Estudos in vitro / ex vivo para a Predição

da Biodisponibilidade de Fármacos

Prof.ª Dr.ª Flávia Almada do Carmo

facarmo@pharma.ufrj.br
 Definições
• O que é biodisponibilidade?

– A biodisponibilidade relaciona-se à quantidade e à

velocidade de absorção do princípio ativo do
medicamento para a corrente sanguínea.
Da Administração ao Efeito Terapêutico
 Sistema de Classificação
Biofarmacêutica (SCB)

 Proposto Amidon e Colaboradores (1995)

 Consolidou nos últimos anos como uma ferramenta útil na predição da
biodisponibilidade.
 Sistema de Classificação
Biofarmacêutica (SCB)
Fundamenta-se no princípio de que o controle da
extensão e da velocidade de absorção de um fármaco,
administrado por via oral, depende basicamente...

Permeabilidade
Solubilidade do através das
fármaco membranas
biológicas
 Sistema de Classificação
Biofarmacêutica (SCB)
AMIDON et al., 1995

LOBENBERG & AMIDON, 2000

 Sistema de Classificação Biofarmacêutica
(SCB)

Determinação de solubilidade:

ANVISA:

• Deverão ser testadas, no mínimo, três condições de PH (1,2; 4,5 e 6,8) a 37 ± 1°C;
• Deverá ser utilizado método para estudos de solubilidade em equilíbrio (shake-flask ou
diagrama de fases).
 Sistema de Classificação Biofarmacêutica
(SCB)

Determinação de permeabilidade:

Considera-se um fármaco altamente permeável aquele cuja extensão da

absorção em humanos for igual ou superior a 90% (FDA) ou a 85% (EMEA).

Segundo os Guias FDA e EMEA:

 Estudos farmacocinéticos em humanos;

 Métodos de predição de permeabilidade.
 Sistema de Classificação Biofarmacêutica
(SCB)

Determinação de permeabilidade:

 Métodos de predição de permeabilidade:

 São métodos que não envolvem seres humanos;
 Prever a extensão da absorção e;
 Alternativa para determinação da permeabilidade de fármacos.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade

Modelos de absorção de fármacos

 in vivo: métodos de avaliação em animais;

 in vitro: baseados em sistemas celulares; os que empregam cultura de células Caco-2 e

seus Subclones; os que usam membranas artificiais imobilizadas (IAM) e os ensaios de
permeabilidade em membrana artificial paralela (PAMPA);

 in silico: utilização de simulação computacional;

 in vitro / ex vivo: métodos utilizando tecidos animais.

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vivo – in situ
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vivo – in situ
a) Estudos em animais;

Ratos Wistar

Coelhos
Perfusão in situ
Métodos de Predição da Biodisponibilidade
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vitro que empregam cultura celular

a) Células Caco-2 e seus subclones

• É uma linhagem imortalizada de células epiteliais humanas, originárias

de adenocarcinoma de cólon;

• É amplamente utilizada em ensaios in vitro, a fim de prever a taxa de

absorção de fármacos através da barreira intestinal.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vitro que empregam cultura celular
a) Células Caco-2 e seus subclones Papp (cm/s)

Fluoresceína

Metoprolol

15 - 30 dias

Volumes apical e basolateral

A  B ou B A

Citotoxicidade

Tempo de Ensaio
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vitro que empregam cultura celular
a) Monocamada de Células Caco-2

Cálculo:

Papp = dQ/dt/(A * 60 * C0)

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos in vitro que empregam cultura celular
a) Monocamada de Células Caco-2

• Modelo celular mais usado, devido a semelhanças morfológicas,

funcionais e bioquímicas com as células humanas.

Limitações do Modelo
 Expressão baixa de transportadores de membrana (PEPT 1 e 2);
 Presença de uma camada estacionária maior que a do intestino humano;
 Células mais justapostas;
 Aderencia física do fármaco nos filtros;
 Baixa permeabilidade a moléculas hidrofílicas;
 Elevado tempo de crescimento e diferenciação (~ 21 dias);
 Dano celular devido a presença de co-solventes no sistema.
 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Predição
da Biodisponibilidade
Métodos in silico
a) GastroPlusTM

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 Métodos de Determinação da
Permeabilidade

 Estudos in vitro / ex vivo

3Rs
Reduce
Refine
Replace
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade

 Estudos in vitro / ex vivo

3Rs
Reduce
Refine
Replace
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
 Estudos in vitro / ex vivo

