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FACULDADE CINCIAS FARMACUTICAS UNIVERSIDADE DE SO PAULO

APOSTILA DE MICOLOGIA CLNICA

PROF. DR. SANDRO ROGERIO DE ALMEIDA

INTRODUO Durante muitos anos a Micologia teve pouca expresso na rea mdica, possivelmente pela falta de diagnstico adequado. Ultimamente, o nmero de pacientes suscetveis aos mais variados tipos de infeces tem aumentado significantemente. Com esse crescimento, as infeces fngicas vm se tornando mais freqentes. Com o aparecimento da antibioticoterapia, utilizao de mtodos imunossupressores, surgimento da AIDS e melhora nos mtodos

diagnsticos observamos aumento no nmero de casos de infeces fngicas. O diagnstico de uma infeco fngica tem por base a combinao de dados clnicos e laboratoriais. O processo laboratorial inclui: demonstrao do fungo no material examinado por microscopia e cultura, deteco de anticorpos especficos e deteco de antgenos e metablitos liberados pelo fungo nos lquidos corpreos ou tecidos. Tendo em vista a importncia do diagnstico micolgico, a disciplina objetiva desenvolver no aluno a capacidade de identificao de fungos filamentosos e leveduriformes assim como introduzir os principais aspectos da Micologia Mdica. Portanto, torna-se imprescindvel o bom

conhecimento das principais estruturas fngicas e das tcnicas utilizadas em sua identificao. As micoses podem ser divididas em: Superficiais: Pitirase versicolor Piedra branca Piedra negra Cutneas: Dermatofitoses Candidase Subcutneas: Cromomicose, Esporotricose Micetoma (eumicetoma e actinomicetoma) Zigomicose Rinosporidiose Doena de Jorge Lobo Feo-hifomicose Hialo-hifomicose

Sistmicas: Paracoccidioidomicose Histoplasmose Oportunistas: Criptococose Aspergilose

PARTE I

MICOSES SUPERFICIAIS Micoses que desenvolvem alteraes apenas na camada mais superficial do estrato crneo e no induz, na maioria das vezes, qualquer resposta inflamatria no hospedeiro. Principais Doenas e agentes etiolgicos: Pitirase versicolor Malassezia furfur Piedra negra Piedraia hortae Piedra branca Trichosporon beiguele - Pitirase versicolor: Infeco geralmente assintomtica, mas, em raras ocasies, pode ser relatado pelo paciente um discreto prurido. Apresenta-se como manchas hipo ou hiperpigmentada, descamativas geralmente no trax, pescoo e braos em adultos jovens, sem distino de sexo. Os principais fatores endgenos para o aparecimento das leses so: Pele gordurosa, elevada sudorese, fatores hereditrios e uso de terapia imunossupressora. Ag. Etiolgico: Malassezia furfur Diagnstico: Raspado de pele clareado com KOH. Escamas de Pele com Malassezia Furfur Coradas pelo P.A.S: Leveduras arredondadas, formando aglomerados em forma de cachos de uva ou mosaico; hifas curtas e grossas, em forma de Y ou L, de cor vermelha. Isolamento: Para isolamento primrio de fungo de material clnico, com suspeita de petirase versicolor, devemos utilizar um meio especialmente preparado para o isolamento dessas leveduras, visto que so lipodependente.

- Piedra Negra Micose que se caracteriza clinicamente pelo aparecimento, nos cabelos e raramente em outros plos do corpo humano, de ndulos endurecidos e de colorao escura. Doena benigna, baixo contgio, carter crnico, freqentemente recidivante que afeta ambos os sexos. Ag. Etiolgico: Piedraia hortae Diagnstico: Piedraia hortae Em plo: Produz a piedra negra. Nmero varivel de ndulos duros, escuros (marrons e negros), localizados ao longo do plo. Microscopicamente observam-se hifas, formando um pseudo-tecido (ou pseudoparnquima), devido a justaposio das mesmas. O aspecto de mosaico, com reas mais claras, onde se localizam os ascos contendo ascosporos, s visveis aps esmagamento e clareamento com KOH. - Piedra Branca: Ndulos fracamente aderidos aos cabelos ou plos de cor brancaamarelado. Doena de distribuio geogrfica com predileo por climas tropicais e temperados, de carter assintomtico, benigno e de baixo contgio, que acomete indistintamente cabelos e plos das regies axilares, pubianos, perianal, barba e bigode. Agente etiolgico: Trichosporon beigelli Diagnstico: Trichosporon beigelii Em plo: Produz a piedra branca, geralmente localizada na extremidade do pelo. A superfcie homognea, devido massa de leveduras. A cor varia de branco a amarelo.

MICOSES CUTNEAS Dermatofitose Candidase Dermatfitos: Pertencem ao grupo dos fungos denominados de dermatfitos os fungos filamentosos, hialinos, septados, algumas vezes artroconidiados, queratinoflicos, passveis de colonizar e causar leses clnicas em plos e/ou extrato crneo de homens e animais. So divididos em trs gneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Em relao ao seu habitat podem ser divididos em geoflicos- vivem em solos, zooflicos vivem em animais e antropoflicos vivem no homem. Os aspectos clnicos das leses dermatofticas so bastante variados e resultam da combinao de destruio da queratina associada a uma resposta inflamatria, mais ou menos intensa, na dependncia do binmio parasito/hospedeiro. Na classificao clnica das dermatofitoses so utilizadas as denominaes Tinea seguidas do stio anatmico das leses, exemplo: Tinea capitis (couro cabeludo). Descrio das principais dermatofitoses e seus agentes mais frequentes: Tinea pedis (tinha do p): T. rubrum, T. mentagrophytes, E.floccosum Tinea ungueum (tinha da unha, onicomicose) : T. rubrum, T. mentagrophytes Tinea corporis, Tinea circinada (tinha de pele glaba): T. rubrum, T. mentagrophytes, M. canis Tinea barbae (tinha da barba): T. verrucosum, M. canis, T. violaceum Tinea cruris (tinha da regio inguino-crural): T. rubrum, E. floccosum Tinea fvica (tinha alopeciante): T. schoenleinni Tinea capitis (tinha do couro cabeludo): endotrix: T. mentagrophytes, T. violaceum, T. tonsurans ectotrix: M. canis, M. gypseum Obs.: endotrix: parasitismo no interior dos plos ectotrix: parasitismo fora do plo

Descrevemos as principais caractersticas diferenciais dos gneros e espcies mais comuns encontradas parasitando o homem: Gnero Trichophyton; Gnero mais freqentemente isolado de material clnico, acometendo tanto a pele glaba como os cabelos e unhas. T. rubrum; Espcie antropoflica cosmopolita. Sua transmisso exclusivamente inter-humana ou por fmites contaminados. Crescimento em 12-16 dias em agar Sabouraud. Colnias com textura algodonosa, apresentam tonalidade branca que, com o passar do tempo, pode tornar-se avermelhada e reverso avermelhado. Apresenta grande quantidade de microcondeos, regulares e piriformess. Os macroconideos, quando presentes, podem apresentar-se como clavas alongadas, quase com um aspecto cilndrico e com duas a nove septaes. T. rubrum

T.tonsurans: Parasita antropoflico. Apresentam crescimento intermedirio, com maturao 12-16 dias aps semeadura primria, colnias bastante variveis que pode variar do algodonoso ao veludoso. Verso com colorao branco e reverso apresenta tons variados de castanho-avermelhado. Apresenta numerosos microcondeos dispostos em acldio e de formas variadas.

