CROMATOGRAFIA

LÍQUIDA
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Química - Departamento de química orgânica 

Alunas: Beatriz Nascimento de Araujo

              Júlia Ferreira Canella
Classificações da cromatografia

Líquido Líquido
CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA
 DEFINIÇÃO DE CONCEITOS

Eluente Soluto
Fase móvel Amostra/mistura de componentes

Eluição Eluídos
Processo de separação Componentes separados
dos componentes de e a respectiva fase móvel
uma mistura pela FM
 Mecanismos de separação
De acordo com a fase estacionária empregada temos diferentes mecanismos de
separação:
• Partição

• Adsorção

• Troca iônica

• Exclusão

• Bioafinidade
 Mecanismos de separação
• Partição             Fase estacionária é líquida
 A separação é baseada nas diferentes solubilidades dos componentes de uma
amostra entre dois solventes imiscíveis, um fixo  e o outro móvel.

Princípio "Semelhante separa semelhante"

fundamental

INCOVENIENTE: solubilidade Utilizar materiais que contenham a

da fase estacionária na fase fase estacionária, quimicamente ligada
móvel. a um suporte sólido.
 Mecanismos de separação
• Adsorção             Fase estacionária é sólida
A separação é baseada na adsorção seletiva dos
componentes de uma amostra pela fase
estacionária, por meio de forças eletrostáticas e
nas diferentes solubilidades que estes
componentes têm na fase móvel.

INCOVENIENTE : alguns casos, poderão ocorrer

dificuldades no processo de dessorção dessas substânci
as. 
 Mecanismos de separação
• Troca iônica            Fase estacionária é uma resina catiônica ou
aniônica
Esquema trocador catiônico A separação é baseada na adsorção reversível e diferencial dos
solutos com carga de sinais contrários a fase estacionária.
+

A diferença de afinidade entre   Controlada por pH

- - os íons da fase móvel 
- e força iônica
pH=7 pH=5
Esquema trocador aniônico

+ + +
 Mecanismos de separação
• Exclusão A fase estacionária é um sólido com poros de tamanho
controlado
A separação é efetuada de acordo com o tamanho
das moléculas.

podem penetrar nos poros

Molécula
e apresentam um maior tempo de
s retenção.
pequenas
Molécula movem-se rapidamente, pois
s grandes  não entram nos poros
 Mecanismos de separação
• Bioafinidade Fase estacionária seletiva a macromoléculas
biológicas

Baseia-se principalmente nas propriedades biológicas ou

Componente
funcionais das espécies que interagem.
não ligado é
eluido
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Forma física
PLANAR
Cromatografia em papel
A cromatografia em papel (CP)
é uma técnica de partição
líquido–líquido, estando um
deles fixado a um suporte sólido.
O suporte é saturado em água e
a partição se dá devido à
presença de água em celulose
(papel de filtro).
Cromatografia em camada
delgada
A cromatografia em camada
delgada (CCD) é uma técnica
de adsorção líquido–sólido. A
separação dos componentes da
mistura ocorre em função da
migração diferencial sobre uma
camada delgada de adsorvente,
fixo numa superfície plana, por
meio de uma fase móvel.
 A forma mais simples é a cromatografia ascendente que utiliza como suporte uma tira
retangular de papel que funciona como uma camada fina de celulose.
Cromatografia em papel

Fase estacionária:
Água

Tipos de placas:
• De vidro : Necessidade de preparar a placa, • Pré fabricada​: custo mais elevado,
Cromatografia em dificuldade de se obter superfície uniforme. uniformes e homogêneas
camada delgada
Cromatografia em papel

Adsorventes mais usados:

Sílica e alumina
 DEFINIÇÃO DE CONCEITOS

Cuba cromatográfica Distância percorrida

Recipiente de vidro com tampa Distância percorrida pela fase móvel
fechada, não deixando escapar os ou componente, desde o ponto de
vapores da fase móvel, onde se partida até a linha de chegada, no
coloca a placa ou papel. mesmo tempo

Frente da fase móvel Rf

Linha de chegada da fase móvel, Razão entre a distância percorrida
visível ainda quando se retira da pelo componente e a distância
cuba. percorrida pela frente da fase móvel.
 DESENVOLVIMENTO DO CROMATOGRAMA

Frente do
solvente

1 2 3 4
Aplicação da Transferência para Cuba Ascensão do solvente Retirada da cuba e
amostra cromatográfica revelação
 REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA

• Etapa necessária quando os componentes eluidos são incolores.

