UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

ESTABILIZAO ENZIMTICA PARA APLICAO EM BIOPURGA DE TECIDOS DE MALHAS DE ALGODO

Tese submetida Universidade Federal de Santa Catarina para a obteno do grau de Doutor em Engenharia Qumica

Orientador: Dr. Antnio Augusto Ulson de Souza - UFSC Co-orientadora: Dr. Marta Cristina Teixeira Duarte - CPQBA- UNICAMP Co-orientadora: Dr. Selene Maria de Arruda Guelli Ulson de Souza - UFSC

Ktya Regina de Freitas

Florianpolis/SC Maro de 2009

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ESTABILIZAO ENZIMTICA PARA APLICAO EM BIOPURGA DE TECIDOS DE MALHAS DE ALGODO

KTYA REGINA DE FREITAS Tese submetida ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica do Centro Tecnolgico da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a obteno do grau de Doutor em Engenharia Qumica. _________________________________ Antnio Augusto Ulson de Souza, D. Sc. Orientador, EQA, UFSC _________________________________ Marta Cristina Teixeira Duarte, D. Sc. Co-orientadora, CPQBA, UNICAMP _________________________________ Selene M. A. Guelli Ulson de Souza, D. Sc. Co-orientadora, EQA, UFSC _________________________________ Leonel Teixeira Pinto Coordenador do CPGENQ Banca Examinadora: _______________________________________________ Prof. Dr. Antnio Augusto Ulson de Souza (EQA, UFSC) Presidente _______________________________________________ Prof. Dr. Selene M. A.Guelli Ulson de Souza (EQA, UFSC) _______________________________________________ Prof. Dr. Regina Vasconcellos Antonio (CCB, UFSC) _______________________________________________ Prof. Dr. Lorena Benathar Ballod (DEQ, FURB) _______________________________________________ Prof. Dr. Agenor Furigo Junior (EQA, UFSC) _______________________________________________ Prof. Dra. Gisela Maria Zanin (DEQ, UEM)

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Dedico minha adorvel me, Sonia.

iv AGRADECIMENTOS

- Ao professor Antnio Augusto Ulson de Souza, pelas crticas, sugestes e orientao deste trabalho. - professora Selene M. A. G. Ulson de Souza, pela co-orientao deste trabalho. - amvel professora Marta C. T. Duarte pela co-orientao e agradvel disponibilidade. - professora Regina Vasconcellos Antonio, Maria Risoleta Freire Marques e Ftima Regina Mena Barreto Silva pelos esclarecimentos e informaes. - Aos admirveis colegas dos laboratrios INTELAB, LABSIN/LABMASSA e LTE pela companhia, troca de ideias e de fantsticas lies de vida. - Andria de Souza, Andressa Vasquez, Cludia Mat, Cristine Mallman, Davi Hoffman, Elaine Vosniak Takeshita, Eliane Forgiarini, Estela Feretti, Fabiane Binsfeld, Fernanda Batista, Fernanda Ferreira, Franciele Furlan, Heloisa Brando, Jilly Anne de Souza, Julieta Furtado, Lilian Bortuluzzi, Lorena M. N. Cerutti, Luciane Juliano, Marcelo Anami, Mauricio Ferreira da Rosa, Rafael Benedet, Renata Prtile, Samir Besen, Solange Natalia Seibert, Tnia Espndola e Viviane da Silva Lobo pela maravilhosa confraria, na qual pude conviver com demonstrao diria de dedicao na busca da realizao, solidariedade, respeito, bom humor, parceria, exemplo e disciplina. Obrigada pelo fantstico aprendizado que me proporcionaram! Por tudo isso: ... eu tenho tanto pra lhe falar, mas com palavras no sei dizer como grande o meu amor por voc (s)! - Ao Ildemar Mayer pelo profissionalismo, amizade, companheirismo, incentivo, pacincia, momentos felizes e principalmente bom humor. - CAPES, pelo apoio financeiro e ao projeto INOTEXTIL/FINEP com participao das empresas BUETTNER, COTEMINAS, MALHARIA BRANDILI e TAPAJS. - Ao SENAI CETEX Blumenau pela possibilidade do desenvolvimento de alguns experimentos em suas dependncias e pela disponibilidade, pronto atendimento e troca de informaes. - Clariant pela doao dos agentes tensoativos. - Novozymes pela doao da enzima Pulpzyme HC utilizada como padro de estabilidade. - Ao secretrio da ps-graduao, Edevilson, pela amizade e disponibilidade.
-

A todas as pessoas que contriburam, direta ou indiretamente, pouco ou muito, para a realizao deste trabalho. OBRIGADA!

v RESUMO

As condies severas do processo de purga empregado tradicionalmente em fibras celulsicas ocasionam um ataque generalizado, especificamente em tecidos 100% algodo, resultando em elevada perda de massa e diminuio da resistncia das fibras. A substituio do processo de purga alcalina pela enzimtica, alm de permitir menor agresso qumica s fibras, devido elevada especificidade das enzimas s substncias que necessitam serem removidas como gorduras, protenas, entre outras. Tambm possibilitam produtos acabados com melhores caractersticas de toque e resistncia. Muitas enzimas j foram testadas para a remoo das substncias hidrofbicas das fibras, entretanto poucos so os estudos para a remoo dos fragmentos das cascas do capulho e gravetos presentes nas malhas produzidos por fios de algodo cardado. Neste trabalho foram avaliados a termoestabilidade do caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 e a influncia da interao entre a enzima e substncias qumicas frequentemente utilizadas no processamento txtil tais como os agentes tensoativos, cidos e bases utilizados para a correo de pH, a adio de poliis para a estabilizao enzimtica e tambm o efeito de inibio ou ativao da atividade enzimtica na presena de ons que comporiam as fibras de algodo. Utilizou-se como parmetro de comparao preparao comercial Pulpzyme HC (Novozymes), que possui o mesmo tipo de atividade de endoxilanase. Os efeitos inibitrios decorrentes dos ons presentes na fibra de algodo poderiam impossibilitar a utilizao da purga enzimtica de substratos txteis, especificamente malha de fio cardado 100% algodo. Dentre os reagentes testados, o KCl, NaCl and (NH4)2SO4 promoveram aumento na atividade quando utilizados na concentrao de 5,0 mM. Dentre as diversas condies testadas constatou-se que o sorbitol 1,0 M, em tampo glicina-NaOH 0,01 M, com 5,0 g/L de umectante e 37,5 minutos de incubao so condies capazes de manter 62,94% da atividade inicial da enzima, e que o emulsificante no tem efeito significativo sobre a atividade da enzima. O agente umectante apresentou efeito significativo, provavelmente por ser composto por lcoois alifticos. Os resultados da biopurga com xilanase mostraram que a enzima no apresentou o efeito desejado como agente de biopurga, considerando-se os padres de qualidade exigidos pela indstria.

Palavras-chave: biopurga, purga enzimtica, xilanase, algodo, indstria txtil, estabilizante, poliol.

vi ABSTRACT

The harsh conditions of the scouring process traditionally employed in this type of cellulose fibres especially 100% cotton fabrics cause an attack generalized, promoting high loss of mass and decreased resistance of fiber. The replacement of the alkaline scouring process by the enzymatic provide a less aggression to the chemical fibers due to the high specificity of the enzymes to substances that need to be removed, such as fats, proteins, etc. Also enable finished products with better characteristics of touch and resistance. Many enzymes have been tested for the removal of substances hydrophobic fibres, but there are few studies for the removal of seedcoats present in the fabric produced by carded cotton. In this work were evaluated the thermostability of crude broth xylanase of Bacillus pumilus CBMAI 0008 and the influence of the interaction between the enzyme and chemicals ions frequently used in textile processing like surfactants, acids and bases. It was tested the addition of polyols to stabilize enzymes and also the effect of inhibition or activation of enzyme activity in the presence of ions that compose the cotton fibers. The commercial preparation comparison Pulpzyme HC (Novozymes), that possesss type of activity the same from endoxylanase. Among the reagents tested, the KCl, NaCl and (NH4)2SO4 promoted increased activity when used at a concentration of 5.0 mM. Among the numerous conditions tested it was found that the sorbitol 1.0 M in glycine-NaOH buffer with 5.0 g/L and 37.5 minutes of incubation time were conditions to maintain 62.94% of the initial activity of the enzyme, and the emulsifying has no significant effect on the activity of the enzyme. The wetting agent presented significant effect probably because it is composed of aliphatic alcohols. From the stabilization of the enzyme in the operational conditions were carried out bioscouring. The combinations results used for the chemical agents had indicated that the emulsifying presented no effect on the activity of the enzyme and that the umectant agent shows significant effect, probably to be composed of aliphatic alcohols. After stabilization were reproduced numerous operational conditions that could be used in the textile process. The results of the combinations used for the chemical agents had indicated that the emulsifying presented no effect on the activity of the enzyme and that the agent umectante presents significant effect, probably to be composed of aliphatic alcohols. From the stabilization of the enzyme in the operational conditions were carried out bioscouring.

Keywords: bioscouring, biotreatment, xylanase, cotton, cotton fiber, stability, polyol.

vii LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1

Comparao entre os processos enzimtico e alcalino realizados em um equipamento de tingimento a jato ................................................... 10

Tabela 2.2

Componentes de celulase de fungos aerbios e seu modo de ao na cadeia celulsica .................................................................................... 14

Tabela 2.3

Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a hidrlise completa de celulose de algodo ............................................ 17

Tabela 2.4

Efeito dos ons e agentes qumicos sobre a atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado ........................................................................ 31 Tempo de meia-vida (t1/2) da b-xilanase de diferentes linhagens de T. lanuginosus em diferentes valores de pH .............................................. 33

Tabela 2.5

Tabela 3.1 Tabela 3.2

Caractersticas das enzimas utilizadas no trabalho ................................ 37 Caractersticas dos produtos qumicos utilizados nos processos de purga convencional e enzimtica .......................................................... 38

Tabela 3.3

Nveis dos parmetros usados para a determinao da melhor combinao tipo de soluo tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ..................................... 47 Planejamento fatorial 24, com duas replicatas, para a determinao da melhor combinao tipo de soluo tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) para o caldo bruto centrifugado ............... 47

Tabela 3.4

Tabela 3.5

Nveis dos parmetros estudados para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ........ 48 Planejamento experimental 33 utilizado para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. 48

Tabela 3.6

Tabela 3.7

Nveis dos parmetros estudados na determinao das condies timas sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para aplicao na biopurga caso 1 e 2 ........................... 49

Tabela 3.8

Planejamento no planejamento fatorial completo de 4 fatores, misto

viii de 2 e 3 nveis, utilizado para determinar as condies timas de sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para aplicao na biopurga ............................................................................ Tabela 3.9 Procedimento (receita) utilizado na biopurga de tecidos em malha 100% algodo, pH 9,0, RB 1:10, 7 esferas de ao inox e agitao de 40 rpm .................................................................................................... 52 Tabela 3.10 Procedimento (receita) utilizado para purga alcalina de tecidos em malha 100% algodo, RB=1:10 ............................................................. 53 Tabela 4.1 Propriedades das xilanases presentes no caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 e na preparao enzimtica Pulpzyme HC ......................................................................................................... Tabela 4.2 Atividade xilanoltica remanescente (%) em funo do tempo de incubao, para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. Tabela 4.3 Atividade xilanoltica remanescente (%) em funo do tempo de incubao, para a preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... Tabela 4.4 Parmetros da equao de Arrhenius para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .......................................................................................................... Tabela 4.5 Parmetros da equao de Arrhenius para a preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0 ............................................................................. Tabela 4.6 Constante de desativao trmica e tempo de meia-vida do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 . Tabela 4.7 Constante de desativao trmica e tempo de meia-vida da preparao enzimtica Pulpzyme HC, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................................................................... Tabela 4.8 Resposta obtida no planejamento fatorial 24, com duas replicatas, para a determinao da melhor combinao tipo de soluo 65 65 63 63 60 59 55 49

tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ................................................................................. Tabela 4.9 Estatstica descritiva da melhor combinao entre tipo de soluo 67

ix tampo e tipo de estabilizantes sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ........................................................................ 68 Tabela 4.10 ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo da combinao entre tipo de soluo tampo e estabilizantes ......................................................................................... Tabela 4.11 Teste de Tukey aplicado s mdias do tipo de tampo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado .................. Tabela 4.12 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de tampo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ........................................................................................... 70 Tabela 4.13 Teste de Tukey aplicado s mdias do tipo de estabilizantes utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ......... Tabela 4.14 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de estabilizante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ................................................................................. Tabela 4.15 Teste de Tukey aplicado s mdias dos fatores tipo de tampo e de estabilizante utilizados sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ................................................................................. Tabela 4.16 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de estabilizante utilizados sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ................................................................................. Tabela 4.17 Resposta obtida no planejamento fatorial completo 4 fatores, misto de 2 e 3 nveis, para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol, 0,5 e 1,0 M, para o caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... Tabela 4.18 Estatstica descritiva da melhor combinao de umectante, tipo de agitao, tempo de incubao e concentrao do estabilizante sorbitol (0,5 e 1,0 M) para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. Tabela 4.19 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do umectante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. Tabela 4.20 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos da 80 79 78 76 75 71 71 69 69

x concentrao de sorbitol utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............................................................................................... Tabela 4.21 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de agitao utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ Tabela 4.22 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tempo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ Tabela 4.23 ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo da combinao para combinao de todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................................... Tabela 4.24 Teste de Tukey aplicado s mdias da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para os tratamentos, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. Tabela 4.25 Resposta do planejamento fatorial completo 4 fatores, misto de 2 e 3 nveis, utilizado para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol, 1,0 ou 2,0 M, para o caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................. Tabela 4.26 Estatstica descritiva da melhor combinao de umectante, tipo de agitao, tempo de incubao e concentrao do estabilizante sorbitol (1,0 ou 2,0 M) sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ........... Tabela 4.27 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tempo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ Tabela 4.28 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos da concentrao de sorbitol utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, 95 pH 9,0 .................................................................................................... Tabela 4.29 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de agitao utilizado sobre a atividade remanescente (%)do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 96 95 95 92 89 86 81 81 81

xi Tabela 4.30 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do umectante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. Tabela 4.31 ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para combinao de todos os efeitos em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0 ............................................................................. Tabela 4.32 Teste de significncia do modelo para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .......................................................................................................... Tabela 4.33 Teste de significncia do modelo da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, aps retirada dos efeitos no significativos .................................... Tabela 4.34 Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos de todos os parmetros utilizados sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. Tabela 4.35 Teste de Levene para homogeneidade de varincias ............................. Tabela 4.36 Estatstica descritiva da influncia dos aditivos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. Tabela 4.37 Resposta do planejamento experimental 3 utilizado para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................................................................... Tabela 4.38 Estatstica descritiva da influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... Tabela 4.39 ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo dos agentes tensoativos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ......................................................................................... 113 Tabela 4.40 ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo dos agentes tensoativos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, aps excluir os termos no significantes ....................... 114 Tabela 4.41 Coeficientes estimados no modelo emprico para atividade 112 111
3

96

103

105

105

107 109

110

xii remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, depois da excluso dos termos no significantes ........................................................................................... 114 Tabela 4.42 Coeficientes estimados no modelo de regresso para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, depois da excluso dos termos no significantes ........................................................................................... 114 Tabela 4.43 Resposta predita de cada efeito no modelo para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. Tabela 4.44 Respostas preditas para cada nvel de cada fator mantendo todos os outros fatores constante ......................................................................... Tabela 4.45 Valores preditos para a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ........................................................................................... 120 Tabela 4.46 Efeito da inibio do carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0, sobre a atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado ................................. 121 Tabela 4.47 Mdia de hidrofilidade para os tipos de purga estudados ..................... Tabela 4.48 Hidrofilidade conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo ................................................................................................. Tabela 4.49 Grau de alvura e coordenadas de cor conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo .................................................................. 128 Tabela 4.50 Perda de massa (%) conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo ................................................................................................. 130 127 123 116 115

Tabela 4.51 Resumo dos parmetros da estabilidade trmica ................................... 132

xiii LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1

Enzimas usadas nas vrias etapas do processamento a mido txtil e no processamento do Denim ................................................................. 11

Figura 2.2

Atuao das enzimas multicomponentes da celulase na estrutura da celulose .................................................................................................. 15 Atuao da endo--1,4-xilanase na xilana ............................................ Processo de biopurga com umectao inicial, antes da etapa enzimtica ............................................................................................. 52 53 54

Figura 2.3 Figura 3.1

18

Figura 3.2 Figura 3.3 Figura 4.1

Processo de biopurga all in ................................................................... Perfil do processo de purga alcalina ..................................................... Eletroforese SDS-PAGE do (1) caldo bruto centrifugado de xilanase de Bacillus pumilus CBMAI 0008 e (2) Pulpzyme HC revelado com corante comassie brilliant blue R-250 ..................................................

56

Figura 4.2

Atividade enzimtica xilanoltica em funo da temperatura do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. 57

Figura 4.3

Atividade enzimtica xilanoltica em funo da temperatura da preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ........................................... 57

Figura 4.4

Atividade xilanoltica remanescente (%) para o caldo bruto centrifugado, durante 150 minutos no intervalo de temperatura de 4090C, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................... 60

Figura 4.5

Atividade xilanoltica remanescente (%) para a preparao enzimtica Pulpzyme HC, durante 150 minutos no intervalo de temperatura de 40-90C, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................. 61

Figura 4.6

Efeito do tipo de tampo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ................................................................................. 70

Figura 4.7

Efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do 72 caldo bruto centrifugado .......................................................................

Figura 4.8

Efeito do estabilizante conforme o tipo de tampo utilizado sobre a

xiv atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ..................... Figura 4.9 Resduos em funo da ordem, do efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado .................. Figura 4.10 Figura 4.11 73 73

Grfico da probabilidade normal esperada dos resduos ....................... 74 Resduos em funo dos valores preditos, do efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado .......................................................................................... 74

Figura 4.12

Anlise da interao entre os efeitos umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... 82

Figura 4.13

Anlise da interao entre os efeitos tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... 82

Figura 4.14

Anlise da interao entre os efeitos concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................................... 83

Figura 4.15

Anlise da interao entre os efeitos tipo de agitao, umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 83

Figura 4.16

Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 84

Figura 4.17

Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. 84

Figura 4.18

Anlise da interao entre todos os efeitos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. 85

Figura 4.19

Resduos em funo dos valores preditos da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para todos os efeitos ..................................................... 87

Figura 4.20

Diagrama de disperso: mdias e desvios padres da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos,

xv em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................. 88 Figura 4.21 Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................. 88 Figura 4.22 Diagrama de disperso: mdias e desvios padres da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para todos os efeitos .............................. Figura 4.23 Anlise da interao entre os efeitos do tipo de agitao e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................................... 97 Figura 4.24 Anlise da interao entre o efeito umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................... Figura 4.25 Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 98 Figura 4.26 Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e tipo de agitao sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 98 Figura 4.27 Anlise da interao entre os efeitos do tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................................... 99 Figura 4.28 Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 99 Figura 4.29 Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. Figura 4.30 Anlise da interao entre o efeito umectante, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 100 Figura 4.31 Anlise da interao entre o efeito umectante, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto 100 97 91

xvi centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ............ 101 Figura 4.32 Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .. Figura 4.33 Anlise da interao entre todos os efeitos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. 102 Figura 4.34 Resduos em funo dos valores preditos dos efeitos umectante, tipo de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................................................. 105 Figura 4.35 Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ................................. 108 Figura 4.36 Grfico da probabilidade normal esperada dos resduos para o modelo da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 ....................................... 108 Figura 4.37 Resduos em funo da ordem do umectante, tipo de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 .................................................................................................... 109 Figura 4.38 (a) Superfcie de resposta que mostra o efeito das diferentes concentraes de umectante e tempo na atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. (b) Curva de nvel para a superfcie do item (a) .................................................................................................. Figura 4.39 Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para os agentes tensoativos ............................................................................................. 118 Figura 4.40 Grfico de normalidade dos erros, da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, em funo dos agentes tensoativos .......................................... Figura 4.41 Resduos em funo da ordem para a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, 118 117 101

xvii pH 9,0, para os agentes tensoativos ...................................................... Figura 4.42 Grfico de Pareto dos efeitos estimado (valor absoluto) sobre a 119 119

atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado ..................... Figura 4.43 Grau de alvura nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, sob diversas condies, tendo os corpos de prova da purga alcalina como

padro .................................................................................................... 124 Figura 4.44 Grau de alvura nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, com preparao e all in, sendo a purga alcalina o padro ............................. 124 Figura 4.45 Perda de massa nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, sob diversas condies, sendo a purga alcalina o padro ............................ Figura 4.46 Perda de massa nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, sob diversas condies, sendo a purga alcalina o padro ............................ Figura 4.47 Grau de alvura nos corpos de prova aps o processo enzimtico, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, purga enzimtica com caldo bruto centrifugado estabilizado contendo 3 g/L de umectante (PE3CBX) e 5 g/L de umectante (PE5CBX), com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante (PE3P) e 5 g/L de umectante (PE5P), tendo os corpos de prova da purga alcalina (PA) como padro ............ Figura 4.48 Perda de massa nos corpos de prova aps o processo enzimtico, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, purga enzimtica com caldo bruto centrifugado estabilizado contendo 3 g/L de umectante (PE3CBX) e 5 g/L de umectante (PE5CBX), com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante (PE3P) e 5 g/L de umectante (PE5P), tendo os corpos de prova da purga alcalina (PA) como padro ............ 130 129 126 125

xviii SIMBOLOGIA

A AE Ae ANOVA APSU Atinicial Atresidual Berger bG C CB CBD CBH CMC CMCase cN/Tex CO D Da DNS DP e Ea E.C. Ed EDTA

= Absorbncia = = Atividade enzimtica [U/mL] Atividade especfica [mmol/mg.min]

= Anlise de varincia = Unidade padro de atividade de pectinase alcalina = Atividade enzimtica inicial [U/mL] = Atividade enzimtica remanescente aps o tratamento trmico durante um perodo de incubao [U/mL];