T. tonsurans

T. mentagrophytes:

Pode apresentar variedades : T. mentagrophytes var. mentagrophytes espcie zooflica em agar Sabourad apresenta textura pulverulenta de colorao que pode variar do branco-amarelado ao castanho-avermelhado reverso avermelhado e T. mentagrophytes var. interdigitale espcie antropoflica colnia veludosa ao algodonosa, de colorao brancoamarelado, reverso acastanhado ou avermelhado. A diferenciao das variedades no evidente. Microscopicamente, as colnias apresentam grande quantidade de microcondeos arredondados e agrupados, o que lhes confere o aspecto em cacho. Os macrocondeos, quando presentes, mostram um aspecto semelhante a um charuto, som um a seis septos transversais. Com freqncia observam-se estruturas de ornamentao, tais com hifas em espiral.

T. mentagrophytes

T. verrucosum: Trata-se de um fungo cosmopolita que parasita principalmente bovinos, podendo esporadicamente causar leses em humanos. Clinicamente pode causar leses bastante inflamatrias do couro cabeludo, pele glaba, barba e bigode. Crescimento lento que varia de 13-25 dias. Macroscopicamente, a colnia caracteriza-se por uma textura veludoso, pigmentao do verso que varia do branco ao amarelo ocre. O reverso apresenta-se em de amarelo com pigmento no difusvel pelo meio. A microscopia ptica, de material proveniente de Agar Sabouraud no apresenta microcondeos nem macrocondeos. O que chama a ateno e a quantidade de cadeias formadas por clamidoconideos grandes. T. verrucosum

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T. schoenleinii: Crescimento lento que varia de 14 a 30 dias. Colnias com textura veludosa e pigmentao que varia do bege ao castanho escuro. O reverso segue o mesmo tom do verso no se observa pigmento difusvel no meio. Na microscopia geralmente no so observados macrocondeos nem microconseos; entretanto, vem-se numerosas hifas septadas e em bifurcao, associadas a hifas em forma de candelabro e a hifas em forma de cabea de prego.

T. schoenleinii

Gnero Microsporum: M.canis: um dermatfito zooflico transmitido ao homem por diversos animais domsticos principalmente felinos jovens. Clinicamente, responsvel por leses do couro cabeludo, caracterizada por grandes placas de alopcia, principalmente em crianas. Crescimento rpido de 6-10 dias. Textura algodonosa de tonalidade branca. O reverso apresenta-se de colorao amarelo-limo. A microscopia direta da colnia mostra na maioria das vezes grande quantidade de macrocondeos fusiformes verrucosos, de paredes grossas e com numerosas septaes, que variam

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de 5 a 7. Os microcondeos sem em quantidade variadas e sem nenhum valor diagnstico. M.canis

M. gypseum: Espcie geoflica, que infecta o homem atravs do contato com o solo contaminado. Colnia de crescimento rpido 3-5 dias. Macroscopicamente a colnia possui textura pulverulenta com pigmentao amarelo-acastanhado. O reverso pode apresentar variaes de cores que vo do alaranjado ao marrom. Microscopicamente apresentam macrocondeos simtricos, com 3-7 septos de paredes finas, extremidade arredondada e superfcie levemente rugosa.

M. gypseum

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Gnero Epidermophyton; E. floccosum: Dermatfito antropoflico. Crescimento rpido 7-10 dias. Macroscopicamente essas colnias apresentam textura algodonosa. A colorao dos bordos e do verso amarelo-esverdeada. O reverso da colnia tende a acompanhar a colorao do verso. Pigmento difusvel no meio. Microscopicamente, caracteriza-se pela presena de macrocondeos de parede fina, com 2 a 5 septos e agrupados em cachos.

E. floccosum

-Candidases: Nome de conotao genrica para denominar doenas causadas por Cndida albicans e outras espcies. O habitat da Candida bastante amplo, no homem essa levedura habita a mucosa digestiva e por contigidade a mucosa vaginal. A infeco pode atingir mucosas, tecido cutneo e em alguns casos pode ser sistmica. As manifestaes clnicas apresentam grande diversidade de quadros, podendo ser divididas em trs grandes grupos: Candidase cutneo-mucosa, Candidase sistmica e candidase alrgica. As principais espcies patognicas so: C. albicans C. tropicalis

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C. pseudotropicalis C. guilliermondi C. parapsilosis C. krusei

MICOSES SUBUTNEAS Micoses subcutneas so infeces causadas por um grupo diversificados de fungos que ataca o homem e os animais . As leses aparecem inicialmente a partir de um ponto de inoculao de estruturas fngicas, atravs de traumatismos diversos. Podem permanecer localizados ou se espalhar pelos tecidos adjacentes, por via linftica ou hematognica. As maiorias dos fungos envolvidas so saprbios habituais do solo e vegetais em decomposio. As principais micoses subcutneas so; Cromoblastomicose, esporotricose, micetoma (eumicetoma e actinomicetoma), zigomicose, rinosporidiose, doena de Jorge Lobo, feo-hifomicose e hialo-hifomicose.

Cromoblastomicose: Infeco crnica, granulomatosa, caracterizada por leses nodulares, verrucosas, papilomatosas, por vezes ulceradas, localizadas, preferencialmente nos membros inferiores, tendo como agente etiolgico fungos de colorao escura (demaciceos), distribudos por diversas espcies. Os principais so: Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Phialophora verrucosa, Clodophialophora carrionii e Rhinocladiella aquaspersa. A principal via de contgio se faz atravs de soluo de continuidade produzida na pele por fragmentos de vegetais ou madeira contaminados. Diagnstico: Exame direto: Material proveniente das leses (escamas, crostas ou pus) ou pequeno fragmento de bipsias clarificado com KOH. Observam-se

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clulas arredondadas de contornos bem ntidos, acastanhados, algumas se mostrando em processo de reproduo binria (clulas esclerticas).

