Tcnicas em Imunologia

Parte I Mtodos Laboratoriais em Imunologia

Prof.Doutor Jos Cabeda

Tcnicas de Imunologia

Tcnicas baseadas em imunoglobulinas

Ensaios Liqudos (ensaios homogneos)

Ensaios Slidos (ensaios heterogneos)

Difrao da luz Nefelometria turbidimetria Outros ensaios liquidos EMIT CEDIA Imunofluorescncia Aglutinao Quimioluminescncia

ELISA Competitivo No-competitivo indirecto RIA

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Tcnicas baseadas na difraco da luz

Nefelometria

Imunoturbidimetria

Baseada na reaco de imunoprecipitao Mede a quantidade de luz difractada devido presena de complexos imunolgicos O ngulo de difraco e o comprimento de onda so aspectos importantes 31 permite melhor razo sinal/rudo

Baseada na reaco de imunoprecipitao Mede a diminuio de luz que consegue atravessar uma soluo na presena de complexos imunolgicos O detector est sempre alinhado com a fonte de luz (0), pelo que a medida no da luz difractada, mas da no difractada

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Curva de imunoprecipitao

Assumindo: Ig pelo menos bivalentes IgG Antignio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reaco Se Antignio em excesso, um aumento de antignio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antignios, o que diminui a precipitao A quantificao s possvel se o anticorpo estiver em excesso
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Cintica da Curva de imunoprecipitao

A reaco inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s aps a adio do antignio A reaco prossegue de modo aproximadamente linear at que a precipitao dos complexos origina uma aparente diminuio da reaco

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Rate Nephelometry

[Ab] constante Aumento progressivo da [antignio] Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Em nefelmetros automticos deste tipo, 2 [antig] so inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: So testadas novas [] testada o excesso de antig

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End-point nephelometers

Medida no ponto mximo da reaco Medida de branco ou no inicio da reaco Valor interpolado de uma curva de calibrao Variaes Particle enhanced
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Particle enhanced nephelometry

So utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antignio competidor Aumento de sensibilidade

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Ensaios

Requisitos Qualquer fluido Soro Plasma Urina CSF Deve ser diludo (para no interferir na leitura) Amostras ricas em lipdios devem ser clarificadas por filtrao ou ultracentrifugao Amostras ictricas ou hemolisadas No afectam a nefelometria Afectam a turbidimetria
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Outro ensaios homogneos

CEDIA (Cloned enzyme donor assay) B-galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor Enzyme acceptor A reaco imune junta-os activando a enzima. Se no houver antignio o anticorpo liga-se enzima inactivando-a

EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuio da actividade enzimatica com a reaco Ag-Ab

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Imunofluorescncia

Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de deteco Vantagens relativamente RIA: To sensivel Reagentes mais estveis Mais fcil de implementar

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Principais fluorocromos utilizados

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Tcnicas de imunofluorescncia (I)

Directas Anticorpo directamente conjugado Indirectas Anticorpo secundrio conjugado Acopladas Duas reaces acopladas Fluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarizao da luz emitida quando um antignio-FITC forma complexos imunes, o que se deve s restries ao movimento rotacional do antignio no complexo
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Tcnicas de imunofluorescncia (II)

Fluorescent Quenching assay Mtodo competitivo directo que utiliza [ab] fixa Competio para o ab entre o antignio marcado e o no marcado (a testar) A fluorescncia absorvida (quenched) quando o antignio marcado se liga ao anticorpo A intensidade de fluorescncia uma medida da quantidade de antignio no marcado que competiu para o anticorpo Mtodo indirecto
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Tcnicas de imunofluorescncia (III)

Substrate labelled Fluorescent immunoassay Mtodo indirecto Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligao do Ab

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Tcnicas de imunofluorescncia (IV)

Fluorescent energy transfer immunoassay Mtodo competitivo Analito conjugado com FITC Anticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonncia a energia do FITC excita a rodamina Se por competio, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, no haver excitao da rodamina

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Problemas da imunofluorescncia

Autofluorescencia Proteinas do soro (320350nm) Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes desnaturantes

Quenching Bilirrubina Hemoglobina Fotodestruio Diminuio da fluorescncia ao longo da excitao

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Aglutinao

Baseada na reaco ag-ab Observada visualmente Tipos: Directa (ABO) IgM aglutina vrias RBC IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte Indirecta ou passiva Antignio ligado a subtncia inerte Reversa Anticorpo ligado a substncia inerte
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Aglutinao de partculas

Mais sensiveis que a aglutinao Mensurvel por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigneo conjugado com particulas de ltex Reaco ag-ab aglutina as particulas que saem de soluo A medida das partculas em soluo inversamente proporcional ao titulo a determinar
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Ensaio quimioluminescente

Produo de luz por uma reaco quimica, habitualmente uma reaco de oxidao-reduo O modo mais sensvel de deteco em imunoensaios (atomole=10-18 a zeptomole=10-21) Compostos utilizados: Esteres de acridina (deteco do NaOH e H O ) 2 2

Limite de deteco de 0.5 atomoles Derivados do isoluminol (deteco com H2O2 e um catalizador)

Limite de deteco de 50 atomoles

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Enzimas utilizadas em ensaios Quimioluminescentes

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Ensaios em fase slida

ELISA Competitivo

No competitivo-indirecto

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Ensaios em fase slida

ELISA Sandwich ou de captura

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Resolver problemas do ELISA

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Electroforese de Imunoglobulinas
Electroforese em agarose de alta resoluo Imunofixao Imunosubtraco Electroforese capilar

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Electroforese de Ig em agarose

Electroforese + Corar com Ponceau S e secar

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Imunofixao

Electroforese Aplicao de tira de acetato de celulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas no pp so lavadas Corar os pp com amido black nigrosin

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Imunosubtraco

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Crioglobulinas (I)

Tipo I Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Tipo II Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Tipo III Policlonal

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Crioglobulinas (II)

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