Universidade Federal do Rio de Janeiro

Thiago Britto Borges

Caracterizao da Cu(I)-ATPase de fgado de rato e efeito da diabetes mellitus no transporte ativo do on cobre

Rio de Janeiro 2012

Thiago Britto Borges

Caracterizao da Cu(I)-ATPase de fgado de rato e efeito da diabetes mellitus no transporte ativo do on cobre

Dissertao de Mestrado desenvolvida no Laboratrio de Fsico-Qumica Biolgica Ada Hassn-Voloch (Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil), sob a orientao da Professora Jennifer Lowe, apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Biofsica), Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias Biolgicas (Biofsica). O apoio financeiro para a realizao desta dissertao foi concedido pelas agncias de fomento: Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, programa Bolsa Nota 10) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq). Orientadora: Jennifer Lowe Rio de Janeiro 2012

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BRITTO-BORGES, Thiago
Caracterizao da Cu(I)-ATPase de fgado de rato e efeito da diabetes mellitus no transporte ativo do on cobre. / Thiago Britto Borges. Rio de Janeiro: 2012. 73 pginas, 17 ilustraes e referncias da p. 55 a p. 73. Dissertao (Mestrado em Cincias Biolgicas: Biofsica) Universidade Federal do Rio de Janeiro / IBCCF, 2012. Orientadora: Jennifer Lowe 1. Cu(I)-ATPase. 2. Cintica enzimtica. 3. Diabetes mellitus. 4. Homeostasia do cobre. 5. Insulina. I. Lowe, Jennifer (Orientadora). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, Ps-Graduao em Cincias Biolgicas Biofsica. III. Ttulo

AGRADECIMENTOS Agradeo a minha famlia, em especial aos meus irmos (Joo Victor e Joo Gabriel, Igor, Flvia e Junior) pela competio saudvel (eu ainda sou o mais inteligente ) e aos meus pais (Andr e Marcia) por manterem uma estrutura familiar razoavelmente estvel, que foi essencial para meu amadurecimento. Gostaria agradecer tambm a Nadja, minha namorada, pelo diversos auxlios prestados (como me dar foco, corrigir meu portugus e fazer a sobremesa) e pelos bons momentos. Agradeo a professora Jennifer, no apenas pelos dois anos de orientao e por fazer um esforo descomunal para me por na linha. Agradeo pela amizade, pelas dicas e pelo convvio agradvel e carinho. Agradeo tambm aos professores Marcelo Einicker-Lamas e o professor Rafael Valverde pelo convvio, amizade e pela fora. Agradeo tambm ao Professor Adalberto Vieyra por ter me aceito no laboratrio de Fsico-Qumica Biolgica, por ter me corrigido e muito me ensinado. Sem vocs eu no teria ido a lugar algum, obrigado. Agradeo ao pessoal do LFQB, a todos sem distino. Gostaria de agradecer a uma srie de professores, que tiveram diferentes papis que vieram a convergir no meu amadurecimento cientfico: ao professor Wagner Dias. professora Lucienne Morcillo. professora Dbora Foguel. ao professor Paulo Bisch. ao professor Manuel Gustavo. professora (em breve) Juliana Ado-Novaes. ao professor Rodrigo Fortunato. professora Claudia Janot. Um agradecimento especial professora Eleonora Kurtenbach, minha madrinha cientfica e uma amiga incrvel, muito obrigado. Monique Judice por me guiar ao induzir a DM. Ao Stephan por me auxiliar na dosagem de insulina. Agradeo aos membros da banca, ao aceitarem o convite: Wagner Barbosa Dias, Mauro Sola-Penna, Isis Hara Trevenzoli, Alfred Sholl Franco (desculpe pelo trabalho!) e Lucienne da Silva Lara Morcillo. Agradeo ao pessoal do Instituto de Biofsica: alunos, professores, secretrias e moas da limpeza. Presto um agradecimento especial aos meus colegas de graduao Amanda, Andr, Camila, Carolina, Eduardo, Elmo, Estefania, Fernando, Frederico, Gabriela, Ivan, Juliana, Luana, Lus Felipe, Main, Mara, Marcelo, Paulo, Pedro, Rafael, Renato, Ricardo, Rodrigo, Sonia e Thas. No sei por onde andam muitos de vocs. Entretanto por outros, considero amigos de uma vida inteira. Queria agradecer por ter sido exatamente da forma como foi, valeu! Daniel, Manuela, Thiago e Kissney que em diferentes momentos nos ajudaram durante a graduao e depois, de vocs que lembro e agradeo, valeu! Marcelo, Rafa, Rafael, Karine, Milene, Elaine, Luzia, Rose, Andr, Luiz Fernando, Fernando, Flvio, Nat, Camila, Wendel, Ju, Guilherme, Rodrigo, Joo, Cris, Ju, Raiane, Fabricio, Pierre, Diego, Filipe, Eduardo, Natlia, Re e Stephany. Aos amigos com quem a tempos no tenho contato, desculpem-me pela ausncia, sei que vocs entendero. Possivelmente eu esqueci algum. Agradeo a natureza por ser algo to interessante a ponto de ocupar quase todo meu tempo.

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I know the pieces fit 'cause I watched them fall away

JONES, A.; CAREY, D.& KEENAN, M.J. da banda Tool

RESUMO O fgado responsvel pela distribuio e excreo (do excesso) do on cobre, sendo considerado o rgo mais importante na homeostase deste metal graas expresso de Atp7b, a Cu(I)-ATPase heptica. Alm disso, tambm um dos rgos centrais no metabolismo energtico, controlando os nveis sanguneos de glicose, atravs da ao de hormnios como insulina e glucagon. Estes hormnios, tendo o fgado como alvo, sinalizam sobre o estado nutricional disparando diferentes vias de sinalizao envolvendo cinases (PKA, PKC e tirosina cinase). Estudos recentes do nosso grupo demostraram que a PKA fosforila resduos especficos modificando o comportamento cataltico da Cu(I)-ATPase de levedura, Ccc2, quando expressa heterologamente em clulas Sf9 e em fraes de membrana enriquecidas com vesculas do complexo de Golgi de hepatcitos porcinos. O presente trabalho tem por objetivo caracterizar a Cu(I)-ATPase de rato, e avaliar a interao entre o metabolismo energtico e a homeostase do cobre em um modelo de diabetes mellitus in vivo. Fraes de membrana enriquecidas em complexo de Golgi foram obtidas de fgado de ratos Wistar controle e aps 14 dias de diabetes mellitus, condio induzida pela injeo intraperitoneal de 65 mg/kg p.c. de estreptozotocina. Os resultados da atividade especfica (mdias desvio padro) foram medidos pela diferena entre a presena e ausncia de 0,3 mM cido batocupronodissulfnico (BCS), um quelante de ons Cu(I). O pH timo, concentrao de BCS, quantidade de protena e curva de ATP foram determinados mostrando que a liberao mxima de Pi ocorre em pH cido (5,0 tampo acetato) com 50 g de protena e 5 mM de ATP. A atividade Cu(I)-ATPsica foi de 20, 3 8,9 nmol Pi mg-1 min-1 (N=9) no grupo controle e 20,0 9,8 nmol Pi mg-1 min-1 (N=12) no grupo diabtico. Apesar de no haver diferena entre as atividades ATPsica de Atp7b dos fgados de animais controle e de animais diabticos, ainda h detalhes acerca ao transporte ativo do cobre a serem pesquisados. Mltiplas fosforilaes regulatrias em resduos inibitrios e ativatrios, simultaneamente, explicam a mesma atividade em fgado de animais controle e diabticos, de modo que no se pode afirmar que no h diferenas de regulao. Alm disso, 14 dias talvez no seja tempo suficiente para evoluo da doena ou ainda, a localizao subcelular da ATPase possa estar alterada, de forma que estudos futuros sero necessrios para determinar possveis mecanismos na interao entre o metabolismo energtico e a homeostasia do cobre.

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ABSTRACT The liver is responsible for copper distribution and excretion of its excess, being the most important organ in mammals for copper homeostasis due to the expression of Atp7b, the hepatic Cu(I)-ATPase. Likewise, this organ is also central in energetic metabolism, controlling glucose levels in response to insulin- and glucagon- triggered signaling pathways depending on the nutrition state. These hormones are known for activating different kinasemediated pathways that includes PKA, PKC and tyrosine kinases. Recent studies of our group demonstrated that PKA phosphorylates specific residues that modifies catalytic behavior of yeast Cu(I)-ATPase when heterologously expressed in a Sf9 cells and in pig liver enriched Golgi membrane fractions. The present work focuses not only in rat Cu(I)-ATPase characterization, but seek also to further understanding of an in vivo animal model of interaction between energetic metabolism and copper homeostasis, that was demonstrated in vitro. Golgi-enriched membrane fractions were obtained from Wistar rat liver of control and 14 days diabetic animals, induced by 65 mg/kg streptozotocin intraperitoneal injection Cu(I)ATPase specific activity was evaluated by release of Pi from ATP. The results (means standard deviation) were obtained by the difference in the absence and presence of 0.3 M bathocuproinedisulfonic acid (BCS), a specific Cu(I) chelator. Optimal pH, BCS concentration, protein amount and ATP curve were determined, showing that the maximum Pi release was obtained in acidic pH (5.0) with 50 mg of total protein and 5 mM of ATP. The Cu(I)-ATPase activity for control group was 20.3 8.9 nmol Pi mg-1 min-1 (N=9) and diabetic group 20.0 9.8 nmol Pi mg-1 min-1 (N=12). Atp7b is a P-type ATPase, responsible for active copper transport to the lumen of trans-Golgi network. In vitro studies shows that insulin is responsible for stimulation of Atp7b activity and therefore the kinasesmediated regulatory phosphorylations are being studied in this in vivo model. The absence of difference between control and diabetic Cu(I)ATPase activity indicates that there is a counterbalancing regulatory mechanism maintaining basal levels of ATP hydrolysis or that the 14 days pathology is not enough to modify Atp7b behavior. One last hypothesis concerns in Atp7b traffics being truncate in diabetes mellitus. Future perspectives rely in researching liver molecular mechanistic understandings and its cellular localization in this pathogenesis.