= Unidade de medida do grau de brancura ou alvura = b-glucosidase, celobiase, b-(1,4)-glicose = Concentrao de acar [mmol/mL] = Mistura de soluo carbonato-bicarbonato = Cellulose Binding Domain = Celobiohidrolase, b-(1,4)-D-glucana celobiohidrolase = Unidade da atividade celuloltica = Carboximetilcelulose = Unidade de medida utilizado nos testes de resistncia = Algodo = Diluio da amostra = Dalton = cido 3,5 dinitro-saliclico = Grau de polimerizao = Coeficiente de extino molar do p-nitrofenol (e = 2 mM-1cm-1) = Energia de ativao [cal/mol] = Enzyme Comission = Energia de desnaturao trmica da enzima [kcal/mol] = cido etilenodiaminotetractico

xix EG EglA EGU EGX GL GNaOH k K kd Kd 0 l m1 m2 MSR PA PE PECBX PE3CBX PE5CBX PEP PE3P PE5P PE PG PGL PMG PMGE PMGL QM R* = Endoglucanase; b-(1,4)-D-glucana-celobiohidrolase = Endoglucanase = Unidades de atividade de endoglucanase = Exoglucanase = Graus de liberdade = Soluo tampo glicina-NaOH = Constante de Arrhenius = Coeficiente de adsoro = Constante de desativao trmica ou desnaturao da enzima [h-1] = Fator exponencial = Comprimento de onda = Massa do corpo de prova antes do tratamento [g] = Massa do corpo de prova aps o tratamento [g] = Mtodo de superfcie de resposta = Purga alcalina = Purga enzimtica = Purga enzimtica com caldo bruto centrifugado = Purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 3 g/L de umectante = Purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 5 g/L de umectante = Purga enzimtica com Pulpzyme HC = Purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante = Purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 5 g/L de umectante = Pectiesterases = Poligalacturonase = Poligalacturonato = Polimetilgalacturonase = Polimetilgalacturonato esterase = Polimetilgalacturonato liase = Quadrado Mdio = Refletncia da amostra tingida no comprimento de onda de mxima absoro

xx R RB rpm S SQ t t1/2 T U Ve Vt = Constante da lei dos gases (1,987 cal/mol.K) = Relao de banho = Rotao por minuto [min-1] = Coeficiente de disperso [unidade] = Soma dos Quadrados = Tempo de incubao ou reao [minutos] = Tempo de meia-vida [h-1] = Temperatura [C] ou temperatura absoluta [K] = Unidade de atividade enzimtica [mmol/mL.min] = Volume de enzima [mL] = Volume total da soluo [mL]

xxi SUMRIO

RESUMO ................................................................................................................................... v ABSTRACT ..............................................................................................................................vi LISTA DE TABELAS .............................................................................................................vii LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................xiii SIMBOLOGIA ......................................................................................................................xviii CAPTULO 1 INTRODUO............................................................................................... 1 1.1. MOTIVAO DO TRABALHO .................................................................................... 1 1.2. CONTRIBUIES DO TRABALHO............................................................................. 2 1.3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 3 1.3.1. Objetivo Geral............................................................................................................. 3 1.3.2. Objetivos Especficos ................................................................................................. 3 CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 5 2.1. PROCESSOS ENZIMTICOS DE BENEFICIAMENTO EMPREGADOS EM FIBRAS CELULSICAS ....................................................................................................... 5 2.1.1. Processamento Enzimtico do Algodo a mido....................................................... 6 2.1.1.1. Desengomagem Enzimtica................................................................................... 6 2.1.1.2. Biopreparao ........................................................................................................ 7 2.1.1.3. Bioacabamento....................................................................................................... 7 2.1.2. Processamento Enzimtico do Denim Bioestonagem ............................................. 8 2.2. ENZIMAS UTILIZADAS EM PROCESSOS TXTEIS ................................................ 9 2.2.1. Celulases ................................................................................................................... 11 2.2.2. Xilanases................................................................................................................... 15 2.3. APLICAES DE ENZIMAS EM FIBRAS CELULSICAS .................................... 17 2.3.1. Aplicabilidade de Enzimas para Diferentes Tipos de Fibras .................................... 17 2.3.2. Bioestonagem............................................................................................................ 18 2.3.2.1. Influncia da Presena de Corantes no Tratamento Enzimtico.......................... 19 2.3.3. Estudo das Condies Operacionais do Tratamento Enzimtico ............................. 20 2.3.3.1. Influncia da Agitao Mecnica e Tipo de Equipamento Utilizado no Tratamento Enzimtico..................................................................................................... 22 2.3.3.2. Influncia do Pr-Tratamento na Acessibilidade da Enzima Fibra................... 23 2.3.3.3. Efeito do Surfactante............................................................................................ 25 2.3.3.4. Tempo de Processo .............................................................................................. 26

xxii
2.3.4. Influncia de Agentes Qumicos na Atividade de Xilanases Inibio ou Ativao .... 26

2.3.5. Estabilidade Trmica de Xilanases ........................................................................... 28 CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS........................................................................... 36 3.1. MATERIAL.................................................................................................................... 36 3.1.1. Enzimas..................................................................................................................... 36 3.1.2. Substrato Txtil......................................................................................................... 36 3.1.3. Reagentes .................................................................................................................. 37 3.1.4. Equipamentos............................................................................................................ 38 3.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ...................................................................... 38 3.2.1. Caracterizao dos Corpos de Prova ........................................................................ 39 3.2.1.1. Grau de Branco ou Grau de Alvura ..................................................................... 39 3.2.1.2. Hidrofilidade ........................................................................................................ 39 3.2.1.3. Perda de Massa .................................................................................................... 39 3.2.1.4. Reprodutibilidade................................................................................................. 40 3.2.2. Caracterizao das Preparaes Enzimticas ........................................................... 40 3.2.2.1. Determinao das Protenas................................................................................. 40 3.2.2.2. Determinao da Atividade Enzimtica............................................................... 40 3.2.2.3. SDS-PAGE .......................................................................................................... 42 3.3. PROPRIEDADES CATALTICAS DAS PREPARAES ENZIMTICAS ............. 43 3.3.1. Influncia da Temperatura na Atividade Enzimtica ............................................... 43 3.3.2. Desnaturao Enzimtica.......................................................................................... 43 3.3.3. Efeito do Tipo de Tampo e Estabilizantes .............................................................. 45 3.3.4. Efeito de Inibio e Ativao na Atividade Enzimtica ........................................... 45 3.3.5. Efeito de Agentes Tensoativos ................................................................................. 46 3.4. PLANEJAMENTO ESTATSTICO .............................................................................. 46 3.5. PROCESSOS UTILIZADOS ......................................................................................... 50 3.5.1. Purga Enzimtica ...................................................................................................... 50 3.5.2. Purga Alcalina........................................................................................................... 53 CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................... 55 4.1. CARACTERIZAO ENZIMTICA .......................................................................... 55 4.2. ATIVIDADE CELULOLTICA .................................................................................... 55 4.3. ATIVIDADE XILANOLTICA EM FUNO DO pH E DA TEMPERATURA....... 56 4.4. ESTABILIDADE TRMICA ........................................................................................ 58 4.4.1. Energia de Ativao da Reao Enzimtica ............................................................. 62

xxiii 4.4.2. Constante de Desativao Enzimtica ...................................................................... 64 4.5. EFEITO DO TAMPO E DOS ESTABILIZANTES ................................................... 66 4.5.1. Efeito da Concentrao de Estabilizante .................................................................. 76 4.5.1.1. Anlise para a Concentrao de 0,5 e 1,0 M de Sorbitol..................................... 77 4.6. EFEITO DE AGENTES QUMICOS .......................................................................... 110 4.7. EFEITO DOS AGENTES TENSOATIVOS................................................................ 111 4.8. EFEITO DO CARBONATO-BICARBONATO USADO COMO TAMPO............ 121 4.9. ENSAIOS DE BIOPURGA EM MALHA COM XILANASE.................................... 121 4.9.1. Ensaios Preliminares Caldo Bruto sem Estabilizao ......................................... 121 4.9.2. Ensaios com o Caldo Bruto Estabilizado................................................................ 126 4.9.3. Avaliao dos Efeitos do Caldo Bruto Estabilizado na Biopurga .......................... 131 4.9.4. Consideraes ......................................................................................................... 131 CAPTULO 5 CONCLUSES ........................................................................................... 134 CAPTULO 6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS....................................... 136 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................... 137 GLOSSRIO.......................................................................................................................... 148 APNDICE A Atividades remanescentes........................................................................... 153 ANEXO A Caractersticas das fibras e beneficiamento txtil............................................. 156 ANEXO B Material e mtodos para produo do caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 ............................................................................................................ 173

CAPTULO 1 INTRODUO

O processo txtil utiliza muitos insumos qumicos. Conforme sua relao estabelecida com o meio ambiente pode ser classificado como qumica agressiva e qumica limpa. A primeira utiliza lcalis, cidos, oxidantes e redutores energticos, que ocasionam degradao aleatria da superfcie da fibra e impacto considervel de contaminao ao meio ambiente. A segunda utiliza procedimentos que no agridem as fibras e nem o meio ambiente, principalmente nas etapas de pr-tratamento, como purga e alvejamento. Esses procedimentos correspondem, por exemplo, utilizao de enzimas, que atuam sob condies mais brandas (CEGARA, 2000; HOONDAL et al., 2002; GBITZ, 2001). A partir da dcada de 80, em alguns setores do processo de beneficiamento de produtos txteis, teve incio uma inovao visando manter a competitividade das fibras de algodo em relao s sintticas. Essa inovao buscava reduzir o custo e melhorar a qualidade tanto do tecido quanto do efluente produzido e conferir maior valor agregado ao produto, desde o processo de preparao at o acabamento. Essas inovaes tcnicas desencadearam avanos da biotecnologia e melhoria gentica da fibra, atravs da determinao da estrutura do genoma do algodo e manipulao do gene, influenciando o beneficiamento qumico txtil dos tecidos de algodo (HOLME, 2005). A aplicao de enzimas em processos industriais limita-se forma disponvel desses agentes biolgicos na forma nativa. Entretanto, deve-se considerar que as novas tcnicas de biologia molecular, metodologias de seleo de biocatalizadores e novas abordagens de pesquisa, foram e esto sendo desenvolvidas visando catalisadores com suas especificidades alteradas, bem como a explorao da biodiversidade (CONTI et al., 2001).

1.1. MOTIVAO DO TRABALHO

O surgimento de leis ambientais mais restritas e consumidores mais exigentes tanto com a qualidade do produto txtil quanto com o do ciclo de vida do produto, promovem a substituio ou desenvolvimento dos processos tradicionais de preparao dos tecidos txteis, compreendendo os processos de purga e pr-alvejamento, por processos mais ecolgicos. Os

processos enzimticos apresentam-se como uma alternativa aos processos tradicionais, devido s seguintes vantagens: Possuem elevada especificidade aos compostos que devem ser removidos das fibras de algodo cru; Atuam em temperaturas menores (50-60C), que a do processo de purga tradicional, que se situa na faixa de 90C, implicando num menor consumo de energia; As fibras so preservadas de ataques qumicos generalizados ocasionados pelos produtos qumicos utilizados no processo convencional como os lcalis e oxidantes, resultando em elevada perda de massa e diminuio da resistncia das fibras; Possibilidade de reuso do banho enzimtico, resultando em economia de insumos como gua, energia e produtos qumicos; Menor impacto ambiental do efluente do processo enzimtico (biopurga) devido reduo da carga de produtos qumicos em relao ao processo convencional (purga alcalina) e maior degradabilidade do efluente gerado no processo. Apesar das vantagens apresentadas relativas aos processos enzimticos, sua utilizao nos processos industriais est condicionada a fatores de custo e eficincia dos mesmos. O custo das enzimas comerciais tem reduzido consideravelmente nos ltimos anos, tornando a tecnologia competitiva, mas ainda posicionada em um patamar de 20% acima dos processos tradicionais. A eficincia do processo enzimtico nem sempre verificada nas indstrias, pois no possuem a infra-estrutura tcnica e laboratorial necessria para a determinao da atividade enzimtica e desenvolvimento de melhorias no processo. Todos os desenvolvimentos esto concentrados em alguns poucos fornecedores mundiais de enzimas. No presente trabalho foi estudada a estabilizao da xilanase, proveniente do caldo bruto de cultivo, centrifugado, de Bacillus pumilus CBMAI 0008, para aplicao na purga enzimtica de tecidos de malha 100% algodo, tendo como parmetro comparativo enzimtico a xilanase estabilizada e disponvel comercialmente, pela Novozymes, Pulpzyme HC.

1.2. CONTRIBUIES DO TRABALHO

As principais contribuies do presente trabalho, em relao ao caldo bruto, centrifugado, de xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, foram: - A viabilizao tcnica da sua utilizao aps estabilizao com o poliol, sorbitol, na biopurga de tecidos de malha 100% algodo. - A determinao do tempo de meia-vida (t1/2), constante de desnaturao trmica (kd), energia de ativao (Ea) e energia de desnaturao trmica (Ed); - A determinao do efeito de alguns ons, que podem estar presentes na superfcie da fibra de algodo, e durante o processo de purga enzimtica afetariam o desempenho enzimtico; - A avaliao do efeito dos agentes tensoativos empregados na indstria txtil sob a estabilidade trmica e atividade enzimtica.

1.3. OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo Geral

O objetivo geral do presente trabalho foi a determinao da condio tima de estabilidade do caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 para aplicao no processo de biopurga em tecidos de malha de fio cardado 100% algodo

1.3.2. Objetivos Especficos

- Avaliar o efeito do uso de diferentes poliis (glicerol, sorbitol e xilitol) na estabilidade do caldo bruto, centrifugado, de xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, atravs da atividade remanescente; - Avaliar a influncia de diferentes agentes qumicos na atividade do caldo bruto centrifugado de B. pumilus CBMAI 0008; - Avaliar o desempenho enzimtico do caldo bruto centrifugado aps a correo de pH para a faixa alcalina (pH 9,0); - Avaliar a influncia dos parmetros da biopurga: tempo de incubao, concentrao de emulsificante e umectante na estabilidade do caldo bruto estabilizado com poliol;

- Determinar as condies que devem ser empregadas na biopurga das fibras de algodo; - Avaliar a qualidade conferida, aos tecidos em malhas de fio cardado 100% algodo, pela biopurga em relao a purga convencional, atravs das propriedades: hidrofilidade; grau de alvura e perda de massa.

CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA

O pr-tratamento enzimtico de tecidos (planos, malhas, felpudos, etc.) requer o conhecimento das caractersticas das fibras celulsicas como a possvel presena de interferentes que podem inativar as enzimas, quando estas so aplicadas de forma isolada ou combinadas, das caractersticas das enzimas como especificidade, atividade; dos parmetros operacionais como a presena de tensoativos, agitao mecnica, concentrao de enzimas e a eficincia do processo enzimtico. Neste Captulo, ser apresentada uma reviso da literatura sobre os processos enzimticos empregados no beneficiamento de fibras celulsicas, especificamente algodo e as caractersticas gerais das enzimas, celulase e xilanase, que podem ser utilizadas nos processos de beneficiamento txtil.

2.1. PROCESSOS ENZIMTICOS DE BENEFICIAMENTO EMPREGADOS EM FIBRAS CELULSICAS

Historicamente, as pesquisas visando utilizao de enzimas no processamento txtil, tiveram incio a partir do sculo XX. Durante esse perodo, foi avaliado o potencial das enzimas proteolticas na remoo de escamas da fibra de l, para melhorar o comportamento antifeltro. Porm, devido natureza heterognea e perdas inaceitveis de resistncia, ainda no foi possvel chegar a um processo industrial otimizado. Na dcada de 60, surgiram os detergentes biolgicos, que possuam em sua formulao as enzimas proteases para remoo de manchas orgnicas causadas por protenas do ovo, sangue, etc. Na dcada de 70, descobriu-se que a adio das enzimas celulases lavao conferia detergncia e removiam a fibrilao em mltiplas lavaes dos tecidos (GBITZ, 2001). As aplicaes de enzimas podem ser divididas quanto ao uso industrial, mdico, analtico e cientfico. As principais aplicaes, industriais, visam a melhorar processos e possibilitar o uso de novas matrias-primas, melhorando suas caractersticas fsico-qumicas. A proporo utilizada de enzimas em processos industriais apresenta grandes variaes. A indstria de detergentes consome entre 40-45% das enzimas produzidas, enquanto a indstria

txtil e de papel entre 4-6% (ABRAHO NETO, 2001). A utilizao de enzimas no processo txtil apresenta numerosas vantagens, sendo uma das principais o melhoramento do processo, pois substitui produtos qumicos normalmente utilizados em algumas etapas dos processos txteis, reduzindo

consideravelmente o impacto ambiental, assim como os danos s fibras. Melhora a qualidade dos produtos, pois altamente especfica, permitindo a produo de produtos acabados de melhor qualidade com relao ao aspecto visual, toque e propriedades de resistncia. Reduz o desgaste do equipamento e confere maior flexibilidade na sua utilizao. Possibilita economia de energia, requer maior controle do processo e possibilita aumento de produtividade (COMOLI-LAMBERTI, 1999; CUNHA et al., 2000). O processamento enzimtico do algodo pode ser dividido em desengomagem enzimtica, biopreparao ou biopurga, bioacabamento ou biopolimento. Quando o processo enzimtico aplicado ao Denim (ou jeans, que um tecido plano de algodo tipo sarja 3/1, com o urdume, fio tinto com ndigo vertical, e a trama, fio cru horizontal), tem-se a bioestonagem.

2.1.1. Processamento Enzimtico do Algodo a mido

2.1.1.1. Desengomagem Enzimtica

A engomagem visa garantir a resistncia ao cisalhamento e esforos no processo de tecelagem sem excessiva ruptura de fios. Consiste na aplicao de uma soluo colante natural (amido) ou sinttica (acrilatos). Aps a formao do tecido, esta goma deve ser removida. No processo convencional so utilizados cidos ou agentes oxidantes como persulfatos (de sdio, amnio ou potssio) ou perxido de hidrognio em meio fortemente alcalino a altas temperaturas. Para evitar os danos causados pela desengomagem, como reduo da resistncia dos tecidos devido degradao da fibra, so utilizadas amilases para a remoo da goma de amido. A eficincia da desengomagem enzimtica depende do teor de amilase, temperatura, pH e condies de lavagem no final do processo (MALUF e KOLBE, 2003).

2.1.1.2. Biopreparao

As fibras de algodo so compostas por celulose e vrias substncias no celulsicas como ceras, substncias pcticas e protenas. A cera, substncias pcticas e protenas encontram-se no estado amorfo. A camada de celulose primria muito mais amorfa que a camada secundria (corpo principal da fibra), como mostrado na Figura A.1 do Apndice A. As substncias no celulsicas, considerando-se a composio mdia das fibras, so responsveis por uma porcentagem de 4 a 12% de massa da fibra de algodo (Tabela A.3 do Apndice A). A superfcie da fibra possui microporos ou fendas, por isso, pode-se considerar que a superfcie do algodo mais suscetvel hidrlise enzimtica que a celulose da parede secundria (PACHECO, 2001). A biopreparao, biopurga, purga enzimtica ou bioscouring objetiva a remoo das impurezas no celulsicas com enzimas como pectinases para remoo da pectina; proteases para protenas; lipases para os leos e ceras, xilanases para hemiceluloses, etc. Como alguns pigmentos naturais no podem ser desprendidos da fibra, por estarem associados a impurezas, a remoo dessas impurezas remove esses pigmentos, reduzindo o amarelado da fibra. Geralmente as enzimas usadas para a biopurga so selecionadas com base no pH, temperatura, tempo de tratamento requerido, qualidade do produto final, absoro de gua e alvura (HOONDAL et al., 2002). A combinao de enzimas especficas para remover as impurezas no-celulsicas no algodo permite manter inalterada a estrutura da celulose e reduz o consumo de energia, pois a purga enzimtica exige temperaturas menores que a purga convencional (AXTMARTINELLI, 2002).

2.1.1.3. Bioacabamento

O conceito de bioacabamento, biopolimento ou biopolishing surgiu no Japo em 1988, inicialmente para os tecidos planos de algodo e mais tarde foi estendido para os tecidos de malha. O bioacabamento objetiva eliminar as microfibrilas superficiais da fibra de algodo pela ao dos componentes da enzima celulase (endocelulase, exocelulase e bglicosidase). A celulase modifica a superfcie do tecido de algodo, aumentando a sua suavidade e maciez, de modo permanente e no envolve nenhuma agresso qumica (CEGARA, 2000; CONTRERAS, 2001).

A utilizao de enzimas no processo de acabamento produz artigos txteis com um maior conforto no uso (maciez ao toque, reduzida tendncia a pilling) e aumento do brilho, da mesma forma que reduz o encolhimento no caso dos tecidos de l. Esses efeitos so alcanados somente quando a seleo das enzimas adequada (LIPP-SYMONOWICZ et al., 2004).

2.1.2. Processamento Enzimtico do Denim Bioestonagem

O denim, ou jeans, um material extremamente firme e durvel, mas duro e desconfortvel para o uso enquanto novo, por isso so realizadas lavaes sucessivas para conferir maciez e conforto alm de aspecto gasto e desbotado aos jeans azuis. A essas lavaes com adio de pedras-pomes, para conferir aspecto desbotado ao artigo denim, d-se o nome de estonagem ou stonewashing (ANDREAUS, 2001). A bioestonagem, biolavagem ou biostoning foi introduzida na Europa em 1989 e a primeira vez nos Estados Unidos em 1990, a fim de substituir parcialmente ou na totalidade as pedras-pomes. Com o objetivo de no expelir poeira residual e causar problema de abraso na mquina, causada pela estonagem tradicional. O uso das celulases confere o aspecto desbotado, diminui a resistncia flexo, tornando o uso dos artigos mais agradvel, inclusive melhorando o toque. Entretanto, a utilizao de celulase apresenta o inconveniente de redepositar, sobre o fio branco ou no fio tingido do denim, o ndigo removido. Este problema conhecido como backstaining, pois diminui o contraste desejado entre a trama e o urdume. Dentre as celulases cidas, neutras e alcalinas, as celulases cidas so as que causam backstaining em nveis no aceitveis. O problema de backstaining pode ser superado com o uso de protease alcalina engenheirada (pH 8-10) que pode atuar em temperatura entre 30 a 60C, e baixa dosagem, tipicamente 0,01% em massa (ANDREAUS, 2001; HOLME, 2005). Segundo Andreaus (2001) as principais vantagens da bioestonagem com celulases so: condies moderadas (temperatura entre 40-60C, presso normal); reao especfica das celulases com a celulose; origem natural; biodegradabilidade. Segundo trabalhos citados em Cegara (2000), as celulases empregadas atualmente para o desbotamento so as neutras e as cidas, as quais podem estar compostas de endo-, exo- e b-glucosidase. As celulases neutras apresentam seu mximo efeito de desbote em pH 6, e devem ser utilizadas para conseguir efeitos mais acentuados em tratamentos mais intensos

(60 minutos a 55C), enquanto as cidas necessitam de pH 5 e seriam indicadas para tratamentos rpidos (30 minutos a 45-55C). Entretanto, deve-se considerar que devido aos diferentes tipos de celulases oferecidas no mercado conveniente seguir as prescries de utilizao dos fornecedores. Visando efeito mais preciso, foram desenvolvidas enzimas celulases

monocomponentes. Essas celulases monocomponentes, foram introduzidas no mercado pela Novozymes em 1997, pela linha de produtos DeniMax. Esta linha composta por trs sries: srie 300, cuja abraso ocorre a um pH elevado que proporciona grande contraste e boa conservao da resistncia; srie 400, que produz nvel de contraste mais elevado que a 300 e menor perda de resistncia em relao s outras celulases comerciais da Novozymes e srie 500, com abraso elevada e ao mais rpida das 3 celulases monocomponentes desta linha de produtos. So apresentadas na forma concentrada ou como produto formulado completo e pronto para uso, com um sistema anti-redeposio e tampo. Estas sries podem ser usadas com Denilite, que um sistema de lacase produzida pela empresa para branquear jeans como substituto parcial do hipoclorito (NOVO NORDISK, 2000).