Obs: CCD ,ao contrário da CP, permite a utilização de reveladores que necessitam de aquecimento.

Físicos Químicos Biológicos

Aplicação de um reativo Utiliza-se reações

químico para formar um enzimáticas ou
Visualizados através de luz derivado colorido ou bacterianas para tornar a
ultravioleta. fluorescentes. mancha visível.
• NP-PEG: Flavonoides
• Dragendorff: alcaloides • Enzimas
• Anisaldeídosulfurico: • Antibióticos
saponinas, terpenos e • substratos
esteroides.
REVELAÇÃO DO CROMATOGRAMA
 ANÁLISE QUALITATIVA

• Comparação com padrão eluído em conjunto • Comparação com valores de Rf tabelados

Após eluição
Após eluição
3

10 9
2
cm cm

1 5
3 cm
cm

A B A B
Rf(componente 1) : 3/10 = 0,3
Rf(componente 2) : 5/10 = 0,5
Amostra
Rf(componente 3) : 9/10 = 0,9

ANÁLISE QUANTITATIVA                 Extração e aplicação de métodos instrumentais

 Cromatografia em papel

Análise de compostos polares,  como

antibióticos hidrossolúveis, ácidos orgânicos
íons metálicos, ácidos nucléicos

Cromatografia em camada delgada

APLICABILIDAD Análise de substâncias orgânicas e inorgânicas.
E •  Estudos preliminares dos componentes de
um extrato orgânico.
• Determinar o melhor sistema de solvente para
 uma separação em coluna cromatográfica.
• Monitorar uma coluna cromatográfica.
•  Análise da pureza de compostos.
 Prospecção fitoquímica

Condições usadas em CCD para prospecção fitoquímica de extratos etanólicos de folhas(SANTOS, P. F. P. et al, 2018).
Figura Classe química Fase móvel Agente cromogênico Cor padrão
específico

Ácidos triterpênicos CHCl3/MeOH (15:1) Anisaldeido/H2SO4/ Violáceo (betulínico,

pentacíclicos aquecimento oleanólico, ursólico e
1 barbinérvico

Taninos hidrolisáveis e EtOAc/HCOOH, FeCl3 1% em MeOH Azul (ácido tânico)

condensados CH3COOH/H2O Verde (fenólicos não
2 (100:11:11:27) específicos)

Flavonoides e ácidos EtOAc/HCOOH, NP/PEG/ 365 nm Amarelo, verde ou laranja

fenólicos CH3COOH/H2O (flavonoides)
3 (100:11:11:27) Azul ou verde (ácidos
fenólicos
Química forense
 TESTES SOROLÓGICOS
• Teste rápido para COVID-19 :  consiste em dois componentes: um componente
IgG e um componente IgM. 

No componente IgG, a região da linha de teste IgG é revestida com um anti-IgG

humano. No componente IgM, a região da linha de teste IgM é revestida com
um anti-IgM humano. 

Durante o teste, a amostra reage com as partículas revestidas de antígeno de

COVID-19 no dispositivo de teste. A mistura em seguida, migra para cima na
membrana cromatográfica por capilaridade e reage com o anti-IgG humano na
região da linha de teste de IgG. 
 TESTES SOROLÓGICOS

Os testes de farmácia contêm anticorpos que

encontram o HCG presente na urina em uma fita
de papel absorvente.

