema de refrigerao (Hoefer RCB 300), com geis de poliacrilamida homogneos (8 7 cm; 0,75 cm de espessura) em condies PAGE nativa, no qual se efectuou uma separao das protenas em funo do seu tamanho e da sua carga, deste modo as molculas de protena apresentam diferentes mobilidades mediante a sua relao peso molecular/ carga elctrica, sendo deste modo diferenciadas. Segundo Hames (1990), os geis de poliacrilamida so adequados anlise de protenas, por possurem porosidades na mesma ordem de grandeza das molculas de protenas. Outra das vantagens na sua utilizao trata-se de ser um polmero sinttico, que pode ser preparado a partir de reagentes de elevada pureza qumica. Estes geis so inertes, possuem um elevado campo de actividade de temperaturas e pH. Utilizou-se um sistema descontnuo de tampes, descritos no Anexo I, e composto por gel de separao e gel de concentrao (ver figura 3.2).

- Depsito do tampo superior 34

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- Gel de concentrao

- Gel de separao

- Depsito do tampo inferior

Figura 3.2 Sistema descontnuo de uma dimenso (Hames, 1990)

3.2.2.2 Preparao do gel suporte de poliacrilamida

A preparao do suporte gel poliacrilamida iniciou-se com a preparao do gel de separao, sendo a ltima soluo a adicionar o TEMED, o qual segundo Hames (1990), catalisa a libertao de radicais livres do persulfato de amnio, os quais iniciam a reaco de polimerizao da acrilamida e bisacrilamida. O sistema era composto por um molde no qual se verteu o gel de separao, adicionouse gua ultrapura, de modo a cobrir todo o gel, para impedir deste modo o contacto do gel com o oxignio do ar, e permaneceu a polimerizar durante uma hora. Aps a reaco de polimerizao estar concluda, iniciou-se a preparao do gel concentrador, o qual foi vertido no molde, fixando-se em seguida o pente (para formao dos poos, nos quais foram introduzidas as amostras). Esperou-se a concluso da reaco de polimerizao (o tempo de polimerizao idntico ao do gel de separao) e retira-se o pente (com cuidado para no deformar os poos).
Tabela 3.2 Preparao do gel suporte de poliacrilamida, condies PAGE-nativa (Hames, 1990)

Soluo stock Acrilamida 30% (p/v)-bisacrilamida 0,8% (p/v) Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) Tris-HCl 3,0 M (pH 8,8) gua ultrapura TEMED Persulfato de amnio 1,5 % (p/v) 1
1

Gel concentrador 2,5 % 0,5 ml 1,0 ml --2,3 ml 6 l 0,2 ml

Gel separador 8,0 % 7,5 % 3,2 ml 3 ml ----1,5 ml 1,5 ml 6,7 ml 6,9 ml 8 l 8 l 0,6 ml 0,6 ml

A soluo, devido a ser muito instvel, tem que ser preparada imediatamente antes da sua utilizao. A concentrao de 8% do gel separador utiliza-se somente para a anlise da esterase e usada a concentrao de 7,5 % para os restantes sistemas enzimticos. A gua ultrapura adicionada, assim como todas as restantes solues adicionadas, tm que estar temperatura de 4 C.

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3.2.2.3 Preparao das amostras para electroforese

As amostras dos extractos protecos foram retiradas da arca congeladora, a 80C, e colocadas no gelo com alguma antecedncia. A cada tubo eppendorf (75 l de extracto proteco), foram adicionados 15 l de uma soluo tampo de aplicao [Glicerol 50 % (v/v); azul de bromofenol 0,05 % (p/v)], a qual foi misturada por agitao num agitador tipo vortex. A introduo das amostras dos extractos protecos obedeceu disposio apresentada na figura 3.3, tendo cada gel capacidade para 15 amostras, sendo 12 amostras extractos protecos das estirpes em estudo e 3 amostras de extractos protecos da estirpe utilizada como padro.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Figura 3.3 Representao da distribuio das amostras pelos poos do gel de poliacrilamida Poos 1-2; 4-7; 9-12;14-15: Amostras extracto proteco, das estirpes em estudo Poos 3; 8; 13: Amostras extracto proteco, da estirpe padro (PYCC 4072)

Inicialmente efectuou-se a adio da soluo tampo de electroforese do elctrodo superior (Tris-Glicina-citrato, pH 8,2; excepto para as fosfatases cidas em que a soluo tampo utilizada foi Tris-Glicina-HCl, pH 8,2). De seguida foram aplicados 7,5 l de extracto proteco com tampo de aplicao (5 l para G6PD) em cada poo do gel (seringa de 25 l, Gastigh 1072, Hamilton). E por ltimo adicionou-se a soluo tampo do elctrodo inferior (Tris-Glicina-HCl, pH 8,3).

3.2.2.4 Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE-nativa)

Ligou-se o banho termostatizado cerca de 30 min. antes de se dar incio electroforese para estabilizao da temperatura e de modo a que a electroforese decorresse temperatura controlada de 4 C. Seguidamente iniciou-se a electroforese a 100 V (fonte de alimentao EPS

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301 Amersham, Pharmacia Biotech) durante os primeiros 25 minutos, seguido de 125 V durante 5 min., e de 150 V at final da electroforese.

3.2.2.5 Obteno de perfis isoenzimticos

Aps a separao electrofortica foi detectada a actividade enzimtica dos cinco sistemas em estudo: esterases, fosfatases cidas, lactato desidrogenases, glucose-6-fosfato desidrogenases e lcool desidrogenases, atravs da utilizao da metodologia experimental optimizada por Duarte (2000). No final da separao electrofortica retiraram-se os gis de poliacrilamida e efectuou-se um corte em cada um dos geis no canto inferior direito, de modo a possibilitar a localizao das amostras. Seguidamente efectuou-se uma incubao ao abrigo da luz, dos geis com a soluo de revelao numa estufa regulada a 37 C, at ao surgimento de bandas indicadoras de actividade enzimtica. Terminaram-se as reaces por meio de uma lavagem com gua destilada e por submerso na soluo de fixao [metanol 30 % (p/v), cido actico 10 % (p/v)] durante 15 minutos, tendo igualmente a soluo de fixao a funo de impedir a difuso das bandas de actividade enzimtica no gel. Os geis foram armazenados em gua ultrapura temperatura de 4C.

Soluo de revelao de actividade enzimtica

Figura 3.4 Revelao das bandas de actividade enzimtica no gel de poliacrilamida, aps separao electrofortica.

3.2.2.5.1 Esterase (EST- EC 3.1.1.1)

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O substrato utilizado para a deteco de actividade enzimtica foi o acetato de -naftilo, o qual por aco das esterases hidrolisado e origina os compostos acetato e -naftol. Este ltimo leva formao de derivados corados ao combinar-se com os sais de diaznio (Fast Blue RR), como pode ser visualizado na equao de reaco descrita abaixo (Pasteur et al., 1987). Acetato de -naftilo -naftol + Fast Blue RR
EST

-naftol + acetato Precipitado corado (Pasteur et al., 1987)

Na preparao da soluo de deteco de actividade enzimtica foi adicionado Fast blue RR (6 mg/l) soluo tampo fosfato (NaH2PO4.H2O 48mM; Na2HPO4.2H2O 52 mM), e foi agitado durante cinco minutos (ao abrigo da luz). Depois foi adicionado acetato de -naftilo (8 mg/l) dissolvido previamente em acetona (25 ml/g acetato de -naftilo), e novamente agitado por mais cinco minutos (ao abrigo da luz). A preparao da soluo de revelao encontrava-se concluda imediatamente antes do final da separao electrofortica, sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida e submetidos ao procedimento experimental indicado anteriormente em 3.2.2.5.

3.2.2.5.2 Fosfatase cida (ACP- EC 3.1.3.2)

O substrato utilizado para a deteco de actividade enzimtica foi o fosfato de -naftilo, o qual por aco das fosfatases hidrolisado e origina os compostos fosfato e -naftol. Este ltimo leva formao de derivados corados ao combinar-se com os sais de diaznio (Fast Garnet GBC). Os princpios de reaco aplicados na revelao das fosfatases cidas so idnticos aos aplicados na revelao das esterases, e podem ser visualizados na equao de reaco descrita abaixo (Pasteur et al., 1987). Fosfato de -naftilo -naftol + Fast Garnet GBC
ACP

-naftol + fosfato Precipitado castanho (Pasteur et al., 1987)

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Na preparao da soluo de deteco de actividade enzimtica foi adicionado fosfato cido de -naftilo [0,1 % (p/v)], Fast Garnet GBC [0,1 % (p/v)] e MgCl2 [0,1 % (p/v)] soluo tampo de acetato [cido actico 0,2 M; acetato de sdio 0,2 M; acerto de pH a 4,5 com soluo HCl 30 % (v/v)], e foi agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A preparao da soluo de revelao encontrava-se concluda imediatamente antes do final da separao electrofortica, sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida, lavados com a soluo tampo de acetato, acima referida, e submetidos ao procedimento experimental indicado em 3.2.2.5.

3.2.2.5.3 Lactato desidrogenase (LDH- EC 1.1.1.27)

O substrato utilizado para a deteco de actividade enzimtica foi o lactato, o qual, como resultado da actividade da lactato desidrogenase sofreu as seguintes transformaes (Pasteur et al., 1987): Lactato + NAD+ NADH + NBT + PMS
LDH

Piruvato + NADH Formazano (precipitado azul) (Pasteur et al., 1987)

Na preparao da soluo de deteco de actividade enzimtica foi preparada em primeiro lugar a soluo de substrato (cido lctico 9,0 % (p/v); Na2CO3 0,56 M; e acerto a pH 7 com soluo Na2CO3 2M). Adicionou-se 10% (v/v) da soluo substrato soluo tampo Tris-HCl (tris 83 mM, e acerto a pH 7,1 com HCl). A esta mistura foi adicionado NAD+ 0,05 % (p/v), NBT (0,03 % (p/v) e PMS 0,002 % (p/v), e foi agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A preparao da soluo de revelao encontrava-se concluda imediatamente antes do final da separao electrofortica, sendo que os geis de poliacrilamida eram retirados e submetidos ao procedimento experimental indicado anteriormente em 3.2.2.5.