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LISTA DE ILUSTRAES FIGURA 1. DISTRIBUIO DAS CU(I)-ATPASES EM HUMANOS. .................................................14 FIGURA 2. OS PRINCIPAIS DESTINOS CELULARES DO COBRE EM CLULAS HUMANAS. ................16 FIGURA 3. ESTRUTURA ESQUEMTICA DE ATP7B. .....................................................................19 FIGURA 4. A FUNO DE ATP7B, A CU(I)-ATPASE DE FGADO NOS MAMFEROS.......................23 FIGURA 5. ESTRUTURA CELULAR E MICROAMBIENTE DOS HEPATCITOS...................................29 FIGURA 6. DESENHO EXPERIMENTAL. .......................................................................................37 FIGURA 7. ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA DAS FRAES DE MEMBRANA DE RATOS CT MOSTRA UM PADRO LINEAR AT 50 G DE PROTENA POR TUBO.. ..................................................44 FIGURA 8. ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA EM DIFERENTES TAMPES REVELAM HIDRLISE MXIMA EM PH 5,0 (TAMPO ACETATO).. ..........................................................................45 FIGURA 9. CIDO BATOCUPRONODISSULFNICO INIBE A HIDRLISE DE ATP DE UMA FORMA DOSE DEPENDENTE. A HIDRLISE DE ATP FOI REALIZADA COM TAMPO ACETATO (PH 5,0), A 37C POR 10 MIN. ....................................................................................................47 FIGURA 10. MASSA CORPREA ANTES E DEPOIS DA INDUO DA DM.......................................48 FIGURA 11. NDICE GLICMICO ANTES E APS A INDUO DA DM.. ..........................................49 FIGURA 12. DIMINUIO DA INSULINA CIRCULANTE NOS ANIMAIS DM CONFIRMA HIPOINSULINEMIA... ...........................................................................................................50 FIGURA 13. NDICE HEPTICO ...................................................................................................51 FIGURA 14.HIPOINSULINEMIA INDUZ A ATIVIDADE DE PKA NO FGADO.. .................................53 FIGURA 15. PRESENA DA PKA EM PREPARAES DE MEMBRANA DE RATOS CT E DM.. .........53 FIGURA 16. ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA DE FRAES DE MEMBRANA DE RATO CT E DM NO APRESENTAM DIFERENA.. .................................................................................................54 FIGURA 17. FLUXOGRAMA DE CONCLUSES..............................................................................63

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LISTA DE ABREVIAES AGE (advanced glication end-products) produtos de glicao avanados AMPc adenosina monofosfato cclico ATP adenosina trifosfato Atp7a enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doena de Menkes ATP7A gene que codifica Atp7a Atp7b enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doena de Wilson ATP7B gene que codifica Atp7b BCS cido batocupronodissulfnico BSA (bovine serum albulmine) albumina de soro bovino Ccc2 enzima Cu(I)-ATPase de Saccharomyces cerevisiae DM diabetes mellitus DTT ditiotreitol DMT (divalent metal transporter) transportador de metais divalentes DPM/DP desvio padro da mdia/desvio padro g vezes a fora da gravidade MOPS cido 3-[N-morpholino]propanosulfnico MRC meio de reao comum NAD(P)H Nicotinamida adenina dinucletido fosfato reduzido Na+,K+-ATPase Sdio, potssio-ATPase PI3K fosfatidilinisitol-3-cinase PKA protena cinase dependente de AMPc PMCA Ca2+-ATPase de membrana plasmtica RI receptor de insulina RAGE (advanced glication end-products receptors) receptor de produtos de glicao avanados SDS dodecil sulfato sdio TCA cido tricloroactico TETA trietilenotetramina

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SUMRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... iv RESUMO ................................................................................................................................. vi ABSTRACT ............................................................................................................................vii LISTA DE ILUSTRAES ............................................................................................... viii LISTA DE ABREVIAES .................................................................................................. ix 1. INTRODUO ...............................................................................................................11 1.1. O TOMO COBRE E SUAS PROPRIEDADES QUMICAS .....................................................11 1.2. HOMEOSTASE DO COBRE EM HUMANOS .......................................................................13 1.3. ESTRUTURA, MECANISMO E REGULAO DE ATP7B ....................................................18 1.4. DOENAS RELACIONADAS AO METABOLISMO DO COBRE: DOENAS DE WILSON E DE MENKES .................................................................................................................................24 1.5. O FGADO E SUA UNIDADE FUNCIONAL, O HEPATCITO ...............................................26 1.6. INSULINA: SNTESE E AO..........................................................................................28 1.7. A DIABETES MELLITUS ..................................................................................................32 1.8. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................34 2. 3. OBJETIVOS ....................................................................................................................35 MATERIAL E MTODOS ............................................................................................36 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 5. REAGENTES .................................................................................................................36 INDUO DE DM .........................................................................................................36 PREPARAO DAS FRAES DE MICROSSOMAS ...........................................................38 DOSAGEM DE PROTENAS TOTAIS PELO MTODO DE LOWRY MODIFICADO ..................39 DOSAGEM DE INSULINA NO SORO DOS ANIMAIS ...........................................................39 IMUNODETECO POR SDS-PAGE SEGUIDO DE WESTERN BLOTTING ..........................40 ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA ......................................................................................40 ATIVIDADE DA PKA ....................................................................................................42 ANLISE ESTATSTICA .................................................................................................42 CARACTERIZAO DA ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA ...................................................43 INDUO DE DM .........................................................................................................46 MODULAO DA PKA PELA INSULINA ........................................................................52 ATIVIDADE CU(I)-ATPSICA DE FGADO DE RATOS DM E CT ....................................52

RESULTADOS ................................................................................................................43

DISCUSSO ....................................................................................................................55

REFERNCIAS ......................................................................................................................64

1. INTRODUO
1.1. O tomo cobre e suas propriedades qumicas O cobre um metal de transio que alm de estar presente na natureza em sua forma inorgnica, tambm encontrado na matria viva, independente do grau de complexidade e etapa de evoluo (CUILLEL, 2009). Em mamferos, este metal classificado como elemento trao essencial. Essa classificao se deve s caractersticas qumicas do elemento e s propriedades biolgicas que delas emergem. O cobre, assim como o ferro, transita facilmente entre diferentes estados de oxidao (Cu(I) e Cu(II) no ambiente celular), por sua grande capacidade de transferir, tanto doar quanto receber, eltrons em reaes de oxirreduo. Em seu estado metlico, sua distribuio eletrnica no orbital d (4s2 3d9) incompleta, o que o caracteriza como metal de transio (KAIM & RALL, 1996). No estado padro, o cobre tem os potenciais de oxirreduo mais prximo de zero, como nas reaes: Cu(I) + e- Cu (0,52 V, no estado padro) Cu(II) + e- Cu(I) (0,153 V, no estado padro) J que a energia necessria para as transies muito prxima ao zero, a frequncia com que ocorrem alta. Desta forma, a natureza priorizou os chamados centros de ferro e/ou cobre em enzimas que possuem atividade oxirredutora (Tabela 1). Essas enzimas so crticas para vida na presena de oxignio (O2), tornando a deficincia do cobre um destino invivel o que acontece na doena de Menkes, que ser descrita em tpico 1.4. Por isso, o cobre classificado como elemento essencial. No entanto, o mesmo cobre (em excesso) catalisa reaes de oxirreduo em cascata, que geram radicais livres de forma inespecfica e desregulada, culminando na inativao via oxidao de lipdios, protenas e cidos nucleicos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1984). 11

Tabela 1. Cuproenzimas essenciais. Relao entre as enzimas que necessitam do cobre em sua estrutura e a sua funo nos organismos em que so expressas. (Modificado de TAPIEIRO et al., 2003)

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O excesso do on cobre observado na doena de Wilson, que pode levar morte por deficincia heptica se no for devidamente tratada. J os organismos com contedo corporal do cobre na faixa da normalidade possuem quase nenhum cobre citoplasmtico livre (RAE et al., 1999). Alm disso, a fora da evoluo priorizou os sistemas biolgicos que pudessem diferenciar os estados de oxidao de diversos metais (LEWINSON et al., 2009), possibilitando a captao dos metais essenciais e inibindo a entrada inespecfica de metais txicos. Concluindo, em sistemas biolgicos o papel do cobre antagnico: essencial em baixas concentraes, entretanto deletrio em excesso (KAIM & RALL, 1996).

1.2. Homeostase do cobre em humanos A homeostase do cobre compreendida pela absoro, distribuio, armazenamento e excreo do metal (FIGURA 1). A recomendao de ingesto do cobre de 1,5 a 3,0 mg/dia, para um adulto, do quais 50% so absorvidos pelo sistema digestrio (TAPIERO et al., 2003). A absoro do cobre varia com diversos fatores e diminuda com a ingesto de outros ctions divalentes, antioxidantes (como a vitamina C) e fibras. Se a absoro do cobre aumentar, a excreo tambm aumentar. A absoro ocorre prioritariamente no intestino delgado. Duas hipteses acerca do mecanismo de transporte entre lmen do intestino e o entercito ainda so controversas, pois ainda no foi identificada a protena responsvel por este transporte (ARREDONDO et al., 2003; MARYON et al,. 2007; WEISS et al., 2008; ZIMNICKA et al., 2011). Uma das possibilidades, e a mais aceita atualmente, que a difuso do Cu(II) seja facilitada por transportadores passivos de ctions divalentes (como Dmt1), presentes na membrana de borda em escova (apical) dos entercitos (ARREDONDO et al., 2003). Dentro do entercito, duas outras protenas so essenciais para o fenmeno de absoro do metal: Ctr1 e Atp7a. Ambas so enzimas transportadoras de Cu(I), sendo Ctr1 13

Figura 1. Distribuio das Cu(I)-ATPases em humanos. Atp7a expressa em quase todos os tecidos, com exceo do fgado. Esta enzima est envolvida com a absoro intestinal do cobre e na entrega do mesmo as cuproenzimas recm-sintetizadas. J a Atp7b (heptica) responsvel pela excreo do excesso do metal no organismo. Alguns tecidos, como o renal, pulmonar e mamrio, placentar e cardaco, expressam as duas protenas. CP: ceruloplasmina. Adaptado de Lutsenko et al., 2007.

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um transportador passivo encontrado na membrana basolateral do entercito (KAPLAN & LUTSENKO, 2009). J a Atp7a um transportador ativo de Cu(I), responsvel pela secreo desse metal por exocitose. Atravessando a membrana basolateral do entercito, o cobre ganha a corrente sangunea e chega ao fgado pela veia porta. Esse rgo central na homeostase do cobre, uma vez que est envolvido tanto no armazenamento e distribuio, como na excreo do metal. O armazenamento do cobre acontece no fgado, mas tambm no intestino e em outros orgos (LUTSENKO et al., 2007). Ao entrar no citosol, ao menos metade do metal rapidamente fixado pela glutationa e por metalotionenas (TAPIERO et al., 2003), peptdeos e protenas de baixo peso molecular, ricos em cistenas. Outra frao do cobre quelado por metalochaperonas1. Em mamferos, existem trs metalochaperonas que se diferenciam pelo subcompartimento (FIGURA 2) ao qual iro enderear o metal, possuindo estruturas exclusivas (BANCI et al,. 2009). A Cox17 responsvel pela entrega na mitocndria (BANCI et al., 2008), onde o cobre ser adicionado citocromo c oxidase e participar da respirao celular. Ccs outra metalochaperona que garante a entrega do cobre Sod1 (BROWN et al., 2004) para participar da manuteno do nvel fisiolgico de espcies reativas de oxignio. J Atox1 enderea o cobre para a regio trans do complexo de Golgi, onde o metal ser adicionado estrutura de diversas protenas (TABELA 1). Atox1 entrega diretamente o metal para as Cu(I)-ATPases, os transportadores ativos de Cu(I), os quais, por sua vez, possuem altssima afinidade pelo metal (HILRIO-SOUZA et al., 2011) e realizam seu transporte contra o gradiente eletroqumico do cobre custa da hidrlise de uma molcula de ATP. Em humanos so expressas duas Cu(I)-ATPases: Atp7a e Atp7b,que tiveram seus

As chaperonas so uma famlia de protenas responsveis pelo correto enovelamento proteco. J metalochaperonas um termo genrico para protenas cuja funo quelar metais, sendo os quelantes biolgicos dos mesmos (ROBINSON & WINGE, 2010).