A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido

e após a migração por cromatografia a formação
do imunocomplexo é revelada pelo depósito do
corante coloidal na linha de captura.
 VANTAGENS VS DESVANTAGENS DA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA PLANAR

Vantagens Desvantagens

• Diversas aplicações
• Difícil reprodutibilidade.
• Fácil execução • Difícil determinação exata
• Menor trajeto da fase
do Rf.
móvel
• Rapidez
• Baixo custo
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Forma física
COLUNAR

Clássica Alta eficiência

A cromatografia clássica (CLC) é A cromatografia líquida de alta

uma técnica manual viável para a eficiência (CLAE) é uma
separação e quantificação de técnica que utiliza pressões
substâncias, que utiliza a força da elevadas para forçar a passagem
gravidade para percolar o do solvente através de colunas
solvente através da fase fechadas que contém partículas
estacionária. muito finas capazes de
proporcionar separações muito
eficientes.
 Clássica
cl

Enchimento da coluna

Preparação Aplicação de Eluição Detecção e

de coluna amostra quantificação

CLC
 Cromatografia líquida clássica
• Fase estacionária
mais empregada: Esta técnica é bastante utilizada para isolamento de produtos
      Sílica e alumina naturais e purificação de produtos de reações químicas. Essa
técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das
moléculas envolvidas.

APLICABILIDAD
E
Alta eficiência
cl

CROMATOGRAMA
Cromatograma
 CROMATOGRAMA
FASE
MÓVEL

Sinal
Detector

Tempo (min)

CROMATOGRAMA
FASE
MÓVEL

Sinal
Detector

Tempo (min)

CROMATOGRAMA
FASE
MÓVEL

Sinal
Detector

Tempo (min)
 Parâmetros cromatográficos

Identificação dos compostos separados, avaliar o

IMPORTÂNCIA desempenho cromatográfico e auxiliar na otimização do
processo de separação.

• TEMPO DE RETENÇÃO
• FATOR DE RETENÇÃO
• FATOR DE SEPARAÇÃO
• NÚMERO DE PRATOS
• RESOLUÇÃO
 Parâmetros cromatográficos
• TEMPO DE RETENÇÃO
t'r2
ttr Tempo de
Tempo deretenção absoluto
retenção absoluto tr2
tr1
Medido a partir do momento de t0 t'r1
injeção até o instante máximo do
pico
t0 Tempo de retenção da substância inerte Substância inerte 
1 2
Tempo necessário para fase móvel
passar através da coluna
Volume da coluna/vazão • FATOR DE RETENÇÃO (K) • FATOR DE SEPARAÇÃO (α)

t'r Tempo de retenção corrigido tr - t0  t'r2

α
t'r= tr - to t0  t'r1
 Parâmetros cromatográficos
• NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) = EFICIÊNCIA

Um prato teórico é Quanto maior N ,mais

equivalente a uma etapa Análogo aos pratos da equilíbrios vão existir,
de equilíbrio entre teoria de destilação maior eficiência e melhor
o analito , FE e FM. separação

tr

tr tr Coluna
N Wb N mais
wb eficiente
Wb
 Parâmetros cromatográficos
• Altura equivalente a um prato teórico (H)  Tamanho de cada estágio de equilíbrio

L Onde:
H L = comprimento da coluna
N

H
 Parâmetros cromatográficos
• RESOLUÇÃO Expressa a separação efetiva entre dois
picos
Fornece uma medida 
Wb2 
2(tr2 - tr1) quantitativa da  Resolução de 1,0 ≈ 95% de
Wb2 

R habilidade da coluna  separação

b1N
WWb2 +Wb2  em separar duas  Resolução de 1,5 ≈ 99% de
substâncias separação
Parâmetros cromatográficos

Definem a qualidade de um sistema

cromatográfico:
• NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) = EFICIÊNCIA
• RESOLUÇÃO

Boa resolução com boa

IDEAL
eficiência.
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

• O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente

definido pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase
estacionária.
• CLL- cromatografia líquido-líquido;
Mecanismo: partição 
• CLS- cromatografia líquido-sólido;
Mecanismo: adsorção 
• CE -  cromatografia por exclusão;
• CLFL- Cromatografia de líquida de fase
ligada
•  Cromatografia de Fase Reversa 
• CTI - troca iônica ou cromatografia de íons; 
• CB-  cromatografia por bioafinidade
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiencia 
High Performance Liquid Chromatography
• Quais misturas podem ser analisadas ?