3.2.2.5.4 Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD- EC 1.1.1.49)

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O substrato utilizado para a deteco de actividade enzimtica foi a D-glucose-6-fosfato, a qual, como resultado da actividade da glucose-6-fosfato desidrogenase sofreu as seguintes transformaes (Pasteur et al., 1987): D-Glucose-6-fosfato + NADP+ NADPH + NBT + PMS
G6PD

6-fosfogluconolactona + NADPH Formazano (precipitado azul) (Pasteur et al., 1987)

Na preparao da soluo de deteco de actividade enzimtica foi adicionado glucose6-fosfato 0,2 % (p/v), MgCl2 0,08% (p/v), NADP+ 0,04 % (p/v), NBT 0,02 % (p/v), PMS 0,002 % (p/v), soluo tampo Tris-HCl (tris 0,2 M; e acerto a pH 8 com HCl), e foi agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A preparao da soluo de revelao encontrava-se concluda imediatamente antes do final da separao electrofortica, sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida e submetidos ao procedimento experimental indicado em 3.2.2.5.

3.2.2.5.5 lcool desidrogenase (ADH-EC 1.1.1.1)

O substrato utilizado para a deteco de actividade enzimtica tratou-se do etanol, o qual, como resultado da actividade da lcool desidrogenase sofreu as seguintes transformaes (Pasteur et al., 1987): Etanol + NAD+ NADH + NBT + PMS
ADH

Acetaldedo + NADH Formazano (precipitado azul) (Pasteur et al., 1987)

Na preparao da soluo de deteco de actividade enzimtica foi adicionado etanol 7,0 % (v/v), MgCl2 0,046 % (p/v), NAD+ 0,046 % (p/v), NBT 0,023 % (p/v), PMS 0,0023 % (p/v), soluo tampo Tris-HCl (tris 0,2 M; e acerto a pH 8 com HCl), e foi agitado durante dez minutos (ao abrigo da luz). A preparao da soluo de revelao encontrava-se concluda imediatamente antes do final da separao electrofortica, sendo que eram retirados os geis de poliacrilamida e submetidos ao procedimento experimental indicado em 3.2.2.5.

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3.2.2.6 Digitalizao dos geis obtidos

Decorridos os quinze minutos em que o gel entra em contacto com a soluo de fixao, este foi lavado em gua destilada e fotografado por meio de uma cmara digital (modelo Kodak 290C), recorrendo ao sistema de software (Kodak 1D - Image Analysis Limited Edition, verso 3.5). A fotografia dos geis obtidos na separao electrofortica das isoenzimas, foi analisada por intermdio do software GelCompar II verso 2.0, tendo sido elaborada uma base de dados em que a cada estirpe foi associado um perfil de cada um dos sistemas enzimticos.

3.2.2.7 Determinao do valor de mobilidade electrofortica relativa (Rm)

Aps a fotografia do gel, procedeu-se igualmente medio das distncias de migrao das bandas de actividade enzimtica (mobilidade absoluta), e da distncia de migrao do corante de referncia (azul de bromofenol). A relao destes dois parmetros permitiu a determinao das mobilidades electroforticas relativas de acordo com a seguinte equao: Rm= Distncia de migrao da protena Distncia de migrao do corante referncia A cada valor de Rm calculado, foi efectuada uma correco proporcional correco efectuada aos valores de migrao obtidos para a estirpe de Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072, presente no mesmo gel, e utilizada como padro de modo a corrigir eventuais deformaes ou outras alteraes do gel. Os valores estipulados por Santos et al. (1999), Duarte et al. (1999) e Duarte (2000) para a estirpe PYCC 4072 eram: Rm (EST) = 0.70; Rm (LDH) = 0.38 e Rm (LDH) = 0.54; Rm (ADH) =0.44; Rm (ACP) = 0.54; Rm (G6PD) = 0.52. 41

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3.2.2.8 Secagem dos geis obtidos

Os geis foram colocados entre duas folhas de papel celofane previamente humedecidas em gua destilada, e colocados no secador de gel (modelo 583 BioRad). O mtodo de secagem do gel tratou-se de um sistema combinado de vcuo (bomba de vcuo e presso Millipore), ligado ao secador de gel, e temperatura em que os nveis de vcuo variavam entre 600 e 640 mm de Hg, temperatura de 80 C durante 80 minutos (condies para a secagem de seis gis).

3.2.2.9 Anlise numrica dos resultados

Os resultados foram analisados por mtodos de anlise numrica, recorrendo ao software NTSYS-pc verso 2.1. (Applied Biostatistics Inc.). As matrizes originais foram construdas com base na presena (1), ou ausncia (0) de banda de actividade enzimtica com determinado valor de Rm para cada uma das estirpes em estudo. Foram calculadas as afinidades entre as diferentes estirpes em estudo, mediante a utilizao de um coeficiente de associao, mais especificamente o coeficiente de Dice: SD= 2A / (2A+B+C), A define o n de bandas comuns entre duas estirpes, B o n de bandas presentes numa estirpe x e ausentes noutra y e C refere-se ao n de bandas presente em y e ausentes em x, dando assim origem matriz de semelhanas (Sneath e Sokal, 1973). A aplicao do mtodo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages) matriz de semelhanas permitiu a representao dos resultados obtidos, sob a forma de um dendrograma, isto , sob a forma de uma estrutura ramificada, onde os vrios nveis a que se unem os diferentes ramos esto relacionados com os valores das medidas de semelhana em que se baseou o mtodo de agregao utilizado. Para ajuizar o grau de distoro introduzido pelo mtodo de agrupamento das estirpes (UPGMA), foi calculado o coeficiente de correlao cofentica (r) entre a matriz de valores cofenticos (implcita no dendrograma) e a matriz de

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semelhana. O coeficiente de correlao cofentica exprime o grau de concordncia entre as duas matrizes.

3.2.2.10 Anlise da reprodutibilidade do mtodo

No sentido de se garantir a reprodutibilidade dos resultados, foram inclusas nas corridas de electroforese, para todos os complexos enzimticos, repeties de cerca de 10% das estirpes em estudo, as quais deram entrada de uma forma independente (Tenreiro, 2001). Estes duplicados foram provenientes de culturas de algumas estirpes, e subsequentes rebentamentos das clulas e extraco da protena. Os seus resultados foram analisados e deram entrada na matriz de semelhanas como trs estirpes independentes. As trs estirpes repetidas foram designadas como: EVN 378a, 379a e 381a, duplicados das estirpes EVN 378, 379 e 381.

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3.3 Sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S

A regio D1/D2 possui cerca de 600 pares de bases nucleotdicas (pb), a qual tem sido muito utilizada na identificao de espcies de leveduras (Kurtzman e Robnett, 1998). Para a sequenciao de rDNA (regio D1/D2), foi efectuada uma extraco do DNA, foi efectuada uma primeira reaco de amplificao do DNA por PCR na qual foram usados os primers externos ITS5 e LR6, seguida de uma reaco de sequenciao, na qual foram utilizados os primers internos (NL1 e NL4) que delimitam a regio D1/D2.

ITS5 5S NTS2 ETS 17 18 S

ITS1

NL1 NL4 LR6 5.8S ITS2 25 28 S D1 / D2

NTS1

5S

Figura 3.5 Esquema dos genes do rRNA com indicao da localizao dos primers utilizados e da regio sequenciada.

3.3.1 Estirpes de leveduras analisadas

As anlises ao DNA incidiram sobre 4 estirpes de leveduras pertencentes aos gneros Candida (espcies Candida cantarellii, EVN 366; Candida stellata, EVN 367), Kluyveromyces (espcie Kluyveromyces thermotolerans, EVN 373) e Wickerhamiella (espcie Wickerhamiella domercqiae, EVN 385).

3.3.2 Condies de cultura

As estirpes de levedura foram inoculadas em placas de meio YEPD-agar, e incubadas numa estufa a 28 C durante 3 a 4 dias.