2.2. ENZIMAS UTILIZADAS EM PROCESSOS TXTEIS

O estado fsico em que as enzimas so apresentadas depende da forma de aplicao que proporcione melhores resultados, ou seja, se melhor utilizar as enzimas em estado puro ou em formulaes enzimticas. Entende-se por formulao enzimtica, lquida ou slida, aquela que contm a quantidade correta de uma enzima ou de uma mistura de enzimas, com uma mescla de produtos auxiliares que permitam obter o efeito desejado, com a melhor qualidade e o menor custo possvel (COMOLI-LAMBERTI, 1999; ANDREAUS, 2001). Os processos enzimticos tm sido desenvolvidos para o processamento a mido de produtos txteis, abrangendo as operaes de preparao ao acabamento. Muitas enzimas utilizadas na indstria txtil como as carbohidrolases (celulase, pectinase, xilanase, amilase), proteases e enzimas oxidativas (lacase, mangans peroxidase) so secretadas por fungos no ambiente. Os fungos usam essas enzimas extracelulares para decompor polissacardeos, protenas e ligninas da biomassa em unidades menores que podem ser transportadas para dentro da clula que passa a agir como substrato de crescimento. A Figura 2.1 apresenta as etapas no processamento de txteis na qual podem ser utilizadas enzimas (GBITZ, 2001;

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ALY et al., 2004).

Figura 2.1. Enzimas usadas nas vrias etapas do processamento txtil a mido e no processamento do Denim. FONTE: GBITZ, 2001; KIRK et al., 2002.

Antes do tingimento do fio ou tecido, de algodo, estes passam por vrias etapas no processo txtil. Uma etapa importante a lavao para a eliminao total ou parcial dos componentes no-celulsicos encontrados no algodo bruto, bem como impurezas de lubrificantes de mquinas e de engomagem. Essa lavagem, conhecida como purga, que utiliza produtos qumicos altamente alcalinos como o hidrxido de sdio, produz no tecido uma maior hidrofilidade permitindo que ele seja branqueado e tinto com sucesso. O inconveniente destes produtos qumicos na remoo das impurezas o ataque celulose, reduzindo o massa e a resistncia do tecido. A Tabela 2.1 apresenta a comparao entre alguns parmetros relacionados qualidade do tecido tratado e do processo utilizado no equipamento de tingimento a jato (BIOTIMES, 1999). A maioria dos microrganismos produtores de enzimas como xilanase, podem produzir xilanases com celulases ou ausente de celulases (cellulase-free xylanase), ou ainda a xilanase apresentar comportamento de atuao similar ao de uma celulase. Por isso, estas enzimas sero abordadas a seguir.

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Tabela 2.1. Comparao entre o processo enzimtico e alcalino realizados em um equipamento de tingimento a jato. Medida pH Temperatura (C) Pectina residual (%) Perda de massa (%) Hidrofilidade (segundos) Resistncia ruptura (%) Aumento do brilho (%) Branqueabilidade Tingibilidade Consumo de gua de enxgue (%) Slidos totais dissolvidos (%)
FONTE: BIOTIMES, 1999.

BioPreparation 8,00-9,50 50-60 22-30 < 1,50 <1 95-100 +1-5%

Lavagem alcalina 13,00-14,00 90-100C 10-15% 3,00-8,00% <1 90-97 +5-10 Idntica Idntica com tinturas de tons escuros 40-50 100 20-50 100

2.2.1. Celulases

No ecossistema tpico de degradao de celulose muitas bactrias e fungos celulolticos atuam com microrganismos relacionados para converter substratos celulsicos insolveis em acares solveis principalmente celobiose e glicose, que so ento assimilados pela clula. Sistemas de enzimas mltiplos so assim requeridos para degradar eficientemente a celulose. Tais sistemas abrangem ou uma coleo de celulases livres e/ou complexos multicomponentes chamados celulosomas (BAYER et al., 1998). Segundo Bhat e Bhat (1997), as celulases tm sido utilizadas na indstria txtil para remoo do excesso de corante do tecido denim no pr-desbotamento do jeans azul; remoo de microfibrilas salientes dos tecidos de algodo depois de vrios ciclos de lavao; reconstituio da maciez e brilho da cor nos tecidos de algodo. Enquanto segundo CavacoPaulo (1998) e Andreaus (2001), as celulases tm o uso aumentado na indstria txtil, principalmente no acabamento e lavao. Conforme a atividade e o pH, as celulases podem ser classificadas em: i) cidas, cujo pH de atuao varia entre 4,5 e 5,5 e a temperatura entre 45-55C; ii) neutras pH 5,5-8,0 e temperatura 50-60C e iii) alcalinas que so utilizadas em detergentes. A mistura de celulases cida e neutra conhecida como celulase hbrida. Nestes processos sempre empregada forte ao mecnica nos tecidos. O nvel de agitao mecnica aumenta a perda de massa do tecido e afeta diferentemente as atividades relativas da

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endoglucanase (EG) e celobiohidrolase (CBH) na mistura bruta total. Esta a chave para o entendimento dos mecanismos pelos quais os efeitos causados pelas celulases so obtidos. Independente da classificao, as celulases catalisam a hidrlise e a degradao da celulose, causando diferenas importantes nas propriedades macroscpicas dos tecidos tratados como perda de massa, diminuio do grau de polimerizao, e consequentemente a perda da resistncia trao. Por isso, se faz necessrio o conhecimento e controle de todos os parmetros, para evitar tratamentos excessivos ou indevidamente controlados que ocasionem severos danos aos tecidos e, portanto prejuzos econmicos (ANDREAUS, 2001). Os diferentes modos de ao das enzimas celulolticas sobre o substrato polimrico so comumente descritas como ataques do tipo endo e exo. As celulases so multicomponentes, ou seja, so misturas de trs diferentes tipos de enzimas que atuam em sinergismo, na degradao da celulose a at glicose: a endoglucanase (EG, b-(1,4)-D-glucana 4glucano hidrolase, E.C. 3.2.1.4), a celobiohidrolase (CBH, b-(1,4)-D-glucana celobiohidrolase, E.C. 3.2.1.91) e celobiase (bG, b-(1,4)-glicose, E.C. 3.2.1.21). Existem ainda as exoglucanases (EGX, b-(1,4)-D-glucana celobiohidrolase, E.C. 3.2.1.74), que existem em poucos sistemas celulolticos e no interagem sinergisticamente com as outras celulases. A degradao do polmero de celulose realizada pela ao das celulases multicomponentes que atuam em sinergia. A Tabela 2.2 apresenta os componentes da celulase de fungos aerbios e seu modo de ao na cadeia celulsica e o grau de sinergismo apresentado na Tabela 2.3. Verifica-se que a atividade relativa, quando os grupos de enzimas atuam de maneira isolada, bastante baixa e quando os trs grupos atuam em conjunto, permitem a hidrlise total da celulose. O esquema de atuao das enzimas do complexo celulase sobre a estrutura da celulose apresentado na Figura 2.2 (TEERI, 1997; CAVACOPAULO, 1998; ABRAHO NETO, 2001; ANDREAUS, 2001; MIZUTANI et al., 2002). Segundo Andreaus (2001), o procedimento geral para a aplicao de celulases, em bioestonagem, deve seguir os seguintes passos: introduzir os artigos de fibras de celulose na mquina; ajustar as condies operacionais, como pH e temperatura; adicionar a enzima; controle do tempo, temperatura, pH e agitao mecnica durante o processamento; interromper a atuao da enzima (enzyme stop) pela adio de carbonato de clcio (Na2CO3) e/ou aumento de temperatura a 80C durante 10 minutos; lavagem final com detergente.

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Tabela 2.2. Componentes de celulase de fungos aerbios e seu modo de ao na cadeia celulsica. Enzima Endo-b-(1-4)-Dglucanase EG (E.C. 3.2.1.4) Modo de Ao/Produtos Quebra as ligaes internas nas regies amorfas, de forma Endo-b-(1-4)-glucosidase; aleatria, liberando celob-(1-4)-glucano hidrolase; oligossacardeos com diferentes Endoglucanase; Endocelulase; graus de polimerizao e Carboximetilcelulase (CMCase) celobiose. Tambm libera ou Celulase Cx. terminais livres para a ao da exoglucanase. Exo-b-(1-4)-glucosidase; b-(1-4)-glucano celobiohidrolase; Celobiohidrolase; Exocelulase; Avicelase ou Celulase C1. Exoglucosidase ou b-(1,4)-D-glucanglucohidrolase b-(1-4)-glicose Celobiase Liberam a celobiose da extremidade no reduzida e podem tambm atuar na celulose cristalina. So ativas na celulose cristalina. Hidrolisam a celulose, no terminal no reduzido, produzindo polmeros de glicose. Libera glicose da celobiose e celo-oligossacardeos de cadeia curta (celodextrinas). Sinnimo

Exo-b-(1-4)-D-glucanase CBH (E.C. 3.2.1.91) Exo-b-(1-4)-Dglucosidase EGX (E.C. 3.2.1.74) b-glucosidase bG (E.C. 3.2.1.21)

FONTE: BHAT e BHAT, 1997; DA-SILVA et al., 1997.

Tabela 2.3. Atividades relativas de celulases de Trichoderma koningi sobre a hidrlise completa de celulose de algodo. Enzima EG CBH G EG + G Atividade Relativa < 1% < 1% Nenhuma 5% Enzima CBH + G EG + CBH + G Caldo de cultura inicial Atividade Relativa 4% 103% 100%

FONTE: ABRAHO NETO, 2001.

Muitos estudos foram realizados nos sistemas de celulase de fungos aerbios Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum

pulverulentum, Fusarium solani, Talaromyces emersonni e Trichoderma koningii. Tambm foram identificados outros microrganismos produtores de celulase ativa tais como os fungos aerbios termoflicos (Sporotrichum termophile, Thermoascus aurantiacus, Chaetomium

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thermophile, Humicola insolens), fungos anaerbios mesoflicos (Neocallimastix frontalis, Piromonas communis, Sphaeromonas communis) bactrias aerbias mesoflicas e termoflicas (Acetovibrio cellulolyticus, Bacterides succionogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens e Clostridium thermocellum). Dentre estes microrganismos, os termoflicos celulolticos so os mais interessantes, pois as celulases so geralmente estveis sob uma variedade de condies severas incluindo pH altamente cido e alcalino, bem como temperaturas superiores a 90C (BHAT e BHAT, 1997).

Figura 2.2. Atuao das enzimas multicomponentes da celulase na estrutura da celulose.

FONTE: Adaptao de ANDREAUS, 2001.

As celulases mais estudadas e usadas so produzidas por fungos como Aspergillus niger, Humicola insolens, Penicillium funiculosum e Trichoderma reesei e so enzimas extracelulares, o que facilita a obteno industrial por fermentao (ANDREAUS, 2001). A maioria das celulases fngicas constituda por dois domnios: um grande domnio cataltico e um pequeno domnio de ligao celulose (Cellulose Binding Domain CBD). O domnio cataltico o local em que ocorre a hidrlise das cadeias de celulose, ou seja, o centro ativo que atua sobre o substrato. A catlise de hidrlise das ligaes glicosdicas b-(1,4)-D est associada presena de grupos aminocidos como o aspartato ou glutamato. O CBD estabelece a ligao com o substrato via ligaes hidrfobas e interao de

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Van der Waals. essencial a atividade na celulose cristalina, apesar de possuir atividade prpria de hidrlise, mas interage sinergisticamente com o domnio cataltico. A ligao do CBD com o domnio cataltico realizada por um polipeptdio, conhecido como linker. O linker responsvel pela flexibilidade dos dois domnios. Podem ser citadas como celulases que no possuem CBD e linker, a EG III do Trichoderma reesei e a EG I, EG III e EG VI do Humicola insolens. A presena de CBD essencial para a degradao da celulose cristalina slida. A remoo do CBD tipicamente resulta na diminuio de aproximadamente 50-80% da atividade da celulase fngica sobre os substratos insolveis, mas no nos solveis (ANDREAUS, 2001; HEIKINHEIMO et al., 2000). A adio de celulases totais ao banho de biopurga tem demonstrado o aumento da eficincia de pectinases e de xilanases. Acredita-se que as celulases eliminam as impurezas indesejveis pela hidrlise da celulose subjacente, porm a esse mecanismo, o dano tpico das celulases s fibras pode ocorrer (AXT-MARTINELLI, 2002).

2.2.2. Xilanases

Xilanas so polissacardeos de resduos de D-xilopiranosil, unidas por ligaes b(1,4)-glicosdicas, nos quais os resduos de xilopironose podem ser substitudos por D-xilose, D-arabinose, D-galactose, D-manose e seus cidos urnicos. A degradao completa desse polissacardeo necessita de enzimas especficas, como as do complexo xilanoltico. As enzimas do complexo xilanoltico podem ser divididas em enzimas que degradam a cadeia principal (endo-b-(1,4)-xilanase e b-xilosidase) e enzimas que degradam as cadeias laterais (b-glucuronidase, b-L-arabinofuranosidase e acetilesterase). A endo-b-(1,4)-xilanase (E.C. 3.2.1.8) forma o principal grupo de enzimas envolvidas na degradao da xilana, degrada aleatoriamente a cadeia principal de xilana, liberando xilo-oligossacardeos. A degradao completa desta cadeia principal ocorre por uma ao sinergstica de endo e exo-xilanases (bxilosidases ou b-D-xilosdeo xilohidrolases), que hidrolisam os xilo-oligmeros de baixa massa molar (OLIVEIRA et al., 2002). Do ponto de vista industrial, os fungos filamentosos so interessantes produtores de xilanases, pois excretam as enzimas que degradam a xilana no meio fermentativo, eliminando a necessidade de rompimento celular. A produo de xilanase em culturas de fungos comumente mais elevada do que em leveduras ou em bactrias. As xilanases livres de

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celulases proporcionam a remoo seletiva da xilana da lignocelulose sem afetar a estrutura da fibra da celulose (OLIVEIRA et al., 2002). Dentre os gneros produtores de xilanases pode-se destacar Aspergillus, Bacillus e Trichoderma. Geralmente so acompanhadas de pequenas quantidades de hemicelulases e celulases, sendo que algumas endocelulases no especficas so capazes de clivar xilanas. Por isso, sugere-se no processo de biopurga de algodo a adio de hemicelulases e celulases. As vrias aplicaes das xilanases tm estimulado pesquisas destas importantes enzimas da famlia das glicosil hidrolases. As xilanases microbianas (b-(1,4)-D-xilana xilanohidrolase, EC 3.2.1.8) so catalisadores preferidos para a hidrlise da xilana devido sua alta especificidade, condies de reaes brandas, perda do substrato negligencivel e tamanho do produto gerado. So protenas de subunidades nicas com massa molar variando entre 8145 kDa. Na maioria das vezes, as bactrias produzem dois tipos de xilanase, uma xilanase cida de alta massa molar e uma xilanase alcalina de baixa massa molar. Nos fungos mais comum xilanases alcalinas de baixa massa molar e geralmente so menos termoestveis que as bacterianas. A temperatura tima para a endoxilanase de fontes bacterianas e fngicas variam entre 40-60C. A composio de aminocidos de xilanases pesquisadas de vrias fontes indica predominantemente cadeia lateral cida (cido asprtico, cido glutmico, glicina, serina e treonina) (KULKARNI et al., 1999). Xilanases fngicas so geralmente associadas com celulases. A produo seletiva de xilanases possvel no caso de espcies pertencentes aos gneros Trichoderma e Aspergillus usando apenas xilana como fonte de carbono. Na celulose estas linhagens produzem ambos celulases e xilanases que podem ser devido a traos de hemicelulose presentes nos substratos celulsicos (KULKARNI et al., 1999). A reao de hidrlise catalisada pelas xilanases bem como celulases ocorrem por um mecanismo cido-base envolvendo dois resduos. O primeiro resduo age como catalisador geral e sobre oxignio protonado da ligao osdica. O segundo resduo age como um nuclefilo que, no caso de reteno de enzimas, interage com o oxocarbono intermedirio ou promove a formao de um on OH- da molcula de gua, como observado para a inverso de enzimas (KULKARNI et al., 1999). A reao esquemtica da atuao da xilanase na xilana apresentada na Figura 2.3.

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Figura 2.3. Atuao da endo--1,4-xilanase na xilana. FONTE: COLLINS et al., (2004) modificado.

2.3. APLICAES DE ENZIMAS EM FIBRAS CELULSICAS

Os estudos de aplicabilidade de enzimas em fibras txteis visam reprodutibilidade de qualidade nos substratos tratados principalmente umectabilidade. Numerosos trabalhos j foram desenvolvidos para otimizar ou entender o comportamento e atuao das enzimas nos processos enzimticos. A seguir sero apresentados os estudos j realizados em processos txteis aplicando enzimas de diferentes origens e natureza (celuloltica, proteoltica, etc.) agrupadas conforme o principal objetivo que foi estudado no trabalho.

2.3.1. Aplicabilidade de Enzimas para Diferentes Tipos de Fibras

A utilizao de enzimas em processos txteis deve considerar a aplicabilidade de uma dada enzima para vrios tipos de fibras, uma vez que o processo de purga convencional permite esta possibilidade. Por isso, Buschle-Diller et al. (1994) pesquisaram se o tratamento enzimtico, com celulase de Trichoderma viride, utilizado em fibras de algodo, seria vlido para as fibras celulsicas: linho e ramie; celulsicas regeneradas: viscose raiom e para a mistura de algodo/linho. Verificaram que a hidrlise enzimtica reduziu a espessura, a elasticidade e no geral afrouxou a estrutura de todos os tecidos celulsicos do estudo. No tratamento prolongado algodo, linho e viscose raiom perderam massa com taxa mais rpida que o ramie e a mistura de algodo/linho. Ocorreu a eliminao das fibras em todos os casos com 6 horas de tratamento A relao resistncia/perda de massa do ramie e linho diferiu do algodo e viscose raiom. Verificaram que a microscopia luminosa combinada com corante

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Congo Red pode ser usada para monitorar a localizao do ataque enzimtico no linho e algodo, mas no para viscose raiom e ramie. Os ndices de cristalinidade das amostras no mudaram depois da hidrlise enzimtica, nem acessibilidade da mistura. Lipp-Symonowicz et al. (2004), avaliaram o efeito do tratamento enzimtico, com enzimas de natureza celuloltica (Tinozym CEL da Ciba Geigy A. G., com 542,5 EGU/dm3 e Cellulosoft Ultra L da Novozymes, com 500,0 EGU/dm3) e pectinoltica (BioPrep L da Novozymes, com atividade 3000 APSU/g), na estrutura morfolgica e propriedades da fibra do linho, bem como os parmetros do fio obtido a partir destas fibras. Quando considerada apenas a utilizao dos agentes pectinolticos foi observado que as enzimas acarretaram diferentes alteraes na fibra do linho, como aumento do brilho e frescor ao toque. No caso dos agentes celulolticos, devido a alteraes na superfcie das fibras elementares e tcnicas, a resistncia tenso do fio no foi baixada, enquanto a massa foi consideravelmente reduzida (efeito vantajoso em termos de valores estticos dos txteis acabados). Ocorreu o aumento da alvura da fibra quando o tratamento enzimtico foi realizado antes do alvejamento, devido ao aumento no grau de purificao da fibra das substncias no-celulsicas, que resultou na diminuio considervel da rigidez flexural do fio, com a tenacidade restante do fio no alterada ou ligeiramente reduzida.

2.3.2. Bioestonagem

Heikinheimo et al. (2000) estudaram os efeitos de trs celulases monocomponentes purificadas cromatrograficamente, EG I, EG II e CBH I e duas diferentes misturas de celulase produzidas por modificao gentica da linhagem Trichoderma reesei (Ecostone L celulase comercial cida com endo e exoatividade e Celulase B preparao de celulase experimental rica em CBH doadas pela Rhm Enzyme Filand Oy), no processo de estonagem de tecidos denim. As celulases purificadas de Trichoderma reesei, a EGI foi mais efetiva na remoo de cor do denim devido a um nvel muito baixo de hidrlise, indicando uma ao direta no stio desta enzima na parte colorida da celulose. A CBI no apresentou efeito de estonagem mesmo em elevadas dosagens de enzimas. A celulase comercial Ecostone L produziu um bom efeito de estonagem, mas a Celulase B foi capaz de remover cor apenas com elevadas dosagens de enzima, ou seja, quando a quantidade de EG na mistura bastante elevada. Assim, para bons efeitos de estonagem necessrio que as celulases sejam endoglucanases.

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Belghith et al. (2001) produziram grandes quantidades de celulase em um fermentador com o Penicillium occitanis mutante hiperceluloltico Pol 6 do e avaliaram a convenincia destas celulases para o processo de bioestonagem. Concluram que as celulases Pol 6 oferecem uma excelente alternativa para estonagem de jeans, com efeito, abrasivo uniforme e eficincia comparvel obtida pela celulase comercial.

2.3.2.1. Influncia da Presena de Corantes no Tratamento Enzimtico

Os tecidos tintos de algodo podem ser hidrolisados por celulases, porm com maior dificuldade que nos tecidos de algodo bruto, devido ao efeito inibitrio da presena de alguns corantes adsorvidos ou reagidos com as fibras do algodo. Como os corantes formam ligaes covalentes com os grupos funcionais da celulose nas regies amorfas, modificando quimicamente a celulose, alguns trabalhos foram desenvolvidos para avaliar essa inibio com diferentes classes de corantes. Koo et al. (1994) investigaram a taxa de hidrlise cataltica de tecidos de algodo, mercerizados e no mercerizados, com corantes reativos, a cuba (tina) e direto. Testaram vrias condies de tratamento enzimtico, e usaram como parmetros resistncia a ruptura, tingibilidade, solidez e aparncia superficial. A hidrlise cataltica com a enzima celulase foi afetada pelos corantes, direto e reativo, absorvidos no substrato. O corante tina, no mostrou ao inibitria sobre a reao cataltica da celulase. A perda de massa foi maior nos tecidos mercerizados que no mercerizados, devido diminuio da cristalinidade do algodo pela mercerizao. Ocorreu reduo significativa na resistncia ruptura do tecido. A cor produzida nos tecidos tingidos foi menor que as amostras no tingidas, devido diminuio das regies amorfas onde as molculas de corantes so absorvidas no substrato pelo tratamento. Concluram que os tecidos tratados enzimaticamente e posteriormente tintos mostraram diferentes perfis de enfraquecimento de cor comparado aos tecidos no tratados depois de lavados. Barcellos et al. (1999) pesquisaram a influncia do tratamento com celulase antes e aps o tingimento, pois ocorre o aumento e/ou diminuio na intensidade/tonalidade da cor. Concluram que o tratamento com celulase interfere no tingimento prvio e posterior a esse tratamento, devido remoo de grupos inicos, induzidos durante alvejamento, ou remoo de microfibrilas, alterando a intensidade da cor. Yamada et al. (2005) estudaram o efeito inibitrio dos corantes reativos, no

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tratamento enzimtico de fibras de algodo com celulase comercial (atividade EG) e altamente purificada, celulase tipo exo (CBH I e CBH II) e celulase tipo endo (EG II), pela perda de massa, alteraes morfolgicas na superfcie da fibra. A celulase EG II foi pouco influenciada pelos corantes ligados covalentemente celulose, desde que esses corantes se dissociassem dos substratos livremente. Por outro lado, as celulases CBH I e CBH II foram afetadas pelos corantes mais que o tipo endo. A celulase tipo exo foi mais inibida que o tipo endo pelo tingimento no caso da atividade de sacarificao, sendo que a CBH I foi severamente inibida pelo tingimento quando comparado com CBH II ou EG II do ponto de vista das alteraes morfolgicas na superfcie da fibra.