APLICABILIDAD
E
Em geral, é utilizada na análise de compostos não
voláteis ou instáveis termicamente onde a
cromatografia a gás não pode ser utilizada.
• CLL- cromatografia líquido-líquido;​ FE (líquida) imobilizada por adsorsão
• CLFL- Cromatografia líquida de fase ligada FE (líquida) imobilizada por ligações químicas

Inseticidas
Mecanismo: partição ​

Aditivos de refrigerantes
 • CLS- cromatografia líquido-sólido; Mecanismo: adsorção

 ​

APLICABILIDAD Pirazoliza

E
 CE -  cromatografia por exclusão

APLICABILIDAD
E
 CTI – Cromatografia de troca iônica 

APLICABILIDAD
E
 VANTAGENS VS DESVANTAGENS DA CLAE

Vantagens Desvantagens

• Alta sensibilidade • Instrumentação de Alto

• Alta versatilidade Custo
• Menor tempo de análise • Alto Custo de Operação
• Experiência de Manuseio
• Alta resolução
• Falta de detector universal
sensível
 COMPONENTES BÁSICOS
6 5

3 4
1 RESERVATÓRIO DE FASE MÓVEL

Recipiente contendo fase móvel que será

bombeada para dentro do sistema analítico.

As características desejadas são:

• O frasco deve ser de vidro.
• A tampa deve conter furos para a
passagem de tubulações.
• Técnica de degaseificação .
• Filtro para reter partículas sólidas
porventura existente.
 2 SISTEMA DE BOMBEAMENTO

A função da bomba é transportar a fase

móvel através da estacionária, com fluxo
constante pelo sistema da coluna até o detector.

As características desejadas são:

 Habilidade de gerar altas pressões
(faixa de 600 bars)
 Compatibilidade com o solvente e
resistência à corrosão
· Fluxo constante
· Baixo volume morto para evitar ou
minimizar os problemas quando é
trocado o solvente eluente.
 Melhoria da eficiência de separação por
eluição por gradiente:
2 SISTEMA DE BOMBEAMENTO

• Bombeamento isocrático ou por gradiente

Constituição do solvente
ISOCRÁTICO permanece constante

Composição do solvente
GRADIENTE é alterada
2 TIPOS DE BOMBAS

Seringa Recíprocas Pneumáticas

São bombas que escoam volumes Neste sistema de bombeamento o

Possuem um êmbolo ou pistão
constantes de forma não líquido é deslocado mediante a
que é deslocado de forma
contínua, isso é, pulsante. pressão exercida por um gás
contínua e uniforme por um
Funcionam mediante ao inerte a alta pressão. Pode ser
motor de precisão,
movimento de um pistão e feito de forma direta sobre o
comprimindo o líquido contido
através de um sistema de líquido ou sobre o recipiente
em uma câmara de volume
válvulas, que alternadamente se comprimível que o contém.
constante
abrem e fecham, enchendo e
esvaziando, de modo alternativo
uma pequena câmara.
 3 SISTEMA DE INJEÇÃO

A amostra, introduzida na válvula mediante

seringa, deve encher o espaço interno da porção LOAD
do tubo capilar de aço, a alça de amostragem.

A válvula se abre e a
INJECT Amostra injetada e
FM é empurrada para LOAD
a coluna. excesso descartado.

INJECT
4 COLUNA CROMATOGRÁFICA
Entrada

As colunas são constituídas de um pedaço de Pré-coluna

tubo de algum material inerte, de diâmetro
interno uniforme e capaz de resistir às pressões
usadas. Invólucro de Al
anodizado
Eficiência: determinada pelo seu Coluna principal
comprimento, diâmetro e material de recheio.

Comprimento: 5 - 30 cm

Suportes mais comuns: são as Diâmetro interno: 1 - 5 mm

Saída
partículas porosas, microporosas de
Partículas: 3 - 10 µm
sílica ou peliculares, altamente puras e
esféricas
5 SISTEMA DE DETECÇÃO

Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para a

cromatografia líquida de alta eficiência.

O detector a ser
empregado vai depender
da natureza da amostra.
 PARÂMETROS BÁSICOS DE DESEMPENHO

Características de um Detectores mais

detector ideal amplamente empregados

 Alta sensibilidade • Detectores baseados na

 Linearidade absorção da radiação
 Baixo limite de detecção ultravioleta ou visível
 Resposta rápida a todos os
solutos • Detectores refratométricos
 Insensibilidade a mudanças
na temperatura e na vazão da • Espectrometria de massas
fase móvel
 Resposta independente da
fase móvel
 DETECTORES BASEADOS NA ABSORÇÃO
5 DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA OU VISÍVEL

Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta:

Chamados de espectrofotômeros, são de aplicação mais

Comprimento variada e sensível, porém são mais caros. 
de onda
variável Comprimento  de  onda:  de 190-800 nm .