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3.3.3 Extraco do DNA

Foram retiradas 3 hansadas fortes de cultura fresca de cada uma das estirpes, e ressuspendidas em 500 l de tampo de lise celular [50 mM Tris, 250 mM NaCl, 50mM EDTA, e 0,3 % (p/v) de SDS, pH = 8,0]. Foi adicionado o equivalente ao volume de 200 l de esferas de vidro (0,5 mm ), e efectuou-se uma agitao atravs de um agitador em vrtice, por um perodo de 2 minutos velocidade mxima. Os tubos foram selados com parafilme e incubados em banho-maria a uma temperatura de 65 C, durante uma hora, seguindo-se de nova agitao em vrtice durante 2 minutos, velocidade mxima. De seguida efectuou-se uma centrifugao a 14000 r.p.m. (18188 g), durante 10 min. a 4 C (centrifuga Biofuge stratos, Heraeus), recolheu-se o sobrenadante para outro eppendorf e foram adicionados 600 l de soluo clorofrmio/lcool isoamlico [proporo 2:1 (v/v)], homogeneizou-se por inverso, e centrifugou-se a 14000 r.p.m. (18188 g), 10 min. temperatura ambiente. No sobrenadante efectuou-se a precipitao do DNA com a adio de 1/10 do volume de acetato de sdio 3M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto frio (-20C), misturados por inverso, centrifugou-se a 14000 r.p.m. (18188 g), durante 10 min. temperatura ambiente. Por ltimo retirou-se o sobrenadante e efectuou-se a lavagem do DNA, com a adio de cerca de 500 l de soluo de etanol 70 % (v/v) a -20C, a qual foi cuidadosamente retirada, e o pellet foi seco em estufa (37C, 2 h 30 min.), e resuspendido em TE (100 mM Tris-HCl, pH = 8; 100 mM EDTA), e conservado a 4C. Foi separada uma alquota de 5 l do DNA extrado para observao, atravs do sistema de electroforese horizontal de modo contnuo e tampo nico, em gel de agarose. Observao do DNA extrado por electroforese em gel de agarose Efectuou-se uma preparao do gel de agarose 0,8 % (p/v) em TBE 0,5x (descrito no Anexo II), com as dimenses 6 x 7 cm e 7 mm de espessura, a qual se levou a uma cozedura num microondas, at obteno de uma soluo lmpida. Verteu-se o preparado num molde, fixou-se o pente para formao dos poos, e deixou-se a gelificar durante uma hora. De seguida 45

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o gel foi introduzido no sistema de electroforese (SHU6, Sigma-Aldorich), e foi vertido o tampo TBE 0,5x. s alquotas de 5l de extracto foram adicionados 2 l de tampo de aplicao (6X Loading Dye Solution, Fermentas), mediante a utilizao de uma micropipeta foi homogeneizado pipetando por up & down, e seguidamente as amostras foram introduzidas nos poos do gel, e por fim foram introduzidos no primeiro poo, 5 l de marcador de pesos moleculares (DNA Ladder Mix, Fermentas). Iniciou-se de seguida a electroforese para este sistema, a 90 V (fonte de alimentao EPS 301 Amersham, Pharmacia Biotech) durante duas horas. Findo o tempo de electroforese, mergulhou-se o gel numa soluo de brometo de etdio 5 (p/v) durante 2 min., e descorou-se em seguida, mergulhando o gel em gua destilada durante 35 min. Seguidamente o gel foi colocado num transiluminador (Vilber Lourmat) e as bandas foram visualizadas por meio de luz ultavioleta (= 312 nm). Fotografou-se o gel por meio de uma cmara digital (modelo Kodak 290C) numa cmara escura, e recorreu-se ao sistema de software (Kodak 1D - Image Analysis Limited Edition, verso 3.5) para tratamento da imagem digitalizada do gel. A anlise da fotografia digital obtida do gel foi efectuada com base em dois parmetros, a intensidade bandas e a sua espessura. Estas foram comparadas com as bandas do marcador de pesos molecular (DNA Ladder Mix, Fermentas), e assim foram determinadas as diluies das amostras, para efectuar a reaco de amplificao por reaco PCR, com os primers externos ITS5 e LR6.

3.3.4. Amplificao de DNA (PCR)

Amplificou-se a regio D1/D2 da subunidade grande do rDNA, por PCR, com os primers externos ITS5 (5- GGA AGT AA AGT CGT AAC AAG G) e LR6 (5-CGC CAG TTC TGC TTA CC). A mistura de reaco foi estabelecida para um volume final de 50 l, com os seguintes componentes:

Tampo de PCR MgCl2 Primers DNA molde dNTPs

1x 2,5 mM 0,75 pmol. l-1 0,4-0,8 pg. l-1 0,25 mM 46

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Taq DNA Polimerase

0,04 U. l-1

A reaco de PCR foi efectuada num termociclador (T Gradient 96, WhatmanBiometra), a qual consistiu numa desnaturao inicial a 94C durante 3 min., e 36 ciclos de PCR de: Desnaturao 1 min., 94C; Emparelhamento 1 min., 58C; Extenso 1.5 min., 72C.

Aos 36 ciclos de PCR seguiu-se uma extenso final, que decorreu a 72C durante 5 min. Para confirmar a amplificao efectuou-se a sua observao mediante electroforese em gel de agarose 0,8 % (p/v) em TBE 0,5x. Para tal foi separada do produto PCR uma alquota de 3 l qual foram adicionados 2 l de tampo de aplicao (6X Loading Dye Solution, Fermentas), assim como foram introduzidos no primeiro poo 3 l de marcador de pesos moleculares (DNA Ladder Mix, Fermentas), deu-se incio electroforese a 90 V durante 50 minutos, na qual foram seguidos os procedimentos descritos em 3.3.3. Aps essa confirmao efectuou-se uma purificao do produto da reaco PCR, para ser submetido sequenciao, mediante a utilizao de um kit de purificao Jetquick PCR (Genomed), para o qual foram seguidos os procedimentos do fabricante. Aps a purificao do produto PCR foi efectuada uma outra corrida electrofortica aplicando os procedimentos atrs descritos. A partir da anlise do gel deste modo assim obtido, efectuou-se uma determinao aproximada da quantidade de amostra a utilizar na reaco de sequenciao.

3.3.5. Sequenciao de rDNA (D1/D2)

A sequenciao de DNA seguiu o mtodo de Sanger ou Terminao dideoxi, em que mediante a elevao de temperatura se promove a separao das cadeias homlogas de rDNA, s quais se acopla o primer (NL1 ou NL4) e d-se incio actividade da DNA polimerase. Esta efectua a sntese a partir dos referidos primers, por insero das quatro bases (dNTPs- A, G, T, C), assim como de bases homlogas marcadas por fluorforos especficos (ddNTPs- A, G, T, C), as quais actuam como terminais de transcrio. Originam-se deste modo diversos fragmentos nucleotdicos com tamanhos consecutivos e so, por meio de um sequenciador 47

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automtico, separados por electroforese capilar e detectada a sua fluorescncia (Towner e Cockayne, 1993). Sequenciaram-se duas cadeias complementares da regio D1/D2 mediante novas reaces PCR do anterior produto PCR purificado, respectivamente com os primers internos NL1 (5- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) e NL4 (5- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G). Em primeiro lugar procedeu-se diluio da amostra de DNA (3 l de produto PCR purificado, para cada estirpe) com gua ultrapura esterilizada at perfazer 10 l, seguindose a sua desnaturao a 95C, durante 8 min. no termociclador (T Gradient 96, WhatmanBiometra). Colocaram-se as amostras em gelo e adicionou-se 2 l do primer NL1 (25 pmol.l-1) ou do primer NL4 (25 pmol.l-1), e a adio de 8 l do kit de amplificao CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman Coulter), seguidamente efectuou-se uma centrifugao instantnea a 13000 r.p.m. (15682 g) para misturar os componentes de reaco de amplificao, e foi programado o termociclador (T Gradient 96, Whatman-Biometra) para efectuar 36 ciclos de PCR de: Desnaturao 20 seg., 96C; Emparelhamento 20 seg., 50C; Extenso 4 min., 60C. A cada eppendorf foram adicionados 5 l de soluo STOP (1 volume glicognio; 2 volumes 3M NaOAc pH =5,2; 2 volumes 100mM EDTA) e efectuou-se uma agitao num agitador tipo vortex. Foram adicionados 60 l de etanol a 95% (v/v) frio (-20C), os quais foram misturados pipetando up & down. Seguidamente efectuou-se a transferncia para eppendorfs de 1,5 ml de capacidade, incubou-se a -20C durante 10 minutos, e centrifugou-se a 13000 r.p.m. (15682 g), a 4C durante 30 minutos, e foi retirado o sobrenadante. Lavou-se com uma soluo de etanol a 70 % (v/v) que se encontrava a -20C e centrifugou-se a 13000 r.p.m. (15682 g), a 4C durante 10 minutos. Removeu-se cuidadosamente o sobrenadante por meio de uma micropipeta, e repetiu-se a operao de lavagem. Deixou-se o eppendorf secar temperatura ambiente durante 40 minutos, e findo o tempo de secagem resuspendeu-se em 30 l de formamida, seguiu-se a transferncia para uma placa com capacidade para 96 amostras, e efectuou-se uma centrifugao instantnea a 3000 r.p.m. (1369 g). A cada poo preenchido pelas amostras foi adicionada uma gota de leo mineral. Encheu-se outra placa com 96 poos 48

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(placa de lavagem) com tampo de separao (Beckman Coulter), nos locais correspondentes s amostras. Colocaram-se ambas as placas no sequenciador automtico CEQ 8000 (Beckman Coulter), e procedeu-se separao dos fragmentos obtidos por electroforese capilar. As sequncias directas e inversas obtidas foram alinhadas atravs da utilizao do software CEQuence Investigator (Beckman Coulter), e obtida a sequncia consenso aps correco de eventuais erros.

3.3.6. Comparao dos nucletidos sequenciados

A sequncia consenso da regio D1/D2 foi inserida num site fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), o qual efectua uma busca de sequncias nucleotdicas semelhantes numa srie de bases de dados. Assim, cada sequncia nucleotdica foi introduzida na janela do Portal de busca (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), e utilizou-se uma ferramenta de busca de locais de alinhamentos (BLAST- Basic Local Alignment Search Tool), a qual forneceu as sequncias nucleotdicas mais semelhantes, provenientes das bases de dados de sequncias nucleotdicas Gen Bank (NCBI, Estados Unidos da Amrica), EMBL (European Molecular Biology Laboratory- European Bioinformatics Institute, Reino Unido), DDBJ (DNA Data Bank of Japan- National Institute of Genetics, Japo) e PDB (Protein Data Bank- NCBI, Estados Unidos da Amrica), com as sequncias obtidas no presente trabalho.

