UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA AGRCOLA

ANLISES DE MATERIAIS BIOLGICOS

PROF. DR. KIL JIN PARK DRA. GRAZIELLA COLATO ANTONIO

2semestre/2006

1. INTRODUO Uma das principais funes dos alimentos fornecer energia ao organismo. Os alimentos so compostos complexos constitudos de carboidratos, protenas, gorduras, vitaminas e sais minerais que pela digesto so divididos para serem aproveitados pelo organismo. Para se conhecer a composio qumica de um alimento so realizadas determinaes analticas. Essas determinaes atuam em vrios segmentos dentro de uma indstria, desde a caracterizao da matria-prima que ir compor um novo produto, at seu controle de qualidade e estocagem. A anlise de alimentos tambm utilizada para anlise de alimentos processados quando deseja-se verificar a eficincia do processo ou at mesmo a comparao de processamento, como por exemplo, diferentes tipos de secagem. Atravs das anlises qumicas pode-se verificar o que ocorreu com os constituintes dos alimentos processados, isto , se ocorreram perdas de vitaminas e/ou minerais, desnaturao das protenas, gelatinizao de amido, etc. Alm de serem utilizadas para a caracterizao de alimentos in natura, principalmente, alimentos novos e ainda desconhecidos como as frutas ou vegetais exticos tpicos de regies menos exploradas. No processamento de alimentos importante conhecer a sua composio e avaliar se as condies a matria-prima estar sendo submetida ir produzir efeitos indesejveis ou mesmo desejveis ao produto final. Para a realizao dessas determinaes diversos mtodos podem ser empregados. Esses mtodos foram desenvolvidos, testados e catalogados. Alguns centros de pesquisas brasileiros desenvolveram mtodos analticos para determinar essas composies, como o Instituto Adolfo Lutz, Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Centro de Estudos de Amidos e Razes Tropicais (CERATI), entre outros. A Association of Official Analytical Chemists (AOAC) uma associao de cientistas e organizaes dos setores pblico e privado, que promove a validao de mtodos e medidas de qualidade nas cincias analticas. Essa associao, a muitos anos, vem publicando coletneas de mtodos de anlise e procedimentos obtidos por estudos sistemticos inter-laboratoriais de vrios pases. So mtodos oficiais vlidos em todo o mundo e muito utilizados. Os mtodos esto catalogados em dois volumes, onde so descritos, para cada tipo de produto (frutas, cereais, carnes, ps, etc.), os procedimentos recomendados para o preparo e as determinaes analticas subseqentes. A escolha do mtodo de anlise deve ser bem avaliada para que a exatido seja a maior possvel. Em funo do alto custo muitas vezes no possvel utilizar o melhor mtodo de anlise, portanto, o tipo de anlise limitado em relao ao tipo de equipamento ou at mesmo ao tipo de reagente ou pessoal especializado. 2. TIPOS DE ANLISES Caracterizar um alimento envolve analisar a sua constituio qumica, caractersticas fsicas e sensoriais. A determinao da composio centesimal dos alimentos visa determinar principalmente os teores de: umidade, cinzas, protenas, carboidratos, fibras, lipdios, vitaminas
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e minerais. Outros parmetros como a atividade de gua, cor e textura, tambm possuem grande importncia na indstria de alimentos. Novas ferramentas de anlise tm sido muito empregadas na caracterizao, controle de processo e controle de qualidade de produtos alimentcios, como a anlise da microestrutura (microscopia tica, eletrnica de varredura e de transmisso, confocal, etc.). 2.1. Anlises Qumicas e Fsico-qumicas A anlise de alimentos aplicada para determinao de um ou vrios componentes ou elementos qumicos que o constituem. Com a evoluo e o surgimento de novos instrumentos de medida, tem havido uma reduo considervel no nmero de anlises necessrias para se obter resultados, conclusivamente, alm de se observar uma grande melhoria na preciso dessas anlises. 2.1.1. Determinao de Umidade 2.1.1.1. Definio A determinao de umidade uma das medidas mais importantes e utilizadas na anlise de alimentos. No processo de secagem essa determinao fundamental. A umidade de um alimento est relacionada com sua estabilidade, qualidade e composio, e pode afetar as seguintes caractersticas do produto:

Estocagem: alimentos estocados com alta umidade iro deteriorar mais rapidamente que os possuem baixa umidade. Por exemplo, gros com umidade excessiva esto sujeitos a rpida deteriorao devido ao crescimento de fungos que desenvolvem toxinas como aflatoxina. Embalagem: alguns tipos de deteriorao podem ocorrer em determinadas embalagens se o alimento apresentar uma umidade excessiva. Por exemplo, a velocidade do escurecimento em vegetais e frutas desidratadas ou a absoro de oxignio (oxidao) em ovo em p podem aumentar com o aumento da umidade, em embalagens permeveis luz e ao oxignio. Processamento: a quantidade de gua importante no processamento de vrios produtos, como, por exemplo, a umidade do trigo na fabricao do po e produtos de padaria. A umidade o principal fator para os processos microbiolgicos, como o desenvolvimento de fungos, leveduras e bactrias, e tambm para o desenvolvimento de insetos. No caso dos produtos perecveis o frio normalmente utilizado como inibidor do processo microbiolgico, enquanto que para os produtos deteriorveis a secagem, para nveis de umidade at 12-13%, o processo mais simples e eficaz. O conhecimento do teor de umidade das matrias primas de fundamental importncia na conservao e armazenamento, na manuteno da sua qualidade e no processo de comercializao.

