INTRODUO

1. INTRODUO

1.1. Consideraes histricas

A primeira descrio de um paciente afetado pela sndrome de Noonan (SN) foi atribuda a Kobylinski, em 1883. Este autor descreveu um paciente tuberculoso, cuja caracterstica fenotpica principal era a presena do pescoo alado. Em 1979, Opitz e Pallister publicaram um artigo de reviso com a fotografia desse paciente, na qual os autores constataram, alm do pescoo alado, tambm denominado pterigium colli, anomalias faciais sugestivas da SN. Ullrich, em 1930, descreveu uma paciente de oito anos de idade com dismorfismos faciais, pescoo alado, baixa implantao de cabelos na nuca, cubitus valgus, anomalias ungueais e, ao nascimento, linfedema de mos e ps. Oito anos aps, Turner relatou sete mulheres com idades entre 15 e 23 anos que apresentavam uma trade de sinais composta por pterigium colli, cubitus valgus e infantilismo sexual. A trade de Turner no sexo masculino foi decrita por Flavell, em 1943. As descries de Ullrich e Turner correspondiam mesma doena, conhecida posteriormente como sndrome de Turner. Em 1959, foi demonstrado por Ford e colaboradores a monossomia do cromossomo X nesta sndrome e, a partir da, a denominao sndrome

de Turner foi utilizada para pacientes do sexo feminino com apenas um cromossomo X ou outra aberrao estrutural envolvendo o cromossomo X. Aqueles que apresentavam constituio cariotpica normal passaram a receber vrias designaes como sndrome de Turner no homem, pseudosndrome de Turner, sndrome de Turner XX e sndrome de Turner XY. Somente em 1963, no Congresso de Pesquisa Peditrica da Sociedade do Meio-Oeste nos Estados Unidos, Noonan e Ehmke relataram a presena de malformaes associadas em crianas com defeitos cardacos. Nesse estudo, as autoras observaram nove indivduos (seis do sexo masculino e trs do sexo feminino), em um total de 835 crianas com defeitos cardacos, que apresentavam especificamente estenose pulmonar valvar e outras anomalias extra cardacas como baixa estatura,

hipertelorismo ocular, deficincia mental leve e, menos frequentemente, ptose palpebral, criptorquia e anomalias esquelticas. Consideraram essa doena, a qual afetava ambos os sexos, como uma possvel nova sndrome. Em 1968, Noonan ampliou seu espectro com a presena de outros defeitos cardacos que no apenas a estenose pulmonar valvar, alm de hepatoesplenomegalia e trombocitopenia em alguns afetados. Todos apresentavam cromatina sexual compatvel com o sexo gonadal e o estudo cromossmico, realizado em seis deles, foi normal. A partir dessa descrio, muitos indivduos com constituio cromossmica normal, diagnosticados como tendo sndrome de Turner XX ou sndrome de Turner XY, passaram a ser considerados como afetados por esta nova sndrome descrita por Noonan e Ehmke.

O epnimo sndrome de Noonan foi proposto por Optiz et al. (1965) para esta nova sndrome, comeando a desfazer assim a sobreposio entre a sndrome de Turner e a sndrome de Noonan, a qual perdurou por vrias dcadas.

1.2. Incidncia

Embora no se saiba ao certo qual a incidncia da SN na populao, Nora et al. (1974) estimaram-na entre 1:1000 a 1:2500 nascimentos.

1.3. Quadro clnico

1.3.1. Achados craniofaciais

A regio ocular a que apresenta as caractersticas mais tpicas da SN, com inclinao para baixo das fendas palpebrais, hipertelorismo, ptose palpebral e proptose. Anomalias intra-oculares tambm so comuns, como a presena de nervos corneanos espessados no segmento anterior do olho, observado em 46% dos afetados (Lee et al., 1992). Alm disso, h m-ocluso dentria, palato alto e orelhas baixoimplantadas e/ou posteriorizadas com espessamento da poro superior da hlice (Noonan, 1994). O fentipo varia com a idade (Allanson et al., 1985) e, no adulto, as caractersticas faciais podem ser sutis, o que dificulta o diagnstico.

1.3.2. Pescoo

Durante o perodo neonatal, as crianas afetadas pela SN podem apresentar um excesso de pele na regio da nuca e, com o seu crescimento, o pterigium colli e a baixa implantao de cabelos na nuca tornam-se mais evidentes (Allanson et al., 1985).

1.3.3. Achados cardiovasculares

As anomalias cardacas ocorrem em aproximadamente 50% dos pacientes (Nora et al., 1974; Mendez e Opitz, 1985; Noonan, 1994), sendo que praticamente todo tipo de defeito cardaco j foi descrito na SN (Noonan e OConnor, 1996). Entretanto, a estenose pulmonar valvar (EPV) a anomalia cardaca mais comum e caracterstica, presente em 50% dos afetados (Char et al., 1972; Allanson, 1987). Muitas vezes a valva pulmonar displsica, o que acarreta dificuldades no seu manejo. O grau de displasia e obstruo varivel (Noonan e OConnor, 1996). Em muitos pacientes, apesar da valva ser displsica, no h sinais de obstruo ou regurgitao. Mas, em alguns deles, ocorre uma obstruo progressiva, o que no observado em crianas com mais de dois anos de idade que possuem EPV nosindrmica, na sua forma leve ou moderada. A miocardiopatia hipertrfica o segundo achado cardaco mais comum, com uma freqncia que varia de 20% (Sharland et al., 1992) a 30%

(Nora et al., 1975). A histria natural desta anomalia na SN no bem conhecida. H uma grande variabilidade clnica, com alguns pacientes apresentando sintomas j na lactncia e uma rpida progresso do quadro, enquanto outros permanecem estveis por vrios anos ou mesmo apresentam os primeiros sintomas reconhecveis na infncia tardia. Os casos sintomticos apresentam uma alta taxa de mortalidade, mesmo na lactncia. De forma semelhante miocardiopatia hipertrfica nosindrmica, a maioria dos pacientes com SN apresenta um padro de hipertrofia assimtrico do ventrculo e, no exame anatomopatolgico, um desarranjo das fibras musculares e espessamento das paredes das artrias coronrias intramurais. Por outro lado, a concomitncia de valvas cardacas displsicas ocorre apenas na SN. Outros defeitos cardacos comuns so: comunicao interatrial (CIA), comunicao interventricular (CIV) (Bertola et al., 2000), tetralogia de Fallot e prolapso da valva mitral (Noonan e OConnor, 1996). Anomalias eletrocardiogrficas (desvio superior do eixo do QRS e ondas S profundas nas derivaes precordiais) so comuns na SN, independente do tipo ou da presena ou no de defeito cardaco (Noonan e OConnor, 1996; Bertola et al., 2000). Anomalias do sistema linftico esto presentes em aproximadamente 20% dos casos (Mendez e Opitz, 1985), caracterizadas por linfedema de mos e ps, higroma cstico na regio cervical (Donnenfeld et al., 1991), linfangiectasia intestinal (Herzog et al., 1976), linfangiectasia pulmonar (Fischer et al., 1982), hidropsia fetal (Paupe et al., 1991).

1.3.4. Achados abdominais

A presena de esplenomegalia um achado comum na SN. George et al., (1993) realizaram um estudo ultra-sonogrfico de abdome em 44 pacientes afetados pela sndrome, com 53% deles apresentando

esplenomegalia e, em seis, havia concomitantemente hepatomegalia. A fisiopatologia deste achado na SN permanece ainda desconhecida.

1.3.5. Achados geniturinrios

Alm da criptorquia, a anomalia geniturinria mais comum na SN (presente em 60% dos pacientes do sexo masculino), outros achados so: testculos pequenos, pnis pequeno e hipospdia (Allanson, 1987). As anomalias renais no so freqentes na SN. George et al. (1993), estudando 44 pacientes com SN, observaram 11% de anomalias renais, representadas por agenesia renal unilateral, ectopia renal, duplicao do sistema pielocalicial, cistos renais bilaterais e dilatao da pelve renal.

1.3.6. Achados esquelticos

Allanson (1987) afirmou que a anomalia esqueltica mais comum na SN, presente em 70% dos casos, a deformidade torcica com pectus carinatum superiormente e pectus excavatum inferiormente. Outros achados tambm comuns incluem a presena de cubitus valgus (50%),

clinobraquidactilia (30%), anomalias vertebrais e esternais (25%) e mocluso dentria. As anomalias vertebrais geralmente no apresentam uma expresso clnica evidente, sendo representada especialmente pela espinha bfida oculta, escoliose e cifose (Bertola et al., 1999).

1.3.7. Achados na pele e anexos

As anomalias cutneas na SN so representadas principalmente por coxins nas pontas dos dedos das mos e ps, cabelos encaracolados, sobrancelhas e cabelos esparsos, nevos e eflides, queratose pilar atrfica da face e tendncia formao de quelides (Noonan, 1994).

1.3.8. Achados hematolgicos

Na SN so descritos distrbios de coagulao envolvendo as plaquetas e/ou os fatores de coagulao. As anomalias plaquetrias podem ser quantitativas - trombocitopenias - (Noonan, 1968; Caralis et al., 1974; Phillips et al., 1993) ou qualitativas agregao plaquetria deficiente (Festen et al., 1980). Mais freqentemente, entretanto, so as deficincias de fatores de coagulao, que podem ocorrer de forma isolada ou em combinao (Bertola et al., 2003). A deficincia do fator XI o achado mais comum (Sharland et al., 1990). Outros fatores de coagulao envolvidos incluem os fatores XII (Mollica et al., 1987), VIII, IX, V (Sharland et al., 1990), II (Singer

et al., 1997), assim como anomalias sugestivas da doena de von Willebrand. Mais recentemente, foram descritas doenas mieloproliferativas em pacientes com SN. Bader-Meunier et al. (1997) realizaram um estudo retrospectivo analisando 52 pacientes com doena mieloproliferativa, dos quais quatro tambm afetados pela SN apresentavam leucemia mielomonoctica crnica. Os autores consideraram que provavelmente esta associao no era fortuita. Estes mesmos pacientes apresentavam uma esplenomegalia, mesmo na normalizao dos achados hematolgicos, sugerindo ser esta a etiologia da esplenomegalia em pacientes com SN.

1.3.9. Crescimento

O dficit estatural ocorre em aproximadamente 50% dos afetados (Sharland et al., 1992). Witt et al. (1986) elaboraram uma curva de crescimento de pacientes afetados pela SN. Os autores observaram que estes indivduos

apresentavam comprimento ao nascimento localizado prximo do limite inferior da normalidade. Posteriormente, o crescimento caia abaixo do 5 percentil por volta dos 3 meses e permanecia constantemente assim at a idade adulta. Ramke et al. (1988) observaram que o estiro de crescimento na puberdade ocorria com um atraso de dois anos, compatvel com a idade ssea atrasada nesses indivduos e que a altura final aproximava-se dos limites inferiores da normalidade no final da segunda dcada de vida. Os

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homens atingiam uma estatura final mdia de 162,5 +/- 5,4 cm e as mulheres, 152,7 +/- 5,7 cm. Noonan et al. (2003) avaliaram a estatura de 73 adultos (acima de 21 anos de idade) com SN, sem a utilizao de hormnio de crescimento. A baixa estatura nas mulheres era mais importante, com 54,5% delas com estatura abaixo do percentil 3, contra 38% dos pacientes do sexo masculino.

1.3.10. Deficincia mental

H poucos trabalhos na literatura que analisaram as caractersticas cognitivas dos pacientes afetados pela SN. Nora et al. (1974), avaliando o coeficiente de inteligncia (QI) desses pacientes, observaram que eles apresentavam, em geral, um valor 10% inferior quando comparados ao QI de seus familiares. Uma avaliao mais detalhada foi realizada por Money e Kalus (1979) em oito afetados, com uma ampla variao no valor do QI (64 a 127). Seis deles apresentavam um QI dentro da variao da normalidade e um, apresentava um QI superior. Testes para reas cognitivas especficas mostraram uma disparidade entre as habilidades verbais e prxicas em apenas alguns pacientes. Os autores concluram que, embora a casustica fosse pequena, o envolvimento cognitivo varivel e que uma avaliao mais detalhada deveria ser sempre efetuada para a averiguao das reas mais acometidas, no intuito de se estimular especificamente estas deficincias.

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1.4. Diagnstico

O diagnstico da SN baseia-se primariamente em uma suspeita clnica. No h, entretanto, na sndrome, um sinal que seja patognomnico. o conjunto de vrios sinais que levar ao diagnstico clnico. Para tanto, critrios diagnsticos foram propostos por alguns autores (Duncan et al., 1981; van der Burgt et al., 1994). O mais utilizado o de van der Burgt et al. (1994) que estabelece o diagnstico da SN baseado nas caractersticas do quadro abaixo. Quadro 1 - Critrios diagnsticos da SN (van der Burgt et al., 1994)
Caractersticas clnicas Fcies Corao Estatura Trax Histria familiar A=major B=minor Tpico Sugestivo EPV e/ou ECG tpico Outro defeito cardaco <3 percentil <10 percentil Pectus carinatum/excavatum Trax largo Parente de 1 grau com diagnstico Parente de 1 grau com diagnstico definitivo de SN sugestivo de SN Outros Presena de: deficincia mental + Presena de: deficincia mental ou criptorquia + displasia linftica no criptorquia ou displasia linftica no sexo sexo masculino masculino O indivduo considerado afetado pela SN se apresentar o critrio maior fcies tpico associado a mais um critrio maior ou dois menores. Se o fcies for sugestivo (critrio menor), h necessidade da presena de mais dois critrios maiores ou trs menores.

A descoberta de um gene responsvel pela SN abriu a possibilidade de se realizar o teste molecular para a confirmao do diagnstico clnico. No entanto, mutaes no gene PTPN11 foram encontradas em

aproximadamente 50% dos afetados, mostrando haver heterogeneidade gentica na sndrome. Portanto, a presena da alterao gnica no gene PTPN11 em um paciente com caractersticas clnicas da SN confirma o diagnstico, mas a sua ausncia no exclui essa possibilidade.

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1.5. Diagnsticos diferenciais

1.5.1. Sndrome de Turner. Constitui-se no diagnstico diferencial mais importante nas pacientes do sexo feminino. A SN e a sndrome de Turner apresentam vrias caractersticas em comum, entre elas a baixa estatura, dismorfismos faciais como ptose palpebral, epicanto, orelhas displsicas, retromicrognatia, pterigium colli, baixa implantao de cabelos na nuca, cubitus valgus, hipertelorismo mamrio, hiperextensibilidade articular e linfedema de membros (De Majo et al., 1979). Quanto ao defeito cardaco, na sndrome de Turner as anomalias mais freqentes so aquelas que acometem o corao esquerdo, especialmente a estenose artica e a coartao da aorta, enquanto na SN a anomalia mais comum a estenose pulmonar valvar. Algumas caractersticas clnicas ocorrem exclusivamente em apenas uma das duas sndromes, como, por exemplo, a presena de ovrios disgenticos na sndrome de Turner, com conseqente infertilidade (Hall e Gilchrist, 1990). J a deficincia mental, que varivel na SN, rara na sndrome de Turner, embora as afetadas possam apresentar dificuldades em reas como relaes espaciais e habilidade numrica. A realizao do estudo cromossmico permite confirmar o diagnstico da sndrome de Turner. Aproximadamente 50% das afetadas apresentam uma constituio cariotpica 45,X. A presena de um isocromossomo X (duplicao de um brao do cromossomo X com perda do outro brao) ocorre em 12 a 20% dos casos. Mosaicismo (a presena de duas linhagens

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celulares diferentes quanto aos cromossomos sexuais) encontrada em 30 a 40% das afetadas pela sndrome de Turner. Raramente h anomalias cromossmicas estruturais envolvendo o cromossomo X e um autossomo (Hall e Gilchrist, 1990).