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Figura 2. Os principais destinos celulares do cobre em clulas humanas. Aps entrar na clula pelo transportador passivo Ctr1, o metal possui trs destinos subcelulares: (1) ser carreado at a mitocndria pela Cox17 e participar da respirao celular quando incorporado estrutura da citocromo c oxidase (Cco); (2) Graas metalochaperona Ccs, disponibilizado para a superxido dismutase, a qual responsvel por controlar o excesso de espcies reativas de oxignio; (3) o cobre entregue, pela metalochaperona Atox1, ao complexo de Golgi onde ativamente transportado por Atp7a ou Atp7b e para incorporado em diferentes cuproprotenas (TABELA 1), dependendo do tipo celular.

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genes descritos durante a dcada de 90 (ATP7A: CHELLY et al., 1993; MERCER et al., 1993; VULPE et al., 1993; ATP7B: REED et al., 1995; WU et al., 1994). Apesar da alta homologia estrutural, estas ATPases possuem funes independentes e complementares: enquanto a Atp7a necessria para a entrada do cobre nos rgos, a Atp7b est relacionada distribuio do metal e excreo do eventual excesso do cobre no organismo, atravs da bile. No fgado, Atp7b garante que a ceruloplasmina receba 6 a 7 ons cobre durante sua sntese. Essa protena carreia 80% do cobre srico, sendo a fonte deste metal em todo o corpo. Alm de servir de fonte do metal, essa protena extracelular detm atividade peroxidase, neste ponto a homeostasia dos ons cobre e ferro se sobrepe e converge: a ceruloplasmina necessria para a oxidao do on Fe+2 (ferro ferroso) em Fe+3 (ferro frrico), processo essencial para sua incorporao na transferrina (LEYENDECKER et al., 2011). A excreo do cobre tida como ponto chave na regulao do seu nvel corpreo (TURNLUND et al., 1989). neste ponto que o mecanismo se ajusta de modo a manter a quantidade corprea do cobre no limiar entre o txico e o essencial. A secreo do metal na bile torna o fgado o principal rgo na homeostase deste metal. O evento totalmente dependente da enzima Atp7b (HERNANDEZ et al., 2008), a qual tambm necessria para a sada do metal no crebro. Outros rgos como rim, glndulas salivares e sudorparas tambm excretam o metal, mas em menores quantidades (LUTSENKO et al., 2007). A homeostase intracelular do cobre mantida por um sistema de elementos em rede, com vias conectadas entre si (LUTSENKO, 2010), alm de ser determinada por um gradiente de afinidade ao metal (BANCI et al., 2010). A afinidade das cuproprotenas pelo o cobre crescente, de modo que a afinidade de Ctr1 < afinidade das metalochaperonas < afinidade 17

das Cu(I)-ATPases < afinidade nas cuproenzimas. Dessa forma, o metal diretamente direcionado por um fluxo de afinidades. Alm disso, a funo das duas ATPases transportadoras considerada o principal ponto de controle da homeostase do cobre, devido a sua especificidade no transporte de Cu(I) e no possuindo substituto com funo redundante (LUTSENKO et al., 2007). A ausncia da funo destas enzimas leva a srios distrbios como os observados nas doenas de Menkes e Wilson.

1.3. Estrutura, mecanismo e regulao de Atp7b As ATPases que formam um intermedirio fosfo-enzima, acoplando a translocao de ctions atravs de compartimentos celulares hidrlise de ATP so denominadas ATPases do tipo P (ou P-ATPases). A subfamlia responsvel pelo transporte de metais pesados esto agrupadas no grupo I das P-ATPases (LUTSENKO & KAPLAN, 1995) e dentro deste as Cu(I)-ATPases so classificadas como do grupo B. Atp7b ento classificada com uma P1BATPase responsvel pelo transporte do cobre em mamferos. Esta enzima, de 148,3 kDa, possui oito hlices transmembrana, uma regio N-terminal que apresenta papel regulatrio, dotada de 6 domnios de ligao de metal (regio consenso com o motivo CxxC, onde x um aminocido qualquer, LUTSENKO et al., 2007). O fenmeno de transporte ocorre graas a trs domnios com funes preservadas entre as P-ATPases: domnio N, domnio P e domnio A (FIGURA 3). O ciclo cataltico se d pela transio entre 4 estados em que a enzima possui diferentes propriedades

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Lmen do Golgi

Citoplasma

Figura 3. Estrutura esquemtica de Atp7b. Domnios de ligao do metal (1-6) na regio N-terminal de Atp7b, que est conformacionalmente prxima aos domnios citoplasmticos da enzima, podendo modular a sua funo. Cilindros representam as oito hlices transmembrana. Domnio A (atuador) responsvel pela etapa de hidrlise do ciclo cataltico. Domnio N (nucleotdeo) regio de coordenao da molcula de ATP. Domnio P (fosforilvel) contm o cido asprtico presente em todas as ATPases do tipo P. (retirado de LUTSENKO et al., 2010)

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(FATEMI & SARKAR, 2002). No estado inicial, Atp7b possui alta afinidade pelo metal em seu stio de transporte, que formado por diversos aminocidos das hlices transmembrana, mas principalmente pelo motivo CPC (LOWE et al., 2004). Com o metal ocludo entre as hlices transmembranares, o ATP coordenado no domnio N se aproxima do domnio P que possui o cido asprtico invariante nas P-ATPases, que no caso de Atp7b humana a Asp1027 e assim este aminocido auto-fosforilado. Na etapa seguinte o intermedirio fosfo-enzima nomeado de composto de alta energia, devido o acmulo de energia qumica. Esta energia necessria para o transporte contra gradiente eletroqumico do Cu(I), e armazenada na ligao acilfosfato (entre o Asp1027e o fosfato- proveniente do ATP). Concomitante com a translocao do ction para o lmen do complexo de Golgi a energia da ligao acilfosfato deca e este intermedirio denominado fosfo-enzima de baixa energia. Este intermedirio suscetvel a autodesfosforilao pelo domnio A. Aps a desfosforilao a enzima retorna para etapa inicial, pronta para realizar um novo ciclo cataltico (LOWE et al., 2004). Diversas formas de regulao ps-traducional so conhecidas, modificando funes enzimticas de modo que podem at alterar o destino celular (HUBER & HARDIN, 2004). Dentre as modificaes mais comuns esto: acetilao, fosforilao, glicosilao, protelise, ubiquitinao, entre outras (WALSH et al., 2005). Estas modificaes so responsveis por alterar a funo de enzimas e outras protenas modificando (a) localizao subcelular, (b) meia vida funcional e (c) afinidade por substratos e outros ligantes. Os principais pontos de controle da homeostase celular do cobre so as modificaes ps-traducionais nos transportadores passivos Ctr1 e Ctr2 e nos transportadores ativos Atp7a e Atp7b (VAN DEN BERGHE & KLOMP, 2010). Apesar da nica modificao ps-traducional relatada no banco

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de dados Universal Protein Resource (UniProt2) ser a fosforilao regulatria, existem relatos da ubiquitinao de Atp7b (DE BIE et al,. 2007). Esta modificao est relacionada com a estabilidade do transportador, diminuindo sua meia vida funcional por aumentar a sua taxa da degradao proteassomal. Essa degradao est relacionada s mutaes em resduos crticos para estrutura terciria de Atp7b, que levariam a sua reteno no retculo endoplasmtico e baixa trfego para complexo de Golgi (DE BIE et al,. 2007). Outras modificaes no covalentes, como interaes protena-protena alteram a funo e estruturadas Cu(I)-ATPases. Diversos parceiros j foram determinados para Atp7b, alguns transientes e outros interagindo de modo mais duradouro. Atox1, uma das metalochaperonas intracelulares do cobre, entrega o metal diretamente a Atp7b no Golgi, sendo ento a interao entre estas protenas essencial para translocao do cobre do citoplasma para o complexo de Golgi (WALKER et al., 2002). Essa parceria se deve a interao protena-protena que acontece entre Atox1 e o N-terminal de Atp7b, que garante que o Cu(I) seja endereado diretamente ao complexo de Golgi, aps entrar na clula. Outra classe de protenas, que modulam a atividade de Atp7b, so as glutaredoxinas, que mantm os grupamentos tiis das cistenas em seu estado reduzido, de forma que estes grupamentos (presentes no N-terminal de Atp7a, Atp7b e diversas outras cuproprotenas) possam coordenar o Cu(I) (LIM et al., 2006). Uma terceira protena que interage com Atp7b e vem chamando a ateno de pesquisadores por ainda no possuir funo conhecida, alm de participar da homeostase do cobre, a COMMD1 (VONK et al., 2011). Sabe-se apenas que esta protena liga cobre e que esta ligao est aumentada em casos que h mutaes relacionadas doena de Wilson, sugerindo que COMMD1 esteja relacionada com a estabilidade de Atp7b (DE BIE et al,. 2007). A modulao de funo fisiolgica das Cu(I)-ATPases mais bem compreendida sua resposta adaptativa ao aumento do cobre intracelular que induz o relocalizao subcelular da enzima para permitir a retirada
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http://www.uniprot.org/uniprot/Q9QUG4 acessado em 15 de fevereiro de 2012.

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de excesso de metal pesado da clula (FIGURA 4). J foi demonstrado que Atp7a tambm migra para a regio perimembranar de macrfagos em resposta hipxia (WHITE et al., 2009) levando a um aumento na atividade bactericida destas clulas. Alm disso, insulina e estrognio aumentam a expresso de Atp7a, estimulando seu trfego para a membrana plasmtica. Em contrapartida, esses hormnios diminuem a expresso de Atp7b e a retm no complexo de Golgi (HARDMAN et al., 2007) em clulas placentrias. Nestas clulas polarizadas, ambas Atp7a e Atp7b so expressas, sendo a primeira responsvel pelo suprimento de cobre no feto em desenvolvimento, enquanto Atp7b elimina o excesso do metal, retornando-o para circulao maternal. Ento este tipo celular um bom exemplo de como as funes de Atp7a e Atp7b so complementares no corpo humano, protegendo-o dos efeitos deletrios, mas garantindo a quantidade necessria para sua incorporao nas cuproprotenas. Atualmente, o evento de fosforilao regulatria vem sendo estudado para um melhor entendimento da regulao da Cu(I)-ATPase heptica. Esse evento consiste na transferncia do fosfato- (terminal) da molcula de ATP para a cadeia lateral de um resduo de serina, treonina ou tirosina da protena alvo, por uma protena cinase (SHABB, 2001). Esta fosforilao denominada uma ligao do tipo ster-fosfato, diferente da ligao acil-fosfato que ocorre durante o ciclo cataltico de todas as ATPases do tipo P, em um resduo de aspartato. Alguns resduos de Atp7b foram identificados como fosforilveis por cinases, atravs de mtodos de espectrometria de massas: Ser478, Ser481, Ser1121 e Ser1453 (PILANKATTA et al., 2009). O mesmo grupo sugeriu, em outro trabalho, que a protena cinase D (PKD) seria responsvel por essa fosforilao, e que ela regularia o trfego da ATPase (PILANKATTA et al., 2011). Outro grupo (BARTEE et al., 2009) identificou outros

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Figura 4. A funo de Atp7b, a Cu(I)-ATPase de fgado nos mamferos. Esta enzima, em condies normais (Cu), transporta o cobre para a regio trans do complexo de Golgi, onde o metal ser adicionado ceruloplasmina, que por sua vez ser secretada no sangue e o distribuir pelo corpo. Com o aumento da concentrao do cobre citoslico (Cu), a protena endereada para vesculas periapicais. Aps este evento adaptativo, a enzima possu uma nova funo fisiolgica: secretar o metal para o canalculo biliar, excretando-o. Modificado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002.

