PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TEC. FARMACÊUTICA

FACULDADE DE FARMÁCIA - UFRJ

Ensaios de
Liberação

Prof. Dr. Luiz Cláudio Pereira da Silva

luizclaudio@pharma.ufrj.br
Liberação a partir de sistemas particulados

Matriz de liberação, geralmente controla e retarda a disponibilidade

do fármaco no alvo.

Tempo de circulação prolongado para liberação progressiva e

estendida.

Forte retenção até o momento do estímulo da liberação. Interação

entre a matriz carreadora e o fármaco pode ser medida.
Liberação a partir de sistemas particulados
Liberação a partir de sistemas particulados

Atualmente, “formulações particuladas” clássicas necessitam de

avaliação de liberação/dissolução, sendo a cinética de liberação um
fator determinante para comparação e controle de qualidade.

Nanoformulações não possuem padrão ouro estabelecido como no

caso de formulações macroparticuladas.

Grande variedade de metodologias aplicadas na literatura para micro

e nanopartículas.
Mecanismos de Liberação

Os sistemas de carreamento devem ser concebidos para a liberação

do ativo de forma programada em local específico, em taxa
controlada e/ou em reposta à estímulos (“gatilhos”) do ambiente em
que se encontra.

O “gatilho” pode ser endógeno e estar presente em mais de um local

diferente no organismo.
Mecanismos de Liberação

Gatilhos endógenos podem ser: variações no pH, presença de

enzimas (hidrolases, lactamases, glicosidases, etc.)

Estímulos exógenos representam alternativas às circunstâncias que

impeçam a utilização de estímulos endógenos por algum motivo.

São exemplos de gatilhos exógenos: magnetismo (RMN), ultrassom,

infravermelho, temperatura
Mecanismos de Liberação

Os sistemas de carreamento podem apresentar diferentes cinéticas e

mecanismos de liberação.

O mecanismo de saída do ativo a partir do sistema de carreamento depende de

diferentes aspectos.

Modelos matemáticos e curvas de liberação são utilizados para descrever os

mecanismos plausíveis.

Mecanismos de liberação são ordenados em:

• Difusão
• Intumescimento/”Swelling”
• Fragmentação
• Erosão/Dissolução
Mecanismos de Liberação
Difusão

O agente ativo é liberado através de difusão molecular, atravessando a barreira

imposta pelo sistema particulado (Baker 1987).

A matriz da partícula deve manter-se íntegra em sua maior parte durante a difusão,
podendo modificar sua estrutura por conta de intumescimento,
encolhimento/retração de tamanho, erosão ou fragmentação.
Difusão
A taxa de liberação do ativo depende de diversos fatores:

- Peso molecular (ativo).

- Polaridade (ativo e matriz particulada).

- Reologia (matriz particulada).

- Interações de superfície (matriz particulada).

- Estado físico da partícula.

- Tamanho, carga, formato e estrutura do sistema particulado.

- Gradiente de concentração de solutos entre interior da partiíula e meio externo.

- Condições meio de liberação.

Dissolução
O ativo é liberado da partícula como resultado do processo de dissolução do
sistema de carreamento, quando este encontra um ambiente específico (Baker
1987).

O ativo é liberado conforme a dissolução da partícula ocorra e conforme se dê

sua inserção no sistema particulado (posicionamento e distribuição).

A taxa de liberação é governada pela taxa de dissolução da matriz particulada,

o que depende da composição e estrutura desta, assim como a magnitude e
duração do fator responsável pela dissolução (diluição, tipo de solvente, pH,
força iônica do meio, temperatura, enzimas, etc).

A dissolução é vista como um processo que inicia-se da superfície e invade o

sistema particulado.
Erosão
O ativo é liberado como resultado da erosão do sistema quando este encontra
condições específicas (Baker 1987).

Degradação química das moléculas da matriz particulada.

Erosão do bulk (toda a partícula)

Erosão de superfície (parte externa)

Estímulos:
Temperatura elevada
Solvente (ácidos e bases fortes)
Ação enzimática (amilases, lipases, proteases, p ex.)