1.5.2. Sndrome de Williams. Caracteriza-se

por

anomalias

craniofaciais, como a fronte ampla, sobrancelhas espessas na sua poro medial, regio periorbital proeminente, estrabismo, ris com padro estrelado, ponte nasal rebaixada, regies malares hipoplsicas, filtro longo e hipoplsico, lbios grossos, boca grande e mento proeminente; deficincia mental, geralmente leve a moderada e anomalias cardacas, presentes em 75% dos casos. O defeito cardaco mais comum a estenose artica supravalvar, seguida da estenose das artrias pulmonares perifricas. A hipercalcemia, quando presente, pode levar a um quadro de dficit ponderal, vmitos, episdios de constipao alternados com diarria e, em alguns casos, nefrocalcinose. Outros achados na sndrome so: baixa estatura, microcefalia, pescoo longo, cifoescoliose, hrnia inguinal ou umbilical, unhas

hipoplsicas, hlux valgo e voz rouca (Burn, 1986). Bzdch (1995) comparou 10 pacientes com SN e 10 com sndrome de Williams e observou que a EPV estava presente em nove pacientes com SN e a estenose artica supravalvar em todos os afetados pela sndrome de Williams. A deficincia mental e o dficit estatural eram mais freqentes na

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sndrome de Williams. Alm disso, os dismorfismos faciais so tpicos para cada doena. A sndrome de Williams decorre de uma microdeleo no brao longo do cromossomo 7 (7q11.23), considerada uma sndrome de genes contguos. Esta deleo, na grande maioria dos casos, detectada pela tcnica da hibridizao in situ por fluorescncia (FISH). Os pacientes afetados apresentam uma hemizigosidade no lcus do gene da elastina entre outros, o qual est relacionado com algumas caractersticas da doena, como a estenose artica supravalvar, a voz rouca e o envelhecimento precoce da pele.

1.5.3. Sndrome de Aarskog. Caracteriza-se por baixa estatura; deficincia mental leve a moderada; dismorfismos faciais com hipertelorismo ocular, ptose palpebral, leve inclinao para baixo das fendas palpebrais, nariz curto com narinas antevertidas, ponte nasal alargada, hipoplasia maxilar, displasia auricular, filtro largo e presena de um sulco abaixo do lbio inferior; umbigo proeminente; braquidactilia e anomalias de genitlia com criptorquia e escroto em cachecol (Porteous e Goudie, 1991). Trata-se de uma doena gnica de herana recessiva ligada ao cromossomo X, cujo gene FGDY localiza-se no brao curto do cromossomo X (Pasteris et al., 1994).

1.5.4. Sndrome de Alcoolizao Fetal. determinada pela ingesto materna de bebida alcolica durante a gestao.

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Os pacientes afetados apresentam um retardo de crescimento pr e ps-natal, disfuno do sistema nervoso central e anomalias faciais, representadas por fendas palpebrais estreitas, nariz curto com narinas antervertidas, filtro hipoplsico, lbio superior fino e hipoplasia maxilar. Pode haver tambm ptose palpebral e inclinao para baixo das fendas palpebrais (Clarren e Smith, 1978). A deficincia mental uma das caractersticas mais comuns e graves associada teratogenicidade pelo etanol. Distrbios comportamentais como hiperatividade e dficit de ateno podem tambm estar presente.

1.6. Prognstico e tratamento

O prognstico dos afetados est diretamente relacionado presena ou no das diferentes malformaes. A anomalia que mais preocupa na SN a cardaca. O grau de displasia e obstruo causada pela EPV varivel. Em muitos pacientes, apesar da valva ser displsica, no h sinais de obstruo ou regurgitao. Entretanto, em alguns deles ocorre uma obstruo progressiva a partir dos dois anos de idade, o que no observado em indivduos com EPV no sindrmica (Noonan e OConnor, 1996). Pelo fato da valva ser displsica, muitas vezes a valvuloplastia com balo no efetiva em abolir a obstruo da sada do ventrculo direito. Muitas crianas, portanto, necessitam de tratamento cirrgico com resseco completa da valva e dos feixes musculares anmalos (Noonan e OConnor, 1996).

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A miocardiopatia hipertrfica tambm apresenta uma variabilidade grande de apresentao na SN e quando sintomtica, est associada com uma mortalidade significativa, mesmo na lactncia. A incidncia de morte sbita, comumente descrita na forma no sindrmica, no conhecida na SN, mas sua ocorrncia j foi observada (Ishizawa et al., 1996). O tratamento dessa anomalia cardaca no difere da forma no sindrmica, com utilizao de agentes receptores -adrenrgicos e bloqueadores dos canais de clcio. A cirurgia recomendada naqueles casos com obstruo da sada do ventrculo esquerdo que no respondem aos medicamentos. O procedimento mais utilizado tem sido a miectomia-miotomia septal ventricular transartica (procedimento de Morrow). O transplante cardaco j foi realizado em alguns pacientes com miocardiopatia hipertrfica e SN. Na presena de anomalias valvares ou na miocardiopatia hipertrfica, a profilaxia da endocardite bacteriana deve ser realizada. Embora cada vez mais utilizado, o emprego do hormnio de crescimento sinttico na SN ainda controverso. Alguns trabalhos mostram um aumento da velocidade de crescimento nos afetados (Ahmed et al., 1991; Cotterill et al., 1996), mas poucos so os pacientes que atingiram a sua estatura final, o que permitiria melhor caracterizao da eficcia do hormnio para o crescimento. Em um trabalho recente (Ferreira et al., 2005), os autores utilizaram o hormnio de crescimento sinttico em sete pacientes com SN que apresentavam mutaes no gene PTPN11 e em sete, sem mutaes, por um perodo de trs anos. A mdia de idade dos afetados era de 12,3 anos e

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a idade ssea de 9,8 +/- 2,7 anos. Apesar de haver um aumento da velocidade de crescimento em ambos os grupos, essa velocidade foi maior naquele grupo sem mutaes no gene PTPN11, alm de um maior aumento nos nveis de IGF-I. Esses achados sugerem que alteraes nesse gene acarretam um efeito negativo na terapia hormonal, possivelmente por interferncia na via de sinalizao do hormnio de crescimento. A infertilidade nos pacientes do sexo masculino parece estar associada presena da criptorquia bilateral. Elsawi et al. (1994) estudaram 11 adultos afetados pela SN, com seis deles apresentando criptorquia bilateral corrigida cirurgicamente com uma idade mdia de 5,5 anos. Os autores observaram que em cinco deles os nveis plasmticos de FSH eram elevados e quatro deles apresentavam oligospermia ou azospermia. Na eventualidade de um procedimento cirrgico, uma ateno especial deve ser dada aos distrbios de hemostasia nos afetados pela SN.

1.7. Aspectos genticos

A etiologia da SN tem sido objeto de investigao h dcadas. Inicialmente, pelas semelhanas entre o quadro clnico da SN e o da sndrome de Turner, a possibilidade da SN ser uma aberrao cromossmica foi levantada, mas no confirmada nos casos tpicos (Fraccaro et al., 1961; Steiker et al., 1961). Evidncias de que a SN era uma doena gnica de herana autossmica dominante surgiram a partir da descrio de casos familiais,

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com transmisso vertical de pai para filho (Levy et al., 1970). Atualmente esta herana amplamente aceita, catalogada com o nmero *163950 por McKusick (1998). Como comum para a maioria das doenas gnicas de herana autossmica dominante, a expressividade bastante varivel, ou seja, as manifestaes fenotpicas variam em pessoas que apresentam o mesmo gentipo.

1.7.1. A descoberta do gene responsvel pela SN

Pela associao da SN com neurofibromatose tipo 1 - NF1 (Allanson et al., 1985), o primeiro gene testado como possvel candidato para a sndrome de Noonan foi o NF1, localizado no brao longo do cromossomo 17 (17q11). Entretanto, nos casos tpicos da SN, sem evidncias de neurofibromatose, no foram encontradas alteraes neste gene (Flintoff et al., 1993; Alhbom et al., 1995). De forma semelhante, a regio 22q11 tambm foi aventada como possvel localizao do gene responsvel pela SN. Wilson et al. (1993) descreveram um paciente que apresentava a sndrome de DiGeorge, sabidamente reconhecida como uma microdeleo da regio 22q11, associada a um fentipo Noonan. Os autores sugeriram que a ocorrncia de ambas patologias em um mesmo indivduo poderia ser explicada por uma das seguintes quatro possibilidades: associao ao acaso das duas doenas; o fentipo Noonan seria conseqncia de um desenvolvimento

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anormal do 3 e 4 arcos branquiais; mais de um gene estaria deletado no probando e um deles seria responsvel pelo fentipo Noonan; ou vrios outros genes secundrios contribuiriam para o fentipo Noonan em adio a um gene principal, sendo que o gene acometido na sndrome de DiGeorge atuaria de alguma forma no fentipo Noonan. A ausncia de deleo da regio 22q11 em quatro pacientes com SN e defeitos conotruncais, os quais no so comuns na SN, mas esto freqentemente relacionados deleo do cromossomo 22q11, levou excluso desta regio como a responsvel pela localizao do gene da SN (DiGiglio et al., 1996). Em 1994, Jamieson et al. mapearam o gene da SN no brao longo do cromossomo 12, na regio 12q22-qter, entre os marcadores D12S84 e D12S366, a partir do estudo por anlise de ligao de uma famlia com oito afetados em trs geraes. Os autores tambm demonstraram haver heterogeneidade de lcus no caso de uma outra famlia em que um dos afetados herdou um hapltipo totalmente diferente de sua irmandade afetada. O estudo de outra famlia com oito afetados pela SN e dois afetados pela sndrome cardiofaciocutnea (caracterizada por um fentipo Noonan com um envolvimento ectodrmico e neurolgico mais acentuados) em quatro geraes, delimitou a regio do lcus gnico da SN para 5cM, entre os marcadores D12S84 e D12S1341 (Legius et al., 1998). Com a regio crtica do gene da SN melhor determinada, genes candidatos, localizados neste intervalo cromossmico, foram testados. Crosby et al., (1998) estudaram cinco desses genes situados no brao longo

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do cromossomo 12 MYL2, DCN, EPS8, HMGI-C e RPL6. Trs destes genes (EPS8, DCN, HMGI-C) foram excludos pela tcnica da hibridizao in situ por fluorescncia por no estarem localizados dentro do intervalo crtico, Para a anlise dos dois outros genes, empregou-se a tcnica do SSCP (polymorphism conformation of single strand) e nenhuma mutao foi encontrada. Somente em dezembro de 2001, Tartaglia et al. (2001) constataram que o gene PTPN11, previamente clonado em 1993 por Ahmad et al., era o responsvel pela sndrome de Noonan. Estes autores consideraram-no como um candidato, uma vez que ele localizava-se na regio 12q24.1 e o seu produto protico, SHP-2, era essencial em vrias vias de transduo que controlam diversos processos do desenvolvimento, incluindo a valvulognese semilunar. Foram estudadas inicialmente duas famlias (uma com quatro afetados em trs geraes e outra com trs afetados em duas geraes) e mutaes missense ou de sentido trocado foram encontradas no xon 3 da regio codificadora do gene. Estas alteraes gnicas foram consideradas patognicas pelo fato de segregarem com o fentipo Noonan nessas famlias, estarem ausentes nos parentes no afetados, no estarem presentes em 200 controles e afetarem resduos altamente conservados evolutivamente. Comprovava-se assim que o gene PTPN11 era o gene responsvel pela SN. Outros 22 propsitos com SN (casos espordicos ou de pequenas famlias, cujo estudo de ligao no havia sido informativo para a regio

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12q24.1) tambm foram avaliados e mutaes missense foram encontradas em apenas metade desses indivduos, demonstrando que na sndrome h heterogeneidade de lcus , como previamente indicado pelo trabalho de Jamieson et al. (1994). O gene PTPN11, com mais de 100Kb de extenso, composto por 16 xons (Tartaglia et al., 2001). O xon 1 contm a regio 5 no-traduzida, o cdon iniciador ATG e alguns cdons adicionais e o xon 15 possui um cdon de parada. O padro de expresso do gene foi explorado em camundongos e seres humanos. Um transcrito de 7,0Kb foi detectado em diversos tecidos (corao, crebro, pulmes, fgado, msculo esqueltico, rins e pncreas), sendo que os maiores nveis foram observados no corao e no msculo esqueltico nos seres humanos e no corao e tecidos neuro-ectodrmicos nos camundongos (Ahmad et al., 1993).

1.7.2. Espectro de mutaes

Estudos moleculares mostraram mutaes na regio codificadora do gene PTPN11 em uma porcentagem que variou entre 29% (Musante et al., 2002) e 60% (Zenker et al., 2004), mas a maioria dos pesquisadores obteve uma positividade em torno de 45% (Tartaglia et al., 2002; Yoshida et al., 2004a). Com exceo de uma deleo de trs pares de bases no xon 3 (Yoshida et al., 2004b) todas as outras mutaes descritas na SN (Grfico 1)

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foram missense (Tartaglia et al., 2001; Kosaki et al., 2002; Maheshwari et al., 2002; Musante et al., 2002; Tartaglia et al., 2002; Sarkozy et al., 2003; Schollen et al., 2003; Loh et al., 2004; Yoshida et al., 2004a; Zenker et al., 2004; Jongmans et al., 2005) e localizavam-se preferencialmente nos xons 3, 8 e 13 (Tartaglia et al., 2002).

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Grfico 1 - Mutaes j descritas em pacientes afetados pela SN

Leu560Phe Gln506Pro Met504Val Gly503Arg Ser502Thr Arg501Lys Thr468Met Thr411Met Ile309Val Asn308Ser Asn308Asp Phe285Ser Phe285Leu Tyr279Cys Ile282Val Gln256Arg Glu139Asp Glu139Asp Glu139Asp Glu111Ala Asp106Ala Gln79Arg Gln79Pro Glu76Asp Glu76Asp Thr73Ile Ala72Gly Ala72Ser Phe71Leu Glu69Gln Tyr63Cys Tyr62Asp Asp61Gly Asp61Asn DelGly60 Gly60Ala Asn58Lys Asn58Asp Thr42Ala Thr2Ile 0

1 1 7 3 3 1 2 1 1 5 41 3 2 2 3 1 1 1 1 1 4 14 2 3 1 13 4 5 1 2 19 9 8 2 1 2 1 1 6 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Exon 14

Exon 13

Exon 12

Exon 11

Exon 8

Exon 7

Exon 4

Exon 3

Exon 2

Exon 1

FONTE: Tartaglia et al., 2001; Kosaki et al., 2002; Maheshwari et al., 2002; Musante et al., 2002; Tartaglia et al., 2002; Sarkozy et al., 2003; Schollen et al., 2003; Loh et al., 2004; Yoshida et al., 2004a; Zenker et al., 2004; Jongmans et al., 2005

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1.7.3. Correlao gentipo-fentipo

Vrias tentativas de se estabelecer uma correlao gentipo-fentipo foram realizadas, mas ainda no h um consenso quanto a esta associao. Inicialmente, Tartaglia et al. (2002) compararam os diversos achados clnicos em pacientes com SN que apresentavam mutao no gene PTPN11 com aqueles sem mutao no gene, em um total de 119 indivduos. Uma associao estatisticamente significante foi observada entre pacientes com mutaes no gene PTPN11 e a presena de estenose pulmonar (70,6% x 46,2%; P=0,008). Por outro lado, a miocardiopatia hipertrfica foi encontrada numa porcentagem bem menor neste grupo de pacientes com mutao, diferena esta tambm estatisticamente significante (5,9% x 26,2%; P=0,004). A mesma associao pacientes com mutao no gene PTPN11 e uma maior freqncia de estenose pulmonar foi observada por Zenker et al. (2004). Entretanto, esse achado no foi reproduzido no trabalho de Musante et al. (2002). Estes autores realizaram o estudo molecular em 79 propsitos com SN e obtiveram uma freqncia semelhante de estenose pulmonar valvar no grupo de pacientes com mutao no gene PTPN11 e naqueles sem mutao. O mesmo ocorreu no trabalho de Sarkozy et al. (2003), em 71 afetados pela sndrome de Noonan. Zenker et al. (2004) obtiveram uma diferena estatisticamente significante em pacientes com mutao no gene PTPN11 e que apresentavam baixa estatura, deformidade torcica e hematomas

freqentes, quando comparados com aqueles sem mutao no gene.