49

Resultados e Discusso

4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Perfis isoenzimticos Os perfis electroforticos de EST, ACP, LDH, G6PD e ADH obtidos foram muito heterogneos sendo distintos para cada uma das estirpes em estudo. Obtiveram-se assim 32 perfis electroforticos para as 32 estirpes estudadas. Na Figura 4.1 apresentam-se as imagens digitalizadas dos perfis electroforticos originados pelos cinco complexos isoenzimticos estudados, armazenados na base de dados elaborada com o software Gelcompar II.

EST

LDH

ADH

ACP

G6PD
384T 392 385 395T 365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T 368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366

Figura 4.1 Imagens digitalizadas de perfis electroforticos dos cinco complexos enzimticos nas 32 estirpes analisadas.

Resultados e Discusso

Determinaram-se os valores das mobilidades electroforticas relativas (Rm), das bandas obtidas para cada um dos sistemas enzimticos estudados de acordo com o descrito em 3.2.2.7. As estirpes da espcie Candida cantarellii (EVN 365 e 366) apresentaram perfis idnticos, com uma s banda de actividade enzimtica para LDH e ACP e revelaram diferentes perfis para EST, ADH e G6PD. A estirpe EVN 365 apresentou duas bandas nos sistemas enzimticos EST e G6PD e uma banda para ADH, enquanto que a estirpe EVN 366 no revelou actividade enzimtica para ADH e apresentou uma banda para G6PD, revelando um perfil de EST idntico ao da estirpe EVN 374, igualmente com uma banda. As duas estirpes de Candida stellata (EVN 367 e 387) apresentaram uma total dissemelhana nos perfis de bandas para todos os sistemas enzimticos. Assim a estirpe EVN 367 apresentou duas bandas para LDH e G6PD, e uma banda para EST, ADH e ACP, enquanto que EVN 387 apresentou uma s banda de actividade enzimtica para todos os sistemas estudados. A estirpe de Candida vanderwaltii, EVN 368, revelou um perfil de EST idntico ao das estirpes EVN 373 e 387, com uma banda de actividade enzimtica, mas apresentou perfis de bandas nicos, para os restantes sistemas enzimticos, designadamente com trs bandas para LDH, e com uma banda para G6PD, e com duas bandas para ADH e para ACP. A estirpe de Pichia mexicana, EVN 369, apresentou um perfil com uma banda de actividade enzimtica para ADH, idntico ao da estirpe EVN 376 e apresentou perfis caractersticos com uma banda para EST e G6PD, e com duas bandas para ACP e no revelou possuir actividade enzimtica para LDH. As estirpes da espcie Pichia fluxuum, EVN 370 e 371, apresentaram um perfil idntico para ACP, e perfis diferentes para ADH, respectivamente com duas bandas e uma banda de actividade enzimtica. Para os restantes complexos enzimticos, as estirpes revelaram possuir algumas bandas em comum. As estirpes da espcie Kluyveromyces thermotolerans (EVN 372, 373 e 374) no apresentaram actividade enzimtica para ADH e ACP. As estirpes EVN 372 e 374, no revelaram possuir actividade enzimtica para LDH, enquanto que a estirpe EVN 373 apresentou um perfil de uma banda. Para G6PD as estirpes EVN 372 e 374 apresentaram um perfil idntico com uma banda, e a estirpe EVN 373, revelou um perfil idntico aos das estirpes 379 e 390, tambm com uma banda. O complexo enzimtico EST, revelou no ser adequado para identificao desta espcie, uma vez que as trs estirpes estudadas apresentaram perfis diferentes, cada uma com uma banda.

Resultados e Discusso

As estirpes EVN 375, 376 e 377 da espcie Metschnikowia pulcherrima, apresentaram um nico perfil para G6PD, com duas bandas. Para os restantes complexos estudados no houve uma to boa concordncia, sendo que para EST e LDH, foram detectados perfis diferentes para as trs estirpes, mas com bandas em comum. Para os complexos ADH e ACP estas estirpes apresentaram respectivamente uma e duas bandas de actividade enzimtica, verificando-se que em ambos os casos a estirpe EVN 376 revelou um perfil diferente do perfil das estirpes EVN 375 e 377. As estirpes EVN 378, 379 e 380 da espcie Pichia carsonii, revelaram perfis idnticos em ACP, com 2 bandas de actividade enzimtica, em EST e em LDH, com uma banda em cada. Para o ltimo sistema enzimtico, algumas das estirpes em estudo (EVN 384, 391, 393 e 394) revelaram um perfil idntico, razo pela qual no pode ser utilizado para distino da espcie. Para ADH, a estirpe tipo (EVN 378) no revelou actividade enzimtica, e as restantes duas, um perfil com uma banda em comum. Para G6PD, as estirpes EVN 378 e 380 apresentaram um perfil idntico de uma banda, e a estirpe EVN 379 apresentou um perfil de uma banda semelhante aos perfis das estirpes EVN 373 e 390. Para as estirpes da espcie Saccharomyces exiguus (EVN 381, 382 e 383), foi detectado um perfil caracterstico, no sistema enzimtico LDH, com uma banda, e ainda um nico perfil com uma banda para ADH, contudo tambm idntico ao da estirpe de Hanseniaspora occidentalis (EVN 392). As estirpes EVN 382 e 383 apresentaram um perfil idntico de uma s banda para EST, com uma banda tambm presente no perfil da estirpe tipo, EVN 381, de trs bandas. As estirpes EVN 381 e 383 revelaram um perfil idntico de uma banda para ACP, o qual diferiu do perfil da estirpe 382 tambm com uma s banda. Para G6PD as estirpes EVN 382 e 383, apresentaram um perfil idntico com 5 bandas, com uma s banda em comum com o perfil da estirpe tipo, de 3 bandas. As estirpes de Wickerhamiella domercqiae, EVN 384 e 385, no apresentaram um nico perfil de bandas idntico, nos cinco complexos enzimticos estudados. Para ADH a estirpe EVN 385 no apresentou actividade enzimtica, e a estirpe EVN 384 apresentou duas bandas, para G6PD e LDH, ambas as estirpes revelaram um perfil com uma banda. Para ACP a estirpe tipo (EVN 384) apresentou duas bandas e a EVN 385 uma, sucedendo o inverso para EST. A estirpe EVN 386 da espcie Lodderomyces elongisporus, apresentou um perfil de bandas que permite a sua diferenciao para os complexos enzimticos estudados, nomeadamente EST com duas bandas, LDH com uma banda e ADH com duas bandas. Tal no vlido para ACP devido a apresentar um perfil idntico ao da estirpe EVN 368, com uma banda.

Resultados e Discusso

A estirpe EVN 388 de Dekkera naardenensis, apresentou perfis caractersticos para cada um dos sistemas enzimticos estudados, assim revelou uma banda para EST, LDH e ACP, e duas bandas para ADH e G6PD. Foram estudadas cinco estirpes pertencentes ao gnero Hanseniaspora, nomeadamente das espcies H. guilliermondii (EVN 390), H. occidentalis (EVN 391), H. osmophila (EVN 392) e H. uvarum (EVN 393 e 394). A estirpe de H. uvarum apresentou um perfil caracterstico, com duas bandas de actividade para G6PD, enquanto que as estirpes EVN 390 e 391 revelaram um diferente perfil, com respectivamente, uma e duas bandas de actividade enzimtica, sendo que a estirpe EVN 392 revelou possuir uma banda em comum com o perfil desta ltima. A estirpe EVN 393 revelou possuir uma banda em comum com o perfil de duas bandas da estirpe tipo (EVN 394) para EST, e as estirpes EVN 390, 391 e 392 revelaram perfis dissemelhantes para o mesmo complexo enzimtico, com respectivamente uma, trs e duas bandas de actividade. Para as estirpes das espcies H. occidentalis e H. uvarum observou-se um perfil idntico de uma banda para LDH, enquanto que para este complexo enzimtico as estirpes EVN 390 e 392 apresentaram diferentes perfis, com respectivamente duas e trs bandas. A estirpe da espcie H. occidentalis revelou um perfil caracterstico de 4 bandas para ADH, e para o mesmo sistema enzimtico, a estirpe de H. guilliermondii, apresentou um perfil caracterstico com uma banda. Quanto s estirpes de H. uvarum, estas apresentaram perfis diferentes mas com uma banda de actividade enzimtica em comum. Para o complexo ACP, excepo de H. uvarum, todas as estirpes das restantes espcies pertencentes ao mesmo gnero revelaram no possuir actividade enzimtica. As duas estirpes EVN 393 e 394 apresentaram perfis diferentes com respectivamente uma e duas bandas de actividade enzimtica. A estirpe tipo da espcie Saccharomycodes ludwigii (EVN 395) revelou perfis caractersticos para EST e LDH, com duas bandas e ACP, com trs bandas de actividade enzimtica. Para G6PD revelou um perfil idntico ao da estirpe EVN 385 da espcie Wickerhamiella domercqiae, assim como revelou, para ADH, um perfil idntico ao da estirpe EVN 367 da espcie Candida stellata. Em relao estirpe de Schizosaccharomyces pombe, EVN 396, esta revelou um perfil caracterstico para os complexos EST, LDH, ADH e G6PD, com uma banda de actividade enzimtica. Para ACP apresentou tambm um perfil com uma banda idntico aos dos perfis de bandas de actividade enzimtica das estirpes EVN 381 e 383. Na anlise de reprodutibilidade (3.2.2.10), verificou-se que os perfis de bandas de actividade enzimtica da estirpe EVN 378 e do seu duplicado (EVN 378a) foram iguais para

Resultados e Discusso

todos os complexos enzimticos, assim para EST, LDH e G6PD, apresentaram uma banda, para ACP duas bandas, enquanto que para ADH, ambas as estirpes no revelaram possuir actividade enzimtica. Para a estirpe EVN 379 a comparao dos perfis isoenzimticos com o seu duplicado, EVN 379a, revelou que os perfis eram idnticos para quase todos os complexos isoenzimticos estudados, assim para LDH e G6PD apresentaram uma banda, e para EST e ADH duas bandas. No entanto, para ACP o resultado designado EVN 379 apresentou uma banda adicional em relao ao seu duplicado. A estirpe EVN 381 e o seu duplicado, EVN 381a, revelaram possuir perfis idnticos para EST e G6PD de trs bandas, e para LDH, de uma banda. Em relao ao complexo ADH foi obtido uma banda adicional para alm da banda comum, e para ACP o duplicado no revelou actividade neste complexo enzimtico, enquanto que a estirpe EVN 381 apresentou uma banda, mas muito tnue.