2.1.1.2. Mtodos para a determinao de umidade Existem muitos mtodos para determinar a umidade em alimentos e a escolha do mtodo vai depender: da forma a qual a gua est presente na amostra, da natureza da amostra, da quantidade relativa de gua, da rapidez desejada na determinao e do equipamento disponvel. A gua pode estar presente na amostra sob duas formas:

gua livre: a gua que est simplesmente adsorvida no material, a mais abundante. perdida facilmente s temperaturas em torno da ebulio. gua ligada: a gua da constituio, que faz parte da estrutura do material, ligada a protenas, acares e adsorvida na superfcie de partculas coloidais, e necessita de nveis elevados de temperatura para sua remoo. Dependendo da natureza da amostra, requer temperaturas diferentes para a sua remoo, que frequentemente no total e em alguns casos no eliminada nem a temperaturas que carbonizem parcialmente a amostra. O aquecimento da amostra pode causar a caramelizao ou decomposio dos acares, perda de volteis ou ainda a oxidao dos lipdeos. Portanto, importante uma avaliao criteriosa e cuidadosa para a escolha do mtodo mais adequado e conveniente amostra e disponibilidade do laboratrio. Por isso, o resultado da medida da umidade deve vir sempre acompanhado do mtodo utilizado e das condies empregadas, como tempo e temperatura. A conservao da matria prima, do ponto de vista qualitativo e/ou quantitativo, vai depender do tipo de produto com que se est trabalhando e para a determinao da umidade o tipo de produto deve ser observado. Os produtos podem ser divididos em: perecvel, com alto teor de gua (como frutas, legumes e vegetais) e deteriorvel, com teor de gua de 15 a 30% na poca de colheita (como os gros). Em geral, a determinao de umidade, que parece um mtodo simples, torna-se complicado em funo da exatido e preciso dos resultados. As dificuldades encontradas, geralmente, so: a separao incompleta da gua do produto; a decomposio do produto com formao de gua alm do original e a perda de substncias volteis do alimento que sero computadas como peso em gua. As determinaes de umidade so classificadas em mtodos diretos e indiretos. Mtodos Diretos Nos mtodos diretos a gua retirada do produto, geralmente por processo de aquecimento, e o teor de umidade calculado pela diferena de peso das amostras no incio e no final do processo. Devido a sua maior confiabilidade, os mtodos diretos so empregados como padro para a aferio de outros procedimentos. Por exigir um tempo relativamente longo para sua execuo, s vezes representa uma desvantagem do mtodo, por exemplo, quando se necessita de resposta imediata no controle de uma determinada operao. Como mtodos diretos tm-se: estufa, infravermelho e destilao.

a) Mtodo de Estufa O mtodo de estufa o mtodo mais utilizado em alimentos e est baseado na remoo da gua por aquecimento, onde o ar quente absorvido por uma camada muito fina do alimento e ento conduzido para o interior por conduo. Como a condutividade trmica dos alimentos geralmente baixa, costuma levar muito tempo (6 18 horas a 100 102 C, ou at peso constante) para o calor atingir as pores mais internas do alimento. A evaporao por um tempo determinado pode resultar numa remoo incompleta da gua, se ela estiver fortemente presa por foras de hidratao, ou se o seu movimento for impedido por baixa difusividade ou formao de crosta na superfcie. Por outro lado, na evaporao at peso constante, pode ocorrer uma superestimao da umidade por perda de substncias volteis ou por reaes de decomposio. O aquecimento direto da amostra a 105C o processo mais usual, entretanto, no caso de amostras de alimento, que se decompem ou sofrem transformaes a esta temperatura, deve-se utilizar estufa vcuo para seu aquecimento, onde se reduz a presso atmosfrica e se mantm a temperatura de 70C. A pesagem da amostra deve ser feita somente aps resfri-la completamente no dessecador, pois a pesagem a quente levaria a um resultado falso. b) Infravermelho Neste mtodo utilizado um aparelho porttil que permite a obteno de resultados rpidos de porcentagem de umidade, sendo todo o processo controlado por um gerador de funes e balana digital. A amostra colocada em um prato de alumnio dentro de uma cmara que protege a balana do calor por meio de um colcho de ar, que garante que haja circulao de ar interna para que os vapores de gua saiam da amostra sem que seja perturbada a leitura da balana. No manual do aparelho existem informaes sobre as condies recomendadas de anlise para cada tipo de produto (tempo, temperatura e massa inicial de produto). c) Mtodo de Destilao c1) Tolueno Quando existem outras substncias que podero se volatizar com gua no processo de aquecimento, a determinao da umidade deve ser feita por processo de destilao com lquidos imiscveis. O reagente utilizado o tolueno. A amostra moda, pesada (5 a 20g) e colocada em um balo contendo tolueno (cerca de 75ml). Este balo aquecido diretamente e a gua da amostra vai sendo destilada para o frasco coletor. A quantidade de gua contida na amostra dada por leitura direta do volume existente no tubo coletor, onde: volume gua = gramas gua. Este valor utilizado no clculo do teor de umidade do produto.