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Sem levar em considerao uma anlise estatstica, Musante et al. (2002) relataram que as caractersticas clnicas mais comuns, com uma freqncia acima de 90%, encontradas em pacientes com SN e mutaes no gene PTPN11, foram a criptorquia nos meninos e a baixa estatura. J as caractersticas craniofaciais mais freqentes neste grupo foram as orelhas baixo implantadas e a inclinao para baixo das fendas palpebrais. Os autores ressaltaram que o hipertelorismo ocular, considerado um dos achados mais importantes da SN, estava presente em apenas metade dos afetados. Defeitos cardacos foram observados em 87,5%, sendo o mais comum, a estenose pulmonar valvar. Jongmans et al. (2005) tambm observaram que a criptorquia era a caracterstica mais comum (84%), juntamente com o fcies tpico (86%), no grupo de pacientes afetados pela SN e mutaes no gene PTPN11. Mais uma vez, a estenose pulmonar valvar era o defeito cardaco mais comum. A tentativa de se estabelecer uma correlao estreita entre uma mutao especfica e o fentipo da SN no tem sido muito frutfera. A nica exceo parece ser o desenvolvimento de uma doena mieloproliferativa (leucemia mielomonoctica juvenil) na sndrome e a mutao T73I. Apesar da mutao no ser especfica, vrios pacientes com SN e esse tipo de leucemia foram descritos (Tartaglia et al., 2003; Loh et al., 2004). H, no entanto, o relato de um afetado com anomalias hematolgicas apresentando a mutao G417C (Musante et al., 2002). Por outro lado, em alguns pacientes com SN e a mutao T73I no h descrio de qualquer distrbio mieloproliferativo (Tartaglia et al., 2002; Zenker et al., 2004).

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1.7.4. Expressividade varivel X Penetrncia incompleta

A penetrncia nunca foi analisada de forma sistemtica, embora a expressividade na SN seja amplamente reconhecida como varivel. O trabalho de Tartaglia et al. (2002) mostrou evidncias que sugerem que a penetrncia na SN praticamente completa. Nos 28 casos familiais, as alteraes gnicas foram identificadas em todos os indivduos considerados como afetados. J nos 26 casos espordicos com mutaes no gene PTPN11, apenas um genitor foi identificado como apresentando mutao.

1.7.5. Produto protico do gene PTPN11 SHP2

O gene PTPN11 codifica uma protena no receptora SHP2 , a qual faz parte de uma pequena sub-famlia de protenas citoslicas tirosina fosfatases (PTP) citoplasmticas, agindo como transdutora de sinalizaes intracelulares. Ela composta por dois domnios (N-SH2 e C-SH2) na regio aminoterminal, por um nico domnio cataltico (PTP) e, na regio carboxi-terminal h dois locais de fosforilao e uma cauda rica em prolina, com um total de 593 aminocidos. Dados obtidos por cristalografia mostraram que o domnio N-SH2 interage com o domnio PTP na conformao inativa, bloqueando o stio cataltico da enzima (Hof et al., 1998). Aps a ligao de um fosfopeptdeo

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no domnio N-SH2, uma mudana na conformao da protena diminui a interao entre os domnios N-SH2 e PTP, tornando o stio catallico disponvel para o substrato. As mutaes encontradas em afetados pela SN concentravam-se nessa regio de interao entre os domnios N-SH2 e PTP, sendo que estudos prvios sugerem que as mutaes estabilizariam o SHP-2 na sua conformao ativa, levando a um ganho de funo (Tartaglia et al., 2001). A protena tirosina fosfatase apresenta um papel fundamental no desenvolvimento embrionrio, uma vez que est envolvida na diferenciao do mesoderma, no desenvolvimento de membros, na diferenciao das clulas hematopoiticas e na valvulognese semilunar (Chen et al., 2000). Ela necessria para a ativao da cascata Ras/proteno-quinase ativadora de mitognio (MAPK) induzida pelos fatores de crescimento de hepatcitos, epidrmicos e de fibroblastos.

1.7.6. Modelo Animal

Araki et al. (2004) criaram um camundongo knock-in expressando a mutao D61G. Quando em homozigose, a mutao foi embrionicamente letal, com a presena de hemorragia, edema, defeitos cardacos graves e necrose heptica. Os camundongos heterozigotos tambm apresentavam uma

diminuio da viabilidade em 50%. Os sobreviventes apresentavam um

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fentipo caracterizado por baixa estatura; dismorfismos faciais com uma tendncia a um fcies de formato triangular e hipertelorismo ocular; cardiopatia, especialmente com acometimento da valva mitral e o desenvolvimento de uma doena mieloproliferativa de curso benigno. Os defeitos cardacos observados foram dependentes da dosagem gnica. Os homozigotos apresentavam uma estenose poli-valvar grave, defeitos septais amplos, dupla via de sada do ventrculo direito, entre outros. Aproximadamente 50% dos camundongos heterozigotos tambm apresentavam defeitos cardacos importantes, embora com uma menor gravidade que os observados nos homozigotos. Nos restantes, os achados eram bem mais leves, indicando que outros alelos modificadores eram responsveis pela variao fenotpica. Os estudos bioqumicos realizados mostraram que o ganho de funo da mutao D61G nos coxins endocrdicos agia de forma semelhante ao produto gnico da neurofibromatose tipo I (neurofibromina), com um aumento da atividade da via Ras-Erk, aumento da proliferao celular e diminuio da apoptose local. Estes achados sugerem que os produtos gnicos da SN e da neurofibromatose tipo I atuam em vias de sinalizao similares. Outro achado comum SN e neurofibromatose tipo I o desenvolvimento de uma doena mieloproliferativa, sendo possvel que mutaes nos genes dessas duas doenas atuem sobre os

hemangioblastos, progenitores das clulas hematopoiticas e algumas clulas endoteliais.

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A gerao de um modelo animal para o estudo da SN permitir uma melhor compreenso da patognese da doena, com definio da atuao da protena SHP2 nas vias de sinalizao.

1.7.7. Sndromes com quadro clnico semelhante SN e o gene PTPN11

O gene PTPN11 foi tambm estudado como um possvel responsvel pela etiologia de sndromes que apresentam um quadro clnico muito semelhante ao da SN. A sndrome de LEOPARD uma doena autossmica dominante, cujo acrnimo define suas caractersticas clnicas principais: manchas lentiginosas, anormalidades eletrocardiogrficas, hipertelorismo ocular, estenose pulmonar, anormalidade de genitlia, retardo de crescimento e surdez. Para o diagnstico clnico da sndrome, Voron et al. (1976)

estabeleceram critrios diagnsticos os quais incluem a presena de manchas lentiginosas associadas a duas outras caractersticas clnicas ou a presena de um parente de primeiro grau com essas manchas associada a outros trs achados no paciente em questo. Mutaes missense (Tabela 1) foram encontradas em torno de 80% dos afetados, especialmente a Y279C e a T468M, localizadas nos xons 7 e 12 do gene PTPN11, respectivamente. Outras alteraes gnicas

envolvendo esses dois xons, assim como o xon 13 foram descritas posteriormente em menor freqncia (DiGilio et al., 2002; Legius et al., 2002; Conti et al., 2003; Froster et al., 2003; Sarkozy et al., 2003; Digilio et al.,

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2004; Keren et al., 2004; Sarkozy et al., 2004a e b; Yoshida et al., 2004a; Kalidas et al., 2005; Paradisi et al., 2005). A mutao Y279C foi descrita tambm em pacientes com diagnstico de SN (Tartaglia et al., 2002; Yoshida et al., 2004a). Entretanto, vale ressaltar que um dos pacientes descritos, com idade inferior a seis anos, apresentava apenas manchas caf com leite. Na sndrome de LEOPARD as manchas lentiginosas aparecem tardiamente, por volta dos cinco ou seis anos de idade e, portanto, o diagnstico da sndrome de LEOPARD nessas crianas no pode ser afastado. Apesar dessas descries, as mutaes no gene PTPN11

encontradas na sndrome de LEOPARD e as mutaes na SN so distintas, praticamente exclusivas de cada sndrome, indicando que as duas doenas so condies allicas. Tabela 1 - Mutaes j descritas na sndrome de LEOPARD
xon Troca de nucleotdeo Troca de aminocido N de probandos

7 A836G Y279C 25 7 A836C Y279S 2 12 G1381A A461T 2 12 G1391C G464A 2 12 C1403T T468M 18 13 C1492T A498L 1 13 G1493T A498W 1 13 A1517C Q506P 2 13 A1529C Q510P 3 FONTE: DiGilio et al., 2002; Legius et al., 2002; Conti et al., 2003; Froster et al., 2003; Sarkozy et al., 2003; Digilio et al., 2004; Keren et al., 2004; Sarkozy et al., 2004a e b; Yoshida et al., 2004a; Kalidas et al., 2005; Paradisi et al., 2005

A sndrome de Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes (SNL), descrita por Cohen et al. (1974), caracteriza-se pela presena de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor/ inteligncia no limite inferior da normalidade, baixa estatura, hipertelorismo ocular, orelhas proeminentes e

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posteriorizadas, cardiopatia congnita (EPV) e leses de clulas gigantes em ossos, principalmente na mandbula e maxila, articulaes e/ou partes moles do organismo. Ainda que a paciente descrita por Cohen et al. (1974) apresentasse caractersticas tanto da SN como da sndrome de LEOPARD, os autores sugeriram que se tratava de uma doena distinta. Contra esta idia, Bertola et al. (2001) descreveram uma famlia de trs afetados com quadro clnico tpico da SN, incluindo ditese hemorrgica, e leses de clulas gigantes na mandbula e maxila em dois deles. O estudo de ligao realizado nesta famlia mostrou que os afetados apresentavam o mesmo hapltipo na regio 12q, local do gene responsvel pela SN. Os autores sugeriram que as leses de clulas gigantes poderiam fazer parte do espectro da SN e, portanto, a SNL no seria uma doena distinta. Com a identificao do gene responsvel pela SN (PTPN11) no intervalo cromossmico 12q24 (Tartaglia et al., 2001), o estudo molecular deste gene na famlia descrita por Bertola et al. (2001) mostrou a presena da mutao N308S, a qual tambm foi encontrada em pacientes com SN e sem leses de clulas gigantes (Tartaglia et al., 2002). Comprovava-se

assim que a SNL no uma doena distinta. O desenvolvimento das leses de clulas gigantes parece decorrer do efeito de outro(s) gene(s) ou da interao gene-ambiente. Duas outras mutaes missense foram descritas posteriormente nos xons 3 (Asp106Ala) e 7 (Phe285Leu) (Lee et al., 2005). Da mesma forma, essas mutaes j tinham sido descritas em pacientes com SN sem leses

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aparentes de clulas gigantes, confirmando que essas leses fazem parte do espectro da SN.

A sndrome da neurofibromatose-Noonan (NFSN), caracterizada por manifestaes clnicas tanto da neurofibromatose tipo I (NF1) quanto da SN, pode decorrer de quatro mecanismos: 1) algumas caractersticas da SN fazem parte do espectro da NF1; 2) algumas caractersticas da NF1 fazem parte do espectro da SN; 3) a NFSN uma doena distinta; 4) coocorrncia de ambas as doenas em um indivduo. Mutaes no gene da NF1 foram descritas em pacientes com quadro clnico compatvel com NFSN (Baralle et al., 2003), sugerindo que o fentipo Noonan faz parte do espectro da NF1. Este achado foi recentemente confirmado pelo trabalho de De Luca et al. (2005). Estes autores, em uma casustica com 17 afetados pela sndrome, demonstraram que 16 deles apresentavam diferentes mutaes no gene NF1, mas no no gene PTPN11, indicando que o gene NF1 o principal responsvel pela sndrome da neurofibromatose/Noonan.

Por outro lado, na sndrome cardio-facio-cutnea (CFC) e na sndrome de Costello, no foram encontradas mutaes na regio codificadora do gene (Ion et al., 2002; Kavamura et al., 2003; Tartaglia et al., 2003), indicando que essas doenas so distintas da sndrome de Noonan. A sndrome CFC foi descrita por Reynolds et al. (1986) como uma nova sndrome de anomalias congnitas/retardo mental com envolvimento

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cardio-facio-cutneo. Ela caracterizada pela presena de macrocefalia; dismorfismos faciais (fronte alta, com constrico bitemporal, hipoplasia das cristas supraorbitrias, inclinao para baixo das fendas palpebrais, ponte nasal deprimida e orelhas posteriorizadas com hlices proeminentes); anomalias ectodrmicas, com cabelos esparsos e quebradios,

sobrancelhas esparsas e leses hiperqueratticas; cardiopatia congnita; retardo de crescimento e desenvolvimento e esplenomegalia. A etiologia da sndrome CFC ainda no conhecida.

A sndrome de Costello caracteriza-se por macrocefalia relativa, cabelos encaracolados, dismorfismos faciais, papilomas periorificiais, hiperelasticidade da pele das mos e ps, pregas palmares e plantares profundas, tonalidade mais escura de pele e deficincia mental (Costello, 1977; Costello, 1996). As anomalias cardiovasculares mais comuns na doena incluem a comunicao interventricular, a estenose pulmonar valvar e a miocardiopatia hipertrfica (Siwik et al., 1998). O gene responsvel pela sndrome (HRAS), envolvido na mesma via de sinalizao da protena SHP2, foi identificado por Aoki et al. (2005). Os autores descreveram quatro diferentes mutaes missense (G13D, G12S, G12A e G12V) em 12 de 13 pacientes com sndrome de Costello.

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1.7.8. O gene PTPN11 e leucemias/sndromes mielodisplsicas

A partir da observao de que pacientes com SN apresentam um risco aumentado de desenvolver uma leucemia mielomonoctica juvenil (LMMJ), Tartaglia et al. (2003) estudaram 62 crianas com LMMJ, mas sem SN. Os autores encontraram mutao apenas no tecido hematopoitico, consistente com mutaes missense somticas, em 34%. Pacientes com sndromes

mielodisplsicas e com leucemia mielide aguda tambm apresentavam mutaes no gene PTPN11, mas em uma proporo menor (10% e 4%, respectivamente) e, raramente, foram encontradas em adultos com estes distrbios hematolgicos (Watkins et al., 2004). Mutaes somticas no gene PTPN11 tambm foram implicadas na gnese das leucemias linfocticas agudas (Tartaglia et al., 2004). De forma semelhante ao estudo anterior, as mutaes foram diferentes das observadas na SN.

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OBJETIVOS

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2. OBJETIVOS

1. Determinar a proporo de pacientes com diagnstico clnico da SN que apresenta mutaes no gene PTPN11. 2. Determinar a proporo de pacientes com diagnstico clnico de sndromes com quadro clnico semelhante SN (sndrome de LEOPARD, sndrome da NFNS e SNL) que apresenta mutaes no gene PTPN11. 3. Estabelecer uma correlao gentipo-fentipo entre os pacientes que apresentam mutao no gene PTPN11 com aqueles sem mutao detectada.

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MTODOS

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3. MTODOS

3.1. Casustica

A casustica composta por 50 propsitos afetados pela SN, assim como trs propsitos afetados pela sndrome de LEOPARD, trs pela SNL e dois pela sndrome de NFSN (Tabela 2), avaliados na Unidade de Gentica Clnica do Instituto da Criana (ICr) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (HCFMUSP). Os parentes de primeiro grau foram examinados clinicamente e 16 destes foram tambm considerados afetados (13 com SN, dois com SNL e um com sndrome da NFNS), perfazendo um total no estudo de 74 pacientes.

Tabela 2 - Total de pacientes com SN e Noonan-like estudados no presente trabalho

Sndrome Noonan LEOPARD Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes Neurofibromatose-Noonan Total N propsitos 50 3 3 2 58 N parentes afetados 13 0 2 1 16

Trata-se de um estudo retrospectivo e prospectivo de pacientes com diagnstico clnico da SN e de sndromes Noonan-like (sndrome de LEOPARD, sndrome NFNS e SNL). Esses indivduos estudados foram selecionados no Ambulatrio de Gentica do Instituto da Criana do Hospital das Clnicas FMUSP. Tanto

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os pacientes com SN j em seguimento, como aqueles que foram avaliados inicialmente na confeco deste trabalho foram examinados por mim e s foram includos quando preenchiam os critrios diagnsticos propostos por van der Burgt et al. (1994). O projeto foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa do Hospital das Clnicas. O responsvel legal pelo probando deu o consentimento informado para participao nesta pesquisa.

3.2. Protocolo

A avaliao clnica foi baseada em um protocolo que incluiu a anamnese, o exame fsico completo com medidas antropomtricas para peso, estatura, permetro ceflico, distncia intercantal externa (DICE) e interna (DICI). A adequao do peso e estatura dos afetados seguiu os grficos de Marques et al. (1982) e o permetro ceflico, o de Neelhaus (1968). A baixa estatura foi assim considerada quando situava-se abaixo do percentil 2,5. J, o hipertelorismo ocular foi considerado quando a distncia interpupilar (DIP), calculada segundo a frmula de Pryor (1969) - DIP=DICEDICI/2+DICI -, localizava-se acima do percentil 97 do grfico de Feingold e Bossert (1974). O levantamento genealgico e o histrico familiar foram obtidos atravs de informaes fornecidas pelos genitores e/ou responsveis pelo paciente. Todos os familiares de primeiro grau foram examinados sempre que possvel e, na sua impossibilidade, fotografias de diferentes pocas foram analisadas.