4.2 Anlise numrica dos perfis isoenzimticos obtidos

Mtodos de anlise numrica foram aplicados aos dados obtidos para inferir os relacionamentos entre as estirpes de leveduras estudadas, assim como a utilizao da anlise de perfis de isoenzimas para fins taxonmicos. A partir dos perfis electroforticos dos cinco complexos enzimticos estudados, foi construda a matriz original de dados (presente no anexo III), na qual para cada estirpe foi assinalada a presena (1) ou ausncia (0) de banda de actividade enzimtica com determinado valor de Rm, num total de 92 bandas. Por aplicao do coeficiente de Dice matriz original, conforme o descrito em 3.2.2.9, foi originada uma matriz de semelhanas. Obteve-se a sua representao grfica mediante a forma de um dendrograma ao aplicar o mtodo de agregao UPGMA. O dendrograma encontra-se representado na figura 4.2, no qual podem ser observadas as relaes entre os perfis electroforticos distintos, obtidos para as 32 estirpes estudadas neste trabalho experimental. Foi igualmente avaliado o grau de distoro da representao grfica da matriz de semelhanas, conforme o descrito em 3.2.2.9, ao ter sido calculado o coeficiente de correlao cofentica (r). Obteve-se um r=0,88, o que permite verificar que o dendrograma obtido se trata de uma boa representao da matriz de semelhanas. A reprodutibilidade de toda a metodologia de anlise de perfis electroforticos de isoenzimas foi tambm analisada, mediante a introduo de extractos protecos provenientes de duplicados de culturas de trs das estirpes em estudo, os quais foram tratados pela anlise

Resultados e Discusso

numrica de um modo independente, conforme o descrito em 3.2.2.10. Verificou-se o agrupamento dos duplicados efectuados com o da estirpe correspondente, a nveis de semelhana muito elevados, designadamente 100% de semelhana entre EVN 378a e EVN 378, e aproximadamente 94% de semelhana entre EVN 379a e EVN 379. Como se fazia supor para os resultados da estirpe EVN 381 e duplicado, em que para os perfis dos complexos enzimticos ADH e ACP foram encontradas algumas diferenas, a anlise numrica revelou um agrupamento a um menor nvel de semelhana de aproximadamente 88%. No dendrograma presente na figura 4.2, foram postos em evidncia os relacionamentos 0.88 entre ra= totalidade das estirpes estudadas, podendo ser observado uma clara separao das p estirpes pertencentes a espcies diferentes. De modo a facilitar a anlise do dendrograma T
365

possvel delimitar grupos, utilizando para tal um mesmo critrio ao longo de todo o 366
372T

369T dendrograma, designadamente traando uma linha recta (Sneath e Sokal, 1973). A recta foi

traada de modo a que estirpes de espcies diferentes ficassem separadas, sendo este o nvel de 374 semelhana (42%) acima do qual as estirpes pertenceriam mesma espcie e vice-versa. Assim 388T
367

foram obtidos 23 grupos, para os quais ser efectuada uma detalhada anlise caso a caso. A fiabilidade para delimitar as espcies revelou ser bastante elevada, visto que na anlise de 394T
T

393

para inferir as espcies os valores de semelhana estipulados foram de 42% de semelhana. 380
379 379a 375T 376 377
378a

378a

382 383 391 384T 392 386T

385 395T 368T 373 387T

370NT 371 390 389T 396T

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

ndice de semelhana

C. K. C. v S W. L. e H. W. H. Sc D H. S. hi . n gu P ste the an ode do lo osm do oc z. aa ill . n po rd ie flu llat rmo der s lu mer gis oph mer cide exig a tol wa dw cq po il cq nt uu mb en rm xu s er lti ig iae rus a iae ali e en ond um a n i ii s sis ii s

381NT 381a

M .p ulc he rri ma

P. c

ar so nii

378 reprodutibilidade a maior divergncia encontrada foi na ordem de 88% de semelhana, e que

D P. C. e b . K. me C. H. ste ha the x c ns rm ica ant uv l la ar ta enii oto na are um lii va ler r . an fab s ry ii

Resultados e Discusso

Figura 4.2 Dendrograma representando a semelhana entre a totalidade de estirpes de leveduras analisadas neste trabalho, com base em perfis electroforticos dos cinco complexos isoenzimticos (EST, ACP, ADH, LDH, G6PD). A escala corresponde a uma medida numrica de semelhana, r, coeficiente de correlao cofentica. T estirpe tipo; NT- estirpe neotipo.

Em algumas das espcies estudadas neste trabalho, somente foi analisada a estirpe tipo dessas espcies ou do anamorfo respectivo. As estirpes designadas so: a estirpe EVN 368 da espcie Candida vanderwaltii, a estirpe EVN 369 da espcie Pichia mexicana, a estirpe EVN 386 da espcie Lodderomyces elongisporus, a estirpe EVN 388 da espcie Debaryomyces hansenii var. fabryii, a estirpe EVN 389 de Dekkera naardenensis, a estirpe EVN 390 da espcie Hanseniaspora guilliermondii, a estirpe EVN 391 da espcie H. occidentalis, a estirpe EVN 392 da espcie H. osmophila, a estirpe EVN 395 da espcie Saccharomycodes ludwigii e a

Resultados e Discusso

estirpe EVN 396 da espcie Schizosaccharomyces pombe. Da anlise do dendrograma presente na figura 4.2, verificou-se que todas as estirpes acima referidas se posicionaram isoladas no dendrograma, que portanto no agrupavam com outras estirpes de outras espcies estudadas, encontrando-se assim deste modo claramente separadas. de referir que o facto de se tratarem de estirpes tipo da sua respectiva espcie ou do anamorfo da espcie, confere ainda mais consistncia ao bom resultado obtido. No que diz respeito s restantes espcies ocorreu agrupamento das estirpes EVN 370 e 371 da espcie Pichia fluxuum, das estirpes EVN 375, 376 e 377 da espcie Metschnikowia pulcherrima, das estirpes EVN 393 e 394 da espcie Hanseniaspora uvarum. Tambm para as referidas espcies, a presena nos agrupamentos das estirpes tipo confere uma consistncia para estes resultados obtidos. O mesmo pode ser tambm aplicado para as estirpes EVN 378, 379 e 380 da espcie Pichia carsonii, e para as estirpes EVN 381, 382 e 383 da espcie Saccharomyces exiguus, nas quais se verificou um agrupamento para cada uma das duas espcies, e de que nesses agrupamentos tambm foi igualmente verificada a presena dos seus duplicados de crescimento, o que tambm contribui para assegurar fiabilidade da anlise isoenzimtica. As estirpes EVN 365 e 366 da espcie Candida cantarellii, agruparam efectivamente, contudo esse agrupamento verificou-se a um menor ndice de semelhana (sensivelmente 34 %), o que no respeita ao definido critrio de semelhana (42%) que indica conspecificidade. Este facto j era previsto na anlise dos seus perfis isoenzimticos, onde foi constatada uma dissemelhana para os perfis electroforticos dos complexos EST, ADH e G6PD. As estirpes EVN 367 e 387 de Candida stellata no agruparam, assim como no foram verificados agrupamentos com outras estirpes. Da anlise dos seus perfis electroforticos, foi verificada uma dissemelhana para todos os complexos enzimticos, facto esse que j fazia supor o no agrupamento entre as estirpes, revelado no dendrograma da figura 4.2. As estirpes EVN 384 e 385 da espcie Wickerhamiella domercqiae, no agruparam, assim como no foram verificados agrupamentos com outras estirpes foi verificada uma dissemelhana entre as duas estirpes, nos perfis electroforticos dos cinco complexos enzimticos focados. Nas estirpes pertencentes espcie Kluyveromyces thermotolerans, EVN 373, 374 e a estirpe tipo EVN 372, foi verificada uma heterogeneidade nos perfis exibidos de alguns complexos enzimticos. Assim, para a estirpe EVN 374 e a estirpe tipo foi verificado o seu agrupamento, mas o mesmo no foi verificado para EVN 373, a qual tambm no agrupou com outras estirpes focadas no presente trabalho.

Resultados e Discusso

Assim as estirpes EVN 366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C. stellata), EVN 373 (Kluyveromyces thermotolerans) e EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae) no agruparam com as estirpes tipo da sua espcie, acima do valor de semelhana definido pela recta traada. Podem ser utilizadas duas hipteses explicativas para este resultado, designadamente, os cinco sistemas enzimticos no foram suficientes para agrupar as estirpes destas espcies, tendo que ser utilizadas enzimas adicionais, ou as estirpes foram mal classificadas taxonomicamente. Foi utilizada uma outra metodologia para verificar esta ltima hiptese avanada no pargrafo anterior. Para tal utilizou-se a sequenciao de regies do DNA ribossmico (rDNA), mais especificamente a regio D1/D2 do rDNA 26S, visto tratar-se uma metodologia de referncia utilizada em estudos taxonmicos na identificao de leveduras ao nvel da espcie.

