Prof

a
Leila Larisa Medeiros Marques
Contagem de coliformes totais e
coliformes termotolerantes em
alimentos
Definio
COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactrias
constitudo por bacilos gram-negativos, aerbios ou
anaerbios facultativos, no formadores de esporos,
oxidase-negativos, capazes de crescer na presena
de sais biliares e que fermentam a lactose com
produo de aldedo, cido e gs a 35C em 24-48
horas. O grupo inclui os seguintes gneros:
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES
TERMOTOLERANTES: so coliformes capazes de
se desenvolver e fermentar a lactose com produo
de cido e gs temperatura de 44,5 0,2C em 24
horas. O principal componente deste grupo
Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do
gnero Klebsiella e Citrobacter tambm apresentam
essa capacidade.

Definio
Coliformes- significado em alimentos
Totais: Utilizado para avaliar as condies
higinicas, sendo que altas contagens significam
contaminao ps-processamento, limpezas e
sanificaes deficientes, tratamento trmicos
ineficientes ou multiplicao durante o
processamento ou estocagem.
Termotolerantes: empregado como indicador de
contaminao fecal, ou seja, de condies
higinico-sanitrias, visto presumir-se que a
populao deste grupo constituda de uma alta
proporo de E. coli, que tem seu habitat no
trato intestinal do homem e de outro animais.
Alm de indicar possibilidade de presena de
outros patgenos entricos.








Tcnicas

Plaqueamento (slido): aplica-se a amostras de matrias-
primas, alimentos e raes, devendo ser utilizada quando o
limite mximo tolerado 100 UFC/g ou mL.

NMP (lquido) em alimentos: aplica-se a amostras de
matrias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o
limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

NMP (lquido) em gua e gelo: Aplica-se a amostras de gua
e de gelo usados em estabelecimentos produtores de
alimentos. O valor obtido em NMP/100mL.


Pesquisa de coliformes: mtodo em placas.
Amostra: acar cristal, morango, coxinha e
hambrguer
gar cristal violeta (VRBA)
sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+;
Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentao da lactose.


Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.


Sais biliares inibem Gram+;
Mistura de fosfatos impedem a acidificao do meio.


Eosina e azul de metileno so corantes inibidores de Gram +.
Com a fermentao da lactose e produo de cido, ocorre
precipitao desses corantes que fornecem o brilho verde
metlico caracterstico da E. coli.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose
Caldo EC
gar eosina azul de metileno (EMB)
45C/24 a 48h
Plaqueamento sobrecamada
Prova confirmativa
para coliformes totais
Prova presuntiva
para coliformes totais
Prova confirmativa
para coliformes
termotolerantes
Em posio invertida
Cada colnia para um caldo verde brilhante
Para cada tubo positivo no caldo
verde brilhante passar para um
tubo de caldo EC
Selecionar 3 colnias tpicas e
3 atpicas para investigar
15 mL
Caracterizao da E. coli
De cada tubo EC positivo
Tcnica de esgotamento por
estrias
Expresso dos resultados
R =(C x c x d)/r
R = Resultado
C = nmero de colnias contadas
c = nmero de colnias confirmadas
r = nmero de colnias repicadas
d = diluio utilizada

Resultado final= R
t
(colnias tpicas) + R
a
(colnias atpicas)

Exemplo de resultado final
Diluio 10
-2
= 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.

Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo.
Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos
testes confirmativos.
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas:
R
T
= 20 x 4 x 100/5 = 1.600

Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:
R
A
= 10 x 2 x 100/5 = 400

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:

Resultado final = R
T
+ R
A
= 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 10
3
UFC/g ou mL.
Exemplo de resultado final
Diluio 10
-2
= 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas.

Para confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo.
Quatro colnias tpicas e duas atpicas apresentaram resultado positivo nos
testes confirmativos.
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias tpicas:
R
T
= ?

Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:
R
A
= ?

O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas:

Resultado final = R
T
+ R
A
= ????????????? UFC/g ou mL.
Exerccio
1. Na placa de VRBA e diluio 10
-2
= 20 colnias contadas, das quais
15 eram tpicas e 5 atpicas; Para confirmao, foram repicadas 3
colnias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para
tubos EC;
2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos
para a confirmao de coliformes totais;
3. Para confirmao de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos
3 tubos repicados de colnias tpicas, 2 positivos; e das 3 atpicas
repicadas, 1 positiva.
4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de tpicas
quanto atpicas), 1 placa EMB tpico deu positivo e 1 atpico
positivo.