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trs resduos possivelmente fosforilveis por uma cinase presa membrana, todos na regio N-terminal da enzima. Um deles prximo a primeira hlice transmembrana, a Ser653, estruturalmente equivalente ao Ser258 de Ccc2, a Cu(I)-ATPase de leveduras, identificada por Valverde e colaboradores (2008). Projetos desenvolvidos por nosso grupo j demonstram que h fosforilao direta em Ccc2, por PKA, sugerindo um papel fisiolgico para esta regulao (VALVERDE et al., 2011). Aps identificar resduos fosforilados, demonstramos que esta fosforilao altera o ciclo cataltico da enzima e propomos uma hierarquia entre a fosforilao dos diferentes resduos (VALVERDE et al., 2008). Demonstramos tambm que a PKA inibe a atividade ATPsica de Atp7b de fgado de porco, alterando a afinidade do on cobre (HILRIOSOUZA et al,. 2011) e que a insulina, atravs da inibio da PKA, estimula a atividade da enzima (HILRIO-SOUZA, resultados no publicados). Nosso grupo tambm vem investigando quais isoformas de PKC ativveis por ster de forbol estimulam a atividade ATPsica da Cu(I)-ATPase de fgado de porco (CARDOSO, resultados no publicados).

1.4. Doenas relacionadas ao metabolismo do cobre: doenas de Wilson e de Menkes A doena de Wilson (nmero no banco de dados OMIM3 2779004) uma desordem monognica, que altera o metabolismo do cobre. Historicamente, a doena foi descrita como uma desordem familiar que culmina na cirrose heptica e distrbios neurolgicos como psicose e parkisonismo (HARADA, 2002). Ela causada por mutaes no gene de ATP7B que codifica a protena de Wilson (Atp7b ou WND). Esta doena causa acmulo excessivo do cobre no fgado e em outros rgos, como o crebro, que leva a cirrose heptica e distrbios neurolgicos como citado acima, alm disso, h deficincia na sntese de ceruloplasmina.
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Extenso banco de dados de fentipos de doenas herdadas da universidade de Johns Hopkins. http://www.omim.org/entry/277900 acessado em 22 de fevereiro de 2012.

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O gene ATP7B est localizado no cromossomo 13, e j foram catalogadas 1119 mutaes causadoras de doena para este gene5. Apesar de pouca relao gentipo-fentipo (BURKHEAD et al., 2011), algumas destas mutaes so mais recorrentes e melhor estudadas, como o caso da His1069Gln (HARADA, 2002), encontrada em indivduos de origem europeia e que leva diminuio da meia vida funcional da enzima (PAYNE et al., 1998) e a localizao subcelular anormal (HUSTER et al., 2003). A pouca relao entre as mutaes encontradas e os achados clnicos se devem, provavelmente, a fatores ambientais (GUPTA et al., 2011) e processos celulares ainda no identificados. A prevalncia dessa doena autossmica recessiva 1:30.000, mas o nmero de portadores de mutaes pode chegar a 1 em cada 90 indivduos (SHERLOCK & DOOLEY, 2002). Considerando que uma frao dos portadores de Wilson so assintomticos, testes genticos no so confirmatrios (devido a grande quantidade de mutaes ainda no relacionadas aos estados patolgicos). Para um diagnstico ideal, um conjunto de testes requerido, entre eles quantificao do cobre heptico (bipsia), determinao de ceruloplasmina e cobre sricos, e mais recentemente testes radiomtricos (PENG el al., 2011). Os anis de Kayser-Fleischer, depsitos do metal em torno da crnea, so indicadores clssicos dos casos neurolgicos de doena de Wilson (LUTSENKO et al., 2010). A doena de Wilson no tratada fatal, pois o dano no fgado irreversvel (CATANA & MEDICI, 2012). Entre os tratamentos recomendados esto os quelantes d-penicilamina e trietina (que levam ao aumento da excreo urinria do cobre) e ingesto de acetato de zinco (que, por competio, diminui a absoro do cobre ingerido) (SHERLOCK & DOOLEY, 2002).

http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/database.asp acessado em 4 de janeiro de 2012.

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A doena de Menkes (OMIN 3094006) um distrbio gentico recessivo. Nessa doena o gene ATP7A (ou MNK), presente no cromossomo X, est mutado. Essas mutaes refletem na perda da funo de Atp7a e por consequncia a perda de atividade das cuproenzimas. Sem a atividade destas enzimas, diversos so os sintomas observados: neurodegenerao, estrutura capilar anormal, aneurismas vasculares e tromboses. Em geral, o portador da doena de Menkes morre nos primeiros anos de vida. Tanto Atp7a quanto Atp7b so P-ATPases de metais pesados, com 54% de homologia de sequncia primria e extrema similaridade funcional. Ambos os transportadores do cobre so necessrios para a entrega do metal no seu destino final. Entretanto, as doenas de Menkes e Wilson so essencialmente distintas, sendo a doena de Wilson caracterizada pelo excesso do metal e a doena de Menkes pela falta de cobre. A simples deficincia do cobre, causada pela baixa ingesto ou excesso de quelao do metal, leva a sintomas distintos da doena de Menkes: anemia e disfuno heptica (HARADA et al., 2011). Isso demonstra que existem detalhes da homeostasia do cobre que ainda no so compreendidos. Alm disso, pouco se sabe sobre a expresso diferencial dos genes ATP7A e ATP7B em humanos. J foi constatado que Atp7b de fgado e rim possuem diferenas estruturais que alteram sua regulao e trfego (BARNES et al., 2009) e que Atp7b uma isoforma especificamente expressa na pineal, tendo propriedades cinticas diferentes da isoforma heptica (BORJIGIN et al., 1999).

1.5. O fgado e sua unidade funcional, o hepatcito Viso macroscpica:

http://www.omim.org/entry/309400 acessado em 22 de fevereiro de 2012.

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O fgado um rgo vital e o maior rgo interno do corpo humano, pesando aproximadamente 1,3 kg, cerca de 1/50 do peso de um adulto. Possui uma enorme diversidade funcional, tendo mais de 500 funes bioqumicas diferentes, o que impossibilita sua substituio por substitutos artificiais existentes (DING & SHI, 2011). Situa-se no quadrante superior esquerdo do abdmen, estando aderido superfcie exterior do diafragma. Anatomicamente, o rgo dividido em quatro lobos, dois principais (direito e esquerdo) e dois na face posterior (caudado e quadrado). O direito (maior) e esquerdo so unidos pelo ligamento falciforme que pode ser observado da viso anterior. A vescula biliar um rgo anexo ao fgado e armazena a bile (ROBBINS et al., 2000), um fluido complexo que transporta, inclusive, diversas substncias txicas, metabolizadas e transformadas no fgado, para que sejam excretadas nas fezes. A bile tambm auxilia a digesto, j que forma sais biliares capazes de emulsificar lipdios, facilitando sua absoro (ZSEMBERY et al., 2000). Este rgo altamente vascularizado, sendo constitudo por um sistema de veias, cuja veia porta a principal, e outro de artrias, cuja artria heptica a principal. Tanto veia porta como a artria heptica so responsveis pelo aporte de nutrientes, oxignio e substncias que sero metabolizadas e excretadas pelo fgado. O fgado ainda o responsvel pelo metabolismo de glicose (e armazenamento de glicognio), metabolismo de aminocidos, sntese de cidos graxos, metabolismo de lipoprotenas, algumas protenas sricas importantes (albumina, protenas da cascata de coagulao, entre outras), armazenamento de vitaminas A, B12 e D. O fgado tambm capaz de produzir hormnios e autacides, sendo considerada a maior glndula do corpo (SHERLOCK & DOOLEY, 2002). Viso microscpica

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O hepatcito a unidade funcional do fgado (FIGURA 5). Este tipo celular mede cerca de 30 m e organiza-se em camadas, onde os espaos no ocupados por estas clulas esto ocupados por vasos e tecido conjuntivo (KUNTZ & KUNTZ, 2008). Entre as membranas plasmticas de hepatcitos vizinhos, pequenos sulcos so formados, o que d origem ao lmen do canalculo biliar. Estas membranas recebem o nome de membrana apical e possuem constituintes distintos da membrana basolateral (SUTHERLAND el al., 1988). Assim, os sulcos entre diferentes camadas de hepatcitos atravs do fgado formam um de sistema de tbulos denominado os canalculos biliares. Outra clula que participa da gnese da bile so os colangicitos, que so as clulas epiteliais destes canalculos biliares. Hernandez e colaboradores (2006) relatam que Atp7b detectada nas junes do tipo apertada da membrana apical de hepatcitos, o que facilitaria o transporte de cobre do hepatcito para o lmen do canalculo, tendo em vista que a junes do tipo apertada permitem que hepatcitos vizinhos permaneam unidos, ao entorno do canalculo biliar. No h relatos da participao dos colangicitos na excreo do cobre.

1.6. Insulina: sntese e ao A insulina um hormnio peptdico central no metabolismo energtico (PLUM et al., 2006). Mais especificamente, a insulina responsvel por sinalizar a sntese de glicognio no fgado, msculo e tecido adiposo, o que acontece no estado de saciedade onde o anabolismo e os mecanismos de reserva energtica so ativados. Este hormnio sintetizado como pr-proinsulina, nas clulas das ilhotas de Langerhans do pncreas. O pr-hormnio constitudo pelas cadeias A, B, C e do peptdeo sinal, totalizando 110 aminocidos (STEINER et al., 1967). Depois de traduzida, a pr-

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Figura 5. Estrutura celular e microambiente dos hepatcitos. O canalculo biliar formado entre os hepatcitos de uma mesma camada. Acima do hepatcito: tecido endotelial e clulas estelares hepticas (responsveis pela sustentao do parnquima heptico), logo abaixo esto os sinusides regio vascular entre as camadas de hepatcitos, onde se encontram as clulas de Kupfer (macrfagos locais). Espao de Disse o pequeno espao entre o sinusides e hepatcito, o qual contm fibras reticulares. Modificado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002.