4.3 Sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S

Para a identificao das estirpes EVN 366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C. stellata), EVN 373 (Kluyveromyces thermolerans) e EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae), foi utilizada a sequenciao da regio D1/D2 da subunidade 26S do rDNA, a qual tem uma dimenso de aproximadamente 600 pares de bases nucleotdicas (pb).

Resultados e Discusso

Para tal efectuou-se a extraco e purificao de DNA conforme descrito em 3.3.3., na qual resultou a imagem digitalizada do gel de agarose presente na figura 4.3, para permitir efectuar uma diluio do DNA para a reaco de PCR com base na sua observao.

1 2 3 4

pb 3000 2000 1500 800 500

Figura 4.3 Perfis de bandas do DNA extrado das estirpes em estudo. M, marcador de pesos molecular; 1, EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.

Na anlise do gel presente na figura 4.3, ao comparar as bandas exibidas pelas estirpes com as bandas presentes no marcador de pesos moleculares, verificou-se que as estirpes possuam sensivelmente a mesma quantidade de DNA. Assim, foi efectuada uma diluio de 1/100 para as quatro amostras de DNA analisadas, para serem submetidas a uma reaco PCR, mediante utilizao dos primers externos ITS5 e LR6. Para tal foram seguidos os procedimentos descritos em 3.3.4, e realizou-se uma electroforese em gel de agarose para verificar se tinha ocorrido a amplificao, tendo sido obtida a imagem digitalizada do gel presente na figura 4.4.

pb 3000 2000 1500 800 500

1 2 3 4

Figura 4.4 Perfis de bandas do produto PCR amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6. M, marcador de pesos molecular; 1, EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.

Resultados e Discusso

Ao comparar as bandas exibidas pelas estirpes com as bandas presentes no marcador de pesos moleculares, constatado que da primeira amplificao por PCR, so gerados fragmentos com aproximadamente 2000 pb para as estirpes EVN 366 e 373, e 1500 pb para EVN 367 e 385. Efectuou-se a purificao do produto PCR mediante utilizao do kit de purificao (Jetquick PCR, Genomed) e realizou-se nova observao, para avaliar a quantidade de amostra a usar na reaco de sequenciao, foi assim obtida a imagem digitalizada do gel presente na figura 4.5. Verificou-se que os fragmentos nucleotdicos continham aproximadamente 2000 pb para as estirpes EVN 366 e 373, e 1500 pb para EVN 367 e 385.

M pb 3000 2000 1500 800 500

1 2 3 4

Figura 4.5 Perfis de bandas do produto PCR purificado, amplificado com os primers externos ITS 5 e LR6. M, marcador de pesos molecular; 1, EVN 366; 2, EVN 367; 3, EVN 373; 4, EVN 385.

Na reaco de sequenciao obteve-se uma sequncia nucleotdica consenso, de acordo com o descrito em 3.3.5, a qual para se obter a identificao, foi comparada com sequncias nucleotdicas num portal de acesso a diversas Bases de Dados de genoma, conforme descrito em 3.3.6, que apresentado nas figuras 4.6 a 4.9. Os resultados da estirpe EVN 366, classificada como Candida cantarellii encontram-se na figura 4.6, tendo sido detectadas seis bases nucleotdicas de diferena numa sequncia com a totalidade de 540 pb, com a sequncia da estirpe tipo da espcie (CBS 4878), o que corresponde a 98,9 % de semelhana, 1,1% de dissemelhana na regio D1/D2 entre as duas estirpes.

Resultados e Discusso

Segundo os autores Kurtzman et al. (2001), trata-se de um valor superior ao valor considerado para a variabilidade intraspecfica (1%), assim estamos muito provavelmente na presena de uma m classificao da estirpe EVN 366 na espcie C. cantarellii e confirmado o resultado da anlise isoenzimtica.
1 120

EVN 366 CBS 4878

cct t agtaacggc ga gt gaa gc ggcaa ga gct caaattt gaaatct ggc gt ct tacggc gt ccgaa ttgt aa ttt gt aga ggt aactt t gga ggc ggt cctt gcat atgtt cctt ggaac

121

EVN 366 CBS 4878

ag gac gtcat aga gggt ga gaa tc cc gt acgt ggt ggggt gccc gt ct cc ttgt aa agt gc ctt cgac ga gt cga gtt gt t tggga at gcaact ctaagt gggt ggt aa att ccat ctaa

240

241
agct aa atat cagc ga ga gacc gat agc gaacaa gtaca gt gat ggaa agat gaaaa gaact tt gaaa a ga ga gtgaaa gt acgt gaaatt gt tgaaa gg ga agcct tt ga gatcaga c a

360

EVN 366 CBS 4878

361
EVN 366 CBS 4878

c a t g g c t t t c g g t g a t c a g c t ac c c t t cg t g g g t g g t g c a c t c g c c g t t g g c t g g g c c a a c a t c g g t t c g g a t g g t g g g a t a a a a g c a t t g g a a t g t a g c t t cct t g a a g t g t t a t ag c t - t g a

480

481
EVN 366 CBS 4878

ct ttgt t cataccgc ct gtc tgga ccga ggacc gc gct t cggct aggatgt t ggc gt aat

540

Figura 4.6 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 366 e CBS 4878 (Gen Bank acesso n U45814, Kurtzman e Robnett, 1997).

Para a estirpe EVN 367, classificada como Candida stellata, foi obtida uma sequncia de 508 bases. Esta revelou na comparao da sequncia nucleotdica (figura 4.7) uma divergncia ainda mais considervel com a estirpe tipo da espcie (CBS 157), sendo que foram detectadas trinta e seis diferenas de pares de bases nucleotdicas numa sequncia com a totalidade de 476 pb, o que corresponde a 91 % de semelhana, valor este muito inferior ao referido por Kurtzman et al. (2001), para que as estirpes sejam consideradas da mesma espcie. Contudo a estirpe revelou possuir 100 % de semelhana com a estirpe 10-372, designada por Sipiczki como Candida cf. stellata, numa totalidade de 475 pb comparados, e com o isolado EJ1, designado por Mills et al. (2002) como pertencente ao gnero Candida, num total de 469 pb comparados. A estirpe 10-372 foi estudada por Sipiczki (Gen Bank acesso n AY160761), e foi isolada de um vinho Tokaj, o qual trata-se de um tipo de vinificao especial em que so vinificados mostos provenientes de uvas infectadas por Botrytis cinerea (Sipiczki et al., 2001). A estirpe EJ1 foi isolada por Mills et al. (2002), num estudo da caracterizao do impacto da temperatura na diversidade das leveduras presentes durante a fermentao de vinhos doces de marcas comerciais, nas quais foram usados mostos provenientes de uvas brancas inoculadas com Botrytis cinerea. Este resultado vem de encontro ao resultado da anlise isoenzimtica, e aponta muito provavelmente para uma m classificao da estirpe EVN 367 na espcie C. stellata.

Resultados e Discusso

1
EVN 367 CBS 157 EJ1 10-372

a a a c c a a c a g g g a t t g c c c t a g t a a c g g c g a g t g a a c a g g c a a a g c t c a g a t t t g a a a g g c a c t tt t g t g c cg t t g t a t t c t g a a g t t a g gg t c c t g a g a a a c g a tg c t t a a g tc t t c t g - - a t t g c a c t a

120

121
g g a a a gg a g c g c c a t g g a g g g t g a t ag c c c c g tc t a g c a t t g a c ct c a t a t a g g a t c t t a a c a t gg a g t c g a g t t g t t t g g g a a t g c a g c t c a a a t g g g t g g t a t g c t c c a t c t aa g c t a a t g a a c g t c a t

EVN 367 CBS 157 EJ1 10-372

240

241
a a a t a tc t g c g a g a g a c c g a t a gt a a a c a a g t a c t g t g ag g g a a a g a t g a a a a g a a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a a g t a c g t g aa a t t g t t g a a a t g g a a g g g t a g g cc g c t a a c c a t g c a t t g t

360

EVN 367 CBS 157 EJ1 10-372

361
t a g ag c c g t g t t t g g g g g g a a g a t a a at g c t gt a g a at g t ag c t c c t c g g a gt a t t a t a g a t g c a g tt c a t a t t c c c ac c c g a g c g c g a g g a t c t c a g g t t c t a c t a a a t g g t g g t a c a c c a c t

475

EVN 367 CBS 157 EJ1 10-372

Figura 4.7 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA da estirpe EVN 367 com as estirpes CBS 157, 10372, e EJ1 (respectivamente Gen Bank acesso n U45730, Kurtzman e Robnett, 1997; n AY160761, Sipiczki, no publicado; n AY078348, Mills et al., 2002).