Cultura: Em gar Sabouraud crescimento em torno de 7 a 15 dias de colnias escuras. O aspecto microscpico da cultura no o mesmo em todos os casos, sofrendo variaes na morfologia, fato que leva a identificao das espcies.

Esporotricose: A esporotricose uma infeco de evoluo sub-aguda ou crnica, caracterizada por pequenos tumores subcutneos (gomas), que tendem supurao e ulcerao. O agente etiolgico o Sporothrix schenckii, fungo dimrfico, que se introduz nos tecidos orgnicos atravs de traumatismo ou, raramente, por inalao. Esse fungo encontrado em vida saproftica em vegetais, solo, guas contaminadas e animais. A forma clnica mais freqente da micose a linfangite nodular ascendente, que se inicia pela inoculao do agente, geralmente nas extremidades (cancro de inoculao), atingindo os glnglios linfticos. Diagnstico:

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Exame direto: A fresco no revela nenhuma forma conclusiva do S. schenckii. Esfregaos de pus corados pelo Gram, PAS ou Gomori, raramente permitem a visualizao do fungo. As clulas fngicas observadas nas leses so raras, e quando presentes so vistas pequenas leveduras com ou sem brotamento em forma de navete, ou sob a forma de corpo asteride. Cultura: Macromorfologia: Culturas de crescimento rpido (4 dias). Apresentam dimorfismo trmico. A 25-30 C, colnias inicialmente lisas e brancas, que se tornam midas, enrugadas ou aveludadas, e, com frequncia, escurecem apresentando colorao marrom ou preta. Alguns isolados so inicialmente escuros. A 35- 37C colnias de cor creme ou bronzeada, lisas, macias e leveduriformes. Micromorfologia: 25-30C - Hifas septadas, delgadas, conidiforo verticilado, sessil ou pedunculado, com condios alongados, afilados nas duas extremidades, pequenos e unicelulares. Fracamente ligados s hifas, tendo uma disposio com aspecto de margarida.

Micetomas: Definio: Micetoma uma sndrome clnica, de evoluo crnica, caracterizada pelo aumento de volume de uma regio ou rgo, com a presena ou no de fstulas que drenam um material seroso ou seropurulento no qual podem ser encontrados gros. A trade de tumefao, fstulas que drenam e a presena de gros usada no sentido restrito para definir o termo micetoma. O Gro um aglomerado de microrganismos.

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O micetoma pode ser provocado tanto por bactrias como por fungo verdadeiro. Os micetomas so classificados em dois grupos: actinomicticos ou actinomicose e maduromicticos ou maduromicose. O primeiro grupo, mais numeroso, esto os micetomas produzidos por bactrias, os actinomicetos. No segundo esto os micetomas provocados por fungos verdadeiros, ou eumicetos. Ainda os micetomas actinomicticos (de origem bacteriana) podem ser divididos em dois grupos, segundo a origem endgena ou exgena do agente: - Actinomicose, de origem endgena, provocada por actinomicetos anaerbicos, sendo os mais freqentes o Actinomyces israelli, e Arachnia propionica. - Nocardiose, de origem exgena, provocada por actinomicetos aerbios, sendo os mais freqentes a Nocardia asterides, N. brasiliensis e vrias espcies do gnero Streptomyces, principalmente o S. somaliensis. Os micetomas maduromicticos, causados pelos eumicetos so provocados principalmente pelo Madurella grisea, M. mycetomatis e Pyrenochaeta romeroi. Diagnstico: O diagnstico laboratorial dos micetomas baseado na observao dos gros, que drenam espontaneamente das leses, ou que so extrados atravs de puno ou biopsia. Gro de actinomiceto Em corte de tecido: O gro aparece no meio de uma rea com grande infiltrao linfocitria, sem forma regular e sem estrutura interna bem definida. constitudo de massas de finssimos filamentos. Nas bordas freqentemente formam-se massas irregulares ou expanses com forma de clava . A cor varia muito devido diversidade dos agentes causais (desde azul a vermelho claro), variando tambm conforme a tcnica de colorao. Gro maduromictico Em corte de tecido: Gros grandes, de forma irregular, contorno bem

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ntido, com estrutura interna constituda de hifas cortadas em diversas posies, dando um aspecto do mosaico irregular. No apresentam clavas e a colorao varia de marrom a preto. Zigomicose: Zigomicose so infeces causadas por fungos pertencentes classe dos Zygomycetes. Em sua maioria, esses organismos so saprofticos, vivendo no solo, gua e nos vegetais em decomposio. So fungos filamentosos constitudos de hifas largas e sem septo. A zigomicose dividida em duas entidades clnicas distintas: a mucormicose, tambm conhecida apenas como zigomicose; e a entomoftoromicose, cujos agentes etiolgicos pertencem s ordens dos Mucorales e Entomophtorales, respectivamente. A mucormicose uma infeco, em geral, de evoluo rpida e fulminante. Os agentes etiolgicos mais freqentemente isolados nos quadros de mucormicose so os seguintes: Mucor sp., Rhizopus sp., Rhizomucor sp. e Absidia sp.. As principais formas clnicas dessa doena so: Zigomicose cutnea (trauma mecnico), zigomicose pulmonar (bola fngica), zigomicose rinocerebral (forma clnica mais comum- inicia-se nos seios paranasais e evolui para o celebro) e zigomicose sistmica (est relacionada com a forma primria pulmonar). Diagnstico: Exame direto: KOH, observam-se hifas largas, no septadas, irregulares. Cultura; Meio Sabouraud No usar meio com cicloeximida pois impede o crescimento do fungo. Rhizopus sp Macromorfologia: Colnia de crescimento rpido, cotonosa, inicialmente branca, passando para acinzentada ou amarronzada, recoberta de pontos negros. Micromorfologia: Hifas vegetativas largas, cenocticas (septos ausentes), hialinas. Esporangiforos ligados por estolones que conectam as bases das estipes (hastes) nos pontos de fixao sobre a superfcie. As estipes podem ser nicas ou faciculadas (formando feixes), sem ramificao, tendo na

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base os rizides ou rizomorfas que so rgos com aspecto de raiz e tm por funo fixar sobre superfcies e absorver alimentos. A extremidade da estipe alarga-se como guarda chuva(columela) de onde sai a membrana formadora do esporngio. Este globoso, inicialmente incolor, passando a preto com a idade da cultura. No interior do esporngio formam-se os esporangisporos que , quando maduros, so liberados em grande nmero aps a ruptura da membrana.