Diante destes resultados, pergunta-se:
1. Qual o valor para coliformes a 35C?
2. Qual o valor para coliformes a 45C?
3. Qual o valor de E. coli/mL?
Pesquisa de coliformes:
Nmero mais provvel (NMP)
Amostra: leite em p, leite pasteurizado, gua, acar refinado

NMP
Tcnica do nmero mais provvel ou tcnica dos
tubos mltiplos- estimativa da quantidade de Mo
presentes na amostra;
Pelo nmero de tubos positivos em cada uma das
diluies empregada determina-se o Nmero Mais
Provvel por grama de produto, tendo como base a
tabela estatstica de Hoskins para trs, cinco ou dez
tubos;
Por esta tcnica pode-se obter informaes sobre a
populao presuntiva de coliformes (teste
presuntivo), sobre a populao real de coliformes
(teste confirmativo) e sobre a populao de
coliformes de origem fecal (coliformes
termotolerantes)
NMP
a) Teste presuntivo para coliformes totais visa
detectar a presena de microrganismos
fermentadores de lactose. Meio utilizado: lauril sulfato
triptose. Princpio: turvamento e produo de gs,
evidenciado pelo tubo de Durham.
b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio
caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princpio:
turvamento e produo de gs por bactrias gram
negativas, caractersticas do grupo coliforme.
c)Teste confirmativo para coliformes
termotolerantes- utilizao do meio de cultura
seletivo Caldo EC e incubao em 44-45C.
Princpio: turvamento e produo de gs, evidenciado
pelo tubo de Durham.
c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas
bioqumicas.
Poder tamponante
Inibe
Gram+
Inibem
Gram+
Inibe Gram+
NMP
srie 3 tubos
Para cada EC+, um EMB
2 colnias caract. de cada
EMB em tubo de AN
NMP
srie 3
tubos (leite)
Para cada EC+, um EMB
2 colnias caract. de cada
EMB em tubo de AN
De cada tubo AN
Exemplo
10
-1


10
-2



10
-3
Tubos
positivos

3


3


1
Em todos os tubos e
placas de TODAS as
etapas, identificar o
nmero da equipe, o
nome da amostra e o
mais importante a
DILUIO que est ou a
DILUIO precedente !!!!!
Combinao tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL,
com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g
ou mL
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados
de NMP para inculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.




OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0,
0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os
valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na
anlise.
NMP- gua e gelo
Quando o limite de aceitao for <2,0/100mL,
usar srie de 5 tubos.

Quando o limite de aceitao for <1,0/100mL,
usar srie de 10 tubos.
Caracterizao da E. coli
De cada tubo EC positivo
Tcnica de esgotamento por
estrias
Padres microbilgicos
Produto Tolerncia
para
amostra
indicativa

Coliformes
Totais ou a
35C
Tolerncia para
amostra
indicativa
Coliformes
Termotolerante
s ou a 45C

Legislao Tcnica a ser
utilizada
gua para
consumo
humano
Ausncia
em 100mL
Ausncia em
100mL

Portaria 518,
2004
NMP srie
de 10 tubos
Leite
pasteurizado C
4NMP/mL 2NMP/mL IN 51, 2002 NMP srie
de 3 tubos-
amostra pura
Leite em p - 10NMP/g RDC 12, 2001 NMP srie 3
tubos- amostra
diluda
Acar cristal - 10
2
UFC/g

RDC 12, 2001 Plaqueamento
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004
1. Prova do Indol;
2. Vermelho de metila-VM;
3. Voges-Proskauer-VP;
4. Citrato.
Testes bioqumicos para
coliformes- identificao da E. coli
1. Prova do Indol
Triptofano triptofanase Indol + cido pirvico + amnia
desaminao


+ p-dimetilaminobenzaldedo +HCl + lcool (reativo de Kovacs)



Composto quinoidal (vermelho)
CH
2
do anel pirrlico da molcula do indol + o
aldedo em meio cido= quinona




2. Vermelho de metila-VM

cido lctico
cido actico
Glicose fermentao cido frmico
cido mista cido succnico
cido etlico
INDICADOR:
Vermelho de metila escala de 4,4 a 6,0.
pH 4,4 cor vermelha - prova positiva
pH 6,0 cor amarela (acetona) - prova
negativa
3. Voges-Proskauer-VP
Glicose

2 c. pirvico

descarboxilao

Acetilmetilcarbinol + -naftol +KOH 40% Diacetila
(acetona)


Diacetila + ncleo guanidina do -naftol condensao Composto
Vermelho

OBS .: cor cobre resultado negativo
Agente
oxidante
Catalisador
Fermentao
butilenoglicol
4. Citrato

ciclo de Krebs
Citrato citratase
ciclo da fermentao do citrato


Citrato piruvato + CO
2

CO
2
+ sdio carbonato de sdio
Amnia
como fonte
de N
pH
alto

Indicador de pH: azul de bromotimol
pH 8,4=colorao azul-da-prssia
pH 6,9= colorao verde
pH 6,0= colorao amarela
;
Prxima semana: prova prtica
de bolores e leveduras
1. Imprimir roteiro de prova;
2. Estudar o roteiro, dvidas tirar no horrio de PA;
3. Cuidar com tcnica e diluio.
4. Trazer os materiais abaixo para prova:
Equipe 1 Equipe 2 Equipe 3 Equipe 4
AMOSTRAS
Queijo
ralado
Gelia
(a granel de
preferncia)
Papinha
infantil de
fruta
Doce de
abobra a
granel
Legislao
Port.
357/97
RDC 12, 2001 RDC 12, 2001
RDC 12, 2001

Padro
microbiolgico
? ? ? ?