De referir que a estirpe EVN 367 estirpe neotipo da espcie Saccharomyces bacillaris, e de que a estirpe EVN 387, estirpe tipo da espcie Saccharomyces stellatus. As duas referidas espcies foram isoladas por Kroemer e Krumbholz (1931; cit. in Lodder, 1970), em uvas em estado de sobrematurao e em mostos concentrados. Os autores observaram diferenas no arranjo e tamanho das clulas assim como na intensidade de fermentao entre os dois grupos de isolados, pelo que descreveram-nos como pertencentes a diferentes espcies. As duas espcies foram transferidas separadamente para o gnero Torulopsis por Lodder (1932; cit in Lodder, 1970), e assim mantidas por Lodder e Kregger-van Rij (1952; cit. in Lodder, 1970). No foram verificadas diferenas por van Uden e Vidal-Leiria (1970), entre as estirpes tipo e outras estirpes pertencentes s espcies Torulopsis stellata e T. bacillaris, pelo que os autores efectuaram a sua unio numa espcie, e foi seleccionado o epteto especfico stellata para a nomenclatura da espcie criada. No entanto, e dado o paralelismo observado entre os resultados obtidos na anlise isoenzimtica e sequenciao, estamos muito provavelmente na presena de duas espcies distintas, sendo necessrios estudos adicionais para consolidar esta hiptese. Para as estirpes EVN 373 e 385 os resultados da comparao das sequncias nucleotdicas no detectaram uma divergncia significativa, com as estirpes tipo das suas respectivas espcies (figura 4.8 e figura 4.9). A sequenciao da regio D1/D2 de rDNA no

Resultados e Discusso

suportou a hiptese avanada, com base na anlise isoenzimtica, de uma m classificao ao nvel da espcie para as duas estirpes visadas. Para a estirpe EVN 373, a comparao das sequncias nucleotdicas com a estirpe tipo da espcie Kluyveromyces thermotolerans (CBS 6340), estudada por Kurtzman e Robnett (1998), revelou uma diferena de uma base numa sequncia com o total de 519 pb, enquanto que para a estirpe EVN 385 a comparao com a sequncia nucleotdica da estirpe tipo da espcie Wickerhamiella domercqiae (CBS 4351) estudada por Kurtzman e Robnett (1997), detectou a diferena de duas bases numa sequncia com o total de 517 pb. Os resultados fornecidos pela sequenciao de rDNA (regio D1/D2) confirmam que as duas estirpes EVN 373 e EVN 385 so pertencentes respectivamente s espcies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae. Para estes dois casos os resultados da anlise de perfis electroforticos, com base nos cinco sistemas isoenzimticos estudados no foram adequados para a sua classificao, e a anlise isoenzimtica ter que ser efectuada com complexos enzimticos adicionais.
1
EVN 373 CBS 6340

c c t t a g t aa c g g c g a g t g a a g c g g c a a a a g c t c a a a t t g a a a t c t g g c at c t t c g g t g t c c g a g t t g t a a t t t g a a g a a g c t a c t t t g g g g c t a g t c c t t g t c t a t g t t c c t t g g a a c a c

120

121
EVN 373 CBS 6340

g ga c gt c at gga g g gt ga ga a t c c c gt a tg gc ga g ga gt c t a gt c ct a t gt a a agt gct t t c ga cga gt c ga gt t gt t t gg ga a t gc a gc t c t a a gt gg gt g gt aa at tc c at c t a a a gc

240

241

EVN 373 CBS 6340

taa a t at tg gc ga ga ga c c ga t agc ga a c a a gt a c a gt ga t g ga a a ga t ga a a a gaa c t tt ga a a a ga ga gt ga a a aa gt ac gt ga a a t t gtt ga aa g g ga a g g gc at tt ga t c a ga ca t

360

361
g gt gt tt tgc gac c c t c gc t c c tt gt g ggt ggg ga t c t c gc a gc t c a c t g g gc ca a c at c a gt t tt g gc g gt ag ga t a a a t ct tt g g ga a c gt g gc t t gt c tt c g ga ga a gc gt t at a gc

480

EVN 373 CBS 6340

481
ccaggggaatact gcca gcc gggactga ggact gc act g

519

EVN 373 CBS 6340

Figura 4.8 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 373 e CBS 6340 (Gen Bank acesso n U69581, Kurtzman e Robnett, 1998).

Resultados e Discusso
1
EVN 385 CBS 4351

g c g a g t g a a g c g g c a a a a g c t c a a a tt t g a a a t c c g t c t tt t g a t g g a g t t g t a a t t t g a a g a t a a c a a t t c t t g a a g c a g c c c t g c t c a a g t t t c c t g g a a c g g a a c a t c a t g g a g g g t

120

121

EVN 385 CBS 4351

ga ga a t c c c gt ga t g c g gg g gc t c t gc t t ct t a ca ga gt gt t at c ga c ga gt c ga gt t gttt g g ga a t gc a gc tc t a a gt g g gt g gt a a a tt c c a t ct a ag gct a a at a tt g gc ga ga g c

240

241
a c c g a t a g c g a a c a a g t a c t g t g a ag g a a a g a t g a a a a g c a c t t t g a a a a g a g a g t g a a a t a g a a c g t g a a a t t g t t g a a g t g g a a g g g t t t g a a g t t a g a c t t g g t a g t t t a c g c t c c a

360

EVN 385 CBS 4351

361
256 c g art = cc t c g g g gc c g t g t a c t c g t t t t c t g c c g g g c c a g c a t c a g t t t t g a t a g a a g t a c a a a g a c a t t g g a a c g t g c c t t c t t a t g t t g g t t t a t a g a c t t t g t t a a t g c t t c t c a t c c 0.88 251 167 t t 260 253 255

480

EVN 385 CBS 4351

481
EVN 385 CBS 4351

g g g a ct g a g g a c c g c g c t t t t t g c t a g g a t g c t g g c g

517

Figura 4.9 Alinhamento das sequncias parciais do rDNA das estirpes EVN 385 e CBS 4351 (Gen Bank acesso I n U45847, Kurtzman e Robnett, 1998).

4.4 Comparao com os perfis isoenzimticos das estirpes da base de

dados da EVN

Os resultados obtidos neste trabalho foram adicionados aos da base de dados de perfis perfazendo na sua totalidade 160 estirpes e cerca de 50 espcies de leveduras. III
II

electroforticos de isoenzimas existente na Estao Vitivincola Nacional (Duarte, 2000), Para verificar os relacionamentos entre a totalidade das estirpes inseridas na base de
Y-12628

dados, efectuou-se a anlise numrica dos dados isoenzimticos, de acordo com os procedimentos anteriormente descritos em 3.4.2., resultando o dendrograma presente na figura

4.10., encontrando-se a azul as estirpes analisadas no presente trabalho. O traado de uma linha recta a um nvel de semelhana de aproximadamente 0,42 evidenciou uma elevada correlao cofentica, r= 0,88, o que permite indicar que o dendrograma gerado trata-se de uma V
IV

correspondncia entre os agrupamentos e as espcies estudadas. Foi calculado o coeficiente de

boa representao da matriz de semelhanas. contudo, de referir que os valores de Rm base de dados existente que apresentaram valores semelhantes.

VI determinados no presente trabalho deveriam ter sido comparados em gel com os das estirpes da

VII VIII

262 166 267 237 263 Saccharomyces cerevisiae 258 261 264 257 265 266 268 254NT 252 259 216 Zygosaccharomyces lentus 230 382 383NT Saccharomyces exiguus 381T 329 Debaryomyces hansenii 222T N. I. 284 285 299 302 292 293 Pichia membranifaciens 298 301 290 291 303 287 N. I. 269T 271 270 Saccharomyces ayanus b 272 273 274 276 277NT Saccharomyces pastorianus 275 278 235 355T Zygosaccharomyces rouxii 242 243 244 245 248 Zygosaccharomyces bisporus 246 247 249 390 Hanseniaspora guilliermondii 279NT 280 281 Saccharomyces paradoxus 283 282NT 370 371T Pichiafluxuum 378 380 Pichia carsonii 379 212 223 217 219 213 215 218 224 Zygosaccharomyces bailii 229 227 220 221 225 228T 226NT 312 310 Pichia anomala 311 340 341 Kluyveromyces marxianus 342T 384 Wickerhamiella domercqiae 392 Hanseniaspora osmophila 391 Hanseniaspora occidentalis 345NT 346T Rhodotorula mucilaginosa 231T Zygosaccharomyces florentinus 368 Candida vanderwaltii 373T Kluyveromyces thermotolerans 387T Candida stelatta 354 Zygosaccharomyces mellis 348 349T Saccharomycodes ludwigii 395 339T 394 Hanseniaspora uvarum 393 367 Candida stellata 305 308 Pichia kluyveri 307T 388 Debaryomyces hansenii fabryii var. 168 350 351T Schizosaccharomyces pombe 396 294 288 289 Pichia manshurica 300 295 336 337T Issatchenkia orientalis 338NT 326 Torulaspora delbrueckii 327T 372 Kluyveromyces thermotolerans 374 232 234 233NT 241 Zygosaccharomyces rouxii 238 239T 333 334 D ekkera bruxellensis 335T 330 331 D ekkera anomala 332 385 Wickerhamiella domercqiae 236T N.I. 375 376 M etschnikowia pulcherrima 377 343 344T Lodderomyces elongisporus 386T 389 Dekkera naardenensis 296T N.I. 369 Pichiamexicana 304 306 Pichia scaptomyzae 297 N.I. 286 N.I. 309T Pichia farinosa 365 366 Candida cantarellii 325 N.I

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

ndice de semelhana Coefficient

Resultados e Discusso

Figura 4.10 Dendrograma representando as relaes da totalidade de estirpes estudadas (160 estirpes), com base nos perfis electroforticos de EST, ACP, G6PD, LDH e ADH. A escala corresponde a uma medida numrica de semelhana. r, coeficiente de correlao cofentica. N. I.= No Identificada; T estirpe tipo; NT estirpe neotipo.