2.3.3. Estudo das Condies Operacionais do Tratamento Enzimtico

Hartzell e Hsieh (1998) apresentaram os primeiros resultados da aplicao de diversos tipos de enzimas (lipase, protease, pectinase e celulase) em tecidos de algodo bruto e pr-tratado. Os ensaios realizados buscaram aumentar a umectabilidade, resistncia e alvura. Verificaram que o tampo (fosfato de sdio para as enzimas pectinase, celulase e lipase e carbonato de sdio para enzima protease) utilizado, para cada enzima, no interfere na avaliao do efeito das enzimas. Provavelmente, a ineficincia das enzimas no-celulases no algodo bruto ocorreu devido falta de acessibilidade dos componentes no celulsicos especficos das paredes celulares do algodo. As proteases parecem ser efetivas na remoo do material proteinceo no lmen, mas no na superfcie das protenas. O pr-tratamento com gua a 100C realou os efeitos da pectinase e celulase nos tecidos, mas no quando combinadas. A temperatura para a reao enzimtica efetiva extremamente abaixo daquelas usadas na purga alcalina, assim tendo vantagens significantes no consumo de energia. Hsieh e Cram (1999) investigaram dez enzimas proteolticas, disponveis comercialmente como agentes de purga, para o algodo. Estudaram o uso de sistemas completamente aquoso e operao sob condies de reao mais brandas do que aquelas empregadas na purga alcalina, visando aumentar o comportamento de umectabilidade. Utilizaram amostras pr-tratadas com gua a 100C. Sob condies de reao tima, o resultado do comportamento umectante do algodo purgado com protease foi similar ou superior ao com purga alcalina. A temperatura requerida variou entre 25C-45C e um tempo mnimo de 10 a 30 minutos, com pH variando entre 4,0-7,0. Quatro proteases produziram umectabilidade superior no algodo, e vrias outras tambm aumentaram a umectabilidade,

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mas em menor grau. Sob condies de reao tima, o resultado do comportamento umectante do algodo, purgado com protease, similar ou superior ao com purga alcalina. Tzanov et al. (2001) investigaram um processo, para tecidos de algodo, utilizando purga enzimtica, com pectinases cidas e alcalinas; alvejamento com perxido produzido enzimaticamente por glicose-oxidase durante a oxidao de glicose e o processo nico de purga/alvejamento reutilizando o banho residual da desengomagem enzimtica com amilase. Observaram que a pectinase alcalina apresentou desempenho similar cida, entretanto em concentrao inferior, que interessante do ponto de vista econmico. Foi necessria a utilizao de surfactantes para atingir adequada remoo do material da fibra e tornar a estrutura txtil acessvel ao acabamento. O processo desengomagem/purga/ alvejamento enzimtico em circuito fechado parece ser possvel e economicamente atrativo. Cortez et al. (2002) estudaram a aplicao de celulases para aumento da estabilidade de tecidos celulsicos. Inicialmente estabeleceram as concentraes de celulase e o tempo de reao, para depois otimizarem as composies de celulases utilizadas para aumentar a estabilidade dimensional e minimizar a perda de massa e tenso do tecido. Observaram que os tratamentos com baixos nveis de celulases ricas em EG (1,0 a 5,0 mg/g) causaram excelente melhoria na estabilidade dimensional da extenso dos tecidos celulsicos. Parece que a relaxao do estresse pode ser alcanada mais efetivamente com a perda mnima de massa, pela maximizao do nmero de quebra na cadeia pela EG, quando minimizada a contribuio de celobiohidrolase. Sangwatanaroj et al. (2003) estudaram a purga custica e enzimtica, com pectinase, lipase, protease e celulase, em tecidos de algodo. Verificaram, conforme estudos prvios, que a lipase, protease e celulase no foram efetivas na purga do algodo quando usadas individualmente, requerendo a combinao das mesmas. Quando a combinao continha celulase, realizaram duas etapas no processo de purga enzimtica, devido diferena de pH e temperatura das enzimas. A alvura do tecido purgado com pectinase foi a mesma que a obtida pela purga custica. Os tecidos purgados com a combinao lipase e protease e celulase produziram resultados ligeiramente diferentes que os tecidos purgados com pectinase e com purga custica, entretanto, todos os tecidos mostraram adequada absoro para gua e corantes. Para estudar os efeitos individuais e a interao entre os parmetros do processo de biopurga (temperatura, pH e concentrao de surfactante), nas fibras de algodo, com pectinase cida, disponvel comercialmente como Pectinase 062L (Biocatalyst), Calafell e Garriga, (2004), utilizaram anlise de varincia em dois nveis. A reao foi mais eficiente

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quando utilizada alta relao de banho, mas sob condies timas de temperatura, pode ser utilizada baixa quantidade de enzima e relao de banho. O pH e o surfactante pareceram ser determinantes no desempenho timo da enzima, sob as condies estudadas. Karapinar e Sariisil (2004) estudaram o efeito da variao do pr-tratamento, combinao enzimtica (celulase, pectinase e protease) e tempo de tratamento, em tecidos 100% algodo, para determinar as condies timas capazes de conferir melhor propriedade de alvejamento e tingimento. Devido diferena nas condies operacionais entre as enzimas, as combinaes que incluram celulases, foram realizadas em dois diferentes banhos. Em muitos casos, 30 minutos de tratamento foi insuficiente para realizar a purga efetiva, quando comparado com 60 e 90 minutos, apesar de que acima destes tempos os resultados foram estatisticamente os mesmos. Em alguns casos, a purga alcalina convencional, gerou melhores resultados que a enzimtica; no entanto o resultado mais prximo purga alcalina, pela mdia de umectabilidade e remoo de pectina foi encontrado nas combinaes: celulase e pectinase; celulase, protease e pectinase. Para melhorar as propriedades fsico-mecnicas e proporcionar alta umectabilidade e absorbncia de corante, Aly et al. (2004), submeteram tecidos de algodo engomado a desengomagem com a enzima Kemylase. Nestes tecidos foram realizadas: purga enzimtica (Bioprep); biopolimento (Cellusoft L) e alvejamento (Denilite) e agente redutor (glicose). Foram avaliadas as condies operacionais: dosagem de enzima, pH, temperatura, tempo e variedade do algodo da qual o tecido foi feito. Avaliaram a perda de massa, umectabilidade, resistncia trao, espessura, alvura e medida da solidez. Os autores verificaram que o tecido tratado enzimaticamente, na desengomagem, purga e alvejamento, apresentaram caractersticas (umectabilidade, espessura, resistncia trao, perda de massa, alvura e absorbncia de corante) comparveis se no superiores aos tratamentos qumicos empregados convencionalmente.

2.3.3.1. Influncia da Agitao Mecnica e Tipo de Equipamento Utilizado no Tratamento Enzimtico

A influncia da agitao no processamento de txteis com celulases contendo CBD, de diferentes famlias, foi testada por Azevedo et al. (2000). Purificaram a endoglucanase EG V (E.C. 3.2.1.4) de Humicola insolens, da Novo-Nordisk e CenA (E.C. 3.2.1.4) de Cellulomonas fimi preparada pela University of British Columbia, Vancouver, Canad, para

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hidrolisar os tecidos de algodo com diferentes nveis de agitao mecnica. Para tentar esclarecer o papel dos CBD foram realizados experimentos com o domnio da enzima removido. Tambm foram realizados ensaios de adsoro/dessoro para observar a reversibilidade da ligao das celulases pertencentes ao CBD das famlias I e II. Verificaram que a presena de CBD no foi essencial para a atividade EG com altos nveis de agitao mecnica, similar s condies de processo utilizado na indstria txtil. EG V mostrou menor porcentagem de adsoro sob ambos os nveis de agitao. O processo de adsoro/dessoro das celulases foi elevado, devido aos altos nveis de agitao mecnica. A ligao de celulase com CBD da famlia I (EG V) foi mais reversvel do que CBD da celulase da famlia II. Alguns pesquisadores verificaram que a qualidade dos efeitos de acabamento da celulase nos tecidos celulsicos pode depender do tipo de maquinrio. Cortez et al. (2001) usaram celulases bruta total (EG I, EG II, CB I e CB II), rica em EG (EG I e EG II) e rica em CBH (CBH I e CBH II) de Trichoderma reesei para confirmar as propriedades finais do tecido submetido ao processamento em dois equipamentos: tratado sob condies realsticas de processo na mquina jet e molinete. Foi perceptvel e quantificvel a diferena daquelas amostras de tecidos tratados usando as mesmas condies de temperatura, tempo, pH, concentrao de enzima e relao de banho nos dois equipamentos. Verificaram que em todos os casos a medida de atividade da celulase so maiores no equipamento jet que no molinete, com base no aumento da agitao no primeiro. Atriburam estas diferenas ao aumento na atividade aparente de EG relativa a CBH com a alta taxa de agitao no equipamento jet.

2.3.3.2. Influncia do Pr-Tratamento na Acessibilidade da Enzima Fibra

Csiszr et al. (1998) usaram celulase comercial cida para investigar os efeitos do pr-tratamento enzimtico nos fragmentos de sementes de algodo e tambm a remoo destes do tecido de algodo, aps desengomagem enzimtica com amilase. Esta celulase contm 108 U/mL de atividade celulase, 81 U/mL de atividade b-glucosidase, 72.500 EG U/mL de atividade b-(1,4)-endoglucanase e 12.800 U/mL de atividade xilanase. Foi observado que dependendo do tempo de tratamento e concentrao da enzima, ocorreu perda de massa dos fragmentos de sementes num intervalo de 28,434,6%. A celulase hidrolisou as fibrilas ligadas aos fragmentos de sementes dos tecidos. Concluiu-se que o pr-tratamento com celulase antes da purga alcalina aumenta tanto a degradao dos fragmentos de sementes quanto a remoo dos tecidos de algodo desengomados.

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Pere et al. (2001) estudaram o tratamento de fibras e fios de algodo, com celulases monocomponentes, e diferentes pr-tratamentos nas fibras para aumentar a acessibilidade da enzima na fibra. Os tratamentos enzimticos foram avaliados microscopicamente e pela anlise dos efeitos das fibras tratadas na fiabilidade, uniformidade de fio, tenacidade e pilling. Concluram que a limpeza prvia ao tratamento enzimtico foi um mtodo simples que aumentou a atividade hidroltica de celulases nas fibras de algodo. O pr-tratamento qumico testado tambm aumentou a eficincia das celulases na seguinte ordem: oxidao < tratamento alcalino wash < tratamento fortemente alcalino. O tratamento realizado nas fibras totais no realou a processabilidade do algodo, embora tenha ocorrido alguma melhoria na fiabilidade e nas propriedades do fio. Os fios tratados com celulases resultaram na modificao das propriedades do fio cardado. O tratamento com EG aumentou a qualidade do fio como a diminuio de arrepiado e aumento na uniformidade. O efeito do pilling da EG mais efetivo quando aplicado nos tecidos de algodo, mas o tratamento do fio para controle do pilling pode oferecer uma vantagem para superar os problemas encontrados com biocabamento de tecidos em malha. Em todos os casos a atividade endoglucanase foi melhor que a atividade celobiohidrolase para estas modificaes. Lin e Hsieh (2001) estudaram se as proteases (tripsina E.C. 3.4.21.4, quimiotripsina E.C. 3.4.21.1, subtilisina E.C. 3.4.21.6) seriam agentes de purga efetivo quando empregados diretamente nos tecidos de algodo bruto sem pr-tratamento com gua quente. Observaram que todas as proteases melhoraram a umectabilidade do tecido a um nvel similar purga alcalina sob condies brandas. As condies de reao para alcanar a umectabilidade tima para tripsina foram 5 g/L a 45C, para subtilisina 5 mL/L a 55C e para quimiotripsina 1 g/L a 55C, 2 g/L a 45C e 5 g/L a 35C, durante 30 minutos, para todas as enzimas. Concluram que as proteases so capazes de acessar a superfcie das protenas sem o pr-tratamento alterando a superfcie das ceras favorecendo a remoo dos compostos hidrofbicos da superfcie. A eliminao do pr-tratamento com gua quente e posterior lavao do tampo claramente vantajoso pela perspectiva de recuperao qumica e de energia. Essa purga melhorou a umectabilidade do tecido no mesmo nvel que a purga alcalina, e similarmente melhorou as propriedades de perda de tenso. A vantagem dessa purga que no adiciona alterao na superfcie de atrito e resulta em menor encolhimento lateral. Entretanto, produziu um leve amarelado no tecido. Considerando que as condies operacionais para a aplicao de enzimas so alteradas quando existe ou no pr-tratamento, Hsie e Cram (1999) e Lin e Hsieh (2001) compararam a purga com protease, de algodo pr-

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tratado com gua quente e a purga direta com a enzima. Observaram que a purga de algodo com protease pr-tratado e com gua quente em relao purga direta exigiu um aumento na concentrao (subtilisina), alta temperatura (subtilisina e quimiotripsina) ou longo tempo (tripsina e quimiotripsina) para encontrar umectabilidade e absoro similar.

2.3.3.3. Efeito do Surfactante

Para a celulase, o uso de surfactante oferece umectabilidade, conduzindo o substrato ao contato ntimo com as enzimas e permitindo s enzimas alcanarem diferentes lugares inacessveis. Mizutani et al. (2002) estudaram o efeito do surfactante, monolaurato sorbitano polioxietileno, conhecido como Tween 20 (Aldrich), na hidrlise enzimtica com celulase, de Trichoderma reesei, de diferentes fibras celulsicas e relacionaram estrutura da fibra de celulose. Verificaram que o surfactante aumenta a formao de acar dos materiais celulsicos cristalinos tais como Avicel, algodo e Tencel. A formao de acares redutores relacionou-se inversamente cristalinidade das celuloses, mas o grau que esta sacarificao foi elevada pela presena do surfactante foi diretamente relacionado sua cristalinidade. Embora a incluso do surfactante tenha elevado a sacarificao de celulose, a reduo no foi superior resistncia tenso ocasionada pela celulase utilizada sozinha. O elevado efeito de sacarificao pelo surfactante foi atribudo inibio da soro no produtiva da endoglucanase na superfcie da celulose, que d importante acesso cadeia terminal de celulose pela exoglucanase. O efeito desejado pelo processo de purga enzimtica depende da natureza do substrato, tipo de enzimas, complexo enzimtico ou um componente especfico, atividade enzimtica, uso de tensoativos e agitao mecnica. A combinao da pectinase com celulase permitiram reduzir a quantidade de enzima utilizada para obter a caracterstica de umectabilidade pelo descrude enzimtico do algodo. A quantidade de pectinase P9179 usada em combinao foi trs vezes menor e a quantidade de celulase C1184 foi oito vezes menor do que quando usadas individualmente. Isto pode ser observado pela anlise da estrutura das camadas da fibra do algodo, composio da enzima e modo de ao na estrutura. A ao das pectinases cria mais stios disponveis na parede primria da fibra do algodo para a ao das celulases, que por sua vez, criam mais stios disponveis na camada de substncias pcticas para a ao das pectinases (PACHECO, 2001).

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Tensoativos so compostos anfiflicos, orgnicos ou organometlicos que formam colides ou micelas em soluo. Substncias anfiflicas ou anflicas so molculas possuidoras de regies distintas e caractersticas como hidrofbicas e hidroflicas. Os tensoativos causam influncia na atuao das enzimas. Os tensoativos no-inicos so compatveis com as enzimas pectinase P9179 e celulase C1184, pois no interferem na sua estrutura tridimensional. Para incrementar a atividade da celulase foi aumentada a concentrao de quase todos os no-inicos. Os tensoativos catinicos podem dar algum incremento na atividade em baixa concentrao, mas os aninicos sempre atuam como inibidores (MANIASSO, 2001; PACHECO, 2001).

2.3.3.4. Tempo de Processo

Buscando minimizar o tempo de incubao enzimtico requerido no processo de biopurga contnuo, Lenting et al. (2002), investigaram como e sob quais condies, o tempo de incubao da enzima BioPrep 3000L, da Novozymes, influenciaria o tempo de processo, e ainda, avaliar a eficincia e rapidez da remoo enzimtica dos compostos da cutcula. Notaram que nveis eficientes de degradao de pectina foram obtidos na presena de concentraes de surfactante relativamente altas. Tempo de incubao relativamente longo, 30 a 60 minutos, como frequentemente descritos na literatura, no so necessrios, entretanto, tempo de incubao curto no remove toda a pectina. O restante da pectina nas fibras teria um efeito na massa do tecido, ou seja, a perda de massa menor depois do processamento. A capacidade de absoro de gua do tecido melhorou como consequncia desse residual de pectina amorfa.

2.3.4. Influncia de Agentes Qumicos na Atividade de Xilanases Inibio ou Ativao

A aplicao de enzimas em processos industriais requer o estudo da viabilidade tcnica e econmica para sua produo em escala industrial. Estudos com diferentes fontes de carbono a fim de selecionar o tipo de fonte capaz de produzir maior quantidade de enzimas desejadas, alm do estudo das propriedades catalticas, como estabilidade trmica e influncia da presena de compostos orgnicos ou ons, sobre a atividade, so os objetivos de muitos trabalhos. A seguir sero abordados alguns trabalhos relevantes para a produo, caracterizao e aplicao de xilanase proveniente de fungos e bactrias.

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Beg et al. (2000) estudaram a produo e caracterizao de xilanase e pectinase termoestvel de Streptomyces sp. QG-11-3. Estas enzimas foram parcialmente purificadas e testadas com alguns compostos qumicos e ons metlicos para avaliar se estes as influenciariam de forma indutora (aumentando a atividade) ou inibitrio (diminuio da atividade) na atividade. A atividade tima, para ambas enzimas, ocorre a 60C e o pH timo, para xilanase e pectinase, em 8,6 e 3,0, respectivamente. As enzimas se mantiveram 100% estveis a 50C acima de 24 horas. O tempo de meia-vida (t1/2), para xilanase foi determinado, a 70, 75 e 80C, como sendo 90, 75 e 9 minutos, enquanto para a pectinase nestas mesmas temperaturas, foi 90, 53 e 7 minutos, respectivamente. O efeito da presena de ons na atividade da xilanase purificada apresentado na Tabela 2.4, quanto ao efeito sobre a atividade da pectinase no so apresentados. Damaso et al. (2002) produziram um nvel elevado de xilanase livre de celulase com Thermomyces lanuginosus IOC-4145, usando sabugo de milho como fonte de carbono. A composio do meio que proporcionasse maior produo com baixo custo foi determinado por meio de planejamento experimental. Testaram a influncia da adio de ons e reagentes qumicos (3 e 5 mM) na atividade do caldo bruto centrifugado, cujo efeitos so apresentados na Tabela 2.4. O pH timo da enzima foi determinado como 6,0 e temperatura tima como 75C. A enzima apresentou, a 50C, tempo de meia-vida de 24 horas, a 60C, manteve 50% da atividade inicial aps 4 horas de incubao e a 70C, perdeu mais que 80% de atividade aps 1 hora. No teste de estabilidade estocagem a 20C, na ausncia de qualquer agente estabilizante, ocorreu perda de 15-20% da atividade inicial nos primeiros 30 dias, mantendose estvel, subsequentemente, por 5 meses. Nascimento et al. (2002) produziram e caracterizaram a xilanase, quase exclusivamente celular e baixssima atividade celuloltica, de Streptomyces sp. da linhagem AMT-3 isolada do solo do cerrado brasileiro. Esta xilanase apresentou atividade tima no intervalo de temperatura, 55-65C, e pH 6,0. Dentre os numerosos substratos testados (xilana de larchwood, farelo de trigo, grmen de trigo, gro de cevada, sabugo de milho, resduo de papel) para maximizar a produo de xilanase, nas condies: 30C, pH 7,0, 150 rpm, 10 dias, verificaram que, em geral, o crescimento celular, na presena de 1% de substrato, ocorreu at o 2 e 3 dia, enquanto a xilanase foi detectada a partir do final da fase de crescimento celular, aumentando deste ponto em diante, obtendo as seguintes atividades: para xilana de lario de madeira 70,0 U/mL, farelo de trigo 28,4 U/mL, grmen de trigo 20,4 U/mL, gro de cevada 16,0 U/mL, sabugo de milho 9,1 U/mL, resduo de papel 7,9 U/mL. A enzima manteve 50%

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de atividade depois de 20 horas a 55C. O efeito da presena de ons na atividade da xilanase apresentado na Tabela 2.4. Concluram que estas propriedades asseguram a aplicao biotecnolgica desta enzima, composta de 4 isoformas, detectadas pela SDS-PAGE, duas acima de 600 kDa e duas com cerca de 240 e 170 kDa. O uso de enzimas em escala industrial requer: produo de enzimas com alta atividade em curto tempo de fermentao, a baixo custo. Dentro deste contexto existem muitos trabalhos e dentre esses, o de S-Pereira et al. (2002) que conseguiram produzir cerca de 12 U/mL de xilanase, pH 6,0 e 50C, em 18 horas de fermentao. A atividade tima foi alcanada a 60C e pH 6,0. Permaneceu totalmente estvel a 60C durante 3 horas e a 90C, manteve 20% de atividade remanescente depois de 14 minutos. O efeito inibitrio ou realado dos ons na atividade da xilanase apresentado na Tabela 2.4. A xilanase purificada do Fusarium proliferatum, massa molecular 22.400 Da, 591 U/mg de protena de atividade, temperatura tima 55C e pH timo 5,0-5,5, apresentou estabilidade total entre 30 a 55C em pH 5,0 durante 30 minutos, entretanto a 60C permaneceu com 22% atividade residual e a 70C com 14% (SAHA, 2002). A influncia de agentes qumicos sob a atividade da xilanase apresentada na Tabela 2.4. Dentre os vrios parmetros estudados, por Ryan et al. (2003), da terceira xilanase (XynC) purificada, produzida pelo fungo Penicillium capsulatum, a caracterizao dessa enzima com baixa massa molecular (22.000 Da) demonstrou atividade tima em pH 3,8 e 48C. A 50C, apresentou tempo de meia-vida para pH 3,2 de 25,8 minutos e pH 4,0 de 39 minutos. Aps 24 horas de incubao em pH 5,0 a 50C, a enzima apresentou 52% de atividade remanescente. O efeito da adio de alguns sais de ons metlicos (monovalentes, divalentes e trivalentes) sobre a atividade da XynC apresentado na Tabela 2.4. A xilanase alcalina de Bacillus halodurans S7 (43.000 Da) apresentou temperatura tima a 75C em pH 9,0 e 70C em pH 10. Aps 4 horas de incubao a 60C em pH 9,0, a enzima permaneceu totalmente estvel, entretanto em pH 10, apresentou 45% da atividade original, quando foi incubada a 65C, a enzima manteve 60% de atividade remanescente depois de 3 horas de incubao e no foi detectada atividade aps 1 hora de incubao a pH 10. A influncia de aditivos na atividade dessa enzima alcalina mostrada na Tabela 2.4.