Liberação dependente da taxa de erosão (assim como a dissolução), extensão da

erosão (bulk vs. superfície).
Fragmentação
Ativo é liberado após fragmentação da partícula devido à possíveis ações químicas,
físicas ou enzimáticas.

Taxa de liberação depende da velocidade de formação dos fragmentos e

propriedades (tamanho e formato) de fragmentos, devido ao tipo de estresse
submetido.

Dissolução, Erosão e Difusão complementam o processo.

Aumento de área superficial acelera o processo global.

Intumescimento/”Swelling”
Ativo é liberado após a absorção de moléculas do solvente pela partícula.

Formação/aumento de poros  movimentação do material incorporado.

Peso molecular vs Diâmetro do poro

Dependente de taxa de intumescimento, percurso do ativo através dos poros da

matriz particulada.
Intumescimento/”Swelling”
Design de Perfis de Liberação

Aplicação de acordo com a finalidade do sistema

Burst, Delayed, Triggered e Targeted

Perfil de liberação é desenhado em função:

• Concentração do ativo
• Local do ação
• Tempo de ação
Design de Perfis de Liberação
Design de Perfis de Liberação

Parâmetros numéricos derivados de curvas de liberação:

Área sob a curva (AUC),
Concentração máxima de liberação (Cmax),
Quantidade máxima liberada (Qmax)
Tempo para atingir o pico de liberação (tQmax)
Tempo para atingir a concentração máxima de liberação (tCmax).
Design de Perfis de Liberação
Design de Perfis de Liberação

A taxa de liberação depende fatores relacionados à microestrutura

do sistema de carreamento (tamanho, forma, carga, taxa de
degradação, etc) mas também de fatores relacionados aos
componentes do teste in vitro (agitação, temperatura, adição de co-
solvente, etc).
Design de Perfis de Liberação
Retenção

Eficiência de retenção (RE) – percentual do ativo inicialmente

presente dentro das partículas e que permanece dentro após períodos
pré-estabelecidos de armazenamento ou tratamento
Características de Retenção
RE = 100 × mA,t/mA,0.

mA,t = massa de ativo encapsulado no interior das partículas em

tempo t
mA,0 = massa de ativo encapsulado no interior das partículas em
tempo zero

RE pode variar entre 0% (liberação total) to 100% (retenção total)

dependendo do tipo de sistema.

Idealmente um sistema coloidal de liberação deve possuir alto LC,

alto EE e alto RE (armazenamento) e baixo RE (tratamento).
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro

Em controle de qualidade, definir a relação entre liberação de

fármacos e a performance terapêutica justifica o uso de testes
in vitro de liberação/dissolução.

Um teste robusto, tempos curtos de análise e capacidade

discriminativa de qualidade são desejáveis
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro

Durante o desenvolvimento formulativo a predição do

comportamento in vivo é uma característica desejada aos
ensaios de liberação in vitro.

O uso de meios fisiológicos é recomendado pela EMA e

FDA em regulamentação específica para lipossomas.
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Drug Product Specification You should
provide a drug product specification
that accounts for specific attributes for
your liposome products. The following
are examples of characteristics or
attributes specific to the liposome
formulation that should be included in
the specification:
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
a. Physicochemical parameters of the liposome determined to be the CQAs of the product
(e.g., mean particle size and size distribution of liposomes, osmolality, zeta-potential and
physical stability)
b. Liposome contained and free drug substance
c. Total drug substance content, as labeled
d. Degradation products related to the lipids (e.g., lysolipids) or drug substance
e. Lipid content (to demonstrate consistency with the intended formulation)
f. Residual solvent(s), if any organic solvent(s) are used in the manufacture of the
liposome product. The residual solvents acceptance criteria should be based on the
performance of the liposome drug product as well as safety concerns.
g. In vitro release of drug substance from the liposome drug products
h. For injectable liposome drug products, sterility and the absence of pyrogens or bacterial
endotoxins
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
A validated analytical procedure for in vitro release should be established,
preferably using an appropriate physiological medium (e.g., simulated physiological
medium or human plasma) with suitable agitation. osome drug product is
extremely stable under physiological conditions, an in vitro quality control (QC)
release test can be performed under nonphysiological conditions to accelerate the
release of drug substance from the liposomes. For all drug products, information
about any relationship or correlation between the in vitro quality control release
test and the in vivo pharmacokinetic profile should be provided to justify the use
of such a QC test, as established through analytical method development studies. In
some cases, a test using cell culture or animal models may be appropriate.
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro

Tipo de liberação e delivery (suatained, triggered, targeted, non-

targeted, etc)

Técnicas acessórias (diálise, filtração, centrifugação, etc)

Ferramenta analítica – método destrutivo x não-destrutivo

Tamanho de partícula e/ou microscopia x Liberação (dissolução,

erosão, fragmentação, intumescimento
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro

Meio de liberação – simulação de fluidos biológicos ou não

Marcação (fluorescência, radioatividade)

Cálculos e plotagem de dados

Modelos matemáticos de cinética de liberação

Formulações sensíveis ao estresse mecânico/hidrodinâmico

Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro

A diversidade de sistemas é refletida pelos testes de

liberação/dissolução empregados na literatura.

Condições sink ou não.

Uso de solubilizantes (SDS, polissorbato 80 e

ciclodextrinas).

Drug targeting – avaliação mais cautelosa

Determinação de porosidade do aparato de separação

Ultracentrifugação preparativa

Impossibilidade de separação de lipossomas com diâmetros

inferiores a 100 nm por esta técnica. (Wallace et al., 2012).

Efeitos similares são observados para nanopartículas poliméricas

de baixa densidade (Beyer et al., 2015)

Centrifugação pode levar a estresse mecânico ao Sistema,

provocando liberação forçada

Relatos de centrifugação a 200.00 x g durante 10 a 20 horas para

separação efetiva de lipossomas unilamelares.
Ultracentrifugação preparativa

Ultracentrifugation of colistin liposomes at 300,000 g, a relatively

high centrifugal force, yielded a supernatant that scattered light at
~37,000 kcps. According to the calibration plot in Figure 2 this
corresponded to approximately 0.06% DOPC, or 1.13% of the total
liposomes in the formulation, remaining in the supernatant.
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Métodos com uso de membranas de filtração
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Métodos com uso de membranas de filtração
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Métodos com uso de membranas de filtração
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Métodos com uso de membranas de filtração
Estabelecimento de modelo de
liberação/retenção in vitro
Métodos com uso de membranas de filtração

Ruptura da membrana por ação mecânica ou química

Entupimento de membranas

Utilizações múltiplas
Ultrafiltração centrífuga
Ultrafiltração centrífuga

Força gravitacional menor do que a ultracentrifugação clássica.

Separação em tempo real

Tempo de centrifugação reduzido

Concentração do material coloidal  Entupimento de

membranas

Menor risco à integridade do sistema carreador

Ultrafiltração centrífuga

Volumes de separação muito

pequenos

Formulações sensíveis

Lavagens sucessivas para realizar

testes de liberação
Células de ultrafiltração por pressão
Células de ultrafiltração por pressão

Versátil

Custo de membranas

Manutenção das condições sink

Agitador próprio do sistema

Minimiza entupimento
Membrana de Diálise
Membrana de Diálise
Membrana de Diálise

Xie, L., Beyer, S., Vogel, V., Wacker, M.G., Mantele, W., 2015. Assessing the Drug release from
nanoparticles: Overcoming the shortcomings of dialysis by using novel optical techniques and a
mathematical model. Int J Pharm 488, 108-119.
Membrana de Diálise
Side-by-side diffusion cell
Franz cell
Considerações sobre técnicas de separação

Adsorção de fármacos:

Membranas de filtros

Plástico

Vidro

Membranas de diálise
Considerações sobre técnicas de separação

Adsorção de fármacos:

Membranas de filtros
Considerações sobre técnicas de separação

Adsorção de fármacos:

Membranas de filtros
“In vitro, it is obvious that the three preparations of nanoparticles prolong the
release of nifedipine when compared with nifedipine dissolved in PEG (Figure
1).”