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Os exames complementares compreenderam a realizao de uma avaliao cardiolgica com eletrocardiograma e ecocardiograma, raio-X da coluna vertebral, ultra-som abdominal, avaliao oftalmolgica e

hematolgica (hemograma completo, coagulograma e dosagem do fator XI). O estudo cromossmico com banda G do sangue perifrico foi realizado em todos os probandos.

3.3. Estudo molecular

O estudo molecular do gene PTPN11, realizado no Laboratrio de Biologia Molecular do Instituto do Corao - InCor - foi baseado na tcnica da cromatografia lquida de alta preciso desnaturante (DHPLC) dos xons 2 a 15 em todos os propsitos. Naquelas amostras que apresentavam um perfil cromatogrfico alterado, pela tcnica do DHPLC, o seqenciamento do xon correspondente foi realizado. Nos casos familiais, o estudo molecular era realizado no propsito e, uma vez detectada uma mutao, o xon especfico era testado no parente afetado para confirmao. Nos casos aparentemente espordicos com mutao encontrada, o gentipo dos parentes de primeiro grau foi realizado, sempre que possvel.

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3.3.1. Extrao de DNA a partir de sangue total (Miller et al., 1988)

Para a extrao de DNA genmico dos propsitos foram coletados 4 ml de sangue de uma veia perifrica em um tubo contendo EDTA 5%. O sangue total foi transferido para um tubo de 15 ml, ao qual adicionou-se 6 ml de uma soluo de lise. O tubo foi agitado (vrtex), colocado na geladeira a 4 C por 10 minutos para a obteno da lise das membranas das hemcias e centrifugado a 4 C por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 10 ml de soluo de lise atravs de agitao, colocado novamente na geladeira e centrifugado. O sobrenadante foi descartado novamente e ressuspendido com 1,5 ml de uma soluo tampo, 100 ul de SDS 10% e 250 ul de uma soluo contendo proteinase K para a lise dos ncleos dos leuccitos. As amostras foram deixadas em uma estufa a 37 C por 12 a 18 horas. No dia seguinte, foi adicionado 500 ul de uma soluo de NaCl 6 M, misturado vigorosamente e centrifugado a 4 C por 20 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi tranferido para outro tubo de 15 ml, ao qual adicionou-se um volume de etanol a 100%. O DNA foi assim obtido e transferido para um novo tubo que j continha 1 ml de etanol a 70%. A amostra foi centrifugada a 4 C por 15 minutos a 13500 rpm, descartado o sobrenadante e o tubo foi deixado temperatura ambiente para secar bem. O DNA foi ento ressuspendido em 1 ml de TE 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0).

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3.3.2. Reao em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA genmico foi amplificado atravs da reao em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-se pares de primers (Tabela 3) que flanqueiam cada um dos 14 xons codificantes do gene PTPN11 xons 2 a 15, tanto para a realizao do seqeciamento quanto para a tcnica do DHPLC.

Tabela 3 - Seqncia dos primers utilizados para amplificao dos xons do gene PTPN11 e suas temperaturas de hibridizao
xon 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Primer forward CGA AAT GCA GGC AGC A GGT AAA ATC CGA CGT GGA GTG TTT AGG AGA GCT GA GAA TAA TGC TGC AGT GA TCA ACT GCT GTA CTC GA GAA CAT TTC CTA GGA TGA ATT CC GGC TGG GGA GTA ACT GA TCC TTC CTC ATG TCC TGA TTC TGA TCT CTT CCA GA AAG CTT AGA ACC GGG TGA GCT TGG TTT TGA GTC TGA GCA TTG TCT CTG AGT CCA AAC CAT TGT CCC TCA GCC CAA AGA ATG TAG TA Primer reverse AGC TGT GTT GTG GA AGC CTT TGG AGT CAG AGA GGT GTC TGT CTT CTG TCA ACC TCT GTC TGT TTG CA TCA AGT CTC TCA GGT CCA GGT ACA GAG GTG CTA GGA ATC A CTT TCA GGA CAT GAG GA CCT AAA CAT GGC CAA ATG CAT GCA TGT ATG CA AAG AGC TAG GAG TGG GTA CAA CCT CTC TTC CCC AGA CCT GTC CTC CTG CTC A AAA CCA CCA TGA CCA AAT TGC TTG CCT GCT TA Temp. (C) 61,8 53,4 61,8 53,7 61,8 56,0 50,5 59,6 50,5 50,5 50,5 53,4 56,7 59,6

A reao de PCR para o seqenciamento de cada xon continha 2 ul de DNA, 9 ul de um tampo com os quatro desosirribonucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e DTTP), 2 ul de cada primer em uma concentrao de 12,5 pm (F e R), 2,5 ul de DMSO a 5%, 0,25 ul da enzima Taq-polimerase e gua destilada para completar 50 ul. As amostras foram colocadas em um termociclador (Perkin-Elmer) com os seguintes ciclos programados: desnaturao inicial a 92 C por 3 minutos, desnaturao a 94 C por 30 segundos, hibridizao por 1 minuto, extenso a 72 C por 30 segundos e extenso final a 72 C por 10 minutos,

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em um total de 35 ciclos. A temperatura de hibridizao variou de acordo com o xon estudado (Tabela 3). Para a tcnica do DHPLC, realizou-se um PCR contendo 1,5 ul de DNA, 2,5 ul de um tampo, 0,5 ul de uma soluo com os quatro desosirribonucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e DTTP), 1 ul de cada primer em uma concentrao de 12,5 pm (F e R), 0,75 ul de MgCl2 50 mM, 0,125 ul da enzima Taq-polimerase Platinum e gua destilada para completar 25 ul. A ciclagem consistiu em desnaturao inicial a 94 C por 2 minutos, desnaturao a 94 C por 30 segundos, hibridizao por 30 segundos (Tabela 3), extenso a 72 C por 30 segundos e extenso final a 72 C por 10 minutos, em um total de 35 ciclos. Aps a reao de PCR, os produtos foram submetidos a uma desnaturao a 94 C por 10 minutos e resfriados lentamente at a temperatura ambiente. Os produtos de PCR amplificados, tanto para o seqenciamento como para a tcnica do DHPLC, foram submetidos eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etdio e observados em um transiluminador com luz ultravioleta.

3.3.3. DHPLC (cromatografia lquida de alta preciso desnaturante)

Nesta tcnica existe uma coluna de 4,6 mm preenchida com uma matriz porosa de gros de copolmero poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB), os quais so neutros, hidrofbicos e no reagem diretamente com o DNA. O buffer acetato de trietilamnia (TEAA) uma soluo on-pareante que atua

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promovendo a afinidade do DNA com os gros da coluna. A carga positiva do grupo amnia do TEAA se liga ao grupo fosfato da molcula de DNA, enquanto que os grupos hifrofbicos daquele ligam-se coluna, servindo como uma ponte entre a coluna e o DNA. Esta matriz da coluna refere-se fase estacionria do DHPLC. A fase mvel consiste da combinao de tampes que eluem o DNA da coluna, os quais contm acetonitrila. Conforme se aumenta a sua concentrao no fluxo, as interaes hidrofbicas entre o DNA e o TEAA so quebradas e assim o DNA solto. Nos indivduos que so heterozigotos para um nico nucleotdeo, aquecendo as amostras a 95 C e esfriando devagar, promove-se a hidridizao dos produtos de PCR e formao de mistura de homoduplex e heteroduplex (estruturas que possuem pores no pareadas de fita simples). Sob condies de desnaturao parcial, estas formaes de heteroduplex eluem mais rapidamente da coluna, permitindo a diferenciao entre eles. O programa que acompanha o sistema computacional de aparelho ajuda na escolha da temperatura ideal desta coluna, baseada na seqncia de DNA do fragmento a ser eludo. Os fragmentos so detectados por um sistema de luz ultravioleta e os resultados so apresentados como cromatogramas. Foram inicialmente preparadas 4 solues tampes: Tampo A: 50 ml de TEAA e 250 ul de acetonitrila em 1 litro de gua; Tampo B: 50 ml de TEAA e 250 ml de acetonitrila em 1 litro de gua; Tampo C: 80 ml de acetonitrila em 1 litro de gua;

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Tampo D: 750 ml de acetonitrila em 1 litro de gua. Os tampes C e D so usados para lavagem do sistema. Uma planilha foi construda no computador ligado ao sistema com parmetros a serem definidos, como a localizao da amostra na placa, o volume de injeo da amostra, tipo de aplicao, nome da amostra, seqncia do xon estudado, temperatura de corrida j estabelecida previamente, tempo de reteno na coluna. O sistema composto de quatro mdulos, sendo que o 1 possui as vlvulas que fazem as misturas dos tampes. Uma lavagem do sistema para eliminao de bolhas e detritos foi realizada no incio. As amostras amplificadas de forma satisfatria foram colocadas no mdulo 2. Para cada anlise, uma agulha retirou 8ul da amostra a qual foi levada por um capilar coluna (mdulo 3), juntamente com o tampo. Para a formao de homo e heteroduplex, as amostras so aquecidas a 95 C e posteriormente esfriadas para que ocorra uma desnaturao parcial, com temperaturas previamente estabelecidas (Tabela 4). Com o aumento da concentrao da acetonitrila no fluxo, as interaes hidrofbicas entre o DNA e o TEAA so quebradas e assim o DNA solto. Em algumas situaes, devido prpria seqncia de DNA a ser eludo, que varivel quanto ao seu contedo GC, a temperatura tima para a diferenciao de fragmentos homo e heterozigotos pode variar para cada poro deste fragmento. Por exemplo, os primeiros 200 bp tm uma temperatura de eluio tima diferente dos ltimos 300 bp em um fragmento de 500 bp. Nesta situao, realizamos duas passagens independentes deste produto de PCR pelo

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DHPLC, cada qual com uma temperatura de eluio especfica. O Objetico deste procedimento tornar o mtodo mais sensvel e menos sujeito a resultados falso-negativos. No mdulo 4 a amostra passou por uma leitura por luz ultra-violeta, cujo resultado foi analisado por um programa de computador e representado como um cromatograma para posterior anlise.

Tabela 4 - Temperatura da coluna do DHPLC para desnaturao parcial da amostra especfica para cada xon
xon 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Temperatura (C) 58,5/56,5 57,8 55,5/60 55,5/57,8 55,5/57,5 56,7 56,8/58,8 56,2/60,2 57,9 59/61 58,5 59,8 57,5/63 54,9/57,8

3.3.4. Reao de seqenciamento

A purificao dos produtos de PCR foi realizada naqueles com amplificao satisfatria utilizando-se o E.Z.N.A. (easy nucleic acid isolation) cycle pure kit do Laboratrio Omega Bio-Tek. Para a realizao da reao de seqenciamento, utilizou-se o kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, o qual contm os didesoxirribonucleotdeos marcados com fluorocromos. Desta soluo,

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4 ul foram adicionados 1ul de primer em uma concentrao de 5 pmol/ul e 2 ul do produto de PCR purificado. O volume foi completado para 10 ul com gua MilliQ. Uma nova reao de PCR foi realizada com uma temperatura de desnaturao inicial de 96 C por 5 minutos e 25 ciclos incluindo 20 segundos a uma temperatura de 96 C, 10 segundos a 50 C e 4 minutos a 60 C. Ao fim da ciclagem, para precipitao do produto para posterior injeo no ABI PrismTM 377 (Perkin Elmer), acrescentou-se 50 ul de etanol a 80% e incubou-se por 20 minutos em temperatura ambiente. A soluo foi centrifugada por 45 minutos a 4 C e 4000 rpm e o etanol foi desprezado invertendo-se a placa e drenando-o em papel toalha. Centrifugou-se a placa por 1 minuto a 1000 rpm. Em seguida, adicionou-se 120 ul de etanol a 70% e novamente a placa foi colocada na centrfuga por 15 minutos a 4 C e 4000 rpm e o lcool desprezado. As amostras foram aquecidas a 95 C por 2 minutos no termociclador. Ao final, 2 ul de tampo de corrida contendo Blue Dextram e Formamida Deionizada foi acrescentado, homogeneizado em vrtex e desnaturado no termociclador a 90 C por 2 minutos. As amostras foram conservadas em gelo at o momento da aplicao no gel de seqenciamento bidirecional em equipamento ABI (utilizando o kit Big Dye Terminator Sequencing Kit) para realizao de uma eletroforese com durao de 8 horas. O gel foi confeccionado com 9 g de uria, 2,5 ml de long ranger, 5 ml de TBE 5X e 10,5 ml de gua MilliQ. o seqenciamento do xon em questo foi realizado para elucidao dessa alterao. O resultado

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destas reaes foi, ento, analisado em aparelho ABI Prism 377 da Perkin Elmer e os gentipos foram determinados utilizando os programas GeneScan v3.1.

3.4. Anlise estatstica

O teste exato de Fisher foi utilizado para anlise dos dados obtidos. Um valor P< 0,050 foi considerado estatisticamente significante.

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RESULTADOS

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4. RESULTADOS

4.1. Sndrome de Noonan

Os 50 propsitos (23 do sexo feminino e 27 do sexo masculino) que preenchiam os critrios de van der Burgt et al. (1994) foram includos nesse estudo. A idade cronolgica deles, por ocasio da realizao do estudo molecular, variou entre 3 meses e 24 anos e 1 ms, com mdia de 9 anos e 5 meses. A idade do diagnstico da SN variou entre 3 meses e 20 anos e 4 meses, com mdia de 5 anos e 9 meses. Oito dos 50 pacientes estudados eram casos familiais (16%), sendo metade de origem materna. Dos 50 propsitos estudados, 30 deles (60%) foram encaminhados do Instituto do Corao (InCor), 5 pacientes (10%) da Endocrinologia Peditrica do Instituto da Criana, 6 propsitos eram provenientes de diferentes especialidades (Neurologia, Hepatologia, Imunologia, Nefrologia e

Neonatologia) e 9 foram encaminhados da rede bsica de sade.

4.1.2. Estudo molecular na SN

Mutaes missense (Tabela 5) foram encontradas em 21 (18 espordicos e trs familiais) dos 50 propsitos (42%). Alguns exemplos destas mutaes podem ser vistos na Figura 1.

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Dentre os oito casos familiais, trs apresentavam mutaes no gene PTPN11 (37,5%), as quais segregavam nos parentes afetados. Uma paciente apresentava um irmo que j havia falecido por ocasio do estudo, no sendo, portanto, includo na casustica. Um desses casos familiais foi inicialmente considerado como um caso espordico, mas a mesma mutao encontrada na probanda (T411M) foi tambm observada na me e na irm. A me apresentava baixa estatura e um pescoo curto e a irm apenas um hipertelorismo ocular leve. Dentre os 42 casos espordicos, 18 pacientes apresentaram mutao de novo no gene PTPN11 (43%). Em quatro casos aparentemente

espordicos, o gentipo dos pais no foi realizado, seja por falta de disponibilidade ou recusa.

Tabela 5 - Mutaes encontradas nos propsitos com SN

xon Troca de aminocido N de propsitos 1 1 1 1 1 3 1 2 1 1 21 11 1 1 1 1 1 RG dos propsitos

3 3 3 3 3 3 3 4 8 8

G60A D61G Y62D Y63C T73I Q79R D106A E139D F285S N308S

11 T411M2 13 P491H2 13 P491S 13 M504V 13 S502L2 13 V508M2 (1) casos familiais (2) mutaes no descritas anteriormente

6030318J 5042700H 5110506I 6054054D 6109379A 5181532A/ 6056853G/ 5050940C 55373292J 6097858F/ 6106602J 6100175C 5245426A 6094675D/ 5220523D/ 6076224E 5222686B 5209601H 5353798G 5263313I 5168365G

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Normal

F285S

N308S

Figura 1 - Cromatograma do seqenciamento do xon 8 mostrando a mutao F285S comparada com o seqenciamento normal e a mutao N308S.

Detectamos duas mutaes silenciosas: uma troca de guanina para adenina na posio 162 do aminocido (D162D) e uma troca de guanina por adenina na posio 85 (H85H), consideradas como polimorfismos.