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proinsulina carreada at o retculo endoplasmtico, onde o peptdeo sinal excisado por protelise. No retculo, a proinsulina ter sua conformao nativa estabelecida, graas s duasligaes dissulfeto entre as cadeias A e B (KATSOYANNIS, 1966). Finalmente, a proinsulina sofre a ltima etapa para sua maturao: a dupla clivagem da cadeia C, liberando o peptdeo C (33 resduos) e a insulina (51 resduos). A proconvertase e carboxipeptidase so famlias de enzimas que catalisam a quebra do pr-hormnio em resduos especficos, um dos passos limitantes para a sntese da insulina em sua forma ativa. A expresso dos genes de ambas as enzimas diretamente proporcional ao nvel srico de glicose, assim como a traduo do mRNA da insulina. Logo aps sua sntese, a insulina secretada em grnulos e chega corrente sangunea (GUEST et al., 2002). A secreo de insulina iniciada com aumento da concentrao de glicose srica (MALAISSE et al., 1967). Este evento normalmente acontece aps a alimentao e absoro dos nutrientes. O mecanismo sensor dos nveis sricos de glicose detido pela mesma clula que sintetiza a insulina, a clula . Nela a glicose transportada pelo transportador passivo Glut2 e, depois de internalizada, a glicose fosforilada glicose-6-fosfato pela glicocinase. O aumento desse substrato leva elevao dos nveis celulares de ATP e NAD(P)H, que inativam canais de potssio e ativam canais de clcio, elevando os nveis intracelulares de Ca2+, o que dispara a exocitose dos grnulos contendo insulina. J se sabe que a via adenilatociclase-cAMP-PKA tambm est envolvida neste evento, assim como a via fosfolipasefosfoinositdio (DING & GROMADA, 1997). Os efeitos da insulina no corpo so amplos e afetam diversos rgos. Aqui o foco ser para os efeitos no hepatcito devido s vias de sinalizao desencadeadas pela ativao do receptor de insulina (RI). Este receptor um tetrmero constitudo de duas subunidades e duas subunidades (MCKERN et al., 2006). As subunidades so menores e se encontram 30

no exterior da clula. As subunidades possuem uma pequena regio extracelular (194 resduos), uma regio que funciona de ncora na membrana plasmtica (23 resduos), e uma grande regio citoplasmtica (403 resduos) responsvel pela sinalizao. Sendo da famlia dos receptores tirosina cinase, quando o ligante interage com as subunidades no exterior da clula, o receptor altera sua conformao estrutural para um estado ativado que desencadeia diversas reaes intracelulares (MCKERN et al., 2006). Os efeitos da ativao do RI so observados em diferentes compartimentos subcelulares: membrana plasmtica, citoplasma e ncleo. O complexo insulina-RI permite que o receptor se autofosforile em 3 resduos de tirosina na poro intracelular das cadeias (GAMMELTOFT & VAN OBBERGHEN, 1986). Com esses trs resduos fosforilados, h o recrutamento dos substratos do receptor de insulina (SRI), que por sua vez so fosforilados em tirosinas especficas. Os fosfoSRI servem como ncoras para protenas adaptadoras. Essas, por sua vez, possibilitaro diversos eventos em cascatas: ativao de protenas cinases, protenas fosfatases, protenas G e canais inicos. O evento em si no apenas depender do tipo celular, mas tambm das protenas expressas antes da ativao. A cascata clssica descrita para sinalizao via insulina-RI atravs da fosfatidilinisitol-3-cinase (PI3K). Essa enzima fosforila lipdios derivados do inositol (como fosfatidilinositol-4-5-bifosfato e fosfatidilinositol-4-fosfato) que por sua vez ativam a protena cinase B, tambm conhecida como AKT. Outra via ativada pelo complexo insulina-IR a das fosfodiesterases. Esta via conhecida por diminuir a concentrao de monofosfatocclico de adenosina (AMPc) e, por sua vez, a atividade da protena cinase dependente de AMPc (PKA, HOUSLAY & MARCHMONT, 1981).

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O efeito celular da insulina finalizado quando o hormnio inativado por enzimas que desfazem a ligao dissulfeto entre as cadeias A e B ou quando internalizado juntamente com seu receptor (KNUTSON et al., 1983).

1.7. A diabetes mellitus A diabetes mellitus (DM) um complexo distrbio do metabolismo energtico (SAMUEL & SHULMAN, 2012) que atinge 5,2% da populao adulta brasileira (MENDES et al., 2011). O metabolismo energtico o somatrio de diversas reaes bioqumicas que geram um fluxo de energia nos organismos. Essas reaes podem ser divididas em dois grupos: catablicas (degradao para obteno de energia) e anablicas (uso de energia e blocos formadores para sntese de novos compostos). Em humanos, diversos hormnios modulam estas reaes nos diferentes tecidos e orgos. A sinalizao por insulina o eixo afetado na DM. Existem 4 tipos diferentes, categorizados por sua etiologia7: DM tipo 1: Causada pela destruio das clulas do pncreas, o que acarreta em deficincia na sntese e/ou liberao de insulina. Essa incapacidade de causa autoimune ou idioptica. Pode ser corretamente diagnosticada pela dosagem do peptdeo C srico (o peptdeo que clivado para maturao do hormnio), que est diminudo na DM do tipo 1. DM tipo 2: A elevao crnica dos nveis de acar leva a uma produo massiva de insulina, e os altos ndices do hormnio leva, por sua vez, a uma dessensibilizao dos RI. Esse tipo de doena a diabetes mais comum e geralmente encontrado em pessoas obesas e sendo considerado um grave problema da sade moderna.

Segundo a World Health Organization. http://www.staff.ncl.ac.uk/philip.home/who_dmc.htm acessado em 25 de abril de 2012.

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Diabetes gestacional: elevao da glicemia em mulheres grvidas, geralmente o que ocorre em mulheres que possuem pr-disposio para acometimento por DM do tipo 2.

Outros tipos especficos de diabetes: Esse tipo de DM tem causa bem conhecida e englobam os casos genticos de hiperglicemia crnica como resultado de defeitos nos genes do RI ou cnceres nas clulas .

Defeitos genticos nas clulas pancreticas; Defeitos genticos nos RI; Endocrinopatias; Infeco viral no pncreas; Outras sndromes (como a sndrome de Down); Induzida por drogas; Todas tm como principal problema a hiperglicemia crnica que acelera o processo de

glicao inespecfica e causa anormalidades vasculares e bioqumicas (PEPPA et al., 2003). A principal causa de morte microvasculopatia renal, porm sintomas como retionapatia e neuropatia so observados no estgio avanado da doena. O mecanismo molecular pelo qual a hiperglicemia crnica leva a estas doenas e at morte, se no tratada, ainda discutido (SINGH et al., 2012). Parece ser a formao de protenas glicadas que leva ao aparecimento da maioria dos danos causado durante a doena. A oxidao e glicao inespecfica, devido inflamao e hiperglicemia, geram produtos de glicao avanados (AGE do ingls advanced glication end-products) que ativam receptores especficos (RAGE). A ativao da via AGERAGE j associada com no apenas os sintomas da DM, mas tambm com sua causa e desenvolvimento (RAMASAMY et al., 2011).

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1.8. Justificativa Apesar da noo do envolvimento dos metais de transio na DM, o exato papel de Atp7b e do prprio cobre nessa doena ainda so discutidos. Dois trabalhos na dcada 80 mostraram o acmulo de metais pesados (cobre ferro e zinco) no fgado e o aumento da sua excreo renal em animais acometidos por DM induzida por estreptozotocina (LAU & FAILLA, 1984). O aumento da excreo urinria do cobre e seu contedo heptico so revertidos com insulina, demonstrando que este hormnio capaz de modular algum ponto na homeostase deste metal. Ainda, o mesmo grupo determinou a cintica do acmulo dos metais no fgado, rim e duodeno de ratos diabticos. Os dados apresentados mostram que a partir de sete dias de DM o contedo de cobre j se mostra aumentado no fgado e rim, enquanto o nvel no duodeno se mostra inalterado at 28 dias, tempo mximo observado (FAILLA & KISER, 1983). Outros relatos sucederam, observando a quantidade de cobre srico aumentada em pacientes acometidos por DM do tipo 2 (WALTER et al., 1991), levando um desbalano no equilbrio redox destes pacientes. Como ainda restam dvidas se a homeostasia de cobre acelera (ou desacelera) as DM e como o on cobre poderia estar atuando nessa fisiopatologia. Alm disso, possvel que a sinalizao por insulina tenha influncia direta na homeostasia de cobre, tendo em vista que este hormnio capaz de modular a atividade da Cu(I)-ATPase de fgado porcino (HILRIO-SOUZA, resultados no publicados). Ento a necessidade da compreenso da regulao da atividade Cu(I)-ATPsica heptica justifica esta dissertao de mestrado. Assim como a melhor compresso molecular das DM.

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2. OBJETIVOS
Walter e colaboradores (1991) hipotetizaram que alteraes na homeostasia do cobre contribuiriam no avano da DM. Entretanto nenhum mecanismo molecular foi proposto at o momento. Assim, o objetivo geral deste trabalho a caracterizao da Cu(I)-ATPase de fgado de rato para investigar se a insulina regula, in vivo, o transporte ativo do on cobre no fgado. Para tal, os seguintes objetivos especficos foram estabelecidos: Obter os parmetros cinticos para Cu(I)-ATPase de fgado de rato, estabelecendo as

condies timas para determinao da atividade enzimtica, tais como pH, quantidade de protena e concentrao de quelante de cobre (BCS). Identificar as protenas presentes nas fraes de membrana enriquecidas em vesculas

de complexo de Golgi, principalmente Atp7b e PKA. Investigar se h alteraes no transporte ativo do cobre em ratos diabticos, tendo em

vista o acmulo desse metal no fgado e possvel relao com a DM (LAU & FAILLA, 1984).

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3. MATERIAL E MTODOS
3.1. Reagentes Solues, inibidores de protease e ATP foram comprados da Sigma Aldrich. Ureia, DTT, Tampo Mes, Bis-tris propano e Trizma base foram obtidos da Merck. A membrana de nitrocelulose, ECLTM e anticorpos secundrios so da empresa GE Healthcare. PKAi5-24 foi obtido da Calbiochem. Anticorpo anti-subunidade cataltica da PKA foi comprado da Santa Cruz (cdigo H95, contra subunidade cataltica da PKA humana).
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Pi foi obtido pelo

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares e adicionado ao ADP (MAIA et al., 1983) para obter o (-32Pi)ATP. O (-32Pi)ATP j marcado proveniente da Perkin Elmer. Os animais foram obtidos de criadouro comercial, devidamente regulamentado pelos rgos competentes.

3.2. Induo de DM A metodologia aqui descrita foi aprovada pela Comisso de tica com Animais de Experimentao do CCS (CEUA-CCS), cujo nmero de protocolo IBCCF122. Ratos Wistar com 250 g (e em torno de dez semanas) foram randomicamente separados em gaiolas de trs animais. Alimentados com gua e rao padro ad libitum, os animais permaneceram sobre ciclo claro-escuro (12h-12h), foram acondicionados em condies controladas de temperatura (20C) e com ar da sala renovado de 4 em 4 h (FIGURA 6). A DM foi induzida por injeo intraperitoneal de estreptozotocina 65 mg por kg corpreo, este e outros protocolos foram discutidos por Wu & Huan (2008). Dois grupos experimentais foram determinados: diabetes mellitus (DM) e controle (CT). A injeo se deu no dia 0 e, enquanto os animais DM receberam 65 mg/kg de estreptozotocina, os animais CT receberam apenas 0,5 mL de veculo (4,5 M tampo citrato, pH 4,5). A gua dos animais foi suplementada com sacarose 10% por 24 h aps a injeo, de modo a proteger estes animais da 36

Figura 6. Desenho experimental. Protocolo aprovado pela Comisso de tica com Animais de Experimentao do CCS (CEUA-CCS) IBCCF122.

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onda de insulina proporcionada pela necrose das clulas do pncreas. Todos os animais tiveram peso e glicemia acompanhados desde a seleo. A glicemia em jejum de 6 h foi medida por mtodo da gota caudal utilizando kit comercial (medidor de glicose Johnson & Johnson OneTouch Ultra). Nenhum animal teve de ser sacrificado antes do 14 dia por apresentar perda de peso maior que 30% do peso inicial.