“The main problem with the dialysis bag technique is that it is not a rapid sink
method (Washington, 1989; 1990). A more elegant method to study the release
of drugs from colloidal carriers is the centrifugal-ultrafilltration technique.
With such a technique nifedipine-PEG gave a much faster release time than with
the dialysis method (10 min for release of 80% of nifedipine versus about 3 h for
the same percentage release with dialysis). Furthermore besides adsorption of
nifedipine onto fillter membranes, nanoparticles suspensions clogged the
fillters, invalidating this technique in our case.”
 Considerações sobre técnicas de separação

Adsorção de fármacos:

Membranas de filtros
“Albeit, it should be borne in mind that the objective of our in vitro study was
simply to show differences between a `fast release' dosage form (PEG) and the
nanoparticles formulations. Thus when the dialysis method was used, the time
resolution for PEG was much longer than could be expected in vivo, yet the dialysis
technique allows one to demonstrate clearly a major difference between fast and
slow release dosage forms. The general pattern of the release in vitro was
confirmed in vivo since the antihypertensive effect of the nifedipine/PEG solution
was of short duration, lasting less than 7 h.”
 Considerações sobre técnicas de separação

Adsorção de fármacos (plásticos e vidro):

Tominaga Fukazawa, Yuri Yamazaki, Yohei Miyamoto. Reduction of non-specific adsorption of drugs to
plastic containers used in bioassays or analyses. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 61
(2010) 329–333
Plot de perfil de liberação

t (h) massa falcon após massa alíquota massa total no falcon [ ] (mg/mL) % Liberado
retirada da alíquota (ug) massa na alíquota(ug) cumulativa (ug) liberada cumulativa (ug)
0 0,310976994 0,012957375 0,012957375 0,323934369 0,00863825 24,91802838
1 0,762385161 0,031766048 0,044723423 0,355700417 0,021177366 27,36157056
2 1,031490914 0,042978788 0,087702211 0,398679205 0,028652525 30,66763118
3 1,146438553 0,047768273 0,135470484 0,446447478 0,031845515 34,34211372
4 1,250082799 0,052086783 0,187557268 0,498534262 0,034724522 38,34878936
5 1,190710327 0,04961293 0,237170198 0,548147192 0,033075287 42,16516861
24 1,820970584 0,075873774 0,313043972 0,624020966 0,050582516 48,00161279
48 1,718425698 0,071601071 0,384645043 0,695622037 0,047734047 53,50938747
120 2,12393164 0,088497152 0,473142195 0,784119189 0,058998101 60,31686067
144 1,829301637 0,076220902 0,549363096 0,86034009 0,050813934 66,18000694
168 1,789691074 0,074570461 0,623933558 0,934910552 0,049713641 71,91619628
192 1,840835171 0,076701465 0,700635023 1,011612017 0,05113431 77,81630901
288 1,517069497 0,063211229 0,763846252 1,074823246 0,042140819 82,67871124
336 1,644704909 0,068529371 0,832375623 1,143352617 0,045686247 87,95020134
384 1,410320137 0,058763339 0,891138962 1,202115956 0,039175559 92,47045819
456 1,269529593 0,052897066 0,944036029 1,255013023 0,035264711 96,53946329
504 1,175344084 0,04897267 0,993008699 1,303985693 0,032648447 100,3065918
Plot de perfil de liberação

120

100

80
2c release (%)

60

40

20

0
0 100 200 300 400 500 600
Time (h)
Ferramentas analíticas

Análises destrutivas x análises não-destrutivas

Extração de ativo a partir do carreador

Fluorescência, infravermelho, UV – não-destrutivas  monitoramento químico

por medidas de onda.

Secagem, centrifugação, filtração, diálise ou extração por solvente.

Quantidade de amostra disponível.

Produtos de degradação!
Bibliografia recomendada