c2) Brown Duvel semelhante ao mtodo de destilao que utiliza o tolueno, sendo que neste mtodo no h necessidade de moer a amostra, e o aquecimento produzido por um sistema termomtrico que desliza automaticamente a fonte de aquecimento. constitudo por um sistema contendo uma manta aquecedora com balo acoplado a um aparelho de destilao, com receptor graduado para coleta da gua condensada no processo. Para cada tipo de gro, a quantidade ou tamanho da amostra, a temperatura e o tempo, variam, devendo-se consultar o manual que acompanha o aparelho. A Tabela 1 apresenta alguns exemplos da quantidade de amostra e temperatura para cada tipo de gro.
Tabela 1 Quantidade de amostra e temperatura utilizadas para diferentes gros na determinao da umidade pelo mtodo de Brown Duvel. Produto Amostra (g) Temperatura (C) Milho 100 195 Arroz 100 200 Soja 100 173 Feijo 100 175 Trigo 100 190

d) Mtodo de Karl-Fisher um processo de determinao de umidade baseado em reaes que ocorrem na presena de gua. O reagente Karl Fisher (RKF) constitudo por uma mistura de iodo, dixido de enxofre e piridina em metanol, com este reagente podem ser determinadas pequenas quantidades de gua. Ocorre uma reao onde o iodo reduzido pelo dixido de enxofre, na presena da gua: I2 + SO2 + 2 H2O 2 HI + H2SO4 (reao complexa e no estequiomtrica)

O procedimento do mtodo se baseia numa titulao visual ou eletromtrico. O I2 reduzido para o Iodo na presena de gua. Quando toda gua da amostra for consumida, a reao cessa. A titulao direta usualmente fornece a gua total, ou seja, gua livre mais a gua de hidratao. O volume de RKF gasto na titulao da amostra ento utilizado nos clculos do teor de umidade. Por ser o reagente de Karl Fischer um dessecante poderoso, a amostra e o reagente devem ser protegidos contra a umidade atmosfrica em todos os procedimentos. Exemplo de aplicao: aplicado em amostras que no do bons resultados pelo mtodo de secagem a vcuo. Os produtos que so analisados so geralmente produtos com baixo teor de umidade como frutas e vegetais desidratados, balas, chocolates, caf torrado, leos e gorduras. tambm utilizado em produtos ricos em acares, como mel, e produtos ricos em ambos, acares redutores e protenas, como cereais. O mtodo pode ser aplicado

tambm em produtos de nveis de umidade intermedirios como produtos panificados, misturas prontas para bolos ricas em gorduras e tambm em produtos com altos nveis de leos volteis. Mtodos Indiretos Nestes mtodos o teor de umidade estimado em funo das propriedades eltricas do produto em uma determinada condio. Os dois princpios empregados so o da resistncia eltrica e o da medida da constante dieltrica (capacitncia). So mtodos prticos e rpidos, mas esto sujeitos a erros decorrentes da variao das propriedades fsicas dos produtos, da temperatura ou da distribuio da umidade no interior do mesmo. A aferio de equipamentos para a determinao indireta da umidade feita em relao ao mtodo padro de estufa, admitindo-se variao de 0,5% em relao ao mtodo padro para teores de umidade inferiores a 20-25%. O manual de utilizao do aparelho deve sempre ser consultado, pois cada amostra exige tcnica especfica. Esse mtodo mais utilizado para o armazenamento de gros. Clculo do teor de umidade Existem duas maneiras de se expressar a umidade contida em um produto em base mida ou base seca, sendo que a umidade em base mida (Ub) mais utilizada em designaes comerciais, armazenamento, etc. e a umidade em base seca (Ubs) utilizada em trabalhos de pesquisa e equaes de secagem. Umidade em base mida (Ub) (%)

U b =

Pa Pa x 100 = x 100 P (t ) Pa + Ps

onde: Pa = peso da gua; Ps = peso da matria seca (valor constante) e P (t) = peso total. Umidade em base seca (Ubs) (%)

U bs =

Pa x 100 Ps

Mudana de base Passar de Base mida Base Seca Passar de Base Seca Base mida

% U bs =

% U b x 100 100 % U b

% U b =

% U bs x 100 100 + % U bs

2.1.2. Determinao de Lipdios 2.1.2.1. Definio O termo lipdio utilizado para gorduras e substncias gordurosas. Os lipdios so definidos como componentes do alimento que so insolveis em gua e solveis em solventes orgnicos, tais como ter etlico, ter de petrleo, acetona, clorofrmio, benzeno e lcoois. Estes solventes apolares extraem a frao lipdica neutra que incluem cidos graxos livres, mono, di e triacilgliceris, e alguns mais polares como fosfolipdios, glicolipdios e esfingolipdios. Os esteris, as ceras, os pigmentos lipossolveis e as vitaminas, que contribuem com energia na dieta, podem ser extrados apenas parcialmente. Suas propriedades fsicas variam muito pouco dentro de um certo limite e so consideradas constantes, so divididas em fsicas (peso especfico, ndice de refrao e ponto de fuso) e qumicas (ndice de iodo, ndice de saponificao, resduo insaponificvel, cidos graxos livres). Estas constantes esto relacionadas identificao, qualidade e quantidade do leo ou gordura analisada. 2.1.2.2. Mtodos para a determinao de lipdeos A avaliao quantitativa do teor de lipdeos pode ser feita atravs da extrao com solvente a frio ou a quente. Extrao com solvente a frio a) Mtodo de Bligh-Dyer Esse mtodo utiliza a mistura de trs solventes, clorofrmio-metanol-gua. A amostra misturada com o metanol e clorofrmio que esto numa proporo que formam uma s fase com a amostra. Adiciona-se mais clorofrmio e gua promovendo a formao de duas fases distintas, uma de clorofrmio, contendo lipdios, e outra metanol mais gua, contendo substncias no lipdicas. A fase do clorofrmio com a gordura isolada e, aps a evaporao do clorofrmio, obtm-se a quantidade de gordura por pesagem. Extrao com solvente a quente A extrao com solvente a quente est baseado em trs etapas: extrao da gordura da amostra com solvente; eliminao do solvente por evaporao e a quantificao da gordura por pesagem. So utilizados dois tipos de equipamentos: Soxlet, que utiliza o refluxo do solvente e o processo intermitente ou Goldfish, onde o processo de extrao contnuo e mais rpido. Geralmente o solvente utilizado o ter de petrleo e a porcentagem de lipdeo calculada pela equao:

% Lipdeos =

100 x lipdeos ( g ) amostra ( g )

Extrao da gordura ligada a outros compostos Em produtos como po e leite, a gordura est ligada a protena e carboidratos e, portanto, deve ser liberada para quantificao. Esta liberao feita por hidrlise cida ou alcalina. a) Hidrlise cida a1) Processo de Gerber Utilizado somente para leite e produtos lcteos. A gordura presente no leite est em forma de emulso de leo e gua, cercada de um filme de protena. Este filme rompido atravs do tratamento com cido sulfrico. Utiliza-se o lcool isoamlico para facilitar a separao da gordura e reduzir o efeito de carbonizao do cido sulfrico sobre ela. Aps a digesto, a amostra centrifugada num tubo chamado butirmetro. Existem vrios tipos de butirmetros com escalas diferentes, para medir diferentes produtos lcteos, como creme de leite e queijos, e at para alguns produtos no lcteos, como produtos processados de carne e peixe. a2) Processo de Babcock Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de leite e cido sulfricos adicionados, e na adio de gua quente em vez lcool isoamlico. Ambos os mtodos no determinam os fosfolipdios, mas no h problemas com o leite integral que tem apenas 1% de fosfolipdios na gordura total O mtodo de Gerber 2 a 3 vezes mais rpido que o de Babcock. b) Hidrlise alcalina b1) Mtodo de Rose-Gottlieb e Mojonnier A amostra tratada com hidrxido de amnia e lcool para hidrolisar a ligao protena-gordura, e a gordura separada ento extrada com ter de petrleo e ter etlico. O lcool precipita a protena que dissolvida na amnia e a gordura separada pode ser extrada com ter. A extrao com ter muito eficiente em amostras com muito acar como, por exemplo, leite condensado.

Caracterizao de leos e Gorduras a) ndice de iodo Mtodo utilizado para determinar o grau de insaturao de um leo ou gordura e para controlar alguns processamentos. Este ndice baseado no fato de que o iodo e outros halognios se adicionam numa dupla ligao da cadeia insaturada dos cidos graxos. b) ndice de saponificao definido como o nmero de miligramas de hidrxido de potssio necessrio para neutralizar os cidos graxos resultantes da hidrolise completa de 1 g de amostra. Durante a saponificao formado sabo. 2.1.3. Determinao de Protena 2.1.3.1. Definio Protenas so heteropolmeros formados por unidades menores chamadas aminocidos. Os aminocidos (a.a.) esto ligados em seqncia formando uma cadeia polipeptdica, esta cadeia a base da protena e chamada de estrutura primria. As protenas so extremamente importantes na nutrio porque fornecem aminocidos essenciais ao organismo. Os aminocidos so chamados essenciais, pois o organismo no capaz de sinteliz-los, na digesto h a quebra da cadeia de protenas e os aminocidos livres so absorvidos e usados na sntese de novas protenas. So aminocidos essenciais: valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, treonina, lisina, arginina, histidina. No processamento de alimentos as protenas tambm apresentam propriedades importantes como a capacidade de gelificao (gelatina), capacidade de emulsificao (protena da gema do ovo), capacidade de reteno de gua (protena da soja). 2.1.3.2. Mtodos para a determinao de protena A determinao da protena em uma amostra baseada na determinao de nitrognio. Geralmente feita pelo processo de digesto Kjeldahl (autor do mtodo: Johan Kjeldahl). Este mtodo determinada o teor de nitrognio orgnico, ou seja, o nitrognio proveniente de outras fontes alm da protena, tais como: cidos nuclicos, alcalides, lipdeos e carboidratos nitrogenados. Como estes outros componentes geralmente esto presentes em quantidades menores, o mtodo Kjeldahl um mtodo qumico til na determinao de protena.

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No clculo para se obter a porcentagem de protena na amostra utilizado um fator emprico de correo f. Multiplica-se este fator pelo valor total de N obtido na determinao analtica. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de fator f.
Tabela 2 Exemplos de fator f para diferentes produtos alimentcios. Tipo de amostra Fator f Geral N x 6,25 Gelatina N x 5,55 Ovos N x 6,68 Produtos lcteos N x 6,38 Soja N x 6,00 Farinha trigo N x 5,70 Arroz N x 5,95 Carnes N x 6,25

Se o resultado for expresso em % de protena o fator usado deve ser indicado. A determinao de nitrognio compreendida de 3 etapas: digesto da amostra em H2SO4, liberao da amnia por adio de Na0H e titulao da amnia com HCl. O procedimento experimental lento e deve ser cuidadosamente conduzido para se evitar acidentes, ou a produo de falsos resultados. 2.1.4. Determinao de Cinzas 2.1.4.1. Definio A cinza de uma amostra de alimento o resduo inorgnico que permanece aps a queima de matria orgnica de uma amostra. A cinza constituida principalmente de grandes quantidades de K, Na, Ca e Mg; pequenas quantidades de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e traos de Ar, I, F e outros elementos. 2.1.4.2. Mtodo para a determinao de cinzas O mtodo de determinao de cinzas muito simples e consiste na queima da amostra em mufla utilizando temperaturas de 550C a 570C por tempos pr-determinados. Para cada tipo de amostra existem condies recomendadas que devem ser verificadas antes de proceder a determinao. A cinza obtida no necessariamente da mesma composio que a matria mineral presente originalmente no alimento, pois pode haver perda por volatilizao ou alguma interao entre os constituintes da amostra. Os elementos minerais se apresentam na cinza sob a forma de xidos, sulfatos, fosfatos, silicatos e cloretos, dependendo das condies de incinerao e da composio do alimento. Algumas mudanas podem ocorrer como oxalatos de