4.1.3. Aspectos clnicos na SN

Os pacientes com mutao no gene PTPN11 apresentavam, em geral, maior proporo de baixa estatura, inclinao para baixo das fendas palpebrais, m-ocluso dentria, displasia auricular, presena de

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cardiopatia, presena de estenose pulmonar valvar, hepatoesplenomegalia, anomalia renal, criptorquia, anomalias hematolgicas e anomalias vertebrais. Por outro lado, a miocardiopatia hipertrfica foi menos freqente neste grupo (Tabela 6). Os distrbios hematolgicos foram, entretanto, os nicos a atingirem uma diferena estatisticamente significante quando comparados os grupos de pacientes com SN e mutao no gene PTPN11 com aqueles sem mutao (0,043 P < 0,05) (Tabela 6). Os dismorfismos faciais de alguns dos pacientes com SN e mutaes no gene PTPN11 podem ser apreciados na Figura 4.

Tabela 6 - Distribuio dos achados clnicos dos propsitos com sndrome de Noonan (nmero de afetados/ total, %) com mutao e sem mutao no gene PTPN11
Achados clnicos Mutao + Mutao P Total

Baixa estatura 20/21 (95) 24/29 (83) 0,380 44/50 (88) Hipertelorismo ocular 8/21 (38) 14/29 (48) 0,569 22/50 (44) Inclinao ? das fendas 16/21 (76) 17/29 (59) 0,238 33/50 (66) Ptose palpebral 11/21 (52) 20/29 (69) 0,255 31/50 (62) Proptose 6/21 (29) 10/29 (34) 0,763 16/50 (32) Nervos corneanos espessados 1 7/16 (44) 9/23 (39) 1,000 16/39 (41) Fundo de olho alterado 2 2/16 (12,5) 4/23 (17) 1,000 6/39 (15) M-ocluso dentria 10/21 (48) 10/29 (34) 0,393 20/50 (40) Palato alto 7/21 (33) 11/29 (38) 0,774 18/50 (36) Displasia auricular 14/21 (67) 14/29 (48) 0,254 28/50 (56) Pescoo curto/alado 19/21 (90) 27/29 (93) 1,000 46/50 (92) Deformidade esternal 10/21 (48) 18/29 (62) 0,391 28/50 (56) Cardiopatia 19/21 (90) 24/29 (83) 0,684 43/50 (86) Estenose pulmonar valvar 14/21 (67) 14/29 (48) 0,254 28/50 (56) Miocardiopatia hipertrfica 2/21 (10) 4/29 (14) 1,000 6/50 (12) Hepatoesplenomegalia 5/21 (24) 5/29 (17) 0,723 10/50 (20) Anomalia renal 4/21 (19) 3/29 (10) 1,000 7/50 (14) Criptorquia 7/13 (54) 7/14 (50) 1,000 14/27 (52) Anomalia hematolgica 12/20 (60) 8/28 (29) 0,043 20/48 (42) Anomalia vertebral 9/20 (45) 6/27 (22) 0,205 15/47 (32) (1) Alm dos nervos corneanos espessados, a biomicroscopia evidenciou tambm a presena de embriotxon posterior e anomalia de Rieger. (2) As alteraes encontradas no fundo de olho foram: coloboma do nervo ptico/retina e coride, displasia do nervo ptico, alterao pigmentar macular, escavao do nervo ptico, FO mipico, FO tigride e descolamento de vtreo.

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As anomalias cardacas estavam presentes em aproximadamente 90% da nossa casustica, sendo as mais freqentes a estenose pulmonar valvar e a miocardiopatia hipertrfica (Tabela 7).

Tabela 7 - Anomalias cardacas nos propsitos com SN (nmero de afetados/ total, %) com mutao e sem mutao no gene PTPN11
Anomalias cardacas Estenose pulmonar valvar (EPV) Isolada EPV/CIA Outras associaes Miocardiopatia hipertrfica Defeitos septais (CIA e/ou CIV) EPIV/CIA Tetralogia de Fallot Dilatao discreta da raiz da aorta Prolapso da valva mitral Forame oval prvio/canal arterial Anomalia de Ebstein Mutao + 14/21(67) 5/14 (36) 5/14 (36) 4/14 (29) 2/21 (10) 2/21 (10) 1/21 (5) Mutao 14/29 (45) 5/14 (36) 3/14 (21) 6/14 (43) 4/29 (14) 1/29 (3) 1/29 (3) 1/29 (3) 1/29 (3) 1/29 (3) 1/29 (3) Total 28/50 (56) 10/28 (36) 8/28 (29) 10/28 (36) 6/50 (12) 3/50 (6) 1/50 (2) 1/50 (2) 1/50 (2) 1/50 (2) 1/50 (2) 1/50 (2)

As principais caractersitcas clnicas nos parentes afetados podem ser observadas na Tabela 8. A estatura final foi avaliada em nove parentes afetados. No grupo com mutao, a estatura nas quatro mulheres variou de 145,5 cm a 152,5 cm. J no grupo sem mutao no gene PTPN11, as duas mulheres tinham uma estatura final de 151 e 153 cm e nos trs homens, ela variou de 147,5 cm a 152 cm.

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Tabela 8 -

Achados clnicos nos parentes afetados pela SN (nmero de afetados/ total, %)

Mutao + 1/5 (20) 1/5 (20) 5/5 (100) 0/5 (0) 2/5 (40) 1/5 (20) 1/5 (20) 1/5 (20) 2/5 (40) 0/5 (0) 1/5 (20) 0/5 (0) 0/5 (0) Mutao 5/8 (62,5) 3/8 (37,5) 6/8 (75) 1/8 (12,5) 3/8 (37,5) 2/8 (25) 2/8 (25) 0/8 (0) 3/8 (37,5) 1/8 (12,5) 0/8 (0) 0/8 (0) 0/8 (0) 0/5 (0) 0,266 1,000 0,487 1,000 1,000 1,000 1,000 0,385 1,000 1,000 0,385 P Total 6/13 (46) 4/13 (31) 11/13 (85) 1/13 (8) 5/13 (38) 3/13 (23) 3/13 (23) 1/13 (8) 5/13 (38) 1/13 (8) 1/13 (8) 0/13 (0) 0/13 (0) 0/5 (0)

Achados clnicos Baixa estatura Hipertelorismo ocular Inclinao ? das fendas Ptose palpebral Proptose M-ocluso dentria Palato alto Displasia auricular Pescoo curto/alado Deformidade esternal Cardiopatia (EPV) Hepatoesplenomegalia Anomalia renal Criptorquia

4.2. Sndromes Noonan-like

Na sndrome de LEOPARD, dois pacientes do sexo feminino e um do sexo masculino, aparentemente casos espordicos, foram avaliados. Na sndrome Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes, um caso familial (me, filho e filha afetados) e dois casos aparentemente espordicos (um do sexo masculino e um do feminino) foram includos. Na sndrome de neurofibromatose/Noonan, duas pacientes foram estudadas.

4.2.1. Estudo molecular nas sndromes Noonan-like

A mutao Y279C no xon 7 (Figura 2) foi observada em todos os trs afetados pela sndrome de LEOPARD. Nos pacientes com SNL, a mutao N308S, foi encontrada apenas em um caso familial (Tartaglia et al., 2002).

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Uma paciente com sndrome de NFSN, com os seguintes achados: inclinao para baixo das fendas palepebrais, hipertelorismo ocular, orelhas posteriorizadas, pescoo curto, pectus carinatum, cardiopatia congnita estenose pulmonar valvar e coartao da aorta -, mais de seis manchas caf com leite (Figura 5), neurofibromas, eflides nas regies axilares e inguinais, ndulos de Lisch biomicroscopia e glioma do nervo ptico, apresentava mutao tanto no gene da SN (Q510R)(Figura 3), como no gene da NF1 (L844R). Nesse caso, a paciente herdou a mutao do gene PTPN11 do pai, considerado clinicamente afetado. Os genitores no apresentavam nenhuma caracterstica clnica de NF1 e o estudo molecular em ambos foi normal. No outro caso de NFSN nenhuma alterao gnica foi identificada.

Y279C

Normal

Figura 2 Cromatograma do seqenciamento do xon 7 mostrando a mutao Y279C (troca de uma adenina por uma guanina na posio 836 do nucleotdeo), comparada com o seqenciamento normal.

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Q510R

Normal

Figura 3 Cromatograma do seqenciamento do xon 13 mostrando a mutao Q510R. 4.2.2. Aspectos clnicos nas sndromes Noonan-like

Sndrome de LEOPARD

O fcies tpico (Figura 4), a presena de miocardipatia hipertrfica e as manchas lentiginosas estavam presentes em todos os trs afetados (Tabela 9).

Tabela 9 - Achados clnicos nos propsitos com sndrome de LEOPARD

Achados clnicos na sndrome de LEOPARD Baixa estatura Fcies tpico Fundo de olho alterado Miocardiopatia hipertrfica Alterao eletrocardiogrfica Criptorquia Manchas lentiginosas Dficit auditivo Anomalias hematolgicas (doena Willebrand e TTPA alargado) N 2/3 3/3 0/2 3/3 2/3 0/1 3/3 1/2 2/3

de

von

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Sndrome Noonan-like/ leses mltiplas de clulas gigantes

Os trs propsitos com sndrome de Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes apresentavam baixa estatura, dismorfismos faciais, cardiopatia congnita (estenose pulmonar valvar) e leses sseas com clulas gigantes multinucleadas (Tabela 10).

Tabela 10 - Achados clnicos nos propsitos com sndrome de Noonanlike/leses mltiplas de clulas gigantes e nos parentes afetados
Achados clnicos na sndrome Noonan-like/ leses mltiplas de clulas gigantes Baixa estatura Fcies tpico Nervos corneanos espessados Fundo de olho alterado Estenose pulmonar valvar com ou sem CIA Criptorquia Anomalias hematolgicas (doena de Von Willebrand e fator XI diminudo) Leses mltiplas de clulas gigantes Propsitos 3/3 3/3 2/3 0/3 3/3 2/2 2/3 3/3 Parentes afetados 2/2 2/2 0/2 0/2 1/2 1/2 1/2

Sndrome neurofibromatose-Noonan

Os propsitos afetados pela sndrome da neurofibromatose-Noonan apresentvam pelo menos trs critrios clnicos para o diagnstico da neurofibromatose (Tabela 11), alm do fcies tpico da SN (Figura 5).

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Tabela 11 - Achados clnicos nos propsitos com sndrome neurofibromatose-Noonan e nos parentes afetados
Achados clnicos na neurofibromatose-Noonan Baixa estatura Fcies tpico da SN Pescoo curto/alado Anomalia cardaca Manchas caf-au-lait (> 6) Eflides em axila e virilha Neurofibromas Glioma do nervo ptico Ndulos de Lisch sndrome Propsitos 0/2 2/2 1/2 2/2 2/2 2/2 1/2 1/2 2/2

da

Parentes afetados 0/1 1/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

Figura 4 Fotos de alguns dos pacientes com SN e sndrome de LEOPARD com mutaes no gene PTPN11 encontrados na nossa casustica.

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Figura 5 - Propsita com NFNS apresentando hipertelorismo evidente, eflides e vrias manchas caf com leite.

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DISCUSSO

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5. DISCUSSO

5.1 Sndrome de Noonan

Quando analisamos a totalidade de nossos pacientes com SN, independente da presena ou no de mutaes no gene PTPN11, observamos as seguintes freqncias de achados clnicos: Na literatura, a baixa estatura ocorre em torno de 50% dos afetados pela sndrome de Noonan (Sharland et al., 1992; Musante et al.,2002; Sarkozy et al., 2003) e, na nossa casustica, ela estava presente em 88% dos pacientes. Essa diferena pode ser explicada pelo fato do nosso servio ser um Hospital Tercirio, com pacientes apresentando, provavelmente, um quadro clnico mais exuberante. Outro fator importante a utilizao de critrios diagnsticos, o que, alm de homogeneizar mais a amostra, seleciona os pacientes com um quadro clnico mais tpico da doena. Vale ressaltar que no trabalho de Tartaglia et al. (2002), a baixa estatura estava presente em 73% dos afetados, mas no havia relato de como essa caracterstica foi avaliada, se abaixo do percentil 3% ou do 10%. Freqncia semelhante (72%) foi observada por Zenker et al. (2004), que considerou baixa estatura aquela localizada dois desvios-padro abaixo da mdia.

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A cardiopatia, outro sinal cardinal da sndrome de Noonan, encontrada em 50% dos pacientes (Nora et al., 1974; Mendez e Opitz, 1985; Noonan, 1994). No trabalho de Sharland et al. (1992), estudando afetados pela SN encaminhados por Pediatras, Cardiologistas Peditricos e Geneticistas Clnicos no Reino Unido, os autores observaram que apenas 12,5% destes indivduos apresentavam exames ecocardiogrficos normais. Eles atriburam a freqncia maior das anomalias cardacas ao fato de se ter mais segurana em se fazer o diagnstico da SN na presena de um defeito cardaco. Obtivemos tambm uma freqncia de anomalias cardacas superior a descrita na literatura (86%). provvel que isso decorra do fato dos pacientes terem sido encaminhados, na sua maioria, pelo Instituto do Corao (60%). Quanto aos tipos de anomalias cardacas, a estenose pulmonar valvar foi a mais comum na nossa amostra (56%), seguida da miocardiopatia hipertrfica (12%), no diferindo dos achados da literatura. A freqncia da criptorquia nos meninos afetados varia bastante na literatura, desde 41% (Sarkozy et al., 2003) at 77% (Tartaglia et al., 2002). Obtivemos em nossa casustica uma presena intermediria de 52%. Os achados clnicos nos parentes afetados com SN foram, em geral, menos freqentes que nos propsitos. As seguintes caractersticas clnicas atingiram uma diferena estatisticamente significante (P<0,050): baixa estatura, ptose palpebral, displasia auricular, pescoo curto e/ou alado,

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presena de cardiopatia e deformidade esternal, compatvel com um fentipo mais sutil nos parentes afetados. A estatura final observada em nove parentes afetados estava comprometida na quase totalidade deles, com exceo de uma mulher cuja estatura estava acima do percentil 10. Noonan et al. (2003) estudando 73 adultos com SN, observaram que aproximadamente 70% deles

apresentavam uma estatura final abaixo do percentil 10, indicando que embora o dficit diminua com o estiro de crescimento, que mais tardio na SN, ainda assim a estatura final situa-se abaixo do esperado para a idade. A sndrome de Noonan considerada uma doena gnica heterognea. Esta heterogeneidade tanto allica quanto de lcus. Neste ltimo caso, estudos prvios mostraram mutaes na regio codificadora do gene PTPN11 em uma porcentagem que variou entre 29% (Musante et al., 2002) e 60% (Zenker et al., 2004). No presente estudo, as mutaes foram encontradas em 42% da nossa amostra, dado este muito semelhante ao observado por Tartaglia et al. (2002) (45%) na anlise de uma casustica composta por 119 pacientes com SN (Tabela 12). No trabalho de Zenker et al. (2004), a maior taxa de mutaes observadas em sua amostra foi atribuda aos seguintes fatos: 1) o uso da tcnica de seqenciamento direto, ao invs do emprego da tcnica do DHPLC como screening inicial; 2) a maioria dos probandos estudados foram encaminhados da clnica de Cardiologia, levando a um aumento do nmero de pacientes que apresentavam defeitos cardacos. J se havia demonstrado que afetados pela SN com estenose pulmonar valvar apresentavam mais comumente

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mutaes no gene PTPN11 quando comparados com aqueles sem mutaes (Tartaglia et al., 2002). No presente trabalho, a incidncia de estenose pulmonar valvar nos pacientes com mutao no gene PTPN11 foi de 67%, valor este intermedirio entre o observado por Zenker et al. (2004) (74%) e o obtido por Tartaglia et al. (2002) (57%), o que poderia levar a um pequeno vis do nosso resultado. O fato de que uma grande porcentagem de pacientes com diagnstico clnico de SN, os quais preenchiam os critrios diagnsticos para a doena, no apresentar mutaes na regio codificadora do gene PTPN11 confirmou estudos anteriores que j indicavam que a SN uma sndrome heterognea. Jamieson et al. (1994) mostraram que algumas famlias com SN no apresentavam ligao para a regio crtica da localizao do gene em 12q24. Alm disso, van der Burgt e Brunner (2000) sugeriram que havia evidncias de uma forma da SN compatvel com um padro de herana autossmica recessiva. A regio codificadora do gene composta por 15 xons, mas as mutaes descritas em pacientes com SN concentram-se em trs xons especficos 3, 8 e 13. De fato, 86% das mutaes aqui encontradas localizavam-se nessas regies (Tabela 12). Este achado muito semelhante ao da literatura, uma vez que nos trabalhos houve uma variao entre 83 e 88% (Tartaglia et al., 2002; Musante et al., 2002; Sarkozy et al., 2003; Zenker et al., 2004; Jongmans et al., 2005). Por outro lado, a freqncia do envolvimento de cada um desses trs xons varia consideravelmente nos trabalhos descritos na literatura, como,

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por exemplo, de 35% (Sarkozy et al., 2003) a 70% (Musante et al., 2002) no xon 3. Na nossa casustica, mutaes no xon 13 foram observadas com uma freqncia bem maior (24%) quando comparada com outros estudos, mostrando ser um local comum de mutaes na nossa populao. No xon 8 um hot spot foi encontrado na regio onde localizam-se os resduos 308 e 309. No caso do xon 3, as mutaes esto mais espalhadas, sem uma regio preferencial.