2.3.5. Estabilidade Trmica de Xilanases

A desnaturao de enzimas a temperaturas brandas, como 40C ou 50C, torna a sua

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utilizao invivel em processos industriais. Assim, para garantir que a enzima se mantenha estvel durante o maior tempo possvel e, em alguns casos, aps o uso possibilite reuso, so empregados osmlitos, para conferir efeitos significativos na estabilidade trmica. Segundo Taravati et al. (2007) a estabilizao por meio de aditivos mais simples e barato que a estabilizao por engenharia da protena, com a vantagem adicional de que o agente estabilizante pode ser adicionado soluo protica no momento desejado, por exemplo, durante a estocagem ou durante o processo trmico. Os osmlitos so compostos orgnicos, hidrossolveis, com baixa massa molecular, produzidos naturalmente tanto por microrganismos quanto por animais e vegetais, para proteger suas protenas contra estresse ambiental, como presso osmtica e temperaturas extremas (FERREIRA et al., 2004; TARAVATI et al., 2007). So quimicamente classificados em: poliis (polilcoois, lcoois poliidroxlicos), como glicerol, sorbitol, xilitol; compostos nitrogenados (aminocidos e seus derivados), como glutamato, prolina, glicina e carboidratos (acares), como sacarose, frutose, trealose, entre outros. Quando os osmlitos combatem os efeitos que solutos deletrios tm sobre as protenas so denominados solutos neutralizantes e quando exercem pequenos efeitos sobre a funo protica so solutos compatveis (FERREIRA et al., 2004; VIANA et al., 2005; TARAVATI et al., 2007). Os osmlitos alteram o microambiente da protena, pela sua excluso da superfcie, resultando na formao de uma camada de hidratao, com molculas de gua, ao redor da protena. Conforme a extenso da camada de hidratao, tem-se um contedo de energia envolvido para sua manuteno, ou seja, para mant-las organizadas. O mecanismo de estabilizao dos osmlitos envolve a alterao do contedo energtico do estado nativo da protena (N) e do desnaturado (D), ou seja, o deslocamento do equilbrio de desnaturao entre o estado nativo (N) e desnaturado (D) da protena no sentido estado N. Essa atuao dos osmlitos denominada de efeito solvofbico. Adicional a este efeito tem-se o efeito hidrofbico, que pela presena do osmlito, gera o aumento da polaridade do solvente. Por estes aspectos, a utilizao de osmlitos proporciona a elevao de temperatura acima da qual a protena normalmente seria desnaturada (FERREIRA et al., 2004; VIANA et al., 2005; TARAVATI et al., 2007).

Tabela 2.4. Efeito dos ons metlicos sobre a atividade da xilanase.

Organismo Controle kDa Ag+ Fe2+ Fe3+ Na+ Mn2+ Ca2+ Cr3+ Co2+ Cd2+ Cu2+ K+ Ni2+ Zn2+ Ba2+ Mg2+ Pb2+ EDTA NH4+ Streptomyces sp. QG-11-3 Streptomyces sp. AMT3 Bacillus subtilis Penicillium capsulatum (XynC) 22,000,4 79,00 63,00 46,00 36,00 35,00 18,00 74,00 25C, pH 5,0, 30 minutos, concentrao dos ons 10 mM. Ryan et al., 2003 Bacillus circulans 0,93 IU/mg 112,00 94,70 97,00 156,50 42,70 43,00 40,40 85,20 22,80 80C, pH 4,0, 30 minutos, concentrao dos ons 1 mM. Heck et al., 2006 Fusarium proliferatum NRRL 26517 1,10 U/mL 51,002 107,003 122,003 28,004 113,005 95,004 50C, pH 5,5, 30 minutos, concentrao dos ons 5 mM. Saha, 2002.

Condies

Referncia

444,00 IU/mL 33,20 U/mL 83,00 84,00 16,00 201,00 85,00 146,00 107,50 83,00 17,70 156,00 107,00 92,10 74,00 72,00 77,00 90,50 72,00 80,00 18,30 76,00 92,70 87,00 88,00 88,50 16,00 84,00 152,00 91,30 90,00 80,00 80,00 70,00 98,00 115,00 55C, pH 6,0, 60 50C, pH 5,0, tampo 60C, pH 6,0, 10 minutos, l=540 nm, citrato-sdio, minutos, concentrao tampo fosfato 50 concentrao dos ons dos ons 1 mM. mM, concentrao 10 mM. dos ons 1 mM. Beg et al., 2000 Nascimento et al., 2002 S-Pereira et al., 2002

* Os ons testados eram cloretos ou sulfatos.

Continuao da Tabela 2.4.

Organismo Controle kDa Fe3+ Na+ Mn2+ Hg2+ Ca2+ Cr3+ Co2+ Cd2+ Cu2+ K+ Ni2+ Zn2+ Ba2+ Mg2+ EDTA Condies Referncia Bacillus circulans AB 16 Xyl A Xyl B 72,16 IU/mL 33,95 IU/mL 83,28 94,28 7,60 15,90 85,00 71,60 96,64 107,39 106,15 92,40 82,83 67,61 71,57 87,75 95,10 95,38 -/ 65C, pH 7,0, 10 minutos, l=550 nm, tampo fosfato 50 mM, concentrao dos ons 1 mM. Dhillon et al., 2000 Aspergillus caespitosus Xyl I 55,20 U/mg 27,00 72,10 0,00 28,60 90,90 14,10 29,80 51,50 81,80 98,00 Xyl II 133,40 IU/mg 17,70 81,00 11,30 91,30 103,00 75,70 89,50 89,00 93,00 99,00 Thermomyces lanuginosus IOC-4145s 3 mM 96,0001 110,0013 95,0005 113,0002 95,0015 98,0006 106,0004 5 mM 78,0002 113,0003 89,0004 96,0005 90,0003 88,0003 74,0008 -

55C, pH 6,5, tampo MES 100 mM, concentrao dos ons 1 mM. Sandrim et al., 2005.

75C, pH 6,0, 3 minutos, l=540 nm, ons 3 e 5 mM. Damaso et al., 2002

* Os ons testados eram cloretos ou sulfatos.

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A fim de avaliar a termoestabilidade da xilanase produzida pela linhagem SSBP de Thermomyces lanuginosus, Singh et al. (2000), compararam com outras oito linhagens diferentes. A linhagem SSBP permaneceu com 38% da atividade, a 100C, depois de incubada durante 30 minutos, enquanto a linhagem ATCC 16455, ficou com10% de atividade remanescente. O tempo de meia-vida, em pH 6,5, para as linhagens apresentado na Tabela 2.5. O sorbitol e o glicerol foram testados em concentraes variando entre 10 e 50%, para aumentar a termoestabilidade da xilanase da linhagem T. lanuginosus aps 6 horas de incubao a 70C. Verificaram que com 50% de sorbitol a enzima manteve 100% de atividade remanescente enquanto com glicerol foi 90%. Sem a adio destes poliis a enzima ficou com 50%. Tabela 2.5. Tempo de meia-vida (t1/2) da b-xilanase da linhagem SSBP de T. lanuginosus em diferentes valores de pH. Linhagem SSBP T. lanuginosus 60C 65C 70C 75C 80C 85C 90C Ea (kJ/mol) pH 6,50 337 257 157 95 47 5,00 113,00 20,00 11,50 5,00 2,10 2,30 1,10 83,52 6,50 Estvel Estvel 341,00 250,30 180,00 100,00 45,00 102,33 8,00 t1/2 (min) Estvel Estvel 170,20 130,80 90,10 73,20 25,00 99,25 9,00 Estvel Estvel 140,00 110,00 81,00 49,00 45,00 49,20 12,00 45,00 25,00 15,00 12,00 10,50 6,50 5,50 47,34

FONTE: SINGH et al., 2000.

Zhi et al. (2007) investigaram o efeito da adio de surfactante (dioctila sulfosuccinato de sdio); carboidratos (glicose, frutose, galactose, trealose, entre outros) e poliol (glicerina, polietileno glicol PEG200), em tampo citrato 0,05 M, pH 5,0, na atividade e estabilidade trmica de cloroperoxidase (CPO) quando submetidos incubao a 25, 40, 50 e 60C. Observaram que a 25C, a estabilidade aumentou com o aumentou da concentrao dos estabilizantes, depois de longo perodo de incubao (432 horas = 7,2 dias), entretanto a CPO foi quase destruda na presena de glicose 0,01 M e xilose 0,05 M, depois de 9 horas de incubao. A 40C, a atividade praticamente perdida na ausncia de aditivos depois de 90 horas, porm com PEG200, 88,5% da atividade permanece preservada aps 329 horas de incubao. A atividade da CPO, em tampo puro, foi praticamente perdida a 50C,

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nas primeiras 10 horas de incubao. A glicose, frutose e xilose no preservaram a enzima da desnaturao trmica. O PEG200 e glicerina, mantiveram aproximadamente 30% da atividade remanescente em 50 horas para as concentraes testadas (0,01; 0,05; 0,1 e 0,2 M) e manteve 13% depois de 192 horas de incubao. A 60C, a enzima perdeu completamente a atividade, na ausncia de aditivos, em 50 minutos. Concluram que o uso de aditivos possibilita o uso da CPO em processos industriais com condies operacionais extremas. Xilanase de Thermomonospora sp. com 125 IU/mL de atividade foi produzida em culturas agitadas, aps 96 horas de incubao a 50C e pH 9,0. As condies timas de temperatura e pH foram determinadas a 70C e 7,0, respectivamente. O tempo de meia-vida a 60C foi 8 horas; 70C, 4 horas e a 80C somente 9 minutos. Para melhorar a estabilidade a 80C, foram adicionados poliis, na proporo: nmero de grupos hidroxila por molcula de poliol. A adio de alanina (0,5 M), cistena (10 mM), b-mercaptoetanol (10 mM) e Tween 80 (0,1 %) no impediram a perda de atividade a 80C, bem como a adio dos ons, na concentrao final de 10 mM, CoCl2, CaCl2, KCl e NaCl. O sorbitol manteve a proteo mxima na concentrao de 4 M. A adio de 2 M de glicina soluo de xilanase a 80C aumentou o tempo de meia-vida de 8 para 22 minutos. Portanto o efeito termoestabilizante do poliol foi proporcional ao tamanho molecular, ou seja, pode ser correlacionado ao nmero de grupos hidroxila por molcula de poliol. Na cultura depois de filtrada, foi identificada a presena de celulase (23 IU/mL), manase (1 IU/mL) e b-xilosidase (0,1 IU/mL) (GEORGE et al., 2001). Lemos et al. (2000) efetuaram o estudo da endoxilanase (30 IU/mL) e b-xilosidase (1,3 IU/mL) produzida, extracelularmente, pelo Aspergillus awamori. Ainda avaliaram o efeito de poliis na estabilidade da endoxilanase. Verificaram que todos os poliis testados apresentaram efeito positivo sobre a desnaturao trmica, sendo que o sorbitol e o xilitol, ambos com concentrao final de 2 M, manteve 100% da atividade da endoxilanase depois de 270 minutos de pr-incubao a 50C, sendo a atividade residual determinada a 60C. Com base nestes resultados, o caldo bruto foi incubado, na presena de xilitol e sorbitol, 2 M, durante 300 minutos a 52C, no qual a atividade, para ambos os estabilizantes, aps este tempo de incubao se mantiveram aproximadamente 60%, enquanto o controle foi inferior a 20%. No teste de estocagem a baixa temperatura (-4C) durante 165 dias, observaram que a atividade da endoxilanase permaneceu estvel (100%) enquanto a b-xilosidase sofreu reduo na atividade de 20% durante os primeiros 15 dias, e no final (165 dias) manteve 75% da atividade inicial.

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Cobos e Estrada (2003) relatam o efeito de poliis na termoestabilidade e atividade da xilanase de Trichoderma reesei QM 9414, com massa molecular de 20 kDa, produzidas pela induo com palha de trigo, como nica fonte de carbono. Determinaram a estabilidade trmica da xilanase alcalina, purificada, com e sem a adio de poliis. Observaram que a energia de ativao da inativao da xilanase foi 311 kJ/mol. A 60C o tempo de meia-vida sem poliol foi de 2,7 minutos e na presena de 2M de eritritol, xilitol e sorbitol verificaram que o tempo aumentou 8, 32 e 112 vezes, respectivamente. A xilanase apresentou 80% de atividade residual aps 19 horas de incubao a 60C. Concluram que os poliis estabilizam a xilanase considerando os seguintes aspectos: a estabilizao aumenta parabolicamente com o nmero de hidrolixas do poliol bem como a concentrao do poliol correspondente aumentado. A partir do levantamento de trabalhos relevantes na aplicao de enzimas em processos industriais, especificamente txteis, pde-se verificar uma grande lacuna na determinao das melhores condies operacionais da ao combinada de enzimas no prtratamento de tecidos de algodo biopurga. A relevncia dos objetivos do presente trabalho pode ser identificada nos desafios de contribuir na determinao da viabilidade tcnica da utilizao de xilanase, obtida a partir da fermentao da xilana de btula, em caldo bruto, na biopurga de tecidos de malha de algodo, rota que tradicionalmente empregada na indstria de celulose e papel; na determinao das melhores condies operacionais do processo de purga enzimtica utilizando enzimas individuais e de pool enzimtico comerciais que contm xilanase, do estudo de diferentes estabilizantes para prolongar a atividade enzimtica da xilanase visando aumentar a eficincia da biopurga e o reuso do banho enzimtico; e da comprovao do efeito da xilanase de forma individualizada, na biopurga. No prximo captulo sero apresentadas e discutidas as metodologias utilizadas no presente trabalho.

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CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS

Neste captulo ser apresentada a descrio dos procedimentos experimentais utilizados nos processos de purga alcalina e enzimtica, e de tingimento, incluindo os reagentes e equipamentos utilizados. Estes experimentos foram realizados no Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina, no Laboratrio de Transferncia de Massa (Labmassa) e no SENAI Brusque. Foram realizados experimentos para avaliar os efeitos da concentrao enzimtica e tempo de processo, sobre a qualidade final do substrato txtil.

3.1. MATERIAL

3.1.1. Enzimas

Foi utilizada a preparao comercial, gentilmente doada pela Novozymes, Pulpzyme HC com atividade xilanoltica e a xilanase em caldo bruto fermentativo, centrifugado, de Bacillus pumilus CBMAI 0008 (Duarte et al., 2000), do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas CPQBA da UNICAMP. A descrio do mtodo de cultivo para obteno da enzima est descrito no Apndice B. A preparao comercial Pulpzyme HC obtida do Bacillus sp. geneticamente modificado. A Tabela 3.1 apresenta as caractersticas das enzimas utilizadas neste trabalho.

3.1.2. Substrato Txtil

Foram utilizados tecidos de malha de fio cardado 100% algodo, com ttulo do fio da malha 30/1. As amostras de tecidos de malha utilizados como corpos de prova nos ensaios tinham aproximadamente 10 g e foram provenientes de um nico lote, doados pelo SENAI Blumenau/SC, garantindo a padronizao dos corpos de prova, quanto ao tipo de fio, gramatura e substncias hidrofbicas. O grau de branco, hidrofilidade e perda de massa dos

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corpos de prova dos ensaios de purga alcalina foram utilizados como referncia para os corpos de prova da purga enzimtica.

Tabela 3.1. Caractersticas das enzimas utilizadas no trabalho.

Enzima Origem/Fonte pH timo Temperatura tima (C) Componentes presentes Enzyme Comission (E.C.)* Caldo bruto centrifugado Bacillus pumilus CBMAI 0008 9,0 (7,0-8,5) 60 Endo-b-(1,4)-xilanase Pulpzyme HC Bacillus sp. 7,0-9,0 50-75 Multicomponente com atividade principal endo-b-(1,4)-xilanase.

EC 3.2.1.8 criada em 1961 Endo-b-(1,4)-xilanase, b-(1,4)-xilana 4-xilanohidrolase; endo-(1,4)xilanase; xilanase; b-(1,4)-xilanase; endo-(1,4)-xilanase; endo-b(1,4)-xilanase; endo-b-(1,4)-D-xilanase; b-(1,4)-xilana xilanohidrolase; b-xilanase; b-(1,4)-xilana xilanohidrolase; endo-b(1,4)-xilanase; b-D-xilanase b-(1,4)-D-xilana xilanohidrolase Endohidrlise de ligaes b-(1,4)-D-xilosdicas em xilanase

Outros nomes*

Nome sistemtico* Reao*

*FONTE: NC-IUBMB, 2006.

3.1.3. Reagentes

Os reagentes utilizados foram cido actico, cido clordrico, cido 3,5 dinitrosalislico (DNS), lcool etlico, bicarbonato de sdio, carbonato de sdio,

carboximetilcelulose, corante Comassie Brilliant Blue G-250 e CBR-250, fenol, fosfato de sdio dibsico, fosfato de sdio monobsico, glicerol, glicina, hidrxido de sdio, metabissulfito de sdio, metanol, sorbitol, soro albumina bovina (BSA), tartarato duplo de sdio e potssio, xilana de btula (birchwood), xilitol, xilose. Os reagentes utilizados foram de grau analtico P.A. e usados sem prvios tratamentos. Os produtos qumicos utilizados nos processos de purga convencional e enzimtica esto descritos na Tabela 3.2.

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Tabela 3.2. Caractersticas dos produtos qumicos utilizados nos processos de purga convencional e enzimtica.
Produto* Aplicao Carter qumico Composto de tensoativos; contm solvente orgnico Composto base de lcoois alifticos etoxilados Carter Quantidade inico sugerida No inico 1 a 2 g/L

Agente emulsificante para parafina, Fongralen* leos vegetais e minerais para o M lquido tratamento prvio de materiais txteis. Sandozin* SNP.BR lquido Agente umectante, de lavagem, isenta de alquilfenol etoxilado (APEO), silicones e solventes orgnicos, para todos os tipos de fibras txteis. Produto especial de ao polivalente, para o tratamento de materiais txteis com propriedade desmineralizante, dispersante, sequestrante, estabilizadora, anticataltica para perxido.

No inico

0,5 a 5,0 mL/L 1 a 5 g/L

Sirrix CV lquido

Mistura sinrgica Anini de sais orgnicos e co inorgnicos

1,0 a 5,0 mL/L

* Marca: Clariant

3.1.4. Equipamentos

Foram utilizados, para medir o pH, o pHmetro modelo 400M2, marca Quimis; para pesar os reagentes a balana semi-analtica modelo MARK 500 e a balana analtica modelo AB204-S, marca Mettler Toledo; para os ensaios colorimtricos o espectrofotmetro modelo UV mini 1240, marca Shimadzu; espectrofotmetro de remisso; para os ensaios de biopurga, alvejamento e tingimento, o aparelho de laboratrio para tingimento at 135C ALT-B 9306, com microprocessador Datex Pico II; marca Mathis. Para as dosagens de atividade enzimtica foi utilizado o banho termostatizado modelo 550, marca Fisatom; banho termostatizado modelo Dubnoff DI 951, marca Dist. Para a determinao de perda de massa foi utilizada a estufa de circulao de ar MA 035, marca Marconi e para a determinao do grau de branco o espectrofotmetro de re-emisso com lmpada padro, modelo MS-1500 Plus, marca Macbeth.

3.2. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

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3.2.1. Caracterizao dos Corpos de Prova

Os corpos de prova (amostras de malha de fio cardado 100% algodo) sem tratamento e tratados, com o processo enzimtico e alcalino, foram caracterizadas quanto hidrofilidade (absoro de gua), brancura e perda de massa. Todos os corpos de prova possuiam aproximadamente 10 g devido a relao de banho (1:10) utilizada nos ensaios.

3.2.1.1. Grau de Branco ou Grau de Alvura

O grau de branco foi determinado nos corpos de prova submetidos ao processo de biopurga e purga alcalina, com um espectrofotmetro de re-emisso com lmpada padro, modelo MS-1500 Plus, marca Macbeth, usando cermica branca como padro de calibrao.

3.2.1.2. Hidrofilidade

Foi utilizado o mtodo de visualizao rpida, adaptado da norma NBR 13.000 (ABNT/NBR, 13000). Consistiu na fixao do tecido em um bastidor de bordado e o gotejamento de uma gota de gua destilada (202C), a 40 mm da superfcie do tecido. O tempo de formao da gota deve ser de 5 segundos. O cronmetro foi acionado no momento em que a gota tocou o tecido e parado quando a gua foi completamente absorvida sobre a superfcie do tecido. O resultado foi a mdia de 5 ensaios consecutivos, tanto nas laterais como no centro do tecido.

3.2.1.3. Perda de Massa

A perda de massa foi calculada pelas massas dos corpos de prova antes e depois dos tratamentos, com purga enzimtica ou alcalina, aps secagem em estufa de ventilao de ar a 105C, durante 4 horas e resfriamento em dessecador. Este parmetro tambm foi utilizado para o estudo da taxa de hidrlise enzimtica. A equao (3.1) foi utilizada para o clculo da perda de massa percentual (ALY et al., 2004):
(m1 - m 2 ) perda de massa (%) = * 100 m1

(3.1)

40

onde: m1 = massa do corpo de prova antes do tratamento; m2 = massa do corpo de prova aps o tratamento.

3.2.1.4. Reprodutibilidade

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram reprodutveis.

3.2.2. Caracterizao das Preparaes Enzimticas

3.2.2.1. Determinao das Protenas

A quantidade de protenas presente nas amostras das preparaes enzimticas utilizadas foram dosadas pelo mtodo de Bradford (Bradford, 1976), baseado na ligao do corante Comassie Brilliant Blue G-250 protena. A soro albumina bovina (BSA) foi usada como padro para preparar a curva de calibrao nas concentraes de 0-1,0 mg/mL.

3.2.2.2. Determinao da Atividade Enzimtica

3.2.2.2.1. Determinao da curva padro de glicose e de xilose

A curva padro para a determinao da atividade da celulase foi construda com soluo de glicose, nas concentraes de 0,5 a 2,0 mM/mL e para a xilanase a curva padro foi construda com soluo de xilose, variando as concentraes de 0,5 a 10 mM/mL. Em ambas as curvas foram realizadas a adio sequencial de soluo tampo, soluo estoque de glicose ou xilose e soluo de DNS. Os tubos foram agitados, aquecidos durante 5 minutos a 100C, resfriados em banho de gelo. Aps o resfriamento foi realizada a leitura da absorbncia a 540 nm.

3.2.2.2.2. Determinao da atividade xilanoltica

A determinao da atividade xilanoltica foi realizada pela quantificao de acares

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redutores totais (Miller, 1959), usando xilose como padro, liberados a partir de xilana de btula (birchwood), segundo o mtodo de BAILEY et al. (1992). O mtodo consistiu na princubao, durante 5 minutos, de 0,9 mL de soluo de xilana 1%, dissolvida em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M a 50C. Aps esse perodo adicionou-se 0,1 mL de enzima e essa mistura foi mantida sob incubao durante 5 minutos. Em seguida foi adicionada a cada mistura reacional 1,5 mL de soluo de DNS e os tubos foram fervidos durante 5 minutos. A seguir os tubos foram colocados em banho de gelo. As leituras espectrofotomtricas no espectrofotmetro modelo UV mini 1240, marca Shimadzu foram realizadas a 540 nm, utilizando-se uma curva padro de xilose. Em cada ensaio de determinao de atividade, o espectrofotmetro, foi calibrado, com o denominado branco do aparelho, que consistiu na substituio da soluo de enzima pelo tampo. Para determinar a presena de acares na soluo de enzima, denominada branco de enzima, foi substitudo a soluo de xilana 1% por soluo tampo. Uma unidade de atividade enzimtica (U) foi definida como a quantidade da enzima, capaz de hidrolisar a liberao de 1 mmol de acares redutores (xilosacardeos) por minuto, expresso por mmol de xilose/(mL.min). A atividade xilanoltica foi determinada pela equao (3.2), expressa em U/mL, a 50C.
U mmol C * D * Vt mL = mL * min = Ve * t

(3.2)

onde: C = concentrao de xilose liberada [mmol/mL]; D = diluio utilizada; Ve = volume da soluo de enzima [mL]; Vt = volume total da soluo [mL]; t = tempo de incubao ou reao [minutos].