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clcio podem ser transformados em carbonatos, ou at em xidos. A composio da cinza vai depender da natureza do alimento e do mtodo de determinao utilizado. Amostras com alto teor de umidade devem sofrer secagem antes da incinerao, e, portanto muitas vezes vantajoso combinar a determinao direta de umidade e a determinao de cinzas. A presena de largas quantidades de cinzas em produtos como acar, amido, gelatina, frutas cidas ou pectina indesejvel e, portanto cuidados especiais devem ser tomados durante seus processos produtivos. 2.1.5. Determinao de Acares 2.1.5.1. Definio Os carboidratos so os componentes mais abundantes e amplamente distribudos entre os alimentos. Apresentando varias funes como: nutricional (geram energia), adoante natural (glicose, frutose, sacarose, etc.), matria-prima para produtos fermentados, principal ingrediente dos cereais, responsvel por propriedades reolgicas da maioria dos alimentos de origem vegetal (polissacardeo) e pela reao de escurecimento em muitos alimentos. Os acares so os carboidratos existentes nos alimentos e so divididos em: monossacardeos (glicose, frutose), dissacardeos (sacarose, lactose, galactose, maltose), polissacardeos (maltodextrinas, amidos, gomas, pectinas e celuloses). Os carboidratos tm pelo menos duas funes orgnicas (C = 0 e C 0H) que d a estes compostos vrias opes de transformao, como:

Reao de Maillard: acares redutores + aminocidos - Reaes de escurecimento e formao de volteis, ex: po, carne, bolo, etc.

Degradao de Strecker: - Caramelizao degradao de acares. O caramelo um corante largamente empregado na indstria de alimentos. 2.1.5.2. Mtodos para a determinao de acares Exigncias na preparao de amostras: as amostras slidas devem ser modas em condies que causem a mnima mudana no contedo de umidade e que no afetem as propriedades e composio do alimento. Os lipdios e clorofila so geralmente removidos por extrao com ter de petrleo, pois neste solvente os carboidratos so insolveis. Na determinao do contedo de carboidratos em alimentos, deve-se obter soluo aquosa dos acares, livres de substncias interferentes, para posterior identificao e quantificao. Estas substncias interferentes podem ser pigmentos solveis, substncias opticamente ativas (aminocidos etc.), constituintes fenlicos, lipdios e protenas. As substncias interferentes

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podem ser separadas por descolorao, tratamento com resina trocadora de ons, ou clarificao com vrios agentes clarificantes. A funo destes clarificantes de precipitar as substncias que iro interferir na medida fsica ou qumica do acar. Os mtodos quantitativos utilizados para determinao de acares totais e acares redutores utilizados em alimentos so: a) Munson-Walker: mtodo gravimtrico baseado na reduo de cobre pelos grupos redutores dos acares. b) Lane-Eynon: mtodo que utiliza a titulao e tambm est baseado na reduo de cobre pelos grupos redutores dos acares. c) Somogyi-Nelson: mtodo que utiliza a titulao e tambm est baseado na reduo do cobre. Os mtodos de reduo so empricos e as condies estabelecidas para cada um deles devem ser rigorosamente seguidas. Como reagente utiliza-se: Reagente de Fehling, que composto por uma Soluo A (sulfato de cobre cristalino em gua) e uma Soluo B (tartarato de sdio e potssio e hidrxido de sdio) em gua. Os resultados so expressos em: acares redutores, em glicose (%, p/p), acares noredutores, em sacarose (%, p/p). 2.1.6. Determinao de Fibra Bruta 2.1.6.1. Definio As fibras alimentares no fornecem nutrientes para o organismo, entretanto so elementos essenciais na dieta. As fibras, que formam o esqueleto dos vegetais, consistem de celulose de vegetais e outros elementos na alimentao que no conseguimos digerir. As fibras so um paradoxo porque no alimentam, mas so essenciais sade. A fibra bruta o resduo orgnico obtido aps sucessivas extraes e lavagens com ter, cido sulfrico diludo, hidrxido de sdio diludo e lcool. 2.1.6.1.1. Importncia:
Medir o valor nutricional de alimentao de animais: digestibilidade da fibra bruta baixa e

alimentos com alto teor de fibras brutas, tm baixo valor nutritivo;

Anlise de Alimentos: detectar adulteraes (limites estabelecidos); Qualidade de vegetais: contedo de fibra bruta varia com a maturidade.