3.3. Preparao das fraes de microssomas Os animais foram sacrificados por decapitao, aps jejum de 8 h, medio de glicemia e peso, os fgados foram excisados cirurgicamente e devidamente pesados e o sangue colhido e congelado para uso posterior (-20C). Os fgados foram pesados e o ndice heptico foi calculado da seguinte maneira: peso do rgo dividido pelo peso corporal do animal antes do sacrifcio. Para a obteno de microssomas que so sabidamente fraes de membrana enriquecidas em complexo de Golgi, foi modificada a preparao fgado de porco, j estabelecida no laboratrio (HILRIO-SOUZA et al., 2011). A preparao de fgado de ratos foi otimizada e descrita pela primeira vez nesta dissertao. Os fgados foram fatiados e homogeneizados em 1,5 vol. de tampo de homogeneizao gelado [250 mM sacarose, 20 mM HepesTris pH 7.6, 5 mM MgCl2, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 0,15 mg/mL inibidor de tripsina]. Todas as homogeneizaes (vinte percursos completos) aconteceram em homogeneizadores do tipo Potter, 4C, aps a poterizao o homogeneizado total sofreu uma srie de centrifugaes, para que a frao de membrana enriquecida com vesculas de complexo de Golgi fosse obtida. A primeira centrifugao foi de 10000 g por 10 min (rotor SS-34 SORVAL), para que os debris e agregados fossem sedimentados. Em seguida, o sobrenadante foi reservado e o sedimento foi poterizado e sofreu nova centrifugao (10000 g, por 10 min, em rotor SS-34 SORVAL). Os sobrenadantes da primeira e segunda centrifugao foram unidos, poterizados e centrifugados a 100000 g por 38

1 h (rotor 45Ti, BECKMAN, 4C). O sedimento obtido foi poterizado novamente, para garantir a homogeneidade das fraes de membrana, e centrifugado (100000 g por 1 h rotor 45Ti BECKMAN, 4C), pela ltima vez. O sedimento da ltima centrifugao, que contm marcadores especficos do complexo de Golgi (HILRIO-SOUZA et al., 2011) foi ressuspenso por poterizao em tampo de estocagem [100 mM tampo cido 3-(Nmorfolino)-propanossulfnico(ou Mops)-KOH (pH 7,0), 40% glicerol (v/v) e 5 mM DTT] e estocado em N2 lquido (aproximadamente -200C) at o momento do uso.

3.4. Dosagem de protenas totais pelo mtodo de Lowry modificado As protenas totais presentes nas fraes de membranas foram dosadas segundo o mtodo de Lowry (LOWRY et al,. 1951), modificado para melhor solubilizao das protenas de membrana, com a adio de 1% SDS (m/v). Albumina comercial foi utilizada para curva de calibrao (0, 10, 50, 100, 200 e 300 g). O padro e as amostras foram analisados no espectrofotmetro (HITACHI U-2001) 660 nm.

3.5. Dosagem de insulina no soro dos animais O soro dos animais foi colhido aps o sacrifcio e congelado (-20C) at o ensaio. A insulina srica foi dosada por radioimunoensaio utilizando kit comercial (MP Biomedicals, nmero de catlogo 07260102) de acordo com as instrues do fabricante. Este kit foi gentilmente cedido pelo professor Rodrigo Fortunato e utilizado com o auxilio do aluno Stephan Frankenfeld, do Laboratrio de Fisiologia Endcrina Doris Rosenthal, chefiado pela professora Denise Pires de Carvalho. A 125iodo-insulina deslocada pela insulina da amostra foi dosada em espectrmetro gama (Contador gama Wallac1470 Wizard).

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3.6. Imunodeteco por SDS-PAGE seguido de western blotting Sessenta ou trinta g de protena total foram separados por SDS-PAGE (10%) e transferidos para uma membrana de PVDF pr-ativada com metanol. A membrana contendo as protenas de interesse foi bloqueada com 5% de leite em p desnatado comercial (sem clcio excedente). Em seguida, incubou-se o anticorpo primrio monoclonal para PKA (diluio 1:5000) por aproximadamente 16 horas (overnight), 4C, diludo em TBS-T (salina tamponada com tris e contendo 1% tween 20) e 5% de leite desnatado. A membrana sofreu trs lavagens de 5 minutos com TBS-T e em seguida foi incubada, por 1 hora, com o anticorpo secundrio (1:10000 anticorpo anti-cadeia pesada de coelho, gerado em coelho). Aps a ltima incubao, a membrana foi lavada, por trs vezes, de 5 minutos, com TBS-T, temperatura ambiente. Em seguida, revelou-se a membrana em filme fotogrfico utilizando o sistema ECLTM. Para detectar a Atp7b utilizou-se o anticorpo anti-Atp7b humana (Santa Cruz, H20 diluies 1:1000, 1:5000 e 1:10000) e anti-Cu(I)-ATPase de levedura (a enzima Ccc2, marca: Neosystem, Frana, diluio 1:4000).

3.7. Atividade Cu(I)-ATPsica A atividade ATPsica foi medida seguindo o mtodo de Fiske & Subbarow (1925) para medio do Pi liberado durante o ciclo cataltico, modificado para detectar atividade Cu(I)-ATPsica em concentraes residuais do cobre no meio de reao (LOWE et al., 2004). Para determinar os parmetros timos desta atividade um parmetro enzimtico (em anlise) era variado, enquanto os outros permaneciam fixos. Melhores condies refletem mxima hidrlise especfica, isto , nas menores quantidades possveis de cobre e antes da saturao que acontecem quando h enzima ou substrato em excesso. Nesta dissertao os parmetros analisados foram: quantidade de protena, pH, curva do quelante de cobre, BCS. A

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temperatura (37C) e tempo (linear de 1 a 30 min) j haviam sido determinados pelo aluno de iniciao cientfica Felipe Gomes. Cinquenta g de protena total foram incubados em 200 L de meio de reao comum (TABELA 2) por 30 minutos, no gelo. A reao foi disparada pela adio de 50 L de 5 mM ATP e permaneceu durante 10 min, 37C. Aps este tempo, a reao foi parada com 2,125 mL de uma mistura contendo 5% cido tricloroactico (TCA) e 27 mM molibdato de amnio. Aps a parada, a soluo redutora (0,2% 1-amino-2naftol-4cido sulfnico, 1,2% sulfito de sdio e 2,4% bissulfito de sdio) foi adicionada. O contedo de fosfato inorgnico varia linearmente com a intensidade do azul formado e pode ser medido pelo espectrofotmetro (Hitachi U-2001), no comprimento de 660 nm. A diferena entre a condio A (atividade ATPsica total) e B (atividade ATPsica Cu(I)-dependente) resulta na atividade Cu(I)-ATPsica de Atp7b do fgado de rato. A no ser onde diferentemente indicado, os parmetros utilizados so: pH 5,0, 10 min, 37C, 50 g de protena total, 300 M de cido batocupronodissulfnico (BCS) e 5 mM de ATP.

Composto

Concentrao

Acetato (pH 5,0) K2SO4 MgSO4 NaN3 NaF Glicerol Ascorbato (Cond A) Na2SO3 (Cond A) BCS (Cond B)

20 mM 100 mM 10 mM 100 mM 10 mM 4% 100 M 1 mM 300 M

Tabela 2. Componente do meio de reao do experimento de atividade ATPsica. Atentar que os ascorbato e Na2SO3 s esto presentes na condio de atividade total (condio A, azul) e o cido batocupronodissulfnico (BCS) s est presente na condio Cu(I)-dependente (condio B, rosa).

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3.8. Atividade da PKA Cem g de protena total foram incubados na presena de histonas 2B (CABRAL et al., 2007), o substrato clssico da PKA, em um meio contendo 10 mM MgSO4 e 50 mM Mops-KOH. A reao foi iniciada pela adio de 100 M de [-32P]ATP (4,5 Ci/nmol de ATP), 30C. A reao foi terminada, aps 10 min, com a adio de 100 L TCA (50% m/v). Em seguida, o contedo foi filtrado em membranas de celulose (poros 0,45 m) e lavados com 8 mL de TCA (20% m/v) e 2 mL de tampo fosfato 0,2 M. O 32P incorporado s histonas foi medido por cintilao lquida (Perkin Elmer). A atividade especfica de PKA foi obtida pela diferena entre atividade cinsica total e atividade cinsica na presena de 200 nM do inibidor especfico PKAi5-24. 3.9. Anlise estatstica Os experimentos foram realizados em triplicatas e cada nmero amostral (N) representa um animal diferente. Os testes utilizados foram o teste t de Student (anlise de uma condio contra o controle), quando mais de uma condio foi analisada utilizou-se o teste Anova de uma via com os ps-teste de Bonferroni (anlise de diversas condies entre si) e de Dunnett (anlise de diversas condies contra o controle). Foi estabelecido P < 0,05 como estatisticamente significativo. Os resultados foram apresentados como mdia desvio padro da mdia (DPM).

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4. RESULTADOS
4.1. Caracterizao da atividade Cu(I)-ATPsica Para determinar a atividade Cu(I)-ATPsica em fraes de membrana de ratos DM e CT, primeiramente tivemos que estabelecer os parmetros cinticos para dosar a atividade enzimticos da Atp7b presente nestas fraes de membrana. O primeiro parmetro analisado foi a curva de Pi hidrolisado, a partir do ATP em quantidades crescentes de protena total (FIGURA 7), que foi ensaiada por 10 min na presena de 250 M de BCS e pH 7,2 (Mops). Observa-se que, at 50 g, a quantidade de Pi liberado crescente e linear. A partir de 100 g a regio de saturao alcanada e a quantidade de Pi liberado tende a uma constante com o aumento da quantidade de protena total. Para ensaio em estado estacionrio desejvel que no haja saturao da reao enzimtica, de modo que a quantidade de 50 g de protena total foi escolhida para os experimentos subsequentes. Para identificar o ambiente de mxima hidrlise de ATP realizou-se o ensaio de atividade Cu(I)-ATPsica em diferentes pHs, utilizando tampes que melhor se ajustassem quela faixa de pH (FIGURA 8). Os pH/tampes escolhidos foram: 0,5 M de acetato para o pH 5,0, 0,25M Mes-KOH para o pH 6,0, 0,25 M de Mops-KOH para pH 7,0 e 8,0 e 0,25 M de Tris-HCl para pH 9,0. As taxas de hidrlise Cu(I)-ATPsica puderam ser agrupadas em 3 grupos: mximas (pH 5,0), mdias (pH 6, pH 7,5 e pH 8,0) e mnimas (pH 7,0 e pH 9,0). Para os ensaios seguintes o tampo acetato (pH 5,0) foi utilizado. Dez minutos de tempo de reao foram utilizados por estar na parte linear da curva. A linearidade foi obtida at 30 min. Para determinar a atividade hidroltica especificamente relacionada ao transporte do cobre, foi utilizado o quelante especfico de Cu(I): BCS, como descrito em Lowe e

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Figura 7. Atividade Cu(I)-ATPsica das fraes de membrana de ratos CT mostra um padro linear at 50 g de protena por tubo. A atividade foi calculada pela diferena entre a atividade total e a atividade Cu(I)-dependente variando-se a quantidade de protena. O volume final de cada tubo era de 250 L. Por conta da baixa atividade o desvio padro foi omitido neste resultado (N = 3).