3.2.2.2.3. Determinao da atividade celuloltica

A degradao do polmero de celulose pode ser realizada pela ao de uma das enzimas multicomponentes (EG, CBH e bG) que atuam sinergicamente. A determinao da atividade enzimtica da enzima celulase foi realizada para a atividade celuloltica EG pela quantificao dos acares redutores segundo Miller (1959), com glicose como padro. Para eliminar os interferentes gerados durante a reao com o substrato, foram realizadas

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simultaneamente provas em branco. A atividade celuloltica da endo -(1,4)-glucanase ou carboximetilcelulase CMCase Cx foi determinada, utilizando soluo de carboximetilcelulose 2% (massa/volume), em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, segundo o mtodo de Ghose (1987). A soluo de substrato foi pr-aquecida durante 5 minutos. A mistura da reao foi composta de 0,9 mL de substrato e 0,1 mL de enzima. Incubou-se a mistura, sob agitao, a 501C, durante 30 minutos. Aps o tempo de incubao, adicionou-se 1,5 mL do reagente DNS e submeteu-se temperatura de ebulio, durante 5 minutos. A seguir os tubos foram colocados em banho de gelo. Aps o resfriamento foram adicionados 2 mL de gua destilada e realizada a leitura de absorbncia no comprimento de onda 540 nm, usando glicose como padro. Uma unidade de atividade enzimtica (U) foi definida como a quantidade da enzima, capaz de hidrolisar a liberao de 1 mmol de acares redutores (glicosardeos) por minuto, expresso por mmol de glicose/(mL.min). A atividade celuloltica foi determinada pela equao (3.3), expressa em U/mL, nas condies experimentais, a 50C.
U mmol Vt * C * D mL = mL * min = Ve * t

(3.3)

onde: C = concentrao de glicose liberada [mmol/mL]; D = diluio utilizada; Ve = volume de soluo de enzima [mL]; Vt = volume total da soluo [mL]; t = tempo de incubao ou reao [minutos].

3.2.2.3. SDS-PAGE

Foi realizada a eletroforese contnua desnaturante em gel de poliacrilamida (SDSPAGE), usando o gel de corrida a 10% e o gel de concentrao 5%, conforme Laemmli (1970). O padro de massa molecular usado como marcador foi 6,5 a 200 kDa (SDS-PAGE SERVA) e as bandas foram evidenciadas com coomassie brilliant blue. O contedo de protenas foi determinado pelo mtodo de Bradford usando soro albumina bovina (BSA), frao V (Sigma, USA) como padro.

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3.3. PROPRIEDADES CATALTICAS DAS PREPARAES ENZIMTICAS

O caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 foi caracterizado quanto atividade em funo da temperatura. A estabilidade trmica do caldo bruto, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, foi determinado no mesmo intervalo de temperatura que os ensaios de atividade em funo da temperatura. Foram realizados testes para avaliao do efeito de estabilizantes, ons e agentes tensoativos, sobre a atividade enzimtica remanescente. Aps a estabilizao da enzima foram realizados ensaios cinticos nas malhas 100% algodo. Para a Pulpzyme HC, foram realizados ensaios de estabilidade e os ensaios cinticos como padro uma vez que essa enzima preparao enzimtica.

3.3.1. Influncia da Temperatura na Atividade Enzimtica

A influncia da temperatura sobre a atividade enzimtica das enzimas estudadas (caldo bruto e preparao enzimtica) foi avaliada no intervalo de 40-90C, no pH 8,0 (mistura de solues de carbonato de sdio e bicarbonato de sdio, 0,1 M, aqui denominado soluo tampo carbonato-bicarbonato) e 9,0 (soluo tampo glicina-NaOH, 0,1 M), conforme metodologia descrita no item 3.2.2.2. O caldo bruto foi caracterizado por Duarte et al. (2000) como alcalina (pH 8-11), com atividade tima em pH 9,0. Deve-se considerar que o uso de pH superior a este, em processos industriais, requereria quantidade elevada de agente alcalino como soda ou barrilha.

3.3.2. Desnaturao Enzimtica

A velocidade de uma reao pode ser aumentada de duas formas: com o aumento da temperatura ou diminuio da energia de ativao. Entretanto, no caso das enzimas, que so constitudas de protenas, o aumento de temperatura promove a desnaturao trmica, ocasionando a queda abrupta da velocidade de reao, quando temperaturas acima da temperatura de desnaturao so empregadas (VOET e VOET, 2006). Com os dados de atividade em funo da temperatura possvel determinar a energia de ativao da reao enzimtica, pela modificao na equao de Arrhenius, equao (3.3),

44

onde se substitui a velocidade inicial da reao (v) pela atividade especfica da enzima (Ae), equao (3.4a), a seguir grafica-se ln (Ae) em funo de (1/T).

v=k e

Ea - RT

(3.4)

Ea 1 ln Ae = ln k - R T

(3.4a)

onde: Ae = atividade enzimtica da enzima [U/min]; Ea = energia de ativao [cal/mol]; k = constante de Arrhenius [mmol/min] ou [U/min]; R = constante da lei dos gases = 1,987 [cal/mol K]; T = temperatura absoluta [K]. v = velocidade inicial da reao [mmol/min]; A estabilidade trmica das enzimas foi testada em soluo tampo fosfato pH 8,0 e soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para avaliar a estabilidade trmica das enzimas, pela constante de desnaturao, energia de ativao e tempo de meia-vida (t1/2, min). Conforme citado por Voet (2006), utilizou-se para determinar a constante de desativao (kd, h-1) das enzimas, a equao 3.5:

ln Atresidual = ln Atinicial - k d t
onde:

(3.5)

Atresidual = atividade enzimtica remanescente aps o tratamento trmico durante um perodo de incubao [U/mL]; Atinicial = atividade enzimtica inicial [U/mL]; t = tempo de incubao [min]. O tempo de meia-vida (t1/2) corresponde ao tempo necessrio para que ocorra a reduo de 50% da atividade inicial da enzima, e pode ser calculado pela equao (3.6), onde kd a constante de desativao trmica ou desnaturao da enzima, em uma determinada temperatura expressa em minuto-1.
t1 =
2

0,693 kd

(3.6)

45

3.3.3. Efeito do Tipo de Tampo e Estabilizantes

Para melhorar a estabilidade trmica do caldo bruto da xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, antes de utiliz-lo em diferentes condies de ajuste de pH, foi adicionado a este os seguintes poliis: glicerol (marca Amresco), sorbitol e xilitol (marca Acros Organics). Os ensaios foram realizados conforme o planejamento experimental descrito no item 3.4. A mistura de 1 mL de caldo bruto centrifugado e 3 mL de estabilizante diludo nas solues tampo glicina-NaOH, 0,1 M, mistura carbonato-bicarbonato de sdio, 0,1 M, e NaOH, com pH ajustado em 9,00, e gua destilada, com pH aproximadamente 6,00, foi submetida, na ausncia de substrato, a 50C durante 60 minutos. Aps serem retiradas do banho as amostras foram resfriadas em banho de gelo e armazenadas sob refrigerao para posterior determinao da atividade remanescente, conforme o mtodo descrito no item 3.2.2.2.2. A concentrao de poliis utilizada foi 1 M e a concentrao desses no foi corrigida para o ensaio de atividade, pois o objetivo da sua incorporao era conferir estabilidade durante o perodo de incubao. Este mesmo procedimento foi utilizado para avaliar a influncia da concentrao de estabilizante utilizado (0,5, 1,0 e 2,0 M) e tambm para a determinao das condies timas para aplicao na biopurga. O planejamento experimental utilizado para cada grupo de parmetros estudados apresentado no planejamento experimental descrito no item 3.4.

3.3.4. Efeito de Inibio e Ativao na Atividade Enzimtica

Foram verificadas, na literatura, vrias formas para avaliar a influncia de inibio ou ativao pela adio de aditivos (ons, agentes qumicos e sequestrante) sobre a atividade da enzima: numa os aditivos so adicionados ao caldo enzimtico e ento se procede determinao da atividade residual sob as condies experimentais (Christakopoulos et al., 1999), em outra enzima com o aditivo submetido pr-incubao por um dado perodo, na ausncia ou presena de substrato, posteriormente determina-se a atividade remanescente, na mesma concentrao de ons, neste caso, o objetivo tambm avaliar a estabilidade da enzima (Burhan et al., 2003; Ryan et al., 2003; Heck et al., 2006); ainda verificou-se uma na qual os ons so adicionados enzima, junto ao substrato, gerando concentrao final desse on na reao, por exemplo, 3, 5 ou 10 mM (S-PEREIRA et al., 2002; NASCIMENTO et al., 2002).

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Assim, para testar o efeito da concentrao de ons sobre a atividade da enzima, realizou-se a adio dos ons enzima, e mediu-se a atividade com a correo da concentrao de ons, para obter a concentrao final dos ons na reao enzimtica, 5 mM (0,005 M). A determinao da atividade foi realizada conforme o mtodo descrito no item 3.2.2.2.2.

3.3.5. Efeito de Agentes Tensoativos

Para avaliar a estabilidade do caldo bruto na presena dos agentes tensoativos, umectante e emulsificante, utilizado na purga, enzimtica e alcalina, da malha 100% algodo, foram incubados 75 U de caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, com os agentes umectantes segundo as concentraes indicadas no planejamento experimental, totalizando 10 mL de soluo final, em funo da relao de banho (RB) 1:10 10 mL de banho para cada grama de tecido. Foi adicionada uma esfera de ao em cada tubo (20 mL) e esses foram submetidos a 40 rpm de agitao, 50C durante 60 minutos, na presena de substrato xilana birchwood 1%, usado como substrato modelo. O uso de substrato modelo pode ser similar ao efeito esperado no substrato desejado, no caso desse estudo os fragmentos de capulho e ramos, conhecidos como piolhos (Csiszr et al., 2006). Aps serem retiradas do banho as amostras foram resfriadas em banho de gelo e armazenadas sob refrigerao para posterior determinao da atividade remanescente conforme o mtodo descrito no item 3.2.2.2.2. Para a medio de atividade, foi realizada a correo da concentrao dos tensoativos, conforme indicado no planejamento experimental apresentado no item 3.4. Os tubos foram submetidos de forma independente, em triplicata, com triplicata de branco.

3.4. PLANEJAMENTO ESTATSTICO

A Tabela 3.3 apresenta os nveis dos parmetros estudados no planejamento experimental para avaliar a melhor combinao entre soluo tampo e estabilizante sobre a estabilidade do caldo bruto centrifugado e a Tabela 3.4 apresenta o planejamento experimental. Para comprovar os efeitos do pH e composio da soluo tampo sobre a

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atividade enzimtica, foi testada gua destilada sem correo de pH e as possveis substncias que poderiam ser utilizadas pela indstria txtil para a alcalinizao, como NaOH e barrilha. Portanto, foi testado o NaOH e para reproduzir a barrilha foi usado uma mistura entre carbonato-bicarbonato de sdio. A soluo tampo glicina-NaOH foi usada no planejamento como condio ideal.

Tabela 3.3. Nveis dos parmetros usados para a determinao da melhor combinao tipo de soluo tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. Fator Soluo tampo 1 gua 2 Carbonato-Bicarbonato de Sdiob,c 3 Glicina-NaOHb,c 4 NaOHb pH 6,05; b pH 9,0, c 0,1 M. Fator A B C D Estabilizante (1 M) Glicerol Sorbitol Xilitol Ausente

Tabela 3.4. Planejamento fatorial 24, com duas replicatas, para a determinao da melhor combinao tipo de soluo tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) para o caldo bruto centrifugado. Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Combinao 3D 4B 4B 2C 1C 1A 2A 2B 3C 3B 2D 3A 2A 4A 2B 1A Ensaio 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Combinao 1B 2B 1C 4D 4C 1A 3A 1B 2D 4D 3C 3D 4C 3B 2C 3B Ensaio 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Combinao 2A 1D 4D 4A 4B 4A 3C 1C 1B 2C 1D 1D 2D 3D 4C 3A

Para avaliar a influncia dos agentes tensoativos utilizados na purga, umectante e emulsificante, sobre a atividade da enzima, foram realizados ensaios segundo os nveis

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apresentados na Tabela 3.5 e o planejamento experimental proposto na Tabela 3.6. Os valores de concentrao de agente emulsificante e umectante, nos nveis estudados no planejamento experimental, correspondem ao valor mnimo (-1) e mximo (+1) sugerido pelo fabricante. Os nveis estudados para determinar as condies timas para a aplicao do caldo estabilizado na biopurga, usando substrato modelo (xilana birchwood), so apresentados na Tabela 3.7 (caso 1 e caso 2) e o planejamento experimental proposto para essas condies so apresentadas na Tabela 3.8. Essas condies foram definidas aps os ensaios de biopurga preliminares, quando a enzima no estava estabilizada, e aps a anlise estatstica dos ensaios de estabilidade do caldo bruto na presena de tensoativos.

Tabela 3.5. Nveis dos parmetros estudados para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Fator 1 2 3 Concentrao Tempo [min] Agente emulsificante [g/L] Agente umectante [g/L] -1 30,0 1,0 1,0 0 45,0 1,5 3,0 1 60,0 2,0 5,0

Tabela 3.6. Planejamento experimental 33 utilizado para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 +1 0 -1 -1 0 0 Fator 2 -1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 -1 +1 0 0 3 -1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 0 +1 +1 0 0 Ensaio 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 Fator 2 +1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 3 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 -

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Tabela 3.7. Nveis dos parmetros estudados na determinao das condies timas sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para aplicao na biopurga caso 1 e 2. Fator 1 2 3 4 Nvel Tempo [minutos] Sorbitol [M] Tipo de agitao Agente umectante [g/L] -1 40,0 0,5 Com 3,0 Caso 1 0 50,0 1 60,0 1,0 Sem 5,0 -1 40,0 1,0 Com 3,0 Caso 2 0 50,0 1 60,0 2,0 Sem 5,0

Tabela 3.8. Planejamento no planejamento fatorial completo de 4 fatores, misto de 2 e 3 nveis, utilizado para determinar as condies timas sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para aplicao na biopurga. Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Fator 1 0 -1 +1 -1 0 +1 0 -1 +1 +1 +1 +1 -1 +1 0 0 0 +1 -1 -1 -1 0 0 +1 2 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 3 +1 -1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 +1 4 -1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 Ensaio 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Fator 1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 0 -1 -1 +1 +1 0 +1 -1 0 +1 0 0 0 -1 -1 0 -1 0 2 -1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 3 -1 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 4 +1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 +1 +1 -1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

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3.5. PROCESSOS UTILIZADOS

A partir dos resultados obtidos, na literatura, em experincias prvias e nos planejamentos experimentais, para melhor condio de estabilidade e atividade na presena dos agentes umectante e emulsificante, foi realizada a purga enzimtica usando 75 U/g de substrato como concentrao de enzima. A seguir so apresentados os processos de purga, alcalina e enzimtica, utilizadas nos corpos de prova, malhas 100% algodo (CO). Os ensaios de purga (alcalina e enzimtica) foram desenvolvidos no aparelho de laboratrio para tingimento at 135C ALT-B 9306, com microprocessador Datex Pico II, marca Mathis.

3.5.1. Purga Enzimtica

Considerando a similaridade dos tratamentos enzimticos, apesar da peculiaridade entre as fibras de algodo e linho, foram considerados os seguintes procedimentos para fibra de algodo, com base na observao de Ossola e Galante (2004), para a fibra de linho: preparao (pr-lavagem) dos tecidos para umedecer completamente o material e remover a hidrofobicidade. Para facilitar a interao, fibra/enzima antes do processo enzimtico foi realizada uma etapa de preparao, conforme experimentos anteriormente realizados por Hartzel, 1998; Hsieh e Cram, 1999; Buschle-Diller, 2001b; Lenting et al., 2002 e Ossola e Galante, 2004, a pr-mistura da soluo tampo, umectante e enzima antes da introduo dentro do equipamento para ter uma distribuio homognea e evitar a absoro irregular da enzima na fibra. Os corpos de prova foram submetidos a dois tipos de ensaios: os preliminares, na qual o caldo bruto no estava estabilizado e os ensaios com o caldo bruto em condies de estabilidade. Os ensaios preliminares foram realizados segundo dois processos distintos: A) contendo etapa de umectao inicial seguida de lavao antes da aplicao enzimtica, B) all in, na qual todos os agentes qumicos foram adicionados no mesmo banho que a enzima. O processo enzimtico A, com umectao inicial, foi realizado com adio de umectante na etapa do banho enzimtico. Os experimentos foram realizados com controle (tampo e agentes qumicos), para avaliar o efeito da enzima. Os grficos representativos dos processos A e B so mostrados nas Figuras 3.1 e 3.2, respectivamente. Aps os ensaios realizados com o caldo bruto centrifugado para obter as condies ideais para estabilizao, tempo e agentes tensoativos, foi empregada a biopurga com preparao.

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As quantidades dos produtos utilizados, nos ensaios preliminares, nas etapas da biopurga para tecidos em malha 100% algodo, com relao de banho (RB) de 1:10, 100 U de atividade de xilanase/g de substrato, 7 esferas de ao inox, de 6 mm de dimetro, para auxiliar a agitao mecnica a 40 rpm. Nas etapas do processo que continham a enzima foi utilizada soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, conforme procedimento apresentado na Tabela 3.9. Nas outras etapas do processo, foi utilizada gua destilada. Os agentes qumicos utilizados na purga enzimtica foram: sequestrante: Sirrix CV, umectante: Sandozin* SNP.BR e emulsificante: Fongralen* M, da marca Clariant. A Figura 3.1 mostra o perfil do processo de biopurga com etapas de preparao e lavao antes da purga enzimtica, visando influncia da acessibilidade das enzimas ao substrato, bem como a remoo dos possveis metais que poderiam interferir no tratamento enzimtico. Na Figura 3.2 apresentado o perfil do processo all in. Nos ensaios preliminares, na etapa de preparao foi utilizado umectante e sequestrante, a 80C durante 15 minutos, seguida por uma etapa de lavao, somente com gua, a 60C durante 10 minutos. Antes da introduo do substrato aos canecos, 1 g/L de emulsificante e foi misturado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M a 100 U de enzima, para garantir a homogeneidade da enzima e consequentemente sua atuao uniforme nas fibras. Utilizou-se nos testes as temperaturas de 50C e 60C durante 30 minutos. A inativao da enzima foi realizada pela elevao da temperatura do banho para 90C, durante 15 minutos. A seguir, foram realizadas duas lavaes, de 10 minutos: uma a 70C e outra a temperatura ambiente. Antes e aps o processo de biopurga os corpos de prova so submetidos secagem em estufa de ar forado a 105C durante 4 horas, para determinao de perda de massa. Os valores dos parmetros em cada uma das etapas do processo de biopurga apresentados na Figura 3.1 e Figura 3.2 esto definidos na Tabela 3.10. Nos ensaios com o caldo bruto estabilizado, foram seguidas as mesmas regras com as seguintes excees de condies: concentrao de umectante (3 e 5 g/L), concentrao de enzima (75 U/g substrato), presena de 1,0 M de sorbitol (estabilizante), no banho, temperatura de incubao 50C, e tempo de incubao igual a 60 minutos. A Figura 3.2 mostra o processo all in no qual os produtos qumicos e enzima so todos adicionados no incio do processo, ou seja, no existe etapa de umectao, pois o emulsificante, umectante e enzima so adicionados juntos. Neste perfil all in, foram mantidas as mesmas condies de tempo e temperatura para purga enzimtica, inativao e lavaes subsequentes, citadas para o perfil apresentado na Figura 3.1. As amostras foram submetidas secagem em estufa com circulao de ar a 105C durante 4 horas.

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Tabela 3.9. Procedimento (receita) utilizado na biopurga de tecidos em malha 100% algodo, pH 9,0, RB 1:10, 7 esferas de ao inox e agitao de 40 rpm. Etapa Purga enzimtica com etapa de umectao Sequestrante (1 mL/L); Umectante (1,0 g/L); gua destilada; T = 80C; t = 15 minutos. Lavao: T = 60C; t = 10 minutos. Emulsificante (1,0 g/L); Umectante (x g/L); x U de xilanase/g de substrato; Soluo tampo glicina-NaOH; T = 50C ou 60C; t = x minutos. Desativao da enzima T= 90C, t = 15 minutos. Lavao: T= 70C; t = 10 minutos. Lavao: T= 25C; t = 10 minutos. Etapa Purga enzimtica all in Umectante (2,0 g/L); Emulsificante (1,0 g/L); 100 U de xilanase/g de substrato; Soluo tampo glicina-NaOH; T = 50C ou 60C; t = 30 minutos.

1 2

1a

3a

1b

Desativao da enzima T= 90C, t = 15 minutos.

3b 4 5

2 3

Lavao: T= 70C; t = 10 minutos. Lavao: T= 25C; t = 10 minutos.

Sequestrante: Sirrix CV; umectante: Sandozin* SNP.BR e emulsificante: Fongralen* M da Clariant. As indicaes de quantidades indicadas com a incgnita x foram alteradas nos ensaios de biopurga para as condies da enzima antes e aps estabilizao.

Figura 3.1. Processo de biopurga com umectao inicial, antes da etapa enzimtica.

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Figura 3.2. Processo de biopurga all in.

3.5.2. Purga Alcalina

A purga alcalina utilizada convencionalmente para a remoo da matria graxa e colorfica das fibras, por isso consta neste trabalho como padro de resposta. O perfil do processo de purga alcalina, para tecidos em malha 100% algodo, com relao de banho (RB) de 1:10 est representado na Figura 3.3 e as condies utilizadas nos patamares so apresentados na Tabela 3.10.

Tabela 3.10. Procedimento (receita) utilizado para purga alcalina de tecidos em malha 100% algodo, RB=1:10. Etapa 1 2 3 4 Produtos e quantidades Sequestrante (1 mL/L); umectante (1,0 g/L); NaOH 50% (4 mL/L); gua destilada; T = 90C; t = 30 minutos. Lavao: T = 70C; t = 10 minutos. Lavao: cido actico (0,5 mL); T = 50C; t = 10 minutos. Lavao: T = 25C; t = 5 minutos.

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Figura 3.3. Perfil do processo de purga alcalina.

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CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. CARACTERIZAO ENZIMTICA

As propriedades das xilanases presentes no caldo bruto centrifugado do Bacillus pumilus CBMAI 0008 e na preparao enzimtica Pulpzyme HC so mostradas na Tabela 4.1. As condies utilizadas para o caldo bruto tambm foram utilizadas para a Pulpzyme HC, uma vez que esta enzima comercial foi empregada como parmetro de comparao para o desempenho do caldo bruto, aps estabilizao, na biopurga.