Características Gerais
 Os modelos utilizando tecido animal para ensaios de permeabilidade intestinal são
usados desde 1950;

 Os modelos ex vivo trazem como vantagem sobre os métodos in vitro, o fato do

tecido animal ter semelhanças estruturais com o humano, dependendo da espécie
animal selecionada para o estudo;

 Os modelos permitem avaliar e caracterizar o mecanismos envolvidos na permeação

de fármacos por transporte transcelular passivo e ativo, bem como a cinética de
transporte.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos ex vivo
Tecidos animais mais utilizados:

 Fácil aquisição e baixo custo;

 Similaridades anatomofisiológica com os
tecidos humanos;
 Frequentemente utilizado para estudos de
transporte e metabolismo de fármacos;
 Dificuldade em obter tecidos viáveis ou que
se mantenham adequados durante os
ensaios, já que precisam de sangue e
oxigenação constantes.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos ex vivo
Tecidos animais mais utilizados:

 Similaridades anatomofisiológicas com o

intestino humano;
 Estudos de transporte de fármacos;
 Não se apresenta como bom modelo para a
predição da permeação transdérmica de
fármacos;
 Baixo custo;
 Questão ética.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos ex vivo
Tecidos animais mais utilizados:

 Questões éticas em relação ao uso de animais;

 Apresenta-se como bom modelo para predição
da extensão da absorção de fármaco de uso
oral;
 Não se apresenta como bom modelo para a
predição da permeação transdérmica de
fármacos.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Métodos ex vivo
Tecidos humanos:

 Questões éticas envolvidas;

 Origem: cadáveres; tecidos provenientes de

cirurgias bariátricas / abdominoplastia.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção e Validação da Metodologia de Análise

– Determinação do Limite de Quantificação (LQ)

LQ = DPa x 10
IC

– em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo
concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação; IC é a inclinação da curva de calibração.
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção de Meios Receptores - Biorelevantes

– Avaliar a solubilidade do ativo em diferentes meios:

• Salina (NaCl 0,9%)

• PBS (pH = 7,4)

– Acrescentar promotores de solubilidade: ciclodextrinas ou tensoativos

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção dos Tecidos - Via de Administração

– Oral: intestino humano, rato, porco e coelho.

– Tópico ou transdérmico: pele de porco, humana ou artificial (L’Oreal ou Millipore).

– Bucal: bochecha de porco ou humana.

– Ocular: olho de porco ou humano.

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Preparo dos Tecidos - Permeação
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Preparo dos Tecidos - Permeação

Groeber et al., 2011

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Preparo dos Tecidos - Permeação

Groeber et al., 2011

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Preparo dos Tecidos - Permeação

Groeber et al., 2011

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Preparo dos Tecidos - Liberação

– Membrana de Acetato de Celulose

• Ferver três vezes, durante 2 min., em água destilada.

Precede qualquer experimento de permeação!

Se não libera, não há permeação!!!!
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato

Célula de Difusão Vertical do Tipo Franz

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato
 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato

• Seleção da Célula de Franz:

– Oficial (Hanson®): A= 1,767 cm2; V≈ 0,3 mL

– Adaptada: A= 1,131 cm2; V≈ 1,0 mL

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato

Célula de Perfusão/Permeação Intestinal

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato

Célula de Perfusão/Permeação Intestinal

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Seleção do Aparato

a) Ensaios com tecido invertido

b) Ensaios com tecido não invertido

 Métodos de Determinação da
Permeabilidade
Metodologia para ensaio de permeação in vitro / ex vivo
Resultados

Pupe et al., 2013

CIVIV
 Outras Aplicabilidades
Métodos in vitro / ex vivo
Metodologia para verificação de potencial corrosivo

Perkins et al., 1996

 Outras Aplicabilidades
Métodos in vitro / ex vivo
Metodologia para verificação de potencial corrosivo

Perkins et al., 1996

 Outras Aplicabilidades
Métodos in vitro / ex vivo
Metodologia para verificação de eficácia

Groeber et al., 2011

 Outras Aplicabilidades
Métodos in vitro / ex vivo
Metodologia para verificação de eficácia

Groeber et al., 2011

 Contato:

facarmo@pharma.ufrj.br

Profa. Dra. Flávia Almada do Carmo

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Laboratório de Tecnologia Industrial Farmacêutica (LabTIF)
Avenida Carlos Chagas Filho, 373, CCS, Bloco L, subsolo.
Cidade Universitária - RJ, CEP21.941-902