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2.1.6.2. Mtodos para a determinao de fibras Os mtodos para a determinao das fibras variam muito de acordo com as condies de tratamento empregadas amostra. Os mtodos de anlise recuperam de 60 a 80% de celulose e de 4 a 67% de lignina, em relao ao valor real existente na amostra, portanto no uma medida segura ou especfica dos grupos de substncias existentes na amostra. Os equipamentos utilizados para a anlise so: centrfuga de tubos, estufa (130C), dessecador, erlenmeyr, provetas, bquer, funil de Bchner, filtro de linho/algodo, cadinho e mufla. A porcentagem de fibras calculada pela equao: 100 x n gramas de fibra n gramas de amostra

% Fibra ( p / p ) =

2.1.7. Determinao de Slidos Solveis 2.1.7.1. Definio A determinao de slidos solveis em materiais biolgicos uma medida muito utilizada no processamento e conservao de alimentos para avaliao de:
Maturao de frutas (qualidade e estabelecimento de preos, ex.: uva, laranja). Elaborao de caldas (xaropes) para frutas em conserva. Ponto final de processos de concentrao (polpas concentradas, doces em massa, gelias). Qualidade de sucos processados.

2.1.7.2. Mtodo para a determinao de slidos solveis A medida da concentrao de slidos solveis de uma amostra feita atravs do mtodo refratomtrico, simples e rpido, com bom grau de preciso. Utiliza como princpio o ndice de refrao de uma substncia pura, que sendo constante, para determinada condio de temperatura e presso, pode ser utilizado para a sua identificao. Desta forma, foi estabelecido o mtodo para a determinao da concentrao de slidos solveis em uma amosta, onde sabe-se que o ndice de refrao da gua a 20C 1,3330. A presena de slidos solveis na gua resulta numa alterao destes ndices. Conhecendo-se o ndice de refrao da soluo aquosa, possvel determinar a quantidade de soluto presente na mesma. Esta propriedade utilizada para determinar ento a concentrao de slidos solveis de solues de acar. Em sucos de frutas, produtos de tomate, mel e xaropes, como o acar o principal componente, a porcentagem slidos solveis pode ser considerado uma boa aproximao da

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porcentaagem de slidos totais, sendo amplamente utilizada nos clculos onde este valor aplicado. O equipamento mais utilizado denominado: de Refratmetro de Abb. Sua utilizao simples, devendo apenas ser calibrado com gua destilada antes das determinaes. Existem tabelas que permitem efetuar a correo devido a influncia da temperatura: A leitura realizada da seguinte forma: a amostra lquida, sem a presena de interferentes (como slidos de cascas, etc.) colocada sobre o prisma do aparelho, por onde passar um feixe de luz. Oresultado lido imediatamente por uma escala existente no aparelho. O valor obtido da leitura expresso em % slidos solveis ou Brix. 2.1.8. Determinao de pH 2.1.8.1. Definio A determinao do pH uma determinao eletromtrica que avalia a concentrao de ons hidrognio em uma amostra. 2.1.8.1.1. Importncia:
Estado de conservao do produto: decomposio (hidrlise, oxidao, fermentao)

altera a concentrao de ons H+;

Preservao e armazenamento do alimento: cido inibe o crescimento de microorganismos

e ao de enzimas. Os limites de crescimento de m.o. so estabelecidos pelos valores de pH;

Determina o tratamento trmico o qual o alimento dever ser submetido:

pH=4,5 limite estabelecido para definio de tipo de tratamento trmico; pH<4,5 alimentos cidos tratamento trmico mais brando (pasteurizao); pH>4,5 alimentos de baixa acidez tratamento trmico mais drstico (esterilizao).
Afeta as propriedades fsicas de alguns alimentos, por exemplo: textura e ponto de

gelificao de gelias de frutas.

2.1.8.2. Mtodo para a determinao do pH A determinao do pH realizado em um equipamento denominado pHmetro ou potencimetro (eletrodos). uma determinao muito simples e amplamente utilizada nas indstrias de processamento de alimentos. Uma soluo tampo utilizada para calibrar o aparelho antes das medies. Normalmente so utilizadas solues de pH 4 e pH 9. Escala: pH gua pura, 22C = 7 (neutro), pH HCl = 0 (cido), pH NaOH = 14 (bsico).

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Tipos de amostra:
Amostras lquidas - a determinao de pH feita diretamente na amostra simplesmente pela

imerso dos eletrodos na mesma.

Amostras slidas - diluir uniformemente 10g de amostra em 100ml de gua a 25C, imergir

os eletrodos na mesma e efetuar a leitura do pH.

2.1.9. Atividade de gua 2.1.9.1. Definio A quantidade de gua presente em um alimento pode se encontrar na forma de gua ligada e no-ligada. A relao entre o teor de gua no-ligada ou disponvel denominada de atividade de gua. Esse teor designado como aa ou aw e definido em termos de equilbrio termodinmico. um nmero adimensional, resultado da presso de vapor de gua do produto pela presso de vapor da gua pura, mesma temperatura. Varia numericamente de 0 a 1 e proporcional umidade relativa de equilbrio. A quantificao do teor de gua em produtos alimentcios extremamente importante na sua preservao. A gua numa matriz alimentcia pode exercer diversas funes, dependendo de sua disponibilidade e de outros componentes do alimento. 2.1.9.1.1. Transformaes nos alimentos A aw tem muita influncia nas reaes de transformaes de alimentos, que podem ser microbiolgicas, fsicas e qumicas.
Reaes qumicas: a aw afeta de maneira bem definida as velocidades das principais reaes

qumicas de transformao dos alimentos;

Reaes fsicas: uma srie de transformaes fsica ocorre nos alimentos em funo da aw,

como a cristalizao em gelias e doces de frutas; a recristalizao de acares em balas vtreas e lactose em leite em p; a reduo do escoamento livre de ps secos; a perda de crocncia em cereais desidratados; a aglomerao e empedramento de acar e ps secos; a adeso embalagem de balas, caramelos e chicletes; etc;

Reaes microbiolgicas: o comportamento de microorganismos frente aw varivel,

dependendo da espcie, cepa microbiana, substrato, entre outros. No entanto, pode-se afirmar que as bactrias so usualmente mais exigentes quanto disponibilidade de gua livre, seguida dos bolores e leveduras. Os alimentos de baixa aw (< 0,60) so microbiologicamente estveis.