Entomoftoromicose: uma infeco crnica do tecido subcutneo e mucosa, causada por fungos que vivem saprofiticamente no solo , vegetais em decomposio e fezes de rpteis e anfbios. A infeco ocorre com maior freqncia atravs da inalao ou inoculao de esporos. Os principais agentes etiolgicos so; Delacroixia coronata e o Basidiobolus ranarum. Feo-hifomicose: A designao feo-hifomicose foi proposta por Ajello, em 1974, para denominar infeces cutneas, subcutneas e profundas, agudas ou crnicas, causadas por uma grande variedade de fungos escuros com exceo dos agentes da cromoblastomicose. Os principais agentes etiolgicos so; Bipolaris oregonensis, Cladosporium bantianum e Exophiala jeanselmei.

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Exophiala jeanselmei.

Bipolaris oregonensis

Cladosporium bantianum

Hialo-hifomicose: Esse termo foi proposto por Ajello, 1982, para agrupar as infeces ocasionadas por fungos filamentosos hialinos, septados, no formadores de estruturas especficas (como os gros dos eumicetomas) e que, at ento, no eram patgenos clssicos. A maioria dos fungos produtores dessa micose so saprofticas habituais do solo, parasitas de vegetais e degradadores de materiais orgnicos. Grande parte desses fungos oportunista, com limitado poder patognico. Os principais so; Acremonium falciforme, Penicillium marneffei, Scedosporim apiospermum e Scopulariopsis brevicaulis.

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Penicillium sp

Scopulariopsis

Scedosporium

Acremonium

Rinosporidiose: uma infeco mictica submucosa, crnica, de evoluo lenta e granulomatosa, causada pelo Rinosporidium seeberii. Essa infeco caracterizada pela formao de plipos vegetantes localizados, principalmente nas mucosas nasal e conjuntival. O fungo um provvel habitante de guas estagnadas, poos e audes, sendo uma das possveis vias de aquisio da infeco. Diagnstico: Exame direto: KOH do material biolgico (plipos) observa-se clulas arredondadas (esporngio) de parede espessura variando de 10 a 100 m

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de dimetro. Nos cortes histolgicos corado por HE PAS e Gomori observa-se grande quantidade de esporngio com numerosos ndosporos em seu interior. -Doena de Jorge Lobo uma doena crnica, localizada, caracterizada pela presena de leses semelhantes a um queloide, leses verrucosas ou vegetantes, nodulares ou tumorais. O agente etiolgico da micose o fungo denominado de Loboa loboi. A contaminao acredita-se que seja atravs da inoculao acidental do parasita por traumatismo. Diagnstico: realizado basicamente pelo exame direto e histopatolgico. No exame direto com KOH observa-se clula globosa leveduriforme de tamanho uniforme com incluses lipdicas em seu citoplasma e com parede espessa. No exame histopatolgico observa-se clulas arredondadas, de parede espessa, isoladas em cadeias com intensa reao inflamatria. No possvel cultivar o fungo.

MICOSES PROFUNDAS Paracoccidioidomicose (PCM): Trata-se de infeco granulomatosa de evoluo crnica, com grande polimorfismo crlnico, onde as formas pulmonares e cutneo-mucosas predominam, seguindo-se outros rgos, como gnglios linfticos, suprarenal, bao fgado, intestinos, ossos, etc. Na grande maioria dos casos, os pulmes esto comprometidos e, em geral, tal localizao acompanhada

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de leses em outros locais. A paracoccidioidomicose de distribuio geogrfica restrita aos pases latino-americanos. Atinge freqentemente indivduos do sexo masculino entre 30-40 anos. Quanto ao modo de contgio da doena, admite-se, atualmente, que adquirida pela inalao de esporos que vivem na natureza, no solo, vegetais ou na gua, determinando leses primrias pulmonares. A classificao clnica na paracoccidioidomicose pode ser: PCM-infeco: estgios assintomticos e subclnicos. Contatos com o fungo sem desenvolver sintomas. Testes intradermico positivos. PCM-doena; Doena clnica sintomtica Aguda ou juvenil: Evoluo rpida, dissemina-se para rgos e sistemas Crnica: Origina-se da PCM-infeco, leva muitos anos para se manifestar. Pode disseminar para outros rgos. Agente etiolgico: Paracoccidioides brasiliensis. Fungo dimrfico trmico a 25oC forma micelial 37 oC forma de levedura. Diagnstico laboratorial; realizado pela pesquisa direta do agente em escarro, biopsia de leso, pus de linfonodos ou pesquisa de anticorpos no soro. Exame direto: Material da leso ou escarro com KOH. So encontradas formas caractersticas de leveduras com parede dupla e mltiplos brotamentos (em roda de leme). Em pus: Clulas arredondadas (na sua maioria), ovaladas, com parede grossa bem refringente. Tamanho varivel. Formao de brotos nicos, duplos ou mltiplos (em roda de leme). Disposio catenulada ou aglomerada. Pequenos vacolos aparecem no citoplasma. Em material corado pela hematoxilina-eosina: Apresenta-se como formas arredondadas, de 1 a 20 m, com parede grossa e refringente, isoladas ou agrupadas, com brotamento nico ou mltiplo (em roda de leme). A colorao do citoplasma varia de levemente azulada e levemente avermelhada, podendo ser incolor. Com frequncia, aparecem fagocitadas por clulas gigantes (Langhans). Em material corado pela prata: O aspecto o mesmo da preparao

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anterior, mas a colorao das clulas fngicas varia de amarelo claro passando pelo marrom, at preto. Observa-se com maior nitidez as formas com brotamentos mltiplos. Cultura: Cultivo em agar Sabouraud e agar Mycosel a 25oC. Aps 20-30 dias, crescimento de colnias brancas que anlise micromorfolgica apresentam clamidsporos intercalados ou terminais nas hifas. O diagnstico pode ser feito se observado a converso da forma micelial para leveduriforme cultivando-se a 37oC.