Tabela 4.1. Propriedades das xilanases presentes no caldo bruto centrifugado do Bacillus pumilus CBMAI 0008 e na preparao enzimtica Pulpzyme HC. Propriedades Protena total (mg) Atividade total (U/mL) Atividade especfica (U/mg) pH timo Temperatura tima (C)
a

Caldo bruto 7,880,68 188,65a 23,94 9,0b 55Ca (60Cb)

Pulpzyme HC ND d 460 /120.000e/1636,67f ND 7,0-8,0c 60-70Cc

determinado pela autora, 55C, pH 9,0; btempo de incubao: 10 minutos (Duarte et al., 2000); cBhardwaj et al., 1996; d40C e pH 6,0 Ossola e Galante, 2004; e50C e pH 7,0 Csiszr et al., 2001; f60C e pH 9,0. ND = No determinada devido a interferentes.

A massa molecular das enzimas determinada pela eletroforese desnaturante SDSPAGE, apresentada na Figura 4.1, onde o caldo bruto centrifugado do Bacillus pumilus CBMAI 0008, foi estimado em 12 kDa. Esse resultado prximo do encontrado por Duarte et al., (1999) na anlise de protenas extracelulares, 15,5 kDa, em gel homogneo com 12% de poliacrilamida. Para a Pulpzyme HC, foram obtidas vrias bandas, sendo uma banda com massa molecular idntico ao do caldo bruto, 12,00 kDa. Para Ossola e Galante (2004), essa mesma preparao, em SDS-PAGE com gel de 11% de poliacrilamida, no mostrou tantas bandas como observadas nesse trabalho.

4.2. ATIVIDADE CELULOLTICA

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As enzimas estudadas, apresentaram pequena atividade endoglucanase, em tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, a 50C, aps 30 minutos de incubao. Foi obtida 0,627 mmol/(mL*min) de atividade endoglucanase para o caldo bruto centrifugado e 0,472 mmol/(mL*min) para a preparao enzimtica Pulpzyme HC.

Figura 4.1. Eletroforese SDS-PAGE do (1) caldo bruto centrifugado de xilanase de Bacillus pumilus CBMAI 0008 e (2) Pulpzyme HC revelado com corante comassie brilliant blue R-250. Padro de peso molecular: a (200,0 kDa), galactosidase Escherichia coli recombinante (116,0 kDa), albumina bovina (67,0 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa); carboanidrase (29,0 kDa); inibidor de tripsina (21,0 kDa).

4.3. ATIVIDADE XILANOLTICA EM FUNO DO pH E DA TEMPERATURA

Como toda reao, a enzima, sofre incremento na cintica com o aumento da temperatura. Porm esse comportamento ocorre at a temperatura de mxima atividade. A partir dessa, o incremento de temperatura diminui a cintica enzimtica devido a desnaturao da enzima. Toda enzima apresenta uma combinao de pH e temperatura cuja atividade enzimtica mxima. Entretanto, muitas vezes esta combinao no permite o uso em processos industriais, pois a enzima apresenta rpida desnaturao. (Voet e Voet, 2006). Por isso, foi realizado neste trabalho um estudo da condio de pH timo de processo (9,0), na temperatura 50C, visando futura aplicao industrial do processo, uma vez que o caldo bruto centrifugado de xilanase, nestes ensaios, no continham estabilizante enquanto, a preparao enzimtica Pulpzyme HC possui estabilizante.

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Os dados obtidos nos experimentos quanto atividade enzimtica da enzima xilanase (caldo bruto) e Pulpzyme HC (preparao enzimtica), em funo do pH, so apresentados na Figura 4.2 e na Figura 4.3, respectivamente.

Figura 4.2. Atividade enzimtica xilanoltica em funo da temperatura do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

Figura 4.3. Atividade enzimtica xilanoltica em funo da temperatura da preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0.

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A Figura 4.2 mostra o efeito da temperatura na atividade enzimtica em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Em trabalho anterior de Duarte et al. (2000) obteve a atividade mxima, aps 10 minutos de incubao, a 60C, entretanto conforme pode ser observado na Figura 4.2 a temperatura de atividade mxima ocorre a 55C, aps 5 minutos de incubao. Se for considerada a atividade enzimtica por minuto, nota-se que a diferena entre as atividades a 55C e 60C de 3 U/mL, o que poderia ser considerada praticamente a mesma. Portanto, para aplicao industrial, torna-se interessante obter atividade mxima a temperatura mais baixa porque alm da enzima manter-se estvel, o uso de uma temperatura inferior tambm garante um menor consumo de energia no processo. Entretanto, para a preparao enzimtica Pulpzyme HC, observa-se na Figura 4.3 que a atividade mxima, para o pH 8,0 ocorre a 55C e para o pH 9,0, a 60C.

4.4. ESTABILIDADE TRMICA

Para avaliar a estabilidade trmica das enzimas foi determinado o tempo de meiavida e a constante de desativao, atravs da atividade enzimtica sobre o substrato xilana dissolvido em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, em xilana de btula, para xilanase e para Pulpzyme HC, por este ser o pH de atividade mxima. Os resultados experimentais obtidos no teste de estabilidade trmica para o caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1M, pH 9,0, para o intervalo de temperatura 40-90C, so apresentados na Tabela 4.2 e esses dados graficados, so mostrados na Figura 4.4. Observa-se que o caldo bruto centrifugado apresentou comportamento estvel, a 40C, aps 150 minutos de incubao. A 50C, em 60 minutos de incubao a atividade remanescente foi da ordem de 31,17% e aps 150 minutos a atividade diminui para 7,4%. Verifica-se que acima de 60C, ocorre rpida desnaturao, indicando que o processo de inativao por temperatura pode ser utilizado entre 60-90C, durante 15 minutos. Com base nestes resultados comprova-se a necessidade de adio de osmlitos para manter a estabilidade da enzima durante o processo de aplicao industrial, cujos resultados sero apresentados nesta mesma seo. Para a preparao enzimtica Pulpzyme HC, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1M, pH 9,0, a Tabela 4.3 apresenta a atividade remanescente em funo do tempo de incubao no intervalo de temperatura de 40-90C e a Figura 4.5, a Tabela 4.3 na forma

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grfica. Observa-se que a Pulpzyme HC aps 150 minutos de incubao, a 40C, permaneceu com 100% da atividade inicial. Acima desta temperatura a enzima apresenta comportamento trmico instvel.

Tabela 4.2. Atividade xilanoltica remanescente (%) em funo do tempo de incubao, para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tempo (minutos) 0 1 3 5 10 15 20 30 45 60 90 120 150 Atividade remanescente (%) 40C 100,00 ND ND ND ND 100,00 ND 100,00 100,00 98,63 98,05 90,68 86,82 50C 100,00 ND ND ND ND 81,25 ND 62,82 49,30 37,93 21,17 15,65 12,71 60C 100,00 ND ND ND ND 5,16 ND 3,32 3,39 3,32 3,15 3,22 3,11 70C 100,00 ND ND 1,42 1,01 0,95 0,92 0,88 0,88 0,88 ND ND ND 80C 100,00 ND 2,50 1,58 1,04 0,96 0,93 0,96 ND ND ND ND ND 90C 100,00 5,07 2,15 1,32 1,15 1,04 1,11 1,04 ND ND ND ND ND

ND = Atividade remanescente no determinada, nesse tempo, para essa temperatura.

A 50C verifica-se que a atividade remanescente aps 150 minutos foi aproximadamente 90%. A Pulpzyme apresenta 50% de atividade residual aps 150 minutos, na temperatura de mxima atividade (60C). Verifica-se que a 70C esta enzima ainda apresenta atividade nos primeiros 15 minutos. Para as temperaturas de 80C e 90C, a enzima foi desativada em 15 minutos. Em funo desta enzima ser uma preparao enzimtica e possuir estabilizante na sua composio e estar sendo utilizada somente como parmetro para a xilanase, no foram realizados testes para as temperaturas superiores a 70C, em tempos inferiores a 15 minutos. Conforme verificado, tanto a xilanase quanto a Pulpzyme HC sofrem a desnaturao na temperatura de mxima atividade. Outra justificativa para a Pulpzyme HC ter mantido 50% da atividade inicial aps 150 minutos, enquanto para xilanase somente 3%, na temperatura de mxima atividade, se deve a presena de estabilizante na preparao enzimtica da Pulpzyme

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HC. Assim, para empregar o caldo bruto da xilanase em uma temperatura maior, por um perodo de tempo maior, tendo garantia da estabilidade trmica, ser necessrio a adio de estabilizantes, como poliis, ao caldo.

Figura 4.4. Atividade xilanoltica remanescente (%) para o caldo bruto centrifugado, durante 150 minutos no intervalo de temperatura de 40-90C, em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0.

Tabela 4.3. Atividade xilanoltica remanescente (%) em funo do tempo de incubao, para a preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tempo (minutos) 0 15 30 45 60 90 120 150 Atividade remanescente (%) 40C 100,00 89,88 92,38 93,84 97,80 102,49 104,11 98,39 50C 100,00 90,50 87,71 89,01 87,52 86,78 84,92 86,41 60C 100,00 81,03 70,93 64,95 62,27 57,11 54,85 51,13 70C 100,00 35,51 22,81 18,01 10,29 7,55 7,38 6,18 80C 100,00 1,71 2,04 1,82 1,82 1,82 1,71 1,82 90C 100,00 1,71 1,71 1,71 1,71 1,71 1,71 1,71

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Figura 4.5. Atividade xilanoltica remanescente (%) para a preparao enzimtica Pulpzyme HC, durante 150 minutos no intervalo de temperatura de 40-90C, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

A partir destes resultados tem-se que a temperatura ideal para o processo de biopurga com o substrato txtil, utilizando Pulpzyme HC, est no intervalo de 40-60C, com tempo de incubao no excedente a 60 minutos. Para o processo de inativao a temperatura deve ser superior a 80C, durante 15 minutos. Vrios trabalhos sobre termoestabilidade de xilanase so apresentados na literatura, desde a faixa cida alcalina. Dentre todos esses trabalhos nota-se que o pH alcalino apresenta a menor atividade remanescente, conforme j apresentado em literatura (Xiong et al., 2004). Essa influncia negativa do pH alcalino sobre a rpida desativao da enzima pode ocorrer em funo da desprotonao dos grupos carboxlicos da protena e o complexo adquire carga negativa, ou seja, predominncia da espcie aninica, que afeta a estrutura da enzima ou das ligaes no stio ativo, influenciando a estabilidade da enzima (COSTA et al., 2002). A estabilidade trmica da xilanase de B. coagulans BL53 a 50-80C, em tampo acetato 100 mM pH 5,0, acima de 50C, reduz drasticamente com o passar do tempo (Heck et al., 2006). Foi verificado que a xilanase purificada de Trichoderma reesei QM 9414, em pH 5.0, permaneceu estvel depois da pr-incubao a 50C, na ausncia de substrato, durante 30 minutos. Entretanto quando a temperatura foi aumentada para 55C, a atividade foi reduzida

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50%. Em testes de pr-incubao, temperatura ambiente, num intervalo de pH 5,0-8,5, aps 22 horas, permaneceu com 80% de atividade residual (COBOS e ESTRADA, 2003). A xilanase de Thermomyces lanuginosus IOC-4145, em tampo universal 0,12M, pH 6.0, apresentou boa estabilidade trmica, pois a 60C a enzima manteve 50% da atividade inicial depois de 4 horas de incubao e 20% de atividade aps 1 hora a 70C (SINGH et al., 2000). Quando a xilanase de Thermomonospora sp. foi exposta durante 6 horas a 70C, em pH 6,5 (tampo citrato 50 mM) e 7,0 (tampo Tris-HCl 50 mM) a enzima manteve aproximadamente 48% de atividade remanescente. Quando submetida em pH 7,0, a 60C, o tempo de meia-vida foi 8 horas; a 70C (temperatura tima) foi 4 horas e a 80C somente 9 minutos (George et al., 2001). Quando o pH foi modificado para 8,0 e 9,0 (tampo Tris-HCl 50 mM) manteve 39% e 31% de atividade remanescente e em pH 12,00 (tampo glicinaNaOH 50 mM) ocorreu rpida inativao.

4.4.1. Energia de Ativao da Reao Enzimtica

A aplicao da equaes 3.4a s atividades enzimticas em funo da temperatura conforme descrito no item 3.3.2, para a xilanase, e para a Pulpzyme HC, possibilitou obter-se os valores da energia de ativao da reao enzimtica. Os valores obtidos para a energia de ativao da reao enzimtica e constante de Arrhenius, para o caldo bruto centrifugado, para o pH 8,0 e 9,0, so apresentados na Tabela 4.4. Observa-se que a energia de ativao da reao enzimtica com xilanase no pH 8,0 7,23 kcal/mol e que este valor menor do que o encontrado para o pH 9,0, 10,25 kcal/mol. Os parmetros da equao de Arrhenius e energia de ativao obtidos para a preparao enzimtica Pulpzyme HC so apresentados na Tabela 4.5. Verifica-se que a preparao enzimtica Pulpzyme HC apresentou a mesma tendncia de comportamento que o apresentado pelo caldo bruto centrifugado. Observa-se que a energia de ativao no pH 8,0 foi 6,49 kcal/mol e que este valor menor do que o encontrado para o pH 9,0 que foi 7,01 kcal/mol. No pH timo (9,0), para a xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, a energia de ativao de Arrhenius para a reao enzimtica (Ea), para o intervalo de temperatura de 4055C, foi 46,49 kJ/mol. Se o valor da energia de ativao calculado pela equao de Arrhenius linearizada, bastante pequeno, como determinado para a xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, sabe-se que no uma barreira de energia alta para catlise e, portanto, um pequeno

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aumento na temperatura aumentaria exponencialmente o nmero de molculas de enzima ativada, com a mesma energia ou acima da energia de ativao, capaz de reagir. (Cobos e Estrada, 2003). Este valor de Ea foi maior que o reportado pela literatura para xilanases produzidas por fungos e outras bactrias. O Trichoderma reesei QM 9414 (Cobos e Estrada, 2003) em pH 5,0, foi encontrado Ea = 32,1 kJ/mol, para Thermomyces lanuginosus linhagem DSM 10635 (Xiong et al., 2004), no pH timo (6,5), nas temperaturas entre 50-70C, foi Ea = 34 kJ/mol.

Tabela 4.4. Parmetros da equao de Arrhenius para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. pH 8,0 9,0 Ae = k exp (-Ea/RT) Ae = 1,536115*106 exp (-7.232,13/RT) Ae = 2,474920*108 exp (-10.251,15/RT) k [U/mL] 1,5361*106 2,4749*108 Ea [kcal/mol] 7,23 10,25

*Ae = Atividade Enzimtica [mmol/mL]; k = Constante de Arrhenius [mmol/mL]; Ea = Energia de ativao [kcal/mol].

Tabela 4.5. Parmetros da equao de Arrhenius para a preparao enzimtica Pulpzyme HC em soluo tampo fosfato 0,1 M, pH 8,0, e glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. pH 8,0 9,0 Ae = k exp (-Ea/RT) Ae = 6,618923*105 exp (-6.491,26/RT) Ae = 1,773033*104 exp (-7.006,08/RT) k [U/mL] 6,6189*105 1,7730*104 Ea [kcal/mol] 6,49 7,01

*Ae = Atividade enzimtica [mmol/mL]; k = Constante de Arrhenius [mmol/mL]; Ea = Energia de ativao [kcal/mol].

Uma pequena variao de temperatura na soluo de uma protena pode alterar abruptamente as propriedades suas conformacionais como rotao ptica, viscosidade e absoro de ultravioleta (UV). Assim o desdobramento de qualquer parte da estrutura desestabiliza a estrutura restante que colapsa simultaneamente para uma estrutura aleatria (VOET e VOET, 2006). Assim, para avaliar a estabilidade trmica das enzimas foi determinado o tempo de meia-vida e a constante de desativao, na soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para xilanase e para Pulpzyme HC, por este ser o pH de atividade mxima. Os resultados experimentais obtidos no teste de estabilidade trmica para o caldo bruto centrifugado de xilanase so apresentados na Tabela 4.3 e Figura 4.5. Observa-se que o caldo bruto da xilanase, a 40C, permanece com aproximadamente 87% da atividade inicial aps 150 minutos de incubao. Entretanto para 50C verifica-se uma atividade remanescente da ordem de 13%, aps 150 minutos. Verifica-se que na temperatura de mxima atividade da enzima,

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60C,

ocorre

rpida

desnaturao.

atividade

residual

nesta

temperatura

foi

aproximadamente 5% e 3%, aps 15 e 150 minutos de incubao, respectivamente. Nas temperaturas 70C e 80C verifica-se a rpida e completa desnaturao depois de 10 minutos de incubao, pois aps este tempo a atividade residual verificada no apresenta diferena. A 90C esta desnaturao verificada aps 5 minutos.

4.4.2. Constante de Desativao Enzimtica

Visando avaliar o tempo na qual a enzima permanecer ativa no processo, determinou-se conforme descrito no item 3.3.2, a constante de desativao enzimtica e o tempo de meia-vida. Na Tabela 4.6 apresentada a constante de desativao e tempo de meiavida do caldo bruto, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0 para o intervalo de temperatura de 40-90C. Observa-se na Tabela 4.6 que medida que ocorre o aumento da temperatura a constante de desativao aumenta, enquanto o tempo de meia-vida diminui. Na temperatura mais branda (40C) verifica-se tempo de meia-vida equivalente a 9,2 horas. Resultados mais promissores foram obtidos para a xilanase de Thermomonospora sp. (temperatura tima 70C e pH 7,0) cujo tempo de meia-vida a 60C foi 8 horas; 70C, 4 horas e a 80C somente 9 minutos (GEORGE et al., 2001). A partir dos dados de desnaturao trmica para o intervalo 60-90C foi possvel determinar o fator exponencial (kd 0) e a energia de desnaturao trmica da enzima (Ed). Para isso utilizou-se a equao obtida no grfico tipo Arrhenius (ln kd = 10,050093/T+32,040533 e R2 = 0,882790), que pode ser representada pela equao (4.1). kd = 8,222932.1013 exp (19969,54/RT)

(4.1)

Na Tabela 4.7 apresentada a constante de desativao e tempo de meia-vida da preparao enzimtica Pulpzyme HC, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1M, pH 9,0, para o intervalo de temperatura de 40-90C. Os dados apresentados na tabela foram utilizados no mesmo intervalo de temperatura 60-90C para determinar o fator exponencial (kd0) e a energia de desnaturao trmica da enzima (Ed). Para isso utilizou-se a equao obtida no grfico tipo Arrhenius (ln kd = 14,685186/T+43,680271 e R2 = 0,909176), que pode ser representada pela equao (4.2).

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kd = 9,334706.1018 exp (29179,47/RT)

(4.2)

Tabela 4.6. Constante de desativao trmica e tempo de meia-vida do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. T (C) 40 50 60 70 80 Equao de ajuste y = 0,001257 x + 0,042649 y = 0,018146 x 0,018060 y = 0,131536 x 0,401130 y = 0,155430 x 0,682625 y = 0,873851 x 0,305132 R2 0,821781 0,992864 0,889680 0,795432 0,916217 0,771547 kd (h-1) 0,075420 1,088760 7,892160 9,325800 52,431060 71,253000 t1/2 (min) 551 38 5 4 <1 <1

90 y = 1,187550 x 0,746172 * y = ln(Af/Ao); x = t.

Tabela 4.7. Constante de desativao trmica e tempo de meia-vida da preparao enzimtica Pulpzyme HC, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. T (C) 40 50 60 70 80 90 Equao de ajuste ND y = - 0,004362.x 0,011137 y = - 0,009505.x 0,032510 y = - 0,034957.x 0,254245 y = -0,271340x 0,000000 y = -0,269254x R2 ND 0,920015 0,963792 0,938588 1,000000 1,000000 kd (h-1) ND 0,261720 0,570300 2,097420 16,280400 16,155240 t1/2 (min) Estvel 158 72 19 2 2

* y = ln(Af/Ao); x = t; ND = No determinada devido a condio de estabilidade a essa temperatura.

Em trabalhos similares estudando xilanases de Aspergillus sp. 5 (linhagem 5) and Aspergillus sp. 44 (linhagem 44), em tampo acetato de sdio, pH 5,5, Gawande e Kamat (1998) obtiveram os resultados para Aspergillus sp. 5 a 50 C t1/2 = 240 min e kd = 0,17 h-1, a 60 C t1/2 = 15 min e kd = 2,77 h-1 e Aspergillus sp. 44 a 50 C t1/2 = 260 min e kd = 0,16 h-1, a 60C t1/2 = 10 min e kd = 4,1 h-1. E a equao do grfico de Arrhenius para Aspergillus sp. 5 free: y = - 9,5943x + 29,065, R2 = 0,8986 e Aspergillus sp. 44 free: y = - 10,887x + 33,082, R2 = 0,8846, onde y = log k e x = (1/T)*10-1. Entende-se por termoestabilidade a capacidade da enzima no sofrer desnaturao quando submetida condies severas de temperatura na ausncia de substratos. Entretanto, em muitos casos esse estudo pode induzir a erros quando se objetiva aplicao industrial, pois a ausncia de substrato, dependendo do pH e temperaturas estudadas podem levar a aumento

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ou diminuio do tempo de meia-vida, como no caso da xilanase de Thermomyces lanuginosus DSM 10635, quando incubada na faixa cida 4,0-6,5 a 65-70C, na presena de 1% de xilana birchwood apresenta maior tempo de meia-vida que na ausncia de substrato, porm quando o pH alcalino (pH 9,0), a 70, o tempo de meia-vida na ausncia de substrato maior (19 minutos) que na presena de substrato (12 minutos) (XIONG et al., 2004). A atividade da enzima sofre decremento ou desativao medida que a temperatura sofre incremento, para a enzima a energia de decaimento da atividade enzimtica (Ead) foi 91,58 kJ/mol, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, e intervalo de temperatura de 60-90C. O valor da energia de desnaturao trmica obtido para a xilanase (Ead = 19.969,54 cal/mol) em relao ao obtido para Pulpzyme HC (Ead = 29.179,47 cal/mol), comprova a maior estabilidade da Pulpzyme HC em relao xilanase. Na literatura foram encontrados valores para faixas de pH cido para Ead de xilanases, como 311 kJ/mol para xilanase de Trichoderma reesei QM 9414 em pH 5,0, no intervalo de temperatura 55-70C (Cobos e Estrada, 2003); para a xilanase pura de T. lanuginosus DSM 10635, em pH 6,5, a Ead foi 86 kJ/mol no intervalo de 70-90C e o T. lanuginosus SSBP (Singh et al., 2000), apresentou no intervalo de 60-90C, no pH 5,0, Ead = 83,52 kJ/mol, no pH 6,5, Ead = 102,33 kJ/mol e no pH 9,0, Ead = 49,20 kJ/mol, demonstrando que se a enzima estiver presente em um meio com valor de pH afastado do valor do pH timo, a Ead sofrer uma diminuio significativa no seu valor.