Resultados e Discusso

Para as estirpes das espcies estudadas neste trabalho, as quais somente foi analisada isoenzimaticamente a estirpe tipo das respectivas espcies ou do anamorfo, nomeadamente a estirpe EVN 368 da espcie Candida vanderwaltii, a estirpe EVN 369 da espcie Pichia mexicana, a estirpe EVN 388 de Debaryomyces hansenii var. fabryii, a estirpe EVN 389 de Dekkera naardenensis, a estirpe EVN 390 da espcie Hanseniaspora guilliermondii, a estirpe EVN 391 da espcie H. occidentalis e a estirpe EVN 392 da espcie H. osmophila, mediante a anlise do dendrograma presente na figura 4.10., verificou-se que tal como na figura 4.2, que surgiam isoladas no dendrograma, tambm no agruparam com as outras estirpes existentes na base de dados anterior. Verificou-se o agrupamento (agrupamento II) das estirpes EVN 370 e 371 da espcie Pichia fluxuum, o qual se efectuou a um nvel de semelhana idntico ao agrupamento verificado no dendrograma 4.2. O mesmo foi igualmente verificado para as estirpes EVN 378, 379 e 380 da espcie Pichia carsonii (agrupamento III), e para as estirpes EVN 375, 376 e 377 da espcie Metschnikowia pulcherrima (agrupamento VII). Para as estirpes EVN 381, 382 e 383, da espcie Saccharomyces exiguus, verificou-se o seu agrupamento, (agrupamento I) como foi verificado anteriormente no dendrograma 4.2, contudo inserida neste agrupamento, a estirpe EVN 230 pertencente a outra espcie (Zygosaccharomcyces lentus), a qual fazia parte da base da dados anterior. Ter de ser efectuada a comparao dos valores de Rm das bandas dos respectivos perfis por anlise num mesmo gel, de modo a confirmar, ou no, este resultado. Na anlise do dendrograma presente na figura 4.10, verificou-se que as estirpes que no agruparam com as estirpes tipo da sua espcie, no dendrograma presente na figura 4.2., devido s dissemelhanas encontradas entre os perfis dos cinco sistemas enzimticos estudados e os perfis exibidos pelas estirpes tipo da sua espcie, as quais foram a estirpe EVN 366 (Candida cantarellii), EVN 367 (C. stellata), EVN 373 (Kluyveromyces thermolerans) e EVN 385 (Wickerhamiella domercqiae), continuaram igualmente a no agrupar, bem como no foi verificado um agrupamento com as outras estirpes de outras espcies estudadas em trabalhos anteriores. contudo, de referir que para as estirpes EVN 366 e 367 os resultados de sequenciao da regio D1/D2 vieram confirmar estes resultados. Algumas das estirpes visadas neste trabalho experimental, so a estirpe tipo de espcies constantes da base de dados existente, e foram analisadas com o objectivo de confirmar a adequada identificao de estirpes de interesse enolgico pela anlise isoenzimtica. Assim, as estirpes visadas foram: EVN 386 (Lodderomyces elongisporus), EVN 393 e 394 (Hanseniaspora uvarum), EVN 395 (Saccharomycodes ludwigii) e EVN 396

Resultados e Discusso

(Schizosaccharomyces pombe). As estirpes visadas anteriormente geraram agrupamentos com as estirpes j estudadas e existentes na base de dados de perfis isoenzimticos. No caso das estirpes EVN 348, 349 e EVN 395 (estirpe tipo) da espcie Saccharomycodes ludwigii, verificou-se o seu agrupamento (agrupamento IV) para o qual foram obtidas boas semelhanas (cerca de 57%). Para as estirpes da espcie Hanseniaspora uvarum, EVN 339, 393 e a estirpe tipo EVN 394 analisadas, foi verificado o seu agrupamento (agrupamento V) e foram obtidas boas semelhanas (cerca de 60%). As estirpes EVN 343, 344 e EVN 386 (estirpe tipo) de Lodderomyces elongisporus, tambm agruparam (agrupamento VIII), com boas semelhanas (cerca de 58%). Contudo no foi verificado um agrupamento para as estirpes da espcie Schizosaccharomyces pombe, EVN 168, 350, 351 e a estirpe tipo EVN 396, que respeitasse o critrio definido pelo traado da linha, isto foram obtidos baixos ndices de semelhana (cerca de 37%), assim o agrupamento verificado (agrupamento VI) no satisfaz os requisitos para que as estirpes sejam consideradas pertencentes mesma espcie. Assim, para a espcie Schizosaccharomyces pombe, no foi ento possvel a sua identificao e diferenciao com base na anlise electrofortica de perfis dos cinco sistemas enzimticos estudados neste trabalho experimental.

Concluses

5. CONCLUSES
Pode-se concluir que os cinco sistemas enzimticos usados na anlise de perfis electroforticos, esterase (EST), lactato desidrogenase (LDH), lcool desidrogenase (ADH), fosfatase cida (ACP) e glucose-6-fostato desidrogenase (G6PD), foram bastante discriminantes na diferenciao entre as espcies estudadas neste trabalho experimental, e conseguiu-se a diferenciao da maior parte das 32 estirpes de 19 espcies. Quatro das estirpes estudadas no agruparam com as estirpes tipo da respectiva espcie, pelo que a sua identificao foi verificada por outra metodologia a sequenciao da regio D1/D2 do rDNA 26S, tcnica muito utilizada na identificao de espcies de leveduras. Para duas das estirpes esta metodologia veio a confirmar uma incorrecta identificao na espcie (EVN 366 e 367), e suportou deste modo os resultados da anlise isoenzimtica, e para as restantes duas estirpes foi confirmada a sua classificao (EVN 373 e 385). Para estas, pertencentes s espcies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae, a utilizao dos cinco sistemas enzimticos no permitiu a identificao e discriminao ao nvel da espcie, deste modo necessrio o estudo de sistemas enzimticos adicionais. A comparao dos resultados isoenzimticos das estirpes analisadas no presente trabalho com a base de dados da EVN, permitiu verificar que apenas com cinco sistemas enzimticos foi possvel diferenciar a generalidade das cinquenta espcies em comparao. Verificou-se tambm que as estirpes tipo, estudadas no presente trabalho, de algumas das espcies j existentes na base de dados da EVN, agrupavam com estas. Contudo, necessrio efectuar uma confirmao lado a lado num mesmo gel das estirpes deste trabalho com as estudadas anteriormente, uma vez que s assim possvel constatar o grau de semelhana dos perfis electroforticos exibidos. A anlise de perfis isoenzimticos trata-se de uma tcnica com um enorme potencial no controlo de qualidade da tecnologia alimentar, nomeadamente no rastreio de espcies de contaminao na indstria enolgica, devido a no necessitar de uma exigente formao profissional de operadores de laboratrio, devido facilidade de execuo, de ser uma tcnica que necessita de equipamento pouco dispendioso, e o facto de ser relativamente rpida aliado sua fiabilidade sob condies estandardizadas, caractersticas que a tornam esta tcnica adequada para utilizao em rotina na indstria alimentar.

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81

ANEXOS

Anexo I

SOLUES UTILIZADAS NA ELECTROFORESE DAS ISOENZIMAS

1. Soluo de tampo depsito superior (10x)

Tris 0,25 M

Glicina 1,92 M Aps adio dos dois reagentes e gua ultrapura, filtrar por papel Whatman n1 ou 2 a 4C.

1.1 Soluo de tampo depsito superior

Soluo 10x (tampo depsito superior) diluda (1/10) em gua ultrapura, com acerto de pH por soluo cido ctrico 2 M, at pH 8,2.

1.2 Soluo de tampo depsito superior fosfatase cida

Soluo (tampo depsito superior) diluda (1/10) em gua ultrapura, com acerto de pH por soluo HCl 30% (p/v) at pH 8,2.

2. Soluo de tampo depsito inferior (10x)

Tris-HCl 0,25 M Acerto do pH 8,3 com uma soluo de HCl 30% (v/v) diluir com gua ultrapura.

2.1 Soluo de tampo depsito inferior

Diluio (1/10) da soluo 10x de tampo de depsito inferior, com gua ultrapura.

Anexo II

SOLUO UTILIZADA NA ELECTROFORESE DO DNA

1. Soluo TBE (5x)

Tris EDTA 0,45 M 0,001 M

cido brico 0,45 M Acerto de pH por adio de soluo de HCl 30% (v/v) at pH 8,0; autoclavar.

1.1 Soluo TBE (0,5x)

Diluio (1/10) da soluo TBE 5x, com gua ultrapura esterilizada; autoclavar.

Anexo III

Tabela A.1 Matriz dos resultados obtidos de todas as estirpes estudas, para tratamento por anlise numrica. As bandas de actividade enzimtica esto representadas por uma letra, correspondente a cada complexo enzimtico (E EST; L LDH; A ADH; F ACP; G G6PD), seguida do valor de Rm dessa banda. A presena ou ausncia de banda de actividade enzimtica assinalada respectivamente com 1 ou 0.
365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 378a 379a 381a E0.21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 E0.28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 E0.32 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 E0.4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 E0.42 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.48 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.52 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.54 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 E0.58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 E0.61 E0.62 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.63 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 E0.65 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.67 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 E0.68 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 E0.76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 E0.78 E0.80 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.84 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.87 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E0.96 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Tabela A.1 (continuao)

Anexo III

365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 378a 379a 381a

L0.22 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

L0.26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

L0.28 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0

L0.32 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

L0.34 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.36 L0.38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1

L0.43 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.45 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.47 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

L0.52 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0

L0.54 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.6 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0L.67 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

L0.72 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabela A.1 (continuao)

Anexo III

365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 378a 379a 381a

A0.18 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.3 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

A0.32 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0

A0.38 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0

A0.42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.44 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1

A0.48 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

A0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.52 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0

A0.54 A0.56 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A0.58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

A0.6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabela A.1 (continuao)

Anexo III

365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 378a 379a 381a

F0.23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

F0.27 F0.28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.33 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

F0.35 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

F0.41 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.43 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.48 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

F0.5 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.54 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0

F0.56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0

F0.76 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.78 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

F0.87 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabela A.1 (continuao)

Anexo III

365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 378a 379a 381a

G0.22 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.24 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.34 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

G0.4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.42 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

G0.46 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1

G0.48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

G0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

G0.52 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1

G0.54 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.58 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

G0.64 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

G0.65 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0