Histoplasmose: uma doena granulomatosa, tendo como agente etiolgico o fungo Histoplasma capsulatum, que apresenta especial afinidade pelo sistema retculo endotelial, produzindo diversas manifestaes clnicas. Classificao das formas clnicas; Assintomtica: Indivduos que entram em contato com o fungo mais no desenvolvem sintomas. Algumas vezes podem aparecer sintomas que se assemelham desde uma tuberculose a um resfriado. Os glnglios mediastinais podem estar envolvidos. Quando no ocorre a cura espontnea, evolui para a forma generalizada. Generalizada: Ocorre por disseminao pulmonar apresentando sintomas de acordo com o rgo afetado principalmente os que fazem parte do sistema retculo endotelial como fgado, bao e linfonodos. O contgio atravs da inalao de esporos do fungo.

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O Histoplasma capsulatum tambm um fungo dimrfico trmico.

Diagnstico; Exame direto: Material biolgico com KOH as formas de leveduras dificilmente so encontradas por este mtodo. Em corte de tecido corado pela H.E.: Clulas parasitrias arredondadas, aparecendo como elementos intracelulares, de parede grossa e citoplasma retrado. Observa-se uma zona clara entre a parede e o citoplasma, o que simula uma cpsula.

MICOSES OPORTUNISTAS Criptococose: Infeco subaguda ou crnica, de comprometimento pulmonar, sistmico e do sistema nervoso central, causado pelo Cryptococcus neoformans. A infeco primria no homem sempre pulmonar, devido a inalao do fungo da natureza. A infeco pulmonar quase sempre subclnica e transitria; entretanto, pode emergir ao lado de outras doenas que debilitem o indivduo, tornar-se rapidamente sistmica e fatal. Portanto conhecida como infeco oportunista. O fungo possui forte

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neurotropismo. Diagnstico: Materiais biolgicos: lquor, escarro, pus ganglionar, exudatos de leses cutneas e mucosas, urina e sangue. Exame direto: A fresco com tinta nanquim. O fungo visualizado como uma clula arredondada. Macromorfologia: Culturas de crescimento rpido (3 dias). Colnia plana ou levemente elevada, brilhante, mida, com frequncia mucide. Cor inicialmente creme tornando-se bronzeada. Micromorfologia: Clulas arredondadas ou ovalada, isoladas ou com brotamento nico; parede grossa, bem refringente e vacolos no citoplasma. Cpsula bem ntida em preparaes com tinta nanquim.

Aspergilose: A arpergilose no seu sentido amplo definida como um grupo de doenas na qual fungos do gnero Aspergillus esto envolvidos. Esses fungos so cosmopolitas e extremamente presentes na natureza, sendo encontrados em restos orgnicos, no solo, no ar e sobre a superfcie de seres vivos, etc. Por essas razes, representa no laboratrio de micologia, uma fonte freqente de contaminao dos meios de cultura e de espcimes clnicos a serem analisados. No homem a doena depende do estado fisiolgico geral ou local do hospedeiro. As principais manifestaes clnicas so: Aspergilose pulmonar: Aspergiloma (bola fngica), Aspergilose invasiva, Aspergilose alrgica, Aspergilose bronco-pulmonar Aspergilose disseminada Otomicose Onicomicose Diagnstico: Exame direto: Em KOH hifas hialinas

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Cultura: Macromorfologia: Colnia de crescimento rpido, inicialmente branca, passando a azul, verde, amarela ou preta. Reverso incolor, amarelo ou preto. Pulvurulenta ou granulosa, com borda franjada e contorno circular ou lobado, mas limitado. Micromorfologia: Hifas vegetativas, ramificadas, septadas, incolores e refringentes. Conidiforo, com haste simples, saindo de uma clula base, e extremidade globlosa (vescula). Da superfcie da vescula saem filides ou esterigmas, em forma de garrafas e disposio radiada no seu conjunto. Na extremidade de cada filide forma-se uma cadeia de esporos basipetos (condio ou fialosporo), globosos, de cor varivel.

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Tcnicas para identificao de fungos

Tcnicas para identificao de fungos filamentosos 1- Tcnica de esgaramento: Utilizada como primeira tentativa (mais rpida) para identificao de colnias filamentosas. As estruturas fngicas so quebradas, tornando-se mais difcil a identificao.

PARTE II

Com ala de platina em L, retirar um pedao da colnia de bolor crescida no gar. Colocar 1 a 2 gotas de Lactofenol azul-algodo. Cobrir com lamnula, comprimindo levemente. Observar em microscpio com aumento de 400X.

2- Microcultivo em lmina: No microcultivo em lmina, as estruturas permanecem ntegras alm de ser utilizado um meio de cultura (gar batata), que estimula a produo de macro e microcondeos, que na maioria das vezes identificam o fungo. Estimula, tambm, a formao de pigmento.

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Esterilizar placas de Petri com 3 lminas no interior (duas servem para suporte e a outra para realizar o microcultivo). Preparar gar batata em placa Cortar em quadradinhos Colocar um pedao de gar batata no centro da lmina do microcultivo Com a ala em L, cortar pedaos bem pequenos da colnia do bolor, crescidos no gar e colocar nos quatro lados do pedao de gar batata Cobrir com lamnula estril, pressionando levemente Colocar um pouco de gua destilada estril e deixar `a 25oC, repondo a gua estril, sempre que necessrio. Deixar por 10-15 dias, dependendo da velocidade do crescimento do fungo. Para montar, retirar a lamnula com pina estril. Fixar o fungo na lamnula colocando 1 a 2 gotas de lcool e esperar secar. Montar essa lamnula em lmina limpa, com 1 gota de Lactofenol azulalgodo. A lamnula pode ser vedada com esmalte de unha ou Entellan para conservar por mais tempo.

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Reagentes e meios de cultura: Lactofenol azul-algodo: Fenol cristalizado cido lctico Glicerina gua destilada Azul-algodo 20g 20ml 40ml 20ml 0,05g

Fundir o fenol separadamente. Misturar o cido lctico, glicerina e gua com o fenol. Colocar o corante e filtrar em papel. gar Batata: Batata Glicose gar 10g 5g 10g

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gua

500ml

Ferver bem a batata cortada em pedacinhos e descascadas. Amassar bem e completar o volume para 500ml. Adicionar a glicose e o gar e deixar em Banho-Maria at dissolver completamente. Colocar em frascos com aproximadamente 20ml. Autoclavar a 121oC por 15 minutos.

IDENTIFICAO DE LEVEDURAS

1- PROVA DO TUBO GERMINATIVO: A prova do tubo germinativo um teste que caracteriza rpida e presuntivamente a levedura da espcie Candida albicans. A tcnica muito simples e baseia-se, fundamentalmente, na semeadura de um pequeno inculo dessa levedura em soro, que pode ser de vrias espcies animais. Os soros recomendados so o humano, o fetal bovino ou de cavalo, podendo-se, ainda, utilizar albumina de ovo. Tcnica: a. Com a ponta de uma pipeta Pasteur estril, ou ainda, com uma ala de platina calibrada (0,001ml), retirar uma pequena poro de uma colnia de levedura e emulsion-la de forma assptica em 0,5 ml de soro. Evitar, se possvel, o uso de soro humano, que pode ter anticorpos ou ainda antifngicos.