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2.1.9.2. Mtodos para a determinao da atividade de gua H uma grande diversidade de mtodos para se medir a aw, que vai desde procedimentos simples (laboratoriais) no qual o produto alcana o equilbrio em uma atmosfera de umidade relativa conhecida, at o uso de higrmetros de respostas rpidas (Decagon). A Tabela 3 apresenta alguns alimentos e tipos de microorganismos capazes de se desenvolver em determinada faixas de atividade de gua.
Tabela 3: Atividade de gua de alguns alimentos e suscetibilidade deteriorao.
Faixa de aw 1,00 0,95 Microorganismos capazes de se desenvolver Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Shigella, Klebsiella Bacillus, Clostridium perfringers, Algumas leveduras Salmonella, V. parahaemolyticus C. Botulinum, Serratia, Lactobacillus, Pediococcus, Alguns fungos,Rhodotorula, Pichia Micrococus, Muitas leveduras: Cndida, Torulopsis, Hansenula Staphylococcus aureus, Saccharomyces spp., Debaryomyces, A maioria dos fungos A maioria das bactrias halfilas Saccharomyces bisporus, Fungos xeroflicos: Aspergillus chevalieri, A. candidus, Wallemia sebi Leveduras osmoflicas: Saccharomyces rouxii Poucos fungos: Aspergillus echinulatus, Monascus, Monascus bisporus Sem proliferao microbiana Sem proliferao microbiana Sem proliferao microbiana Sem proliferao microbiana Alimentos com aw na faixa indicada Lingias, Salsichas, Pes cozidos, Alimentos contendo at 40% de sacarose e 7% de sal, Alimentos muito perecveis: Frutas frescas, vegetais, carnes e peixe. Carnes curadas (presunto), Concentrado de frutas, Alimentos contendo at 55% de sacarose ou 12% de sal, Alguns queijos: Cheddar, suo, provolone. Embutidos fermentados (salames), Bolos confeitados, Queijos desidratados, Margarina, Alimentos contendo at 65% de sacarose ou 15% de sal. Concentrados de frutas, Leite condensado, Farinha, Arroz, Granulados (contendo 15 a 17% de umidade), Bolos de frutas, Confeitos aucarados. Gelias, Marmeladas, Marzip, Glac de frutas, Marshmallow. Flocos de aveia (contendo 10% de umidade) Cremes para recheio, Gelias, Melao, Caldo de cana de acar, Algumas frutas secas e castanhas. Frutas secas (contendo de 15 a 20% de umidade) Balas, Caramelos, Mel. Macarro e massa similares (contendo 12% de umidade), Temperos (com 10% de umidade). Ovo em p (com 5% de umidade). Biscoitos e torradas (com 3-5% de umidade). Leite em p (2 3% umidade), Vegetais desidratados (5% umidade), Flocos de milho (5% umidade), Sopas desidratadas.

0,95 0,91

0,91 0,87

0,87 0,80

0,80 0,75 0,75 0,65

0,65 0,60

0,50 0,40 0,30 0,20

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2.2. Anlise microscpica 2.2.1. Definio De acordo com AGUILERA e STANLEY (1990), define-se como microestrutura de alimentos a organizao dos componentes de um alimento e suas interaes. Ao sofrer processamento, a microestrutura do alimento destruda e reconstituda, o que poderia ser entendido como uma srie de operaes e reestruturao e reorganizao. 2.2.1.1. Importncia A estrutura do alimento de grande importncia em todos os aspectos de funcionalidade. Realmente, a organizao microscpica de gua e outros componentes do alimento governam as informaes macroscpicas que esto sendo observadas atravs de instrumentao, isto , podem ser criadas reas muito heterogneas no interior do alimento fazendo com que ocorram grandes modificaes na estrutura e textura do produto final. Os parmetros principais que influenciam grandemente tais propriedades so a atividade de gua e a distribuio da mesma. Aumentando o contedo de gua pode-se criar mudanas drsticas no estado fsico dos alimentos. A migrao de gua governada pelas diferenas de potenciais qumicos de gua entre duas zonas diferentes do produto. Esta migrao pode ser limitada pela porosidade do material, a viscosidade da matriz slida, e tambm as interaes mltiplas nas quais a gua envolvida, depende tambm do coeficiente de difuso, temperatura, presso, composio, fatores geomtricos, etc. O reconhecimento da microestrutura de alimentos est agora sendo reconhecido como um pr-requisito necessrio para entender suas propriedades. Todos aqueles que tm interesse de descrever, prever e controlar o comportamento de materiais alimentcios reconhecem a importncia do verdadeiro reconhecimento da maneira como os componentes esto organizados, j que existe uma conexo causal entre estrutura e funcionalidade. Os mtodos para o processamento de alimentos podem ser baseados no conceito de que mudanas na microestrutura afetam as propriedades do produto. Desse modo, tcnicas de anlise de microestrutura so necessrias para entender as relaes estrutura-propriedades. 2.2.2. Mtodos utilizados na anlise estrutural A microscopia (ptica, eletrnica ou atmica, confocal, de polarizao) e outras tcnicas de imagens (como ressonncia magntica) so tcnicas apropriadas para anlise de estrutura de alimentos por ser somente um mtodo analtico que fornece resultados em forma de imagens. Estas tcnicas so utilizadas para examinar alimentos que sofrem processos semelhantes, podendo ser visualizado o comportamento do alimento em termos de morfologia e composio.