Tabela 12 - Freqncia de mutaes (%) encontradas nos probandos com SN e especificamente nos xons 3, 8 e 13 em diferentes estudos e no presente trabalho
Mutaes Tartaglia al., 2002 45 41 39 7 87 et Musante al., 2002 29 70 17 0 87 et Sarkozy al., 2003 32 35 39 9 83 et Zenker al., 2004 60 50 26 12 88 et Jongmans et al., 2005 45 46 27 14 8 Presente trabalho, 2006 42 43 19 24 86

Geral xon 3 xon 8 xon 13 Soma (3, 8 e 13)

A mutao considerada mais comum a N308D no xon 8 (Tartaglia et al., 2002 31%; Zenker et al., 2003 18%; Sarkozy et al., 2003 30%), seguida pela Y63C e Q79R localizadas no xon 3. A mutao N308S (14%), juntamente com a Q79R (14%), foram as mais frequentes na nossa casustica (Tabela 5). O fato de no encontrarmos nenhum probando em nosso trabalho com a mutao considerada mais comum, sugere que a

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mutao N308D no freqente na nossa populao, embora o resduo 308 continue a ser um local importante de ocorrncia de mutao. As alteraes gnicas no descritas anteriormente identificadas no nosso trabalho foram a T411M, localizadas no xon 11, a S502L, a V508M, e a P491H, localizadas no xon 13. Os resduos das mutaes - 491 e 502 j haviam sido descritos como local de alterao gnica anteriormente. Com exceo da mutao T411M que localiza-se na folha do domnio PTP e a E139D, que est no domnio C-SH2, as outras mutaes encontradas esto situadas na interao entre os domnios N-SH2 e PTP, de acordo com o descrito na literatura (Figura 6).

Figura 6 Representao da estrutura terciria da protena SHP-2 com as mutaes encontradas na nossa casustica. O domnio N-SH2 est representado em amarelo, o PTP em cinza e o C-SH2 em verde. As mutaes esto representadas em vermelho e roxo.

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Outra caracterstica da SN a sua expressividade bastante varivel, tanto entre diferentes famlias (inter-familial) quanto dentro da mesma famlia (intra-familial). Esta caracterstica, aliada ao fato de que o fentipo pode variar com a idade, sendo as caractersticas clnicas mais evidentes na criana que no adulto (Allanson, 1987), faz com que o diagnstico clnico nem sempre seja realizado no adulto. s vezes, as caractersticas clnicas so to sutis, que o indivduo pode ser considerado normal. Portanto, recomenda-se que seja feita uma avaliao detalhada dos genitores dos afetados, com fotos dos mesmos quando crianas, o que essencial para um correto diagnstico e posterior aconselhamento gentico. Em uma paciente afetada pela SN, com uma mutao nova (T411M) identificada na nossa casustica, o exame fsico dos pais e dos irmos no revelou caractersticas sugestivas da SN e foram considerados como no afetados (Figura 7). Entretanto, o estudo molecular da me, que apresentava apenas uma inclinao para baixo das fendas palpebrais e um pescoo curto, assim como de uma das irms, com apenas uma tendncia a um hipertelorismo ocular, mostrou a mesma mutao, indicando que elas tambm apresentavam a SN (Bertola et al., 2004)(Anexo A).

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Figura 7 -

Heredograma de uma famlia com SN e com expressividade varivel. As fotos mostram a probanda (apontada por uma flecha), a irm e a me com a mesma mutao no gene PTPN11 (T411M). A foto esquerda da me quando criana.

Em casos como este, fica difcil estabelecer se o fentipo, extremamente sutil, decorrente da expressividade varivel ou de uma penetrncia incompleta. Nos outros 14 dos 18 pacientes espordicos com mutao no gene PTPN11, nenhuma mutao neste gene foi identificada em um genitor ou irm/irmo do propsito. Alm disso, nos outros dois casos familiais da nossa casustica, a mutao segregava com o fentipo em todos os afetados. Embora estes achados corroboram os de Tartaglia et al. (2002), que sugeriram que a penetrncia era praticamente completa na SN, novos estudos so necessrios para que se esclarea de forma definitiva se a penetrncia na SN completa ou no.

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Como corolrio deste achado temos que a expressividade bastante varivel na SN, em pacientes com o mesmo gentipo (a mesma mutao no gene PTPN11), indica que a interao com outro(s) gene(s), assim como com o meio ambiente so importantes na determinao do fentipo. Alm disso, como aplicao prtica, nos casos em que uma mutao identificada em um caso aparentemente espordico, o estudo molecular dos parentes de primeiro grau imprescindvel, mesmo na ausncia de caractersticas clnicas sugestivas da SN nestes parentes. Isto permitir a realizao de um aconselhamento gentico mais adequado. No caso da famlia descrita acima, com mutao T411M, o risco de recorrncia para uma futura prole da me e da irm da paciente mudou de menos de 1% para 50%. Quando avaliamos as principais caractersticas clnicas apenas dos propsitos que apresentavam mutaes no gene PTPN11 aqui estudados e comparamos com os trabalhos de Tartaglia et al., 2002; Sarkozy et al., 2003; Zenker et al., 2004 e Jongmans et al., 2005 (Tabela 13), observamos que a baixa estatura, o fcies tpico e a presena de cardiopatia eram mais comuns na nossa amostra. Quanto presena de cardiopatia, embora esta anomalia tenha sido mais freqente no grupo de afetados pela SN como um todo, independente da presena ou no de mutaes no gene PTPN11, a freqncia de estenose pulmonar valvar no grupo com mutaes no gene foi semelhante encontrada por Jongmans et al. (2005). J a deformidade esternal e a criptorquia foram os achados clnicos que apresentaram maior variao nos diferentes estudos. A deformidade

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esternal, semelhana do observado por Jongmans et al. (2005), foi bem menos freqente nas duas casusticas, em torno de 45%. Nos trabalhos de Sarkozy et al. (2003) e Zenker et al. (2004), os autores usaram o termo deformidade torcica, sendo possvel que tambm levaram em considerao o trax alargado, o que aumentaria a freqncia desse achado, mas no explicaria a diferena observada no estudo de Tartaglia et al., (2002), no qual os autores aparentemente s avaliaram a deformidade esternal. A criptorquia nos propsitos do sexo masculino variou de 43% a 84% nos diferentes trabalhos. Provavelmente essa variao pode ser explicada pela origem do encaminhamento dos pacientes, uma vez que se eles tiverem sido encaminhados com maior freqncia da Clnica

Endocrinolgica, haver uma maior proporo de criptorquia.

Tabela 13 - Achados clnicos nos propsitos com SN com mutaes no gene PTPN11 em diferentes estudos e no presente trabalho (nmero de afetados/ total, %)
Achados clnicos nos propsitos com mutao PTPN11 Baixa estatura Fcies tpico Cardiopatia EPV Miocardiopatia hipertrfica Deformidade esternal/torcica Criptorquia Tartaglia et al., Sarkozy 2002 al., 2003 39/51 (76,5) 36/51 (70,6) 3/51 (5,9) 39/50 (78) 26/31 (83,9) et Zenker et al., Jongmans et Presente 2004 al., 2005 trabalho, 2006 20/23 (87) 28/34 (82) 41/56 (73) 20/21 (95) 21/23 (91) 31/34 (91) 48/56 (86) 20/21 (95) 42/56 (75) 19/21 (90) 13/23 (56) 30/34 (88) 38/56 (68) 14/21 (67) 3/23 (13) 3/34(9) 4/56 (7) 2/21 (10) 21/23 (91) 6/11 (54) 28/34 (82) 6/14 (43) 24/56 (43) 27/32 (84) 10/21 (48) 7/13 (54)

As caractersticas craniofaciais na sndrome de Noonan so extremamente importantes para o diagnstico clnico, sendo a presena do hipertelorismo ocular considerada a mais tpica. Lee et al. (1992) fizeram uma avaliao oftalmolgica detalhada em 58 pacientes afetados por essa

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patologia e observaram que algum tipo de anomalia estava presente em 95% dos casos, sendo que a mais comum era o hipertelorismo ocular, em 74% dos pacientes. Na nossa casustica, esse achado ocular estava presente apenas em 38% dos afetados com mutao no gene PTPN11, sendo que a inclinao para baixo das fendas palpebrais (76%) e a ptose palpebral (52%) foram as anomalias oculares mais comuns. De forma semelhante, Musante et al. (2002) tambm ressaltaram essa discrepncia. Estes autores observaram que o hipertelorismo ocular estava presente em 50% dos propsitos com mutao no gene PTPN11 e a inclinao para baixo das fendas palpebrais e a ptose palpebral foram os achados mais freqentes, perfazendo um total de 71% e 60%, respectivamente. interessante notar que apesar do hipertelorismo ocular no ser to prevalente como o esperado, nos trabalhos que descreviam o fcies como tpico ou sugestivo, sem pormenorizar as caractersticas individualmente, havia uma alta freqncia de fcies tpico (91%), indicando que mesmo na ausncia do hipertelorismo evidente, os outros achados clnicos eram suficientes para o diagnstico. Alm dos achados oftalmolgicos externos, a presena de nervos corneanos espessados, pela avaliao biomicroscpica da cmara anterior do olho, comum, presente em 46% dos pacientes (Lee et al., 1992). Nossos dados corroboram este fato, com uma freqncia de 40% na nossa casustica como um todo e em 44% dos pacientes com mutao presente.

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Na tentativa de se estabelecer uma correlao gentipo-fentipo, as caractersticas clnicas em pacientes apresentando mutao no gene PTPN11 e naqueles que no apresentavam mutao nesse gene foram comparadas. Entretanto, os dados obtidos so discordantes, no havendo, por hora, uma correlao absoluta. No trabalho de Tartaglia et al. (2002), os autores mostraram que os pacientes com mutao no gene PTPN11 apresentavam uma maior incidncia de estenose pulmonar valvar, assim como uma menor incidncia de miocardiopatia hipertrfica, diferena esta estatisticamente significante. No trabalho de Zenker et al. (2004), alm da estenose pulmonar, uma diferena estatisticamente significante entre os pacientes com mutao no gene e aqueles sem mutao foi observada com relao baixa estatura, ditese hemorrgica, deformidade esternal e a presena do fcies tpico. No entanto, a miocardiopatia hipertrfica no apresentou uma relao inversa, como no trabalho de Tartaglia et al. (2002). J Sarkozy et al. (2003) observaram uma freqncia semelhante de estenose pulmonar valvar entre os dois grupos. No presente estudo a nica anomalia que atingiu uma diferena estatisticamente significante, tambm observada por Zenker et al. (2004), foi a anomalia hematolgica (Tabela 6 - P =0,043). Entretanto, h uma

diferena metodolgica entre os trabalhos. No estudo de Zenker et al. (2004), os autores consideraram a presena de ditese hemorrgica como um critrio menor para o diagnstico clnico da SN, sendo que bastava apenas a presena de sintomas e/ou sinais, no havendo necessidade de

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uma comprovao laboratorial da alterao do sistema de coagulao. No presente trabalho, consideramos as alteraes laboratoriais. Dos 21 pacientes com mutao no gene PTPN11, 12 propsitos apresentavam alguma alterao, sendo que um paciente no realizou a avaliao hematolgica. Um diagnstico definitivo foi obtido em cinco casos: deficincia da pr-calicrena em um paciente, sndrome mielodisplsica (leucemia mielomonoctica juvenil) tambm em um paciente e a deficincia de fatores de coagulao em trs casos (deficincia do fator XI em um, do fator XII em outro e uma deficincia combinada dos fatores XI, VII e cofator da ristocetina em outro caso). O restante apresentava uma alterao no coagulograma, com um tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA) alargado. A presena de ditese hemorrgica na SN foi descrita nos primeiros relatos da sndrome (Noonan, 1968) e incluia anormalidades plaquetrias, em nmero e/ou funo, assim como deficincia dos fatores de coagulao, especialmente a deficincia do fator XI (Sharland et al. 1990). Na ltima dcada, a presena de doenas mieloproliferativas foi descrita na SN, sendo que essa associao no parecia ser fortuita (Bader-Meunier et al., 1997). A forma de apresentao dessa sndrome mielodisplsica na SN, uma leucemia mielomonoctica juvenil, geralmente apresenta uma evoluo benigna, com regresso espontnea do quadro. A mutao T73I foi identificada em pacientes com SN que apresentavam essa anormalidade hematolgica (Tartaglia et al., 2003; Loh et al., 2004), embora no seja especfica. H a descrio da mutao G417C em um paciente com esse

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quadro clnico, assim como a presena da mutao T73I em pacientes sem histria de qualquer anormalidade hematolgica. Portanto, a alterao gnica T73I parece predispor os pacientes a apresentar uma sndrome mielodisplsica. Um dos pacientes aqui estudado, com essa mutao identificada, apresentou nos primeiros meses de vida um quadro de hepatoesplenomegalia, com leucocitose, monocitose, anemia e

plaquetopenia, com regresso espontnea dos achados hematolgicos aps quatro meses de evoluo. Portanto, pacientes afetados pela SN com essa mutao especfica devem ser avaliados quanto possibilidade do desenvolvimento de uma sndrome mielodisplsica, especificamente a leucemia mielomonoctica juvenil. Um paciente da nossa casustica, com a mutao F285S, apresentava um dficit pndero-estatural acentuado, quilotraces de repetio por ocasio de dois procedimentos cirrgicos e um quadro sugestivo de linfangictasia intestinal. A mesma mutao foi descrita em um feto com hidropsia fetal (Schluter et al., 2005), sugerindo que essa alterao gnica possa predispor ao desenvolvimento de displasia linftica. Contrrio a esta sugesto existe o fato de que a mesma mutao j foi identificada em outros pacientes com SN (Tartaglia et al., 2001; Yoshida et al., 2004a), aparentemente sem histria de displasia linftica. Entretanto, como os sinais desse achado podem ser observados apenas em situao de um grande stress (por exemplo, um procedimento cirrgico), ainda

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possvel que os casos prvios com mutao F285S apresentassem sinais subclnicos dessa anomalia. A descrio clnica detalhada de outros afetados com SN e a mutao F285S so importantes para a confirmao dessa associao. A alterao gnica N308D, considerada a mutao mais comum na SN, parece estar relacionada com um desenvolvimento intelectual favorvel (Jongmans et al., 2005).