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b. Incubar a 37oC por um perodo de 1,5-2 horas, em banho-maria, ou at 3 horas em estufa bacteriolgica. c. Findo este perodo, deve-se remover uma gota da suspenso e montar uma preparao do tipo lmina-lamnula, para observao microscpica. O tubo germinativo, quando o teste for positivo, aparecer como filamento fino e cilndrico, originado do blastocondio da levedura, no qual no se observa nenhuma zona de constrico, quer na base ou ao longo de sua extenso.

2- MICROCULTIVO DE LEVEDURAS Esta tcnica baseia-se no princpio de que leveduras, quando incubadas num meio com Tween-80 apresentam a capacidade de filamentar, formando pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras. Assim, pelas caractersticas morfolgicas diferenciadas das estruturas filamentosas, pode-se sugerir a espcie de levedura implicada na identificao. Tcnica: Preparar gar Fub e colocar 3 ml de meio, ainda lquido, sobre a lmina do microcultivo, com pipeta estril. Esperar solidificar. Com ala de platina, pegar um pouco da colnia de levedura crescida no gar e semear em estria no gar Fub. Cobrir com lamnula estril. Deixar 2 a 3 dias 25oC e observar a preparao, da forma como est, em microscpio com aumento de 400x.

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Material: gar Fub: Farinha de milho amarela gua gar Tween 80 6,25g 150 ml 1,9 g 1,5 ml

Aquecer em banho-maria 60oC por 1 hora a farinha de milho e a gua. Filtrar. Completar o volume, com gua, para 150 ml. Acrescentar o gar e o Tween e deixar em banho-maria fervendo at dissolver. Colocar em frascos com aproximadamente 3-5 ml. Autoclavar 121oC por 15 minutos.

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Filamentao de Candida sp em gar fub com Tween-80:

3- Auxanograma (Assimilao de Carboidratos e Nitrognio) Assimilao de Carbiodratos: Esta tcnica baseia-se na capacidade que as leveduras apresentam de utilizar determinado carboidrato como nica fonte de carbono, para sua viabilidade celular. Desta forma utiliza-se, nesta tcnica, um meio basal destitudo de qualquer fonte de carbono (sem o qual a clula fngica no pode crescer), onde ser semeada a levedura que se deseja identificar.

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Aps a semeadura, adiciona-se ao cultivo um carboidrato e observa-se a capacidade de utilizao deste como fonte de carbono. Quando o carboidrato assimilado pela levedura, observa-se crescimento desta ao redor da fonte de carbono. Tcnica: Preparar o meio Yeast Nitrogen Base de acordo com as normas preconizadas pelo fabricante. Simultaneamente, preparar uma suspenso de leveduras com turvao equivalente ao tubo nmero 5 da escala de MacFarland Toma-se uma alquota de 1 ml da suspenso de leveduras e adiciona-se a 20 ml de meio basal fundido e resfriado. Transfere-se esta suspenso para uma placa de Petri homogeneizando suavemente. Aguarda-se a solidificao do meio e adiciona-se pequenas quantidades de acares em posies previamente demarcadas.

Incubar as placas a 30oC por 24-48 horas. Observar regies opacas ao redor dos acares adicionados

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Assimilao de Nitrognio: A assimilao de nitrognio demonstra a capacidade que algumas leveduras apresentam de assimilar nitrato de potssio (nitrognio inorgnico), como nica fonte de nitrognio utilizado na sua viabilidade biolgica. Tcnica: Prepara-se o meio Yeast Carbon Base, de acordo com as indicaes do fabricante. Aps a preparao e autoclavao, o meio deve ser estocado em geladeira, at o momento do uso. No momento do uso, fundem-se 20 ml do meio, e aps resfriar a uma temperatura de 45-50 oC acrescenta-se a este 1 ml da suspenso de levedura previamente preparada (com uma turvao correspondente ao tubo 5 da escala de MacFarland) Aps movimentos no muito bruscos de agitao para homogeneizar o inculo, despeja-se o meio numa placa de Petri Aps solidificao do meio, distribuir pequenas quantidades de compostos nitrogenados (nitrato de potssio e peptona) A peptona aqui empregada como controle da viabilidade do inculo, visto que todas as leveduras a utilizam como fonte nitrogenada.

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4- FERMENTAO DE CARBOIDRATOS: A capacidade de uma levedura fermentar determinado carboidrato est diretamente ligada habilidade desta de possuir sistemas enzimticos eficientes, capazes de permitir, em baixas tenses de oxignio, degradar acares para produo de energia, formando, entre outros metablitos, etanol e gs carbnico. Assim, utiliza-se tambm na identificao das leveduras essa caracterstica fenotpica, onde se investiga a habilidade que uma determinada levedura possui de fermentar um acar, atravs da demonstrao da produo de CO2. Tcnica: Prepara-se o meio basal para fermentao e distribudos em tubos de ensaio, contendo um tubo de Durham invertido em seu interior, em alquotas de 3 ml.

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Os tubos so autoclavados e estocados na geladeira por at um ms. No momento da execuo do teste, adiciona-se ao meio basal, 1,5 ml da soluo de acares (6% em gua destilada), mantendo sempre a relao de da soluo de acares para meio basal. Adiciona-se 0,2 ml da suspenso de levedura (escala 5 MacFarland), no meio basal e incubam-se os tubos a 37oC por 10-14 dias.

Material: Meio de cultura Azul de bromotimol Extrato de levedura Peptona gua destilada Etanol a 95% 0,03 g 2,7 g 4,5 g 600 ml 1,8 ml

Dissolver o extrato de levedura e a peptona em gua destilada.

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Separadamente dissolver completamente o azul de bromotimol em etanol. Adicionar o azul de bromotimol dissolvido mistura inicial e homogeneizar. Distribuir 3 ml do meio em tubos de ensaio com tampa roscvel contendo um tubo de Durhan na posio invertida. Autoclavar a 121oC, por 15 minutos. Deixar resfriar. Adicionar a cada tudo, 1,5 ml de uma das solues de acares. Estocar a 4oC.