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Figura 8. Atividade Cu(I)-ATPsica em diferentes tampes revelam hidrlise mxima em pH 5,0 (tampo acetato). A atividade ATPsica foi ensaiada em diferentes tampes: 0,5 M de acetato para o pH 5,0; 0,25M Mes-KOH para o pH 6,0; 0,25 M de Mops-KOH para pH 7,0 a 8,0;0,25 M de Tris-HCl para pH 9,0 (Mdia D.P , pH 5,0 N = 9; pH 6,0 N = 9; pH 7,0 N = 9; pH 7,5 N = 8; pH 8,0 N = 9; pH 9,0 N = 10; ANOVA com ps-teste de Bonferroni e P < 0,05). Letras iguais acima das barras representam valores estatisticamente iguais.

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colaboradores (2004). A capacidade deste quelante em diminuir a atividade Cu(I)-ATPsica mostrada na Figura 9. A presena de um antioxidante (ascorbato) e um agente redutor (Na2SO3) estimula a atividade Cu(I)-ATPsica, que inibida pela adio de BCS, tendo o IC50 calculado em 9 M de BCS. 300 M foi a quantidade determinada para inibir o processo de transporte do cobre, inibindo especificamente a Cu(I)-ATPase heptica, Atp7b na presena de 5 mM de ATP.

4.2. Induo de DM Os animais foram acompanhados semanalmente tendo suas massas medidas como forma de mensurar seu crescimento (FIGURA 10). Os animais CT apresentaram crescimento adequado, com variao de peso positiva (peso inicial peso final = 25,84g 10,28). Os animais DM apresentaram variao de peso negativa (-44,75 g 18,77, diferente do controle P < 0,01). Os nveis de glicose srica tambm foram acompanhados, juntamente com aferio da massa corprea. O valor limite mximo do aparelho de aferio de glicose 600 mg/dL, muito alm da mdia dos animais controle (78,44 10,56 mg/dL contra 560,92 69,54 mg/dL do DM). Dois dias aps a injeo de estreptozotocina j se observa hiperglicemia nos animais DM (FIGURA 11). No dia do sacrifcio, o sangue colhido foi utilizado para medir a concentrao srica de insulina em jejum de oito horas (FIGURA 12). Neste dia, os animais DM apresentavam hipoinsulinemia DM 11,27 3,40 U/mL (CT 59,04 29,65 U/mL). Alm disso, o ndice heptico (FIGURA 13) confirma hipertrofia heptica (DM = 0,0354, CT = 0,0457, P < 0,01), contrariando a perda de peso dos animais DM. Estes dados confirmam que a induo da DM

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Figura 9. cido batocupronodissulfnico inibe a hidrlise de ATP de uma forma dose dependente. A hidrlise de ATP foi realizada com tampo acetato (pH 5,0), a 37C por 10 min. Condio A possui antioxidante (ascorbato) e agente redutor (Na2SO3) para garantir que o cobre presente na amostra esteja no estado Cu(I). Concentraes crescentes de BCS diminuem a atividade Cu(I)-ATPsica (N = 3 mdia E.P), a curva de inibio est representada no inset do grfico. O valor do IC50 encontrado foi de 89 M de BCS.

Figura 10. Massa corprea antes e depois da induo da DM. No dia 0, os animais DM sofreram injeo de 65 mg/kg de estreptozotocina intraperitoneal, enquanto os animais CT receberam veculo. No h diferena entre as mdias, neste tempo de DM, entretanto observa-se uma tendncia dos animais DM perderem massa (Mdia D.P, DM N = 12, CT N = 9). A variao de massa (massa inicial massa final) por outro lado diferente e estatisticamente significativa (Mdia D.P, DM N = 12, CT N = 9, P < 0,01 teste T).

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Figura 11. ndice glicmico antes e aps a induo da DM. Os animais sofreram injees no dia 0. Dois dias aps a induo da DM j se pode detectar hiperglicemia nos animais DM que se mantem at o dia do sacrifcio. Atentar para o limite superior do aparelho que mede a glicose no mtodo da gota caudal: 600 mg/dL. O boxplot foi utilizado de forma que se possa acompanhar a disperso dos dados, a linha mais prxima a zero representa o 1 quartil (25%), a segunda linha representa o 2 quartil (ou mediana) e a linha superior representa o 3 quartil (75%). (DM N = 12, CT N = 9).

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Figura 12. Diminuio da insulina circulante nos animais DM confirma hipoinsulinemia. O soro dos animais foi obtido logo aps o sacrifcio e as clulas foram sedimentadas por centrifugao e a insulina srica foi medida por radioimunoensaio (CT N = 3, DM N 6, P < 0,01 test t-Student).

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Figura 13. ndice heptico. O ndice heptico a razo entre o peso do fgado (g) e peso corpreo (g). Apesar de no haver diferenas entre as massas dos animais, a relao massa do fgado: massa total est aumentada nos animais DM (mdia D.P.M, DM N = 12, CT N = 9, P < 0,01 teste t-Student).

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pela injeo com estreptozotocina gera hipoinsulinemia com alterao tanto macroscpica (ndice heptico) como ao nvel molecular (hipoinsulinemia).

4.3. Modulao da PKA pela insulina Testando a hiptese de que a hipoinsulinemia altera a atividade PKA endgena das fraes de membrana de fgados de ratos CT e DM utilizou-se o mtodo de fosforilao de histonas (FIGURA 14). A atividade mdia da PKA (na ausncia e presena do peptdeo inibidor especfico) proveniente de fgado de ratos DM 3 vezes maior que a de ratos CT. Entretanto, um nmero amostral maior necessrio para sair do campo especulativo e alcanar a significncia estatstica. Para confirmar a presena da PKA ancorada nestas fraes de membrana foi imunodetectada uma banda de 34 kDa referente a subunidade cataltica desta protena cinase (FIGURA 15).

4.4. Atividade Cu(I)-ATPsica de fgado de ratos DM e CT Finalmente, mediu-se a atividade Cu(I)-ATPsica de fraes de membrana proveniente de fgado de ratos DM e CT na condies pH 5,0 (tampo acetato), 10 min, 37C, 50 g de protena total, 300 M de BCS e 5 mM de ATP. No h diferena estatstica (FIGURA 16) entre a atividade Cu(I)-ATPsica de fraes de membrana de fgado de ratos CT (20,3 8,9 nmol Pi mg-1 min-1, N=9) e DM (20,0 9,8 nmol Pi mg-1 min-1, N=12).

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Figura 14 Hipoinsulinemia induz a atividade de PKA no fgado. Atividades da PKA presente em preparaes de membranas de fgado de rato CT e DM foram testadas quanto a sua capacidade em fosforilar histonas. Observa-se que mdia da atividade da PKA de fgado de rato DM 3 vezes maior que a atividade no controle (mdia de 4 experimentos D.P.M.).

34 kDa

Figura 15 Presena da PKA em preparaes de membrana de ratos CT e DM.A banda de aproximadamente 34 kDa pode ser imunodetectada em fraes de membrana CT e DM separadas por SDS-PAGE e reconhecidas em Western blotting com anticorpo especfico para subunidade cataltica de PKA.

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Figura 16. Atividade Cu(I)-ATPsica de fraes de membrana de rato CT e DM no apresentam diferena.A atividade foi realizada em tampo acetato (pH 5,0), 50 g de protena, 37C, durante 10 min e 5 mM de ATP. A atividade total foi subtrada da atividade Cu(I)-dependente (300 M BCS) para estimar atividade Cu(I)-ATPsica especfica (Mdia D.P. de CT N = 9, DM N = 12).

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5. DISCUSSO
O cobre um bioelemento que s teve sua relevncia discutida, em termos biolgicos, nos ltimos trinta anos (KAIM & RALL, 1996). Diferente das doenas relacionadas com a deficincia de ferro (anemias), as doenas relacionadas homeostase de cobre so negligenciadas, de modo que a gentica dos transportadores de cobre s foi desvendada no meio da dcada de noventa e at hoje no foram determinados ligantes que atuem modulando a homeostasia deste metal. A relao entre homeostasia do cobre e diversos outros processos patolgicos e fisiolgicos vem aumentando nos ltimos anos (FONTAINE et al., 2010), de modo que j entende-se que o papel do transportadores ativos de cobre vo alm das fisiopatologias de Menkes e Wilson, mas em processos como angiognese, cncer, hipertenso e doenas neurodegenerativas. O uso de modelos biolgicos vivos interessante para determinar, com o uso conjunto de hormnios ou inibidores farmacolgicos de vias de sinalizao, como , de fato, o mecanismo molecular que responde a alteraes em processos patolgicos, como nas doenas de Menkes e Wilson, mas tambm no cncer, na doena de Alzheimer e na diabetes mellitus. Para investigar a modulao de Atp7b essencial a determinao dos parmetros cinticos para dosagem da taxa de hidrlise de ATP, de modo que a frao sensvel ao quelante de Cu(I) (BCS) diretamente proporcional a atividade Cu(I)-ATPsica de fgado de rato. A presena de antioxidante (ascorbato) e agente redutor (Na2SO3) estimula a atividade Cu(I)-ATPsica (FIGURA 9, condio A), mostrando que quantidades mnimas contaminantes do cobre, presentes na gua e tampes, podem ser reduzidas a Cu(I) (mesmo em um ambiente na presena de oxignio), em comparao a condio sem BCS (FIGURA 9, segund , sem outras adies). Um empecilho ao se trabalhar com Cu(I)-ATPases o N-

terminal regulatrio, que pode afetar a afinidade aparente por cobre, nestas enzimas. H 55

relatos que quando todos os domnios ligadores de metal esto associados ao cobre, a atividade da enzima est reduzida. Quanto ao pH, mostra-se que enzimas ortlogas possuem propriedades enzimticas distintas, j que tanto a Atp7b de fgado de porco (HILRIOSOUZA, 2011) como Ccc2, a Cu(I)-ATPase de Saccharomyces cerevisiae (LOWE et al., 2004), tem sua atividade mxima em pH fisiolgico (pH 7,2). Estudos de Takeda et al., (1999) demonstraram que a Cu(I)-ATPase de fgado de camundongo possu pH timo em 5,0, como em nosso modelo em rato, sugerindo uma similaridade em roedores. Concentraes acima de 50 g de protena levam a altas taxas de hidrlise de ATP, no apenas por Atp7b, mas por outras ATPases. Assim, nas condies em 10 min, 50 g de protena total e pH 5,0 (tampo acetato) pode-se maximizar a hidrlise de ATP, sem atingir pontos de saturao ou esgotamento do ATP, o que levaria a uma estimativa errnea da atividade enzimtica. O uso de quelantes do on cobre, descrito por Lowe e colaboradores (2004), do mesmo modo que se usa quelantes de Ca+2 para inibir o transporte de clcio acoplado a hidrlise de ATP da Ca+2ATPase de membrana plasmtica (PMCA, SCHATZMANN et al., 1973) so uteis pois no h descrito inibidor especfico para estas enzimas. Uma abordagem diferente pode ser empregada para Na+,K+-ATPase e para a Na+,-ATPase que so sensveis a inibidores com alta especificidade, a ouabana (HAMLYN et al., 1991) e a furosemida (PROVERBIO et al, 1986), respectivamente. Neste aspecto, resta apenas identificar o comportamento da enzima em concentraes mais baixas de ATP (menores que 5 mM), o que pode vir a ser interessante tendo em vista a flutuao circadiana das concentraes de ATP no fgado (ATAULLAKHANOV & VITVITSKY, 2002), porm o modelo biolgico mais adequado para observar flutuaes de ATP na faixa do molares cultura de clulas hepticas, de modo que o ATP no se extingua rapidamente.