5.2. Sndromes Noonan-like

Diferentemente da SN, o encontro de mutaes na regio codificadora do gene PTPN11 em pacientes com sndrome de LEOPARD alto, em torno de 90% (Digilio et al., 2002; Keren et al., 2004), indicando que esse gene o principal responsvel pela sndrome. Na nossa casustica, os trs afetados (100%) apresentavam mutao nesse gene. As alteraes gnicas na sndrome de LEOPARD apresentam uma alta especificidade, indicando ser uma condio allica SN. Duas mutaes so recorrentes e muito prevalentes (Y279C e T468M), nos xons 7 e 12 respectivamente. A mutao T468M foi mais freqente (62,5%) no estudo de Digilio et al. (2002), mas no no trabalho de Keren et al. (2004), no qual observou-se a mesma positividade que a Y279C (46%). Apesar da nossa casustica ser constituda por apenas trs pacientes, o fato de encontrarmos a mesma mutao (Y279C) nestes afetados no aparentados, aliado ao fato de que esta mutao tambm ser considerada a mais comum

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(45%) quando analisadas as casusticas de diversos trabalhos em conjunto (DiGilio et al., 2002; Legius et al., 2002; Froster et al., 2003; Conti et al., 2003; Sarkozy et al., 2003; Digilio et al., 2004; Sarkozy et al., 2004a e b; Yoshida et al., 2004c; Keren et al., 2004; Kalidas et al., 2005; Paradisi et al., 2005), sugere que iniciemos o estudo molecular pela anlise do xon 7, local dessa mutao. Os achados clnicos nos nossos propsitos, os quais preechiam os critrios clnicos de Voron et al. (1976), foram tpicos da sndrome, com a presena de dismorfismos faciais, manchas lentiginosas e cardiopatia (miocardiopatia hipertrfica) em todos eles. interessante notar que, diferentemente da SN, na qual pacientes com mutaes no gene PTPN11 apresentam uma prevalncia reduzida de miocardiopatia hipertrfica, na sndrome de LEOPARD essa foi a cardiopatia mais comum. Na literatura, de 29 pacientes descritos com anomalias cardacas e mutao no gene PTPN11, 22 apresentavam miocardiopatia hipertrfica (76%). Este achado sugere que mutaes no domnio PTP, encontrados na sndrome de LEOPARD, desempenham um papel mais importante na proliferao dos cardiomicitos. As alteraes de conduo eletrocardiogrficas, consideradas um dos achados principais da sndrome de LEOPARD, estava presente em dois dos trs afetados em nosso trabalho (67%), freqncia menor que a presena da miocardiopatia hipertrfica. Este fato corrobora os de Yoshida et al. (2004c), indicando que a miocardiopatia hipertrfica um achado caracterstico nos

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pacientes com sndrome de LEOPARD e mutaes no gene PTPN11, mais importante que as alteraes encontradas no eletrocardiograma. Alm disso, as alteraes eletrocardiogrficas observadas nos dois pacientes da nossa casustica, representadas por uma alterao difusa da repolarizao ventricular em ambos os casos e bloqueio de ramo em um deles, podem ser consideradas como decorrentes da prpria miocardiopatia hipertrfica. Anomalias hematolgicas so descritas em aproximadamente 30% dos afetados pela SN, mas no na sndrome de LEOPARD. No entanto, os dois pacientes aqui avaliados apresentavam distrbios hematolgicos, representados pela doena de von Willebrand e alargamento do TTPA, com dosagem normal dos fatores de coagulao. Esse achado amplia o espectro fenotpico na sndrome de LEOPARD, sugerindo que mutaes no domnio PTP tambm predisponham ao desenvolvimento de alteraes

hematolgicas. Na sndrome de Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes, anteriormente considerada uma doena distinta da SN, mutaes no gene PTPN11 (N308S, D106A e F285L) foram encontradas em pacientes com quadro clnico tpico da sndrome (Tartaglia et al., 2002; Lee et al., 2005). Essas mesmas mutaes j haviam sido identificadas em pacientes com SN e sem histria de leses mltiplas de clulas gigantes, indicando que a SNL no uma doena distinta, mas sim parte do espectro da SN. Um dos pacientes estudados por Lee et al. (2005) no apresentava mutao no gene PTPN11, assim como os dois propsitos aqui avaliados, sugerindo haver

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heterogeneidade de lcus na doena. O desenvolvimento das leses de clulas gigantes parece estar relacionado interao com outro gene(s) e/ou gene(s)-fatores ambientais. Os achados clnicos nos nossos propsitos incluram a baixa estatura, o fcies tpico, a cardiopatia (EPV), a criptorquia e leses mltiplas de clulas gigantes em todos eles. Os estudos moleculares na sndrome da NFSN indicavam que essa sndrome decorreria de mutaes apenas no gene da NF1 (Baralle et al., 2003; De Luca et al., 2005). Uma paciente aqui avaliada com NFSN apresentava tanto uma mutao no gene PTPN11 (Q510R), quanto no gene da NF1 (L844R), achado este no descrito na literatura (Bertola et al., 2005) (Anexo B). No caso, ela havia herdado o gene PTPN11 mutado do pai (tambm afetado pela SN) e possua uma mutao de novo no gene NF1. A alterao gnica L844R j havia sido descrita em um caso espordico de neurofibromatose tipo I (Maynard et al., 1997). O encontro de mutaes nesses dois genes sugere que a sndrome NFSN seja uma doena heterognea, em que a coocorrncia de ambas as doenas em um indivduo uma possibilidade, uma vez que elas so relativamente comuns na populao. Embora um grande progresso no entendimento da etiologia da SN tenha sido obtido nos ltimos anos, por ser considerada uma doena heterognea, ainda h um longo caminho a ser percorrido para o total conhecimento dessa sndrome, o que permitir um manejo mais adequado e um aconselhamento gentico mais preciso.

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CONCLUSES

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6. CONCLUSES

6.1.

sndrome

de

Noonan

uma

doena

heterognea.

Aproximadamente, metade dos pacientes (42%) com diagnstico clnico de SN apresenta mutaes na regio codificadora do gene PTPN11, demonstrando que h heterogeneidade de lcus na doena.

6.2.

As mutaes encontradas nos pacientes com SN esto distribudas principalmente nos xons 3, 8 e 13 (86%), semelhante ao descrito na literatura, justificando uma pesquisa inicial nestes xons.

6.3.

A mutao N308D, considerada a mais comum na SN no foi encontrada na nossa coorte, sugerindo que no se trata de uma alterao gnica freqente na nossa populao.

6.4.

As alteraes gnicas no descritas anteriormente identificadas no nosso trabalho foram a T411M, localizadas no xon 11, a S502L a V508M, e a P491H localizadas no xon 13.

6.5.

No h uma correlao gentipo-fentipo bem estabelecida, embora a mutao T73I parea predispor ao desenvolvimento de uma doena mielodisplsica de curso benigno nos pacientes com SN. Alm disso, possvel que a mutao F285S predisponha a uma displasia linftica.

6.6.

A sndrome de Noonan apresenta uma expressividade bastante varivel, sendo que o diagnstico no adulto muitas vezes difcil pelo carter sutil do fentipo. Por esta razo, o estudo molecular dos parentes de primeiro grau essencial para um correto

aconselhamento gentico.

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6.7.

A sndrome de LEOPARD uma doena allica SN, sendo a mutao Y279C a mais comum.

6.8.

Anomalias hematolgicas, semelhana da SN, fazem parte do espectro da sndrome de LEOPARD, ampliando seu fentipo.

6.9.

A miocardipatia hipertrfica a anomalia cardaca mais freqente na sndrome de LEOPARD com mutaes no gene PTPN11.

6.10. A sndrome de Noonan-like/leses mltiplas de clulas gigantes faz parte do espectro da SN e tambm uma doena heterognea.

6.11. Na sndrome da neurofibromatose/Noonan, detectamos uma mutao no gene PTPN11 e no gene NF1, o que comprova a coocorrncia de ambas as doenas na probanda. Este mecanismo, aliado ao fato de que a sndrome da neurofibromatose/Noonan em alguns pacientes decorre de mutaes apenas no gene NF1 (e, portanto faz parte do espectro da neurofibromatose), sugere heterogeneidade gentica na sndrome.

6.12. O estudo do gene PTPN11 importante para a confirmao diagnstica nos casos suspeitos de SN e sndromes Noonan-like e para o aconselhamento gentico adequado.

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ANEXOS

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Anexo A Artigo publicado no Am J Med Genet (2004)

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Anexo B Artigo publicado no Am J Med Genet (2005)

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REFERNCIAS

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8. REFERNCIAS

Ahlbom BE, Dahl N, Zetterqvist P, Anneren G. Noonan syndrome with cafau-lait spots and multiple lentigines syndrome are not linked to the neurofibromatosis type 1 locus. Clin. Genet. 1995;48:85-9.

Ahmad S, Banville D, Zhao Z, Fischer EH, Shen SH. A widely expressed human protein-tyrosine phosphatase containing src homology 2 domains. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:2197-201.

Ahmed ML, Foot ABM, Edge JA, Lamkin VA, Savage MO, Dunger DB. Noonans syndrome: abnormalities of the growth hormone/IGF-I Axis and the response to treatment with human biosynthetic growth hormone. Acta Paediatr Scand. 1991; 80:446-50.

Allanson JE. Noonan syndrome. J Med Genet. 1987;24:9-13.

Allanson JE, Hall JG, Hughes HE, Preus M, Witt RD. Noonan syndrome: the changing phenotype. Am J Med Genet. 1985;21:507-14.

Allanson JE, Hall JG, van Allen MI. Noonan phenotype associated with neurofibromatosis. Am J Med Genet. 1985;21:457-62.

Aoki Y, Niihori T, Kawame H, Kurosawa K, Ohashi H, Tanaka Y, Filocamo M, Kato K, Suzuki Y, Kure S, Matsubara Y. Germline mutations in HRAS protooncogene cause Costello syndrome. Nat Genet. 2005;37:1038-40.

96

Araki T, Mohi MG, Ismat FA, Bronson RT, Williams IR, Kutok JL, Yang W, Pao LI, Gilliland DG, Epstein JA, Neel BG. Mouse model of Noonan syndrome reveals cell type- and gene dosage-dependent effects of Ptpn11 mutation. Nat Med. 2004;10:849-57.

Bader-Meunier B, Tchernia G, Milot F, Fontaine JL, Thomas C, Lyonnet S, Lavergne JM, Dommergues JP. Occurrence of myeloproliferative disorder in patients with Noonan syndrome. J Pediatr. 1997;130:885-89.

Baralle D, Mattocks C, Kalidas K, Elmslie F, Whittaker J, Lees M, Ragge N, Patton MA, Winter RM, Ffrench-Constant C. Different mutations in the NF1 gene as associated with neurofibromatosis-Noonan syndrome (NFNS). Am J Med Genet. 2003;119:1-8.

Bertola DR, Carneiro JD, D'Amico EA, Kim CA, Albano LM, Sugayama SM, Gonzalez CH. Hematological findings in Noonan syndrome. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 2003;58:5-8.

Bertola DR, Kim CA, Pereira AC, Mota GF, Krieger JE, Vieira IC, Valente M, Loreto MR, Magalhaes RP, Gonzalez CH. Are Noonan syndrome and Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome distinct entities? Am J Med Genet. 2001;98:230-4.

Bertola DR, Kim CA, Sugayama SMM, Albano LMJ, Wagenfhr J, Moyss RL, Gonzalez CH. Cardiac findings in 31 patients with Noonans syndrome. Arq Bras Cardiol. 2000;75:409-412.

97

Bertola DR, Pereira AC, Oliveira PSL, Kim CA, Krieger JE. Clinical variability in a Noonan syndrome family with a new PTPN11 gene mutation. Am J Med Genet A. 2004;130:378-83.

Bertola DR, Pereira AC, Passetti F, Oliveira PSL, Messiaen L, Gelb BD, Kim CA, Krieger JE. Neurofibromatosis-Noonan syndrome: molecular evidence of the concurrence of both disorders in a patient. Am J Med Genet A. 2005;136:242-5.

Bertola DR, Sugayama SM, Albano LM, Kim CA, Gonzalez CH. Noonan syndrome: a clinical and genetic study of 31 patients. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo. 1999;54:147-50.

Burn J. Williams syndrome. J Med Genet. 1986;23:389-95.

Bzdch V. Noonan and Williams syndromes basic differential diagnosis. Clin Pediatr. 1995;34:622-3.

Caralis DG, Char F, Graber JD, Voigt GC. Delineation of multiple cardiac anomalies associated with the Noonan syndrome in an adult and review of the literature. Hopkins Med J. 1974;134:346-55.

Char F, Rodriguez-Fernandez HL, Scott Jr CI, Borgaonkar S, Bell BB, Rowe RD. The Noonan syndrome a clinical study of forty-five cases. BD: OAS VIII. 1972;110-8.

98

Chen B, Bronson RT, Klaman LD, Hampton TG, Wang JF, Green PJ, Magnuson T, Douglas PS, Morgan JP, Neel BG. Mice mutant for Egfr and Shp2 have defective cardiac semilunar valvulogenesis. Nat 2000;24:296-9. Genet.

Clarren SK, Smith DW. The fetal alcohol syndrome. N Engl J Med. 1978;298: 1063-7.

Cohen MM Jr., Ruvalcaba RHA, Graham CB, Harrison MT, Morgan AF. A new syndrome simulating the Noonan syndrome, the Leopard syndrome and hyperparathyroidism. Syndr Identif. 1974;2:14-7.

Conti E, Dottorini T, Sarkozy A, Tiller GE, Esposito G, Pizzuti A, Dallapiccola B. A novel PTPN11 mutation in LEOPARD syndrome. Hum Mutat. 2003;21:654.

Costello JM. A new syndrome: mental subanormality and nasal papillomata. Aust Paediatr J. 1977;13:114-8.

Costello JM. Costello syndrome: update on the original cases and commentary. Am J Med Genet. 1996;62:199-201.

Cotterill AM, McKenna WJ, Brady AF, Sharland M, Elsawi M, Yamada M, Camacho-Hubner C, Kelnar CJ, Dunger DB, Patton MA, Savage MO. The short-term effects of growth hormone therapy on height velocity and cardiac ventricular wall thickness in children with Noonan's syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 1996;81:2291-7.

Crosby A, Ion R, Jeffery S, Patton MA, van Reen M, Kremer H, van Der Burgt I, Mariman E, Montgomery K, Kucherlapati R. The analysis of 5

candidate genes in Noonan syndrome. Am J Hum Genet. 1998;63:A357.

99

De Luca A, Bottillo I, Sarkozy A, Carta C, Neri C, Bellacchio E, Schirinzi A, Conti E, Zampino G, Battaglia A, Majore S, Rinaldi MM, Carella M, Marino B, Pizzuti A, Digilio MC, Tartaglia M, Dallapiccola B. NF1 Gene Mutations Represent the Major Molecular Event Underlying Neurofibromatosis-Noonan Syndrome. Am J Hum Genet. 2005;77:1092-101.

De Majo SF, De Otero BC, Reichmann A. Sndrome de Noonan: diagnstico diferencial com el Sndrome de Turner. Bol Md Hosp Infant. 1979;36:108997.

Digilio MC, Conti E, Sarkozy A, Mingarelli R, Dottorini T, Marino B, Pizzuti A, Dallapiccola B. Grouping of multiple-lentigines/LEOPARD and Noonan syndromes on the PTPN11 gene. Am J Hum Genet. 2002;71:389-94.

Digilio MC, Marino B, Giannotti A, Dallapiccola B.

Exclusion of 22q11

deletion in Noonan syndrome with tetralogy of Fallot. Am J Med Genet. 1996;62:413-4.

Digilio MC, Pacileo G, Sarkozy A, Limongelli G, Conti E, Cerrato F, Marino B, Pizzuti A, Calabro R, Dallapiccola B. Familial aggregation of genetically heterogeneous hypertrophic cardiomyopathy: a boy with LEOPARD syndrome due to PTPN11 mutation and his nonsyndromic father lacking PTPN11 mutations. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004;70:95-8.

Donnenfeld AE, Nazir MA, Sindoni F, Librizzi RJ. Prenatal sonographic documentation of cystic hygroma regression in Noonan syndrome. Am J Med Genet. 1991;39:461-5.

Duncan WJ, Fowler RS, Farkas LG, Ross RB, Wright AW, Bloom KR, Huot DJ, Sondheimer HM, Rowe RD. A comprehensive scoring system for evaluating Noonan syndrome. Am J Med Genet. 1981;10:37-50.

100

Elsawi MM, Pryor JP, Klufio G, Barnes C, Patton MA. Genital tract function in men with Noonan syndrome. J Med Genet. 1994;31:468-70.

Feingold M, Bossert WH. Normal values for selected physical parameters: an aid to syndrome delineation. Birth Defects Orig Artic Ser. 1974;10:1-16.

Ferreira LV, Souza SA, Arnhold IJ, Mendonca BB, Jorge AA. PTPN11 (protein tyrosine phosphatase, nonreceptor type 11) mutations and response to growth hormone therapy in children with Noonan syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90:5156-60.

Festen C. Une complication particulire de lorchidopexie dans le syndrome de Noonan. Chir Pdiatr. 1980;21:393-5.

Fischer E, Weiss EB, Michals K, Dubrow IW, Hastrieter AR, Matalon R. Spontaneous chylothorax in Noonans syndrome. Eur J Pediatr.

1982;138:282-4.

Flavell G. Webbing of the neck, with Turners syndrome in the male. Br J Surgery. 1943;31:150-3.

Flintoff WF, Bahuau M, Lyonnet S, Gilgenkrantz S, Maron F, Levilliers J, Kachaner J, Munnich A, Le Merrer M. No evidence for linkage to the type 1 or type 2 neurofibromatosis loci in Noonan syndrome families. Am J Med Genet. 1993;46:700-5.

Ford CE, Jones KW, Polani PE, de Almeida JC, Briggs JH. A sexchromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis (Truner`s syndrome). Lancet. 1959;1:711-3.