IMPORTANTE: Observar na Parte IV desta apostila o Protocolo para identificao de leveduras.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AR A. Finalidade: O isolamento de fungos anemfilos importante na determinao da flora do ar de uma rea, nos estudos sobre alergia a fungos, na determinao do grau de contaminao de ambientes, para obteno de amostras de interesse industrial, etc. B. Fundamento: Usando-se a tcnica de exposio de placas com meio de cultura durante tempos pr-fixados, os esporos em flutuao no ar sedimentam sobre o meio e ai germinam. C. Material: a. Placa com gar Sabouraud ou gar batata dextrose. b. Lactofenol azul algodo c. Lminas, lamnulas, alas, etc. d. Tubos com gar-Sabouraud ou gar batata inclinado. D.Execuo da tcnica: 1. Abrir a placa e expor durante 20 minutos 2. Fechar, identificar e incubar temperatura ambiente

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3. Acompanhar o desenvolvimento das culturas 4. Examinar ao microscpio 5. Repicar em tubos E. Resultado PESQUISA MICROSCPICA DE DERMATFITOS EM PLO A. Finalidade: Diagnstico das tinhas do couro cabeludo. B. Fundamento: O diagnstico laboratorial das tinhas do couro cabeludo baseia-se no exame microscpico de plos e cultura dos mesmos em gar Sabouraud. Os plos com microsporia apresentam esporos ectotrix na base e os plos com tricofcia apresentam parasitismo endotrix e/ou ectotrix em formas artrosporadas. C. Material: 1. Lmina, pina, microscpio, etc. 2. Soluo de KOH a 20% D. Execuo: 1. Colher, com uma pina de ponta chata (pina de depilao), plos danificados das bordas da leso. 2. Colocar os plos entre 2 lminas de vidro bem limpas (ou em placa esterilizada em caso de transporte). 3. Pingar uma gota de soluo de KOH sobre os plos em uma lmina e cobrir com lamnula. 4. Aquecer levemente, passando a lmina vrias vezes sobre a chama, evitando-se rigorosamente a fervura do lquido. 5. Examinar ao microscpio. a. Os plos parasitados por Microsporum apresentam bainha externa de esporos pequenos ao redor do mesmo na regio do folculo. b. Os plos parasitados por Trichophyton apresentam formas filamentosas e artrosporadas externa e internamente. E. Resultado

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A. Exame direto

B. Cultura

PESQUISA MICROSCPICA DE DERMATFITOS EM PELE E UNHA A. Finalidade: Diagnstico de dermatofitoses de pele e unha: tinea corporis, tinea cruris, tinea manum, tinea ungueum e tinea imbricata. B. Fundamento: O exame microscpico baseia-se no encontro de filamentos septados e ramificados, muitas vezes artrosporados, em escamas de pele e unha clareados com KOH. C. Material: 1. Escamas de pele 2. Lminas, lamnulas, ala, etc. 3. Soluo de KOH a 20% 4. Bisturi ou lmina de barbear 5. gar Sabouraud-cloranfenicol D. Execuo: 1. Raspar a pele ou a unha com bisturi ou lmina. 2. Misturar uma parte das escamas com KOH sobre uma lmina de microscpio e cobrir com lamnula. 3. Aquecer levemente evitando a fervura. 4. Comprimir levemente a lamnula. 5. Retirar o excesso de KOH. 6. Examinar ao microscpio. F. Resultado:

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DEMONSTRAO DO DIMORFISMO DOS FUNGOS (Transformao M - Y) A. Finalidade: caracterstica de alguns fungos patognicos, servindo para sua identificao e para estudos morfolgicos ou de atividade antignica, bioqumica etc. B. Fundamento: A transformao M - Y ocorre com a mudana na composio do meio e na temperatura (ou apenas na temperatura). C. Material: 1. gar Sabouraud e gar BHI 2. Cultura de Sporothrix schenckii ou Paracoccidioides brasiliensis 3. Ala de platina, lmina e lamnula etc. D. Execuo: 1. Repicar a cultura filamentosa no meio gar BHI 2. Incubar a 37C, durante perodo suficiente para crescimento, mantendo mido o meio com pequeno volume de caldo Sabouraud (ou colocar vasilha com gua na estufa). 3. Examinar ao microscpio. 4. Repicar, em gar Sabouraud, a cultura da fase levedufirorme 5. Incubar temperatura ambiente por perodo suficiente para crescimento 6. Examinar macro e microscopicamente.

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PESQUISA DE LEVEDURAS EM PELE E UNHA A. Finalidade: Diagnstico das leveduroses de pele e unha. B. Fundamento: O exame microscpico realizado pesquisando-se em escamas de pele e unha, clareadas com KOH, as formas arredondadas ou ovaladas, formando, s vezes, aglomerados e filamentos. Isola-se o agente em gar Sabouraud. C. Material: 1. Escamas de pele e unha 2. Soluo de KOH a 20 ou 30% 3. Lminas, lamnulas, etc. 4. gar Sabouraud-cloranfenicol D. Execuo: 1. Raspar a pele ou a unha para obter escamas 2. Colocar uma gota de KOH sobre a lmina 3. Misturar uma parte das escamas com KOH 4. Cobrir com lamnula 5. Aquecer levemente 6. Examinar ao microscpio 7. Cultivar a outra parte do material em gar Sabouraud-cloranfenicol. 8. Fazer as provas de tubo germinativo, clamidosporo (clamidocondio) e bioqumicas. E. Resultado a. Exame direto b. Cultura

E. Resultado: anotar, conforme tabela:

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PESQUISA DE Malassezia furfur A. Finalidade: Diagnstico da pitirase versicolor B. Fundamento: O diagnstico da pitirase versicolor realizado pela pesquisa microscpica de aglomerados de esporos, em forma de cacho de uva, ao lado de filamentos grossos, septados, curtos, com ramificaes tendo aspecto de Y ou L. C. Material necessrio: 1. Fita adesiva transparente 2. Soluo de KOH a 20% 3. Lminas, lamnulas, microscpio, etc. D. Execuo: 1. Pesquisa com fita adesiva: a. Colocar a face colante da fita sobre a pele em descamao b. Retirar e colar a face colante da fita sobre a lmina c. Examinar ao microscpio, procurando retirar e colar principalmente os esporos arredondados formando aglomerados em mosaico ou cacho de uvas. 2. Pesquisa aps clareamento com KOH: a. Raspar a pele em rea com descamao, usando bisturi ou lmina de vidro. b. Misturar parte das escamas com KOH e cobrir com lamnula. c. Aquecer levemente a lmina, evitando fervura. d. Examinar ao microscpio, procurando os esporos aglomerados em forma de mosaico e os filamentos. E. Resultado:

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PRODUO DE UREASE A. Finalidade: Identificao de C.neoformans. B. Fundamento: Produzindo urease, C. neoformans decompe a uria com formao de amnia que alcaliniza o meio, provocando a viragem do indicador. C. Material: 1. Meio de Christensen 2. Amostra de levedura D. Preparo do material: Meio de Christensen: Uria gar base (Difco).................... 29 g gua destilada................................. 100 ml Esterilizar por filtrao gar............................................... 15 g gua destilada................................ 900 ml Autoclavar 115C - 15 minutos. Esfriar at 50 - 55C, misturar a base e distribuir esterilmente em tubos. Solidificar inclinado. E. Execuo da tcnica: 1. Semear na superfcie 2. Incubar a 37C 3. Observar a viragem do indicador (hidrlise da uria= viragem para vermelho) F. Resultado:

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DIFERENCIAO DE Trichophyton rubrum e Trichophytom mentagrophytes PELO TESTE DA UREASE E PERFURAO EM PELO Meio de cultura utilizado: Peptona 1g NaCl 5g KH2PO4 2g Glicose 5g Agar 15g gua destilada 1000ml Procedimento: Adicionar 6ml de soluo de vermelho de fenol (0,2% em etanol-50%). Autoclavar a 115oC por 15 minutos. Esfriar a 50oC e adicionar 100ml de soluo aquosa a 20% de uria esterilizada por filtrao e inclinar. Resultado: Trichophyton rubrum: Urease fraca ou ausente (no h mudana antes de 14 dias) Trichophyton mentagrophytes: Pulverulento fortemente positivo (antes de 7 dias) TESTE DE PERFURAO: Usar cabelo pr-pbere e colocar em placas de Petri Esterilizar o cabelo por autoclavegem a 120oC por 10 minutos Colocar 25 ml de gua destilada estril Adicionar 2 a 3 gotas de estrato de levedura Fazer leitura em 4 semanas

Resultado: O T. mentagrophytes penetra perpendicularmente dentro do pelo, formando orifcios em forma de cunha. O T. rubrum no perfura o pelo.

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MEIOS DE CULTURA E CORANTE MAIS COMUNS EM MICOLOGIA gar Sabouraud (AS) Peptona......................................... Dextrose....................................... gar............................................. gua destilada.............................. 10 g 20 g 15 g 1000 ml

Dissolver o gar em gua fervente e acrescentar os outros componentes . Distribuir e autoclavar a 115C por 15 minutos. gar Sabouraud + Antibiticos Gentamicina.................................. 25 mg Cloranfenicol................................. 140 mg lcool........................................... 10 ml AS ou ASD fundido..................... 1000 ml Dissolver o cloranfenicol no lcool e depois misturar com AS ou ASD gar fundido. Distribuir e autoclavar a 115C por 15 minutos. Corante Lactofenol azul algodo (Lactofenol de Aman) Fenol............................................. 20 g cido lctico................................. 20 ml Glicerina....................................... 40 ml gua destilada.............................. 20 ml Cotton blue (azul algodo)........... 0,05 g a. Misturar: cido lctico, glicerina e gua. b.Acrescentar fenol e dissolver com calor uniforme. c. Acrescentar azul algodo. d. Filtrar em papel. KOH Hidrxido de Potssio diludo a 10 ou 20% em gua destilada KOH + tinta Hidrxido de Potssio 10 ou 20%, adicionado de Tinta Parker Permanente, na proporo de 2:1.

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PARTE III FLUXOGRAMAS

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PARTE IV
UNIVERSIDADE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS LABORATORIO DE MICOLOGIA CLNICA PROTOCOLO PARA IDENTIFICAO DE LEVEDURAS

Iniciais do paciente:_____________________ Material biolgico:_____________________________________ Exame direto:_________________________________________ Cultura:______________________________________________

No. de entrada da cepa:______________Data:_______________

1 MORFOLOGIA
a) Macroscpia: ASD: Cor:_________________Textura:___________________ b) Microscpia: Agar Fub: Data:____________________ Pseudomiclio ( ) Miclio verdadeiro ( ) Clamidsporo ( ) Arranjo dos Blastocomidios ( ) Artrocondios ( ) Tubo germinativo:____________________________ Outras caracteristicas:___________________________

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2 PROVAS BIOQUMICAS

a) Auxonograma: Data:________________
1 G Glicose ( ) 2 GA Galactose ( ) 3 SOR L Sorbose ( ) 4 SU Sacarose ( ) 5 MA Maltose ( ) 6 CE Celobiose ( ) 7 TR Trealose ( ) 8 LA Lactose ( ) 9 ME Melibiose ( ) 10 RA Rafinose ( ) 11 ST Amido solvel ( ) 12 LAR L Arabinose ( ) 13 RI D Ribose ( ) 14 GL Glicerol ( ) 15 ER Eritritol ( ) 16 RIB Ribitol ( ) 17 GAL Galactiol ou Ducitol ( ) 18 MAN D Manitol ( ) 19 GLU D Glucitol ou Sorbitol ( ) 20 LAC cido Ltico ( ) 21 CIT cido Ctrico ( ) 22 SUC cido Succinico ( ) 23 I Inositol ( ) 24 MZ Melezitose ( ) 25 X L Arabinose ( ) 26 DAR D Arabinose ( ) 27 RH Raminose ( ) 28 AS Salicina ( ) 29 Peptona ( ) 30 NO3 Nitrato ( )

b) Zimograma: Data:________________
Controle Glicose Lactose Rafinose Galactose ( ( ( ( ( ) ) ) ) ) Sacarose Maltose Trealose Celobiose Melibiose ( ( ( ( ( ) ) ) ) )

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c) Provas complementares: Data:__________________

Presena de cpsula:_____________________________ Crescimento a 37 C _____________________________ Alta produo de cido:___________________________ Urease:_________________ Resistncia cicloheximida:______________________ Ascsporos ( Forma e Nmero):___________________

3 - Interpretao das provas do Zimograma e Auxonograma

+ Forte + W Fraco + VW Muito fraco + S Lento - Negativo V Varivel +/- ----------------

Resultados

Repleto de gs Gs pela metade do tubo Somente uma bolha gs Formao de gs aps 3 dias Sem gs Algumas cepas (+) e outras (-)

Aspecto tubo de durhan Formao do halo

Rpida e halo forte Halo fraco Lento ou latente Negativo Muitas cepas (+) Poucas (-)

4 A identificao deve ser feita de acordo com Kreger Van Rij, 1984.

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