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Quanto regulao da homeostasia do cobre por insulina, j foi demonstrado que este hormnio altera tanto a expresso, quanto o trfego Atp7a e Atp7b, em cultura de clulas placentrias que expressam ambas as ATPases (HARDMAN et al., 2007). Essa sinalizao aumentaria a entrega de cobre ao feto em desenvolvimento e diminuiria o retorno do metal corrente sangunea materna. A insulina tambm diminui a expresso da ceruloplasmina, graas ativao da via PI3K/Akt que permite o fator de transcrio FoxO1 regular diversos genes ligados ao estresse oxidativo (LEYENDECKER et al., 2011). O uso de estreptozotocina para a induo de DM do tipo 1 j bem estabelecido no meio cientfico (SCHEIN et al., 1971). Este frmaco um antimicrobiano, que causa necrose especificamente das clulas do pncreas graas capacidade destas clulas expressarem os transportadores Glut2 (LENZEN, 2008). Deste modo, considera-se a induo de DM por estreptozotocina o modelo mais adequado para o estudo in vivo de hipoinsulinemia. A hipoinsulinemia leva a perda da capacidade de internalizar a glicose em diversos tipos celulares, de modo que outras fontes de energia so necessrias para a manuteno da vida, ao que ativa o catabolismo da protena muscular e da gordura no tecido adiposo, o que explica a diferena entre a variao de peso nos animais CT e DM. Esta etapa do projeto foi bem sucedida com a obteno de hiperglicemia e hipoinsulinemia dos ratos DM aps 14 dias de induo, porm no foi tempo suficiente para diferenciar a massa de ambos os grupos (FIGURA 10), apesar da diferena na variao de massas (FIGURA 10 inset). As taxas de insulina presentes no soro no so nulas, apesar de 5 vezes menores que a mdia dos animais CT (FIGURA 12). Isto pode ser explicado pela observao da sntese de insulina extra pancretica, j descrita previamente, no fgado, bao, tecido adiposo e medula ssea de animais diabticos, os quais aparentemente respondem aos efeitos da hipoinsulinemia (CHEN et al., 2010; KOJIMA et al., 2004). 57

A diferena de massas entre fgados de ratos CT e DM foi corrigida durante a preparao de fraes de membrana, entretanto a relao de Atp7b: protenas totais no pode ser estimada, tendo em vista a ausncia de um anticorpo especfico para a enzima de rato, o anticorpo utilizado referente a protena humana que possui apenas 80% de identidade de sequncia primria o que pouco para protenas ortlogas. Por isso, se faz necessria a identificao de um anticorpo capaz de reconhecer, em mnimas diluies, a Cu(I)-ATPase heptica de rato. FANNI e colaboradores (2005) exemplificam um caso em que o anticorpo humano para Atp7b incapaz de reconhecer a protena de rato. A falta de um anticorpo especfico para Atp7b de rato limita tecnicamente outros objetivos desta dissertao. A identificao da fosforilao regulatria in vivo requer imunoprecipitao da enzima, de forma a quantificar a enzima fosforilada lbil em pH alcalino (no caso da fosforilao cataltica) e no lbil em pH alcalino (no caso da fosforilao regulatria), o que j foi realizado em sistemas de expresso heterloga in vitro (BARTEE et al., PILANKATTA et al., 2009; PILANKATTA et al., 2010; 2009; VALVERDE et al., 2008). Nestes sistemas pode-se observar as Cu(I)-ATPases sem a presena de outras PATPases (no caso de transfeco em clulas Sf9) ou grandes quantidades de Cu(I)-ATPase (quando a protena de interesse superexpressa em cultura de clulas), de forma que o sinal enzima fosforilada no proveniente de Atp7b um rudo eliminvel. De fato, a deteco de enzima fosforilada em fraes de membrana de fgado de rato o grande desafio deste projeto, o que garantiria a confirmao (ou refutao) de que Atp7b hiperfosforilada (ou hipofosforilada) por protenas cinases ou que existam alteraes em seu ciclo cataltico em ratos diabticos. De outra perspectiva, sabe-se que a DM altera o balano entre protenas cinases de modo diferente em rgos distintos (WANG et al., 2012), principalmente as diversas 58

isoformas de PKC (TANG et al., 1993; NIVET et al., 1998). Alm disso, muito j foi descrito acerca do papel da PKC na DM (SINGH et al., 2011), alguns autores chegam a propor que o desbalano, induzido pela hiperglicemia, na atividade desta cinase seria a principal hiptese para o desencadeamento da patologia (BROWNLEE, 2001), uma vez que o inibidor especfico da PKC- (uma das PKC clssicas, ativadas por Ca2+e DAG) capaz de reverter os danos da DM (ISHII et al., 1996). Estes mesmos danos (como albulminria e aumento do dimetro glomerular) podem ser revertidos com o uso de trietilenotetramina (TETA), um quelante do cobre utilizado no tratamento de doena de Wilson (GONG et al., 2008). Cooper (2011) sugere que quelantes do cobre possam tratar doenas relacionadas a disfunes no metabolismo da insulina, como DM e a doena de Alzheimer, sabendo-se que j existem alguns relatos da correlao entre diabetes e homeostase do cobre (FAILLA & KISER, 1983; URI-ADAMS et al,. 2005), sem no entanto haver qualquer detalhamento de mecanismo molecular que determina essa correlao. Como o fgado um orgo-alvo da insulina e tambm o principal rgo relacionado com a excreo do cobre, e tendo em mos o conhecimento que a insulina capaz de regular a atividade de Atp7b via atuao de protenas cinases, propomos um modelo in vivo capaz de investigar essa relao: DM induzido por estreptozotocina. Quanto escolha do tempo de hipoinsulinemia, foi escolhido seguindo dados da literatura existente. Alguns autores se preocuparam em descrever o mecanismo molecular pelo qual essa modulao acontece, mas esta alterao da atividade varia de tecido para tecido (VAGUE et al, 2004). A relao entre hormnios do metabolismo energtico e modulao de ATPases do tipo P relatada pela primeira vez por Fehlmann e Freychet (1981), onde os autores mostraram que insulina e glucagon aumentam atividade de transporte da Na+,K+ATPase em hepatcitos isolados de rato. conhecida que a hipoinsulinemia, em 10 semanas, 59

gera aumento na fosfo-enzima da Na+,K+-ATPase de nervo citico, sendo bloqueada com o inibidor clssico da PKC, a estaurosporina (BORGHINI et al., 1994). Este mesmo inibidor capaz de reverter o aumento da atividade ATPsica da Ca+2-ATPase de membrana plasmtica (PMCA) de hepatcito, induzido por uma ou duas semanas de hipoinsulinemia (TAKAHASHI et a., 1998). Sennoune e colaboradores (2000) mostraram que 8 semanas de hipoinsulinemia induz a expresso da isoforma 1 da Na+,K+-ATPase de fgado. De fato Na+,K+-ATPase tem um papel importante na obesidade e, provavelmente, na diabetes, tendo em vista que o transporte de Na+e K+ um dos processos mais energeticamente dispendiosos para o organismo. Nestes termos, Iannello e colaboradores (2006) mostram que a hiperinsulinemia (2 semanas) desenvolvida por camundongos ob/ob diminui a atividade da Na+,K+-ATPase do fgado e rim, e que quando tratados com estreptozotocina, os camundongos ob/ob desenvolviam hipoinsulinemia e concomitante aumento da atividade ATPsica da Na+,K+-ATPase renal e heptica. Com as variaes da atividade enzimtica j so observadas em tempos relativamente curtos (7 a 14 dias) e a observao de um aumento no acmulo de cobre no fgado, descrito por Lau & Failla (1984), foi decidido que 14 dias era tempo suficiente para analisar nossos parmetros. Outro ponto a ser discutido a diferena entre o balano de PKA e PKC em diferentes rgos. Foi descrito (LESAGE et al., 2002) que insulina capaz de modular a secreo de sais biliares nos ductos biliares ativando PKC e inibindo a PKA, simultaneamente. No um evento isolado, porque outros autores (PREZ et al., 2006) j descreveram o fenmeno de contrabalano entre PKA/PKC para a bomba exportadora de sais biliares, Bsep, que tem sua funo ativada por PKC e inibida por PKA. J Wang e colaboradores (2011) sugeriram que esse desbalano entre PKA e PKC explicaria porque o rim (e no crebro ou o fgado) o principal rgo afetado pela microvasculopatia diabtica. Demonstrando que no fgado e 60

crebro o balano entre as cinases est mantido, o que explicaria o porqu do rim ser o primeiro rgo afetado, graas superativao da PKC-II e a inibio da PKA neste tecido, em modelo de ratos espontaneamente diabticos, que desenvolvem diabetes nefrognica. A ausncia de diferena entre atividade Cu(I)-ATPsica observada nas fraes de membrana CT ou DM pode ser explicada por trs hipteses: Alterao no trfego de Atp7b, sem alterao na sua atividade enzimtica,

provavelmente sinalizado por fosforilao regulatria que pode alterar sua funo celular e fisiolgica, e por isso, no pode ser observada em preparaes de frao de membrana. O tempo de hipoinsulinemia escolhido (14 dias) no foi suficiente para

efetivamente alterar o ambiente molecular dos hepatcitos, de modo que outros tempos devem ser escolhidos e estudados para entender se, in vivo, a ausncia da insulina regula Atp7b em fgado de ratos. E tambm investigar o nvel em que se d esta regulao, se por modulao da atividade enzimtica e/ou localizao subcelular. O balano entre as fosforilaes regulatrias por PKA (regulao negativa

HILARIO-SOUZA, 2011) e PKC (regulao positiva, CARDOSO, 2012) agindo de modo complementar, o que resulta na manuteno da mesma taxa de hidrlise de ATP por Atp7b. importante ressaltar que o experimento de atividade ATPsica a resultante entre diversas etapas do ciclo cataltico da ATPase (VALVERDE, 2007), e diversos fatores podem alterar diferentes etapas deste ciclo, ou seja, a ausncia de diferena no implica numa no-regulao por cinases no caso de 14 dias de hipoinsulinemia. Para confirmar esta hiptese, experimentos de fosforilao regulatria e cataltica devero ser realizados com as fraes de membrana provenientes de ratos CT e DM de modo a detectar a fosfoenzima lbil em pH alcalino (acilfosfato) e no lbil em pH alcalino (ster-fosfato).

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O sucesso na caracterizao da Cu(I)-ATPase do fgado de rato possibilita o estudo da homeostasia de cobre em animais, utilizando frmacos no animal inteiro e dissecando possveis vias de sinalizao que no estariam acessveis em outros modelos. Esta dissertao representa mais uma etapa em direo compreenso da modulao do transporte ativo de cobre por hormnios e determinar os mecanismos moleculares envolvidos na sua excreo.

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Figura 17. Fluxograma de concluses. A caracterizao da atividade Cu(I)-ATPsica no fgado de ratos foi bem sucedida no animal controle, entretanto de interesse que alguns do parmetros enzimticos obtidos neste animal sejam observados tambm no animal DM, de modo que se entenda o efeito da hipoinsulinemia na modulao da Cu(I)ATPase heptica. Alm da hiptese da dupla fosforilao, possvel que a hipoinsulinemia mude tambm trfego da enzima o u sua afinidade por cobre ou ATP.

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