101

Fraccaro M, Ikkos D, Lindstein J, Luft R, Tillinger KG. Testicular germinal dysgenesis (male Turners syndrome). Report of a case with chromosomal studies and review of the literature. Acta Endocrinol. 1961;36:98-114.

Froster UG, Glander HJ, Heinritz W. Molecular genetic mutation analysis of the PTPN11 gene in the multiple lentigines (LEOPARD) sndrome. Hautarzt. 2003;54:1190-2.

George CD, Patton MA, El Sawi M, Sharland M, Adam EJ. Abdominal ultrasound in Noonan syndrome: a study of 44 patients. Pediatr Radiol. 1993;23:316-8.

Hall JG, Gilchrist DM. Turner syndrome and its variants. Pediatr Clin N Am. 1990;37:1421-40.

Herzog DB, Logan R, Kooistra JB. The Noonan syndrome with intestinal lymphangiectasia. J Pediatr. 1976;88:270-2.

Hof P, Pluskey, S, Dhe-Paganon S, Eck MJ, Shoelson SE. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 1998;92:441-50.

Ion A, Tartaglia M, Song X, Kalidas K, van der Burgt I, Shaw AC, Ming JE, Zampino G, Zackai EH, Dean JCS, Somer M, Parenti G, Crosby AH, Patton MA, Gelb BD, Jeffery S. Absence of PTPN11 mutations in 28 cases of cardiofaciocutaneous (CFC) syndrome. Hum Genet. 2002;111:421-7.

Ishizawa A, Oho SI, Dod H, Katori T, Homma SI. Cardiovascular abnormalities in Noonan syndrome: the clinical findings and treatments. Acta Paediatr Jpn. 1996;38:84-90.

102

Jamieson CR, van der Burgt I, Brady AF, van Reen M, Elsawi MM, Hol F, Jeffery S, Patton MA, Mariman E. Mapping a gene for Noonan syndrome to the long arm of chromosome 12. Nature Genet. 1994;8:357-60.

Jongmans M, Sistermans EA, Rikken A, Nillesen WM, Tamminga R, Patton M, Maier EM, Tartaglia M, Noordam K, van der Burgt I. Genotypic and phenotypic characterization of Noonan syndrome: new data and review of the literature. Am J Med Genet A. 2005;134:165-70.

Kalidas K, Shaw AC, Crosby AH, Newbury-Ecob R, Greenhalgh L, Temple IK, Law C, Patel A, Patton MA, Jeffery S. Genetic heterogeneity in LEOPARD syndrome: two families with no mutations in PTPN11. J Hum Genet. 2005;50:21-5.

Kavamura MI, Pomponi MG, Zollino M, Lecce R, Murdolo M, Brunoni D, Alchorne MM, Opitz JM, Neri G. PTPN11 mutations are not responsible for the Cardiofaciocutaneous (CFC) syndrome. Eur J Hum Genet. 2003;11:64-8.

Keren B, Hadchouel A, Saba S, Sznajer Y, Bonneau D, Leheup B, Boute O, Gaillard D, Lacombe D, Layet V, Marlin S, Mortier G, Toutain A, Beylot C, Baumann C, Verloes A, Cave H, French Collaborative Noonan Study Group. PTPN11 mutations in patients with LEOPARD syndrome: a French multicentric experience. J Med Genet. 2004;41:e117.

Kobylinski O. Ueber eine flughautahnliche Ausbreintung am Halse. Arch Anthropol. 1883;14:343-8.

103

Kosaki K, Suzuki T, Muroya K, Hasegawa T, Sato S, Matsuo N, Kosaki R, Nagai T, Hasegawa Y, Ogata T. PTPN11 (protein-tyrosine phosphatase, nonreceptor-type 11) mutations in seven Japanese patients with Noonan syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87:3529-33.

Lee NB, Kelly L, Sharland KM. Ocular manifestations of Noonan syndrome. Clin Genet. 1992;15:509-12.

Lee JS, Tartaglia M, Gelb BD, Fridrich K, Sachs S, Stratakis CA, Muenke M, Robey PG, Collins MT, Slavotinek A. Phenotypic and genotypic

characterisation of Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome. J Med Genet. 2005;42:e11.

Legius E, Schollen E, Matthijs G, Fryns JP. Fine mapping of Noonan/cardiofacio cutaneous syndrome in a large family. Eur J Hum Genet. 1998;6:32-7.

Legius E, Schrander-Stumpel C, Schollen E, Pulles-Heintzberger C, Gewillig M, Fryns JP. PTPN11 mutations in LEOPARD syndrome. J Med Genet. 2002;39:571-4.

Levy EP, Pashayan H, Fraser FC, Pinsky L. XX and XY Turner phenotypes in a family. Am J Dis Child. 1970;120:36-43.

Loh ML, Vattikuti S, Schubbert S, Reynolds MG, Carlson E, Lieuw KH, Cheng JW, Lee CM, Stokoe D, Bonifas JM, Curtiss NP, Gotlib J, Meschinchi S, Le Beau MM, Emanuel PD, Shannona KM. Mutations in PTPN11 implicate the SHP-2 phosphatase in leukemogenesis. Blood. 2004;103:2325-31.

104

Maheshwari M, Belmont J, Fernbach S, Ho T, Molinari L, Yakub I, Yu F, Combes A, Towbin J, Craigen WJ, Gibbs R. PTPN11 mutations in Noonan syndrome type I: detection of recurrent mutations in exons 3 and 13. Hum Mutat. 2002 ;20:298-304.

Marques, RM, Marcondes, E, Berqui, E, Prandi R, Yunes J. Crescimento e desenvolvimento pubertrio em crianas e adolescentes brasileiros. II. Altura e peso. So Paulo: Ed. Bras. Cincias; 1982. 206p.

Maynard J, Krawczak M, Upadhyaya M. Characterization and significance of nine novel mutations in xon 16 of the neurofibromatosis type 1 (NF1) gene. Hum Genet. 1997;99:674-6.

Mckusick VA. Mendelian Inheritance in Man. Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. 12th ed. Baltimore: Johns Hopkins University Press; 1998. Mendez HMM, Opitz JM. Noonan syndrome: a review. Am J Med Genet. 1985;21: 493-506.

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16:215.

Mollica N, Antoncecchi S, Antoncecchi Jr E, Bellantuono R, Castellaneta G, De Luca I. Stenosi valvolare combinata aortica e polmonare, alterazioni della emostasi primaria e parziale dficit Del fattore XII nella Sndrome di Noonan. Min Cardiang. 1987;35:311-5.

Money J, Kalus Jr E. Noonans syndrome. IQ and specific disabilities. Am J Dis Child. 1979;133:846-50.

105

Musante L, Kehl HG, Majewski F, Meinecke P, Schweiger S, GillessenKaesbach G, Wieczorek D, Hinkel GK, Tinschert S, Hoeltzenbein M, Ropers HH, Kalscheuer VM. Spectrum of mutations in PTPN11 and genotypephenotype correlation in 96 patients with Noonan syndrome and five patients with cardio-facio-cutaneous syndrome. Eur J Hum Genet. 2002;11:201-6.

Nellhaus, G. Composite International & Interracial Graphs. Pediatrics. 1968;41: 106-14.

Noonan JA. Hypertelorism with Turner phenotype. A new syndrome with associated congenital heart disease. Am J Dis Child. 1968;116:373-80.

Noonan JA.

Noonan syndrome. An update and review for the primary

pediatrician. Clin Pediatr. 1994;33:548-55.

Noonan JA, Ehmke DA. Associated noncardiac malformations in children with congenital heart disease. J Pediatr. 1963;63:468-70.

Noonan J, OConnor W. Noonan syndrome: a clinical description emphasizing the cardiac findings. Acta Pediatr Jap. 1996;38:76-83.

Noonan JA, Raaijmakers R, Hall BD. Adult height in Noonan syndrome. Am J Med Genet A. 2003;123:68-71.

Nora JJ, Lortscher RH, Spangler RD. Echocardiographic studies of left ventricular disease in Ullrich-Noonan syndrome. 1975;129:1417-20. Am J Dis Child.

Nora JJ, Nora AH, Sinha AK, Spangler RD, Lubs HA. The Ullrich-Noonan syndrome (Turner phenotype). Am J Dis Child. 1974;127:48-55.

106

Opitz JM, Pallister DP. Brief historical note: the concept of gonadal dysgenesis. Am J Med Genet. 1979;4:333-43.

Opitz JM, Summitt RL, Sarto GE. Noonans syndrome in girls: a genocopy of the Ullrich-Turner syndrome. J Pediatr. 1965;67:968.

Paradisi M, Pedicelli C, Ciasulli A, Pinto F, Conti E, Sarkozy A, Angelo C. PTPN11 gene mutation in LEOPARD syndrome. Minerva Pediatr.

2005;57:189-93.

Pasteris NG, Cadle A, Logie LJ, Porteous M, Schwartz CE, Stevenson RE, Glover TW, Wiroy RS, Gorski, JL. Isolation and analysis of the faciogenital dysplasia (Aarskog-Scott syndrome) gene: a putative, rho/rac guanine nucleotide exchange factor. Cell. 1994;79:669-78.

Paupe A, Chassevent J, Lenclen R, Blanc P, Carbajal R, Hoenn E, OlivierMartin M. Anasarque nonatale associe un syndrome de Noonan. Pdiatrie. 1991;46:731-4.

Phillips WG, Dunnill MGS, Kurwa AR, Black MM. Orbital oedema: an unusual presentation of Noonans syndrome. Br J Dermatol. 1993;129:190-2.

Porteous MEM, Goudie DR. Aarskog syndrome. J Med Genet. 1991;28:44-7.

Pryor HB. Objetctive measurement of interpupillary distance. Pediatrics. 1969;44: 973-7.

107

Ranke MB, Heidemann P, Knupfer C, Enders H, Schmaltz AA, Bierich JR. Noonan syndrome: growth and clinical manifestations in 144 cases. Eur J Pediatr. 1988;148:220-7.

Reynolds JF, Neri G, Herrmann JP, Blumberg B, Coldwell JG, Miles PV, Opitz JM. New multiple congenital anomalies/mental retardation syndrome with cardio-facio-cutaneous involvement--the CFC syndrome. Am J Med Genet. 1986;25:413-27.

Sarkozy A, Conti E, Digilio MC, Marino B, Morini E, Pacileo G, Wilson M, Calabro R, Pizzuti A, Dallapiccola B. Clinical and molecular analysis of 30 patients with multiple lentigines LEOPARD syndrome. J Med Genet. 2004a;41:e68.

Sarkozy A, Conti E, Seripa D, Digilio MC, Grifone N, Tandoi C, Fazio VM, Di Ciommo V, Marino B, Pizzuti A, Dallapiccola B. Correlation between PTPN11 gene mutations and congenital heart defects in Noonan and LEOPARD syndromes. J Med Genet. 2003;40:704-8.

Sarkozy A, Obregon MG, Conti E, Esposito G, Mingarelli R, Pizzuti A, Dallapiccola B. A novel PTPN11 gene mutation bridges Noonan syndrome, multiple lentigines/LEOPARD syndrome and Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome. Eur J Hum Genet. 2004b;12:1069-72.

Schluter G, Steckel M, Schiffmann H, Harms K, Viereck V, Emons G, Burfeind P, Pauer HU. Prenatal DNA diagnosis of Noonan syndrome in a fetus with massive hygroma colli, pleural effusion and ascites. Prenat Diagn. 2005;25:574-6.

108

Schollen E, Matthijs G, Gewillig M, Fryns JP, Legius E. PTPN11 mutation in a large family with Noonan syndrome and dizygous twinning. Eur J Hum Genet. 2003;11:85-8.

Sharland M, Burch M, McKenna WM, Paton MA. A clinical study of Noonan syndrome. Arch Dis Child. 1992;67:178-83.

Sharland M, Patton MA, Chittolie A, Talbot S, Bevan D. Coagulation factor abnormalities in Noonan syndrome. J Med Genet. 1990;27:649.

Singer ST, Hurst D, Addiego Jr JE. Bleeding disorders in Noonan syndrome: three case reports and review of the literature. J Pediatr Hematol Oncol. 1997;19:130-4.

Siwik ES, Zahka KG, Wiesner GL, Limwongse C. Cardiac disease in Costello syndrome. Pediatrics. 1998;101:706-9.

Steiker DD, Mellman WJ, Bongiovanni AM, Eberlein WR, Leboeuf G. Turners syndrome in the male. J Pediatr. 1961;58:321-9.

Tartaglia M, Cotter PD, Zampino G, Gelb BD, Rauen KA. Exclusion of PTPN11 mutations in Costello syndrome: further evidence for distinct genetic etiologies for Noonan, cardio-facio-cutaneous and Costello syndrome. Clin Genet. 2003;63:423-6.

109

Tartaglia M, Kalidas K, Shaw A, Song X, Musat DL, van der Burgt I, Brunner HG, Bertola DR, Crosby A, Ion A, Kucherlapati RS, Jeffery S, Patton MA, Gelb BD. PTPN11 mutations in Noonan syndrome: molecular spectrum, genotype-phenotype correlation, and phenotypic heterogeneity. Am J Hum Genet. 2002;70:1555-63.

Tartaglia M, Martinelli S, Cazzaniga G, Cordeddu V, Iavarone I, Spinelli M, Palmi C, Carta C, Pession A, Arico M, Masera G, Basso G, Sorcini M, Gelb BD, Biondi A. Genetic evidence for lineage-related and differentiation stagerelated contribution of somatic PTPN11 mutations to leukemogenesis in childhood acute leukemia. Blood. 2004;104:307-13.

Tartaglia M, Mehler EL, Goldberg R, Zampino G, Brunner HG, Kremer H, van der Burgt I, Crosby AH, Ion A, Jeffery S, Kalidas K, Patton MA, Kucherlapati RS, Gelb BD. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 2001;29:465-8.

Tartaglia M, Niemeyer CM, Fragale A, Song X, Buechner J, Jung A, Hahlen K, Hasle H, Licht JD, Gelb BD. Somatic mutations in PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia, myelodysplastic syndromes, and acute myeloid leukemia. Nat Genet. 2003;34:148-50.

Turner HH. A syndrome of infantilism, congenital webbed neck, and cubitus valgus. Endocrinology. 1938;23:566-74.

Ullrich O. Uber typische kombinationsbilder multipler Abartungen. Zschr Kinderh. 1930;49:271-6.

110

van der Burgt I, Berends E, Lommen E, van Beersum S, Hamel B, Mariman E. Clinical and molecular studies in a large dutch family with Noonan syndrome. Am J Med Genet. 1994;53:187-191.

van der Burgt I, Brunner H. 2000. Genetic heterogeneity in Noonan syndrome: evidence for an autosomal recessive form. Am J Med Genet. 94: 46-51.

Voron DA, Hatfield HH, Kalkhoff RK. Multiple lentigines syndrome. Case report and review of the literature. Am J Med. 1976;60:447-56.

Watkins F, Fidler C, Boultwood J, Wainscoat JS. Mutations in PTPN11 are rare in adult myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Am J Hematol. 2004;76:417.

Wilson DI, Britton SB, McKeown C, Kelly D, Cross IE, Strobel S, Scambler PJ. Noonans syndrome and DiGeorge syndromes with monosomy 22q11. Arch Dis Child. 1993;68:187-9.

Witt DR, Keena BA, Hall JG, Allanson JE. Growth curves for height in Noonan syndrome. Clin Genet. 1986;30:150-3.

Yoshida R, Hasegawa T, Hasegawa Y, Nagai T, Kinoshita E, Tanaka Y, Kanegane H, Ohyama K, Onishi T, Hanew K, Okuyama T, Horikawa R, Tanaka T, Ogata T. Protein-tyrosine phosphatase, nonreceptor type 11 mutation analysis and clinical assessment in 45 patients with Noonan syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2004a;89:3359-64.

111

Yoshida R, Miyata M, Nagai T, Yamazaki T, Ogata T. A 3-bp deletion mutations of PTPN11 in an infant with severe Noonan syndrome including hydrops fetalis and juvenile myelomonocytic leukemia. Am J Med Genet A. 2004b;128:63-6.

Yoshida R, Nagai T, Hasegawa T, Kinoshita E, Tanaka T, Ogata T. Two novel and one recurrent PTPN11 mutations in LEOPARD syndrome. Am J Med Genet A. 2004c;130:432-4.

Zenker M, Buheitel G, Rauch R, Koenig R, Bosse K, Kress W, Tietze HU, Doerr HG, Hofbeck M, Singer H, Reis A, Rauch A. Genotype-phenotype correlations in Noonan syndrome. J Pediatr. 2004;144:368-74.