Chamados de fotômetros, funcionam com um ou dois

Comprimento comprimentos de onda fixos. É sensível, econômico e
de onda suficiente para conseguir bons resultados para os
fixo compostos que absorvem luz no comprimento de onda
em que ele funciona. 

Comprimento  de  onda:  de 254  nm a 280  nm.

 DETECTORES DE COMPRIMENTOS DE ONDA VARIÁVEIS

O comprimento de onda é selecionado através do monocromador do feixe de luz emitido e

PRINCÍPIO incide na cela por onde passam os componentes da amostra que absorve parte da luz. A
quantidade de luz não absorvida é detectada pela fotomultiplicadora.
 5 DETECTORES DE COMPRIMENTOS DE ONDA FIXOS

A radiação UV a 254nm, de uma lâmpada de mercúrio de baixa pressão, é transmitida através da cela da
PRINCÍPIO amostra. Esta radiação da fonte é dirigida também através de um divisor de feixe para a cela de referência
e ao atravessá-la atinge a célula fotoelétrica de referência. A diferença de corrente destas células
fotoelétricas alimenta um amplificador, que gera um sinal de saída, linear com a concentração do soluto,
para o registrador. 
 5 DETECTORES POR ÍNDICE DE FEFRAÇÃO

Este  detector  acompanha continuamente a diferença de índice de refração entre a fase móvel
PRINCÍPIO pura e  o efluente que sai  da  coluna  contendo   os  componentes  da  amostra. É  bem 
recomendado  para substâncias  que  muito   pouco  absorvem  no   UV  ou  visível  e  para 
amostras desconhecidas.

• A luz da fonte atravessa os seletores e um filtro de

infravermelho. Os seletores e a lente produzem dois
raios colimados que entram no prisma e incidem
sobre a interface vidro-líquido das celas de referência
e amostra, respectivamente. 

• A diferença de intensidade da luz transmitida está em

função dos índices de refração dos líquidos e é
determinada por meio de um fotodetector que gera um
sinal elétrico para ser transmitido para o registrador. 
 5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS

A espectrofotometria de massas pode ser definida como a análise da matéria através da

PRINCÍPIO formação de íons em fase gasosa e consequentemente caracterizados de acordo com sua
massa, carga, estrutura e propriedades físico-químicas.

• Após a eluição, os compostos são introduzidos

no espectrômetro de massas, ocorrendo a
ionização e evaporação do solvente.

• Formados os íons, estes seguem para o primeiro

analisador que são determinados segundo a
razão massa / carga (m/z).  

• Após a determinação m/z dos íons precursores,

estes são encaminhados para uma célula de
colisão, colidindo com o gás nitrogênio,
formando fragmentos que são determinados no
segundo analisador.
Análise de vitaminas solúveis em água, essa análise por Separação de contaminantes ambientais
cromatografia gasosa é muito difícil pois requer a formação de atmosféricos, sendo muitos policíclicos
derivados voláteis. Já utilizando a CLAE, a análise dos aromáticos. A sua determinação pode ser feita
compostos vitamínicos é possível em um curto intervalo de através da CLAE, porém se essa mesma análise
tempo.  fosse feita por CG, exigiria condições de altas
temperaturas. 
  
REFRÊNCIAS

Disponível em: https://monografias.ufrn.br/jspui/bitstream/123456789/9778/1/AN

%C3%81LISE%20DOS%20ADULTERANTES%20ENCONTRADOS%20EM
%20AMOSTRAS%20DE%20COCA%C3%8DNA%20APREENDIDAS%20NO
%20RIO%20GRANDE%20DO%20NORTE%20NO%20PER%C3%8DODO%20DE
%20JANEIRO%20A%20JUNHO%20DE%202019.pdf

SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª

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PARRIS, N. A. Instrumental Liquid Chromatography: A Pratical Manual, Elsevier, New
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