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2.2.2.1. Microscopia tica Embora o advento das lentes eletrnicas tenha feito com que a microscopia ptica (MO) fosse deixada de lado em estudos estruturais, a descoberta da versatilidade desse instrumento, combinada com a facilidade de uso e preparo da amostra, fazendo dele uma ferramenta indispensvel para a anlise estrutural. A aplicao mais comum da microscopia tica a iluminao de campo brilhante em que a luz transmitida de baixo atravs de um pequeno pedao ou seco de material. A imagem formada acima da amostra num tubo e visto por uma ocular com o tamanho ampliado e aproximadamente 10 a 100 vezes. Os espcimes so examinados a presso atmosfrica normal e no precisam ser desidratadas. Alm disso, a preparao de amostras relativamente fcil. Um dos recursos mais comuns da microscopia tica de campo iluminado aplicar tintura ou corante para aumentar o contraste ou diferenciar tecidos. Na microscopia tica, a colorao um processo til porque tecidos biolgicos so comumente incolores e no oferecem contraste. 2.2.2.2. Microscopia eletrnica de transmisso Simples equipamentos de microscopia eletrnica de transmisso (MET) se tornaram disponveis no final dos anos 30, e logo ficou evidente que produziam resoluo melhor que da microscopia ptica. Em sua forma mais simples, a MET parece-se com uma MO invertida. Um revlver eletrnico (filamento de tungstnio) aquecido e emite estreitos raios de eltrons que viajam em alta velocidade. A voltagem aplicada para se obter essa acelerao a ordem de 4 a 100kV. O raio de eltrons substitui a lmpada da MO e age como uma fonte de iluminao. Como o olho humano no sensvel a eltrons, a imagem fina, formada por eltrons que passaram pela amostra focada numa tela fluorescente ou numa chapa fotogrfica. Entretanto, a grande diferena entre microscpios pticos e eletrnicos que os eltrons precisam de um grande vcuo para viajar a distncia usada na microscopia eletrnica. Essa necessidade de um meio sob alto vcuo combinada com a necessidade de um potente feixe de eltrons para passar atravs do material analisado limita severamente os tipos de amostras que podem ser examinadas, elas devem ser totalmente secas, extremamente firmes e fortes o suficiente para resistir aos danos causados pelo feixe de eltrons. Alimentos geralmente apresentam dificuldades para o microscopista por causa de sua composio heterognea e forma fsica. No entanto, mtodos simples foram desenvolvidos para lidar com amostras problemticas. Amostram particularmente trabalhosas so as gorduras e alimentos que contm gorduras, j que sua microestrutura dependente de temperatura. 2.2.2.3. Microscopia eletrnica de varredura A microscopia eletrnica de varredura (MEV) usada para examinar superfcies. A amostra seca (MEV convencional) ou congelada abaixo de 80C (cryo-MEV). Uma camada espessa de metal (ouro), responsvel pela condutividade eltrica, pulverizada sobre a amostra

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para poder ser visualizada. As imagens geradas pela tcnica de MEV possuem bom foco e intensidade e so relativamente fceis de serem entendidas. O MEV destina-se basicamente ao exame de superfcie das amostras, sendo que as superfcies internas das amostras tambm podem ser visualizadas desde que a amostra seja fraturada e exposta. timos resultados de fratura so conseguidos com o congelamento da amostra empregando-se nitrognio lquido e posterior fratura manual. Uma ampla faixa de aumentos pode ser usada (20x-100.000x) e a MEV pode alcanar uma profundidade de campo aproximadamente 500 vezes maior que a microscopia tica. Este tipo de microscpio constitudo de canho eletrnico, lentes, circuito de varredura, coletor e ampliador de sinais, tubo de raios catdicos, sistema de vcuo, registro de imagens, controles. Algumas dificuldades permanecem: a amostra ainda exposta a alto vcuo, o que significa que desidratao total necessria, e o material bombardeado por um raio de eltrons que pode eventualmente danificar a amostra. 2.2.2.4. Microscopia confocal O microscpio confocal de fluorescncia por varredura laser, referido apenas como confocal, utiliza a fluorescncia para a aquisio das imagens. A fluorescncia um tipo de luminescncia (emisso de luz) em que um corpo absorve luz e aps um curto intervalo de tempo re-emite essa luz. Esse o princpio da microscopia de fluorescncia, na qual compostos qumicos chamados fluorforos so usados para produzir a fluorescncia do material em estudo. O uso dos fluorforos em biologia, por exemplo, acontece quando se quer localizar uma rea especfica da amostra (como uma protena, por exemplo) ou para responder a um estmulo especfico. A tcnica de microscopia de fluorescncia consiste justamente em captar este fton que emitido e com ele gerar umaimagem. O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para promover a excitao dos fluorforos. Atravs de um conjunto de lentes o microscpio capaz de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra a ser estudada. Mudando-se o ponto focal (mantida a profundidade) possvel iluminar todo o plano em estudo, ponto a ponto. A obteno de imagens sucessivas de diferentes planos da mesma amostra possibilita construir imagens tridimensionais e imagens tridimensionais em movimento. O inconveniente desta tcnica a degradao dos fluorforos, o que leva utilizao do confocal para o estudo de fenmenos mais rpidos, no caso de espcimes vivos, ou para estudar detalhes internos das clulas em espcimes vivos ou fixados.

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REFERNCIA BIBLIOGRAFICA
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