4.5. EFEITO DO TAMPO E DOS ESTABILIZANTES

O efeito dos tipos de soluo tampo e estabilizantes sobre a atividade do caldo bruto centrifugado, conforme proposto no planejamento experimental, apresentado na Tabela 4.8 e a estatstica descritiva desses dados, na Tabela 4.9. Percebe-se na Tabela 4.9 que na anlise dos efeitos de forma individual apresenta valores de desvio padro elevados, que acabam influenciando no intervalo de confiana e confundindo as atividades. Por exemplo, para o efeito tipo de soluo tampo, todos apresentaram elevados valores de desvio padro, enquanto para o efeito tipo de estabilizante, o sorbitol e a ausncia, apresentaram desvio padro elevados. Quando se realiza a anlise com o efeito do tipo de estabilizante e soluo tampo combinados, percebe-se que ocorre uma diminuio no desvio padro e os intervalos de confiana no se confundem.

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Tabela 4.8. Resposta obtida no planejamento fatorial 24, com duas replicatas, para a determinao da melhor combinao tipo de soluo tampo/estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.
Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Parmetros Tampo Estabilizante GNaOH Xilitol NaOH Sorbitol NaOH Sorbitol CB Xilitol gua Xilitol gua Glicerol CB Glicerol CB Sorbitol GNaOH Xilitol GNaOH Sorbitol CB Ausente GNaOH Glicerol CB Glicerol NaOH Glicerol CB Sorbitol gua Glicerol gua Sorbitol CB Sorbitol gua Xilitol NaOH Ausente NaOH Xilitol gua Glicerol GNaOH Glicerol gua Sorbitol AR (%) 71,09 52,14 44,77 89,84 69,13 90,92 65,68 76,67 77,55 96,05 38,35 74,26 59,74 63,14 85,95 98,74 94,83 79,84 68,36 69,97 74,07 96,62 72,25 70,51 Ensaio 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Parmetros Tampo Estabilizante CB Ausente NaOH Ausente GNaOH Xilitol GNaOH Ausente NaOH Xilitol GNaOH Sorbitol CB Xilitol GNaOH Sorbitol CB Glicerol gua Ausente NaOH Ausente NaOH Glicerol NaOH Sorbitol NaOH Glicerol GNaOH Ausente gua Xilitol gua Sorbitol CB Xilitol gua Ausente gua Ausente CB Ausente GNaOH Ausente NaOH Xilitol GNaOH Glicerol AR (%) 40,10 68,34 77,90 42,84 80,11 93,40 78,54 93,60 63,98 67,36 70,73 64,83 45,64 60,37 45,94 61,85 74,38 80,95 69,68 66,47 33,79 42,30 77,94 71,04

* CB = Soluo Tampo Carbonato-Bicarbonato 0,1 M, pH 9,0; GNaOH = Soluo Tampo Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0; gua pH 6,0; NaOH pH 9,0; AR = Atividade Remanescente. Atividade enzimtica mdia inicial (50C, 1 h, sem estabilizantes): gua Destilada (pH 6,00) 44,99 U; Carbonato-Bicarbonato de Sdio 17,66 U; Glicina-NaOH 184,58 U; NaOH 112,97 U. A atividade enzimtica mdia inicial com estabilizantes foi similar a sem estabilizantes.

A Tabela 4.10 apresenta a ANOVA da atividade remanescente em funo do tipo de tampo e estabilizante. Adotou-se um nvel de significncia de 5% e as seguintes hipteses nulas: H0: efeito da varivel tampo sobre a resposta nula; H0: efeito da reposta estabilizante sobre a resposta nula; H0: o efeito combinado das variveis tampo-estabilizante nulo. Nota-se que o valor p em todas as hipteses foi menor que o nvel de significncia adotado, ento, rejeita-se as 3 hipteses nulas. Portanto, tanto o tipo de tampo quanto de estabilizante e a combinao destes, afeta estatisticamente a atividade remanescente.

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Tabela 4.9. Estatstica descritiva da melhor combinao entre tipo de soluo tampo e tipo de estabilizantes sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.
Efeito Total T T T T E E E E TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE GNaOH NaOH CB gua Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente GNaOH Xilitol Nvel do Nvel do Fator Fator N 48 12 12 12 12 12 12 12 12 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mdia 67,48021 71,50417 64,31583 66,07167 68,02917 75,57083 75,44667 64,24750 54,65583 75,45667 94,35000 72.51667 43,69333 77,37333 47,43000 62,78000 69,68000 83,00667 80,73333 63,13333 37,41333 66,44667 79,27333 58,56000 67,83667 Desvio padro 15,00250 18,97138 11,66944 19,19909 8,11843 6,74021 18,05616 5,70668 15,04006 1,67584 1,47564 1,62648 1,96431 3,05961 1,70297 2,25169 1,22111 2,99937 0,90716 3,05917 3,25761 3,99940 3,15324 2,42019 1,65724 Erro padro 2,65424 5,476566 3,368676 5,542301 2,343587 1,945731 5,212363 1,647376 4,341691 0,967546 0,851959 0,939048 1,134098 1,766469 0,983209 1,300013 0,705006 1,731688 0,523747 1,766214 1,880783 2,309057 1,820525 1,397295 0,956806 IC -95,00% 63,12394 59,45033 56,90143 53,87314 62,87097 71,28831 63,97433 60,62165 45,09984 71,29365 90,68432 68,47627 38,81370 69,77283 43,19959 57,18650 66,64660 75,55581 78,47983 55,53393 29,32098 56,51160 71,44025 52,54792 63,71986 IC +95,00% 71,83648 83,55801 71,73024 78,27019 73,18737 79,85336 86,91900 67,87335 64,21183 79,61968 98,01568 76,55706 48,57296 84,97383 51,66041 68,37350 72,71340 90,45752 82,98684 70,73274 45,50569 76,38174 87,10642 64,57208 71,95347

GNaOH Sorbitol GNaOH Glicerol GNaOH Ausente NaOH NaOH NaOH NaOH CB CB CB CB gua gua gua gua Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente

* T = Tampo; E = Estabilizante; TE = Tampo*Estabilizante; CB = Soluo Tampo Carbonato-Bicarbonato 0,1 M, pH 9,0; GNaOH = Soluo Tampo Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0; gua pH 6,0; NaOH pH 9,0; AR = Atividade Remanescente; IC = Intervalo de Confiana.

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Tabela 4.10. ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo da combinao entre tipo de soluo tampo e estabilizantes. Causa da variao Coeficiente Tampo Estabilizante Tampo*Estabilizante Erro/Resduos Total GL 1 3 3 9 32 47 SQ 218571,80 341,90 3646,10 6401,30 189,30 10578,50 QM 218571,80 114,00 1215,40 711,30 5,90 F 36.950,53 19,27 205,46 120,24 p 0,00E-01 2,55E-07 0,00E-01 0,00E-01

*GL = Graus de Liberdade, SQ = Soma dos Quadrados, QM = Quadrado Mdio.

Comparando-se o valor de F com o valor de F para o nvel de significncia de 5% segundo o nmero de graus de liberdade do numerador e do denominador, observa-se que F = 1,992. Como F > F(3;32;0,05), ou seja, todos os valores de F so maiores que 19,266, rejeita-se H0 ao nvel de 5% de significncia. Logo, conclui-se do teste F que os fatores tampo, estabilizante e suas combinaes, a um nvel de significncia de 5%, so estatisticamente diferentes. Como o teste F no indica quais tratamentos so iguais, nem se so distintos, utilizou-se o teste de comparaes mltiplas teste de Tukey, apresentado na Tabela 4.11 e dos grupos homogneos na Tabela 4.12. O teste de Tukey realizado sobre o tipo de tampo, mostra dois grupos homogneos (NaOH com carbonato-bicarbonato e carbonato-bicarbonato com gua) e um grupo (glicina-NaOH) que no se confunde com nenhum dos outros tipos de tampo estudados. Logo, pode-se afirmar, a um nvel de significncia de 5%, que a soluo tampo glicina-NaOH apresenta valores nicos e os maiores valores de atividade remanescente, dada a sua mdia elevada e por possuir um intervalo de confiana dessa mdia que no se confunde com nenhum outro. Os resultados do tampo NaOH se confundem.

Tabela 4.11. Teste de Tukey aplicado s mdias do tipo de tampo utilizado sobre a atividade remanescente (%)do caldo bruto centrifugado. Soluo tampo GNaOH NaOH CB gua {1} 71,504 0,000165 0,000187 0,007349 {2} 64,316 0,000165 0,306862 0,003948 {3} 66,072 0,000187 0,306862 0,219936 {4} 68,029 0,007349 0,003948 0,219936 -

*MQ = 5,9153, GL = 32,000; CB = Carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0; GNaOH = Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0; gua pH 6,0; NaOH pH 9,0.

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Tabela 4.12. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de tampo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. Soluo tampo NaOH CB gua GNaOH Atividade remanescente (%) 64,32 66,07 68,03 71,50 1 **** **** 2 **** **** **** 3

*MQ = 5,9153, GL = 32,000. CB = Carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0; GNaOH = Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0; gua pH 6,0; NaOH pH 9,0.

Na Figura 4.6 observa-se o efeito do fator tipo de tampo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. As barras equivalem a 95% do intervalo de confiana e o ponto central a mdia. Nota-se que o tampo glicina-NaOH apresenta os maiores valores de atividade.

74.00 72.00 Atividade remanescente (%) 70.00 68.00 66.00

64.3158 66.0 717 68.0292 71.5042

64.00 62.00 60.00

Glicina-NaOH

NaOH

Carbonato-Bicarbonato

gua

Soluo tampo

Figura 4.6. Efeito do tipo de tampo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

Vrios trabalhos na literatura comprovam que os poli-hidroxilcoois (alditis) tem efeito positivo sobre a estabilidade enzimtica. E consta na literatura que esse efeito est associado ao nmero de grupos hidroxilas, por exemplo: glicerol < xilitol < sorbitol (Lemos et al., 2000, George et al., 2001). A reduo na atividade ou completa inativao aps algum perodo de incubao ocorre quando no so adicionados estabilizantes, independente da enzima, assim a adio de estabilizantes possibilita o uso das enzimas em processos

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industriais com condies operacionais extremas. A adio de estabilizantes ocasiona uma variedade de efeitos na superfcie da molcula da protena e no estado de ionizao da enzima, mudando a relao entre pH e estabilidade. O teste de Tukey realizado sobre o tipo de estabilizante mostrado na Tabela 4.13 e dos grupos homogneos na Tabela 4.14. Observa-se a existncia de dois grupos distintos (ausente e glicerol) e dois grupos homogneos (sorbitol e xilitol). Com base nestes resultados pode-se afirmar que o efeito do sorbitol e xilitol apresentam os maiores valores de atividade, mas se confundem entre si e no se pode afirmar que so distintos. J os resultados do glicerol e da gua so nicos, e apresentam o segundo e terceiro maiores valores, respectivamente. O efeito do aumento na estabilidade pode ser conseguido com o aumento da concentrao de poliol (COBOS e ESTRADA, 2003).

Tabela 4.13. Teste de Tukey aplicado s mdias do tipo de estabilizante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. Estabilizante [1 M] Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente {1} 75,571 0,999350 1,65E-4 1,65E-4 {2} 75,447 0,999350 1,65E-4 1,65E-4 {3} 64,248 1,65E-4 1,65E-4 1,65E-4 {4}54,656 1,65E-4 1,65E-4 1,65E-4 -

Tabela 4.14. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de estabilizante utilizado sobre a atividade remanescente (%)do caldo bruto centrifugado. Estabilizante [1 M] Ausente Glicerol Sorbitol Xilitol Atividade remanescente (%) 54,65583 64,24750 75,44667 75,57083 1 2 **** 3 **** **** ****

Em trabalhos similares (Singh et al., 2000) foi constatado que a xilanase de T. lanuginosus manteve 50% da atividade, sem adio de poliis, aps 6 horas de incubao, pH 6,5, 70C e quando adicionado 50% de sorbitol a xilanase da T. lanuginosus manteve 100% de atividade remanescente aps 6 horas de incubao, enquanto com glicerol este resultado foi 90%.

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A Figura 4.7 apresenta o efeito do fator tipo de estabilizante sobre a resposta. Observa-se que o xilitol e o sorbitol apresentam os maiores valores sobre a atividade, apesar de serem muito semelhantes. J o glicerol apresenta o segundo maior efeito sobre a resposta, e o tipo ausente apresenta o menor valor de atividade remanescente (54,6558%). O mesmo tipo de anlise foi realizado para o efeito combinado do tipo de tampo e estabilizante pelo teste de Tukey aplicado s mdias dos parmetros (Tabela 4.15) e dos grupos homogneos (Tabela 4.16), no qual se pode concluir que o nico efeito distinto da combinao entre soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, e sorbitol. Essa combinao tambm apresenta a maior mdia sobre a resposta atividade remanescente.

76 Atividade remanescente (%) 72 68 64 60 56 52

75.5708

75.4467

64.2475

54.6558

Xilitol

Sorbitol

Glicerol

Ausente

Tipo de estabilizante (1 M)

Figura 4.7. Efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

A Figura 4.8 mostra o efeito combinado tampo e estabilizante sobre a atividade remanescente (%). Observa-se que a maior atividade apresentada pela combinao soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, e sorbitol e a menor atividade remanescente com a combinao entre soluo tampo carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0, na ausncia de estabilizante. Deve-se considerar que o carbonato-bicarbonato promove efeito inibitrio na atividade. A ANOVA supe que ocorre varincia constante nas combinaes dos nveis dos fatores; independncia entre os ensaios e distribuio normal para a variao aleatria. Na Figura 4.9 observa-se que os valores residuais da combinao tampo e estabilizante, em

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funo da ordem em que foram realizados os experimentos, apresentam uma disposio dos erros de forma aleatria, ou seja, no seguem uma tendncia de disposio linear ou curva, o que garante a independncia dos erros. A verificao dessas suposies realizada na Figura 4.10 que mostra que os resduos seguem de maneira satisfatria a distribuio normal esperada.

110 100 Atividade remanescente (%) 90 80 70 60 50 40 30 20

Glic ina-NaOH NaOH Carbonato-Bicarbonato gua

Xilitol 1 M Sorbitol 1 M Glicerol 1 M Ausente

Soluo tampo

Figura 4.8. Efeito do estabilizante conforme o tipo de tampo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

5 4 3 2 Resduos 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 0 5 10 15 20 25 Ordem 30 35 40 45 50

Figura 4.9. Resduos em funo da ordem, do efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

74

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -6 -5

,99 ,95 ,75 ,55 ,35 ,15 ,05 ,01 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Probabilidade

Valor normal esperado

Resduos

Figura 4.10. Grfico da probabilidade normal esperada dos resduos.

A Figura 4.11 mostra os resduos em funo dos valores preditos do efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto estabilizado, nota-se que os resduos no mostram nenhum padro, o que junto com a aleatorizao feita sobre os ensaios, mostra a independncia entre estes.

5 4 3 2 Resduos 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 30 40 50 60 70 80 90 100

Valores preditos

Figura 4.11. Resduos em funo dos valores preditos, do efeito do tipo de estabilizante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

Tabela 4.15. Teste de Tukey aplicado s mdias dos parmetros tipo de tampo e de estabilizante utilizados sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.
Tampo GNaOH GNaOH GNaOH GNaOH NaOH NaOH NaOH NaOH CB CB CB CB gua gua gua gua Estabilizante Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente Xilitol Sorbitol Glicerol Ausente {1} 75,457 1,51E-4 {2} 94,350 {3} 72,517 {4} 43,693 {5} 77,373 {6} 47,430 {7} 62,780 {8} 69,680 {9} 83,007 {10} 80,733 {11} 63,133 {12} 37,413 {13} 66,447 {14} 79,273 {15} 58,560 {16} 67,837

1,51E-4 0,977136 1,51E-4 0,999722 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

1,75E-4 0,264331 0,040074 0,397822 1,94E-4 1,51E-4 1,51E-4 3,63E-4 1,56E-4 1,51E-4

1,51E-4 6,219E-3 0,847307 1,51E-4 0,036819 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

0,977136 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,530614 1,51E-4 2,365E-3 0,983269 9,01E-4 0,017493 3,78E-3 1,51E-4 0,865676 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,201930 0,099938 1,54E-4 0,589117 1,51E-4 1,52E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,164453 1,51E-4 1,51E-4

0,999722 1,51E-4 0,530614 1,51E-4 1,51E-4 1,75E-4 1,51E-4

1,52E-4 0,033673 0,299203 0,934195 1,53E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

5,44E-4 0,999749 1,51E-4 3,084E-3 1,51E-4 4,42E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,865676 1,51E-4 1,52E-4

1,51E-4 1,641E-3 1,51E-4

1,51E-4 2,365E-3 1,51E-4

0,085303 1,51E-4 1,59E-4 1,59E-4 -

1,51E-4 1,000000 1,51E-4 0,880673 1,51E-4 0,737246 0,465657 4,77E-4 0,125117 1,51E-4 0,950575 2,861E-3 4,46E-4 0,999825 0,998109 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 0,866413 1,51E-4 1,52E-4 0,999990 1,51E-4 1,51E-4 1,68E-4

0,264331 1,51E-4 0,983269 1,51E-4 0,033673 1,51E-4 0,085303 0,040074 3,63E-4 9,01E-4 1,51E-4 0,299203 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

0,397822 1,56E-4 0,017493 1,51E-4 0,934195 1,51E-4 1,94E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 3,78E-3 1,51E-4 1,53E-4

4,77E-4 0,998109

1,51E-4 1,000000 0,125117 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,940604 1,51E-4 0,624444 0,581372 1,51E-4 1,70E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4

1,51E-4 0,164453 1,51E-4 1,641E-3 1,51E-4 5,44E-4

6,219E-3 1,51E-4 0,201930 1,51E-4

1,51E-4 0,880673 0,950575 1,51E-4

1,52E-4 0,940604 1,51E-4 1,51E-4

1,70E-4 0,026533 0,999995 1,51E-4 3,36E-4 4,364E-3 -

0,847307 1,51E-4 0,099938 1,51E-4 0,999749 1,51E-4 1,51E-4 1,51E-4 1,54E-4 1,52E-4 1,51E-4

1,51E-4 2,861E-3 0,866413 0,999990 1,51E-4 1,51E-4

4,42E-4 0,737246 4,46E-4

1,51E-4 0,624444 1,51E-4 0,026533 1,51E-4

0,036819 1,51E-4 0,589117 1,51E-4 3,084E-3 1,51E-4 0,465657 0,999825 1,51E-4

1,68E-4 0,581372 1,51E-4 0,999995 3,36E-4 4,364E-3

*MQ = 5,9153, GL = 32,000; CB = carbonato bicarbonato; Glicina-NaOH = GNaOH.

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Tabela 4.16. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de estabilizante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. Soluo tampo CB GNaOH NaOH gua NaOH CB gua gua NaOH GNaOH GNaOH NaOH gua CB CB GNaOH Estabilizante Ausente Ausente Sorbitol Glicerol Glicerol Glicerol Xilitol Ausente Ausente Glicerol Xilitol Xilitol Sorbitol Sorbitol Xilitol Sorbitol AR (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

37,41333 **** 43,69333 **** **** 47,43000 58,56000 62,78000 63,13333 66,44667 67,83667 69,68000 72,51667 75,45667 77,37333 79,27333 80,73333 83,00667 94,35000
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** ****

* CB = CarbonatoBicarbonato 0,1 M, pH 9,0; GNaOH = Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0; gua pH 6,0; NaOH pH 9,0; AR = Atividade Remanescente.

4.5.1. Efeito da Concentrao de Estabilizante

Na literatura so utilizadas concentraes na ordem de 1 a 10 M como na ordem de 5 a 50% massa/massa (Duarte et al., 2000; Lemos et al., 2000; Singh et al., 2000; George et al., 2001; Cobos e Estrada, 2003). A adio de sorbitol a xilanase de Thermomonospora sp. em pH 7,0, a 80C, manteve a proteo mxima na concentrao de 4 M, pois sem a adio de poliol a enzima apresentava a essa temperatura tempo de meia-vida de 9 minutos (George et al., 2001). A adio de sorbitol e o xilitol, 2 M, endoxilanase de Aspergillus awamori aps 300 minutos a 52C em pH 5.0, manteve aproximadamente 60% da atividade inicial, enquanto o controle foi inferior a 20% (Lemos et al., 2000). A xilanase de Trichoderma reesei QM 9414, a 60C apresenta tempo de meia-vida, sem poliol, de 2,7 minutos e na presena de 2M

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de eritritol, xilitol e sorbitol foi verificado que o tempo aumentou 8, 32 e 112 vezes, respectivamente (COBOS e ESTRADA, 2003). Trabalhos anteriores, tambm comprovaram que tanto o efeito termoestabilizante do poliol adicionado proporcional ao tamanho molecular, ou seja, correlacionado ao nmero de grupos hidroxila por molcula de poliol quanto o aumento de concentrao do poliol correspondente. Esse efeito da termoestabilidade devido ao tamanho molecular do estabilizante tambm foi verificado neste trabalho, pois o sorbitol apresenta o maior tamanho molecular (COBOS e ESTRADA, 2003; GEORGE et al., 2001). Para avaliar se existe diferena significativa entre as concentraes de sorbitol empregadas para estabilizar o caldo, os resultados obtidos foram submetidos anlise estatstica em dois grupos de concentrao de sorbitol distintos: o primeiro com a concentrao 0,5 e 1,0 M; o segundo com a concentrao 1,0 e 2,0 M. Adotou-se este mtodo para anlise, pois seria impossvel fazer a anlise estatstica por apresentarem intervalo de proporo diferente (0,5 para 1,0 M a proporo aumentada 0,5; 1,0 para 2,0 M a proporo aumentada 1,0). A anlise realizada para as concentraes de sorbitol 0,5 e 1 M apresentou boa correlao (aproximadamente 0,95) mostrando apenas efeitos lineares, principalmente do tempo. Mas para qualquer transformao aplicada aos dados, a falta de ajuste continuou alta. Diferentemente do que ocorreu para a concentrao de 1,0 e 2,0 M, que ser apresentado no prximo item (4.5.1.2). Nessa anlise percebe-se que a falta de ajuste do modelo foi ocasionada pelo planejamento experimental ser inadequado, pois os dados no se ajustaram a nenhum modelo devido aos resduos serem muito grandes e tendenciosos, no houve uma disperso destes resduos. Os dados foram analisados pelo software STATISTICA 7.

4.5.1.1. Anlise para a Concentrao de 0,5 e 1,0 M de Sorbitol

A Tabela 4.17 mostra o planejamento experimental utilizado para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol na estabilidade da atividade xilanosdica. A Tabela 4.18 apresenta a estatstica descritiva das mdias, desvio padro e o efeito do desvio padro sobre o intervalo de confiana das mdias, para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Verifica-se que as amostras apresentaram elevados valores de erro padro e que o intervalo de confiana nessas amostras tornou-se muito elevado.

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Tabela 4.17. Resposta obtida no planejamento fatorial completo quatro fatores, misto de 2 e 3 nveis, para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol, 0,5 e 1,0 M, para o caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Sorbitol 0,5 M Umectante Tipo de Tempo agitao (g/L) (min) 5 com 60 5 com 60 3 com 60 5 sem 60 3 com 60 3 sem 60 3 sem 60 5 com 50 3 sem 60 5 sem 50 5 com 50 5 com 60 3 com 50 3 com 50 3 com 60 5 sem 60 5 com 50 5 com 40 5 sem 60 3 com 50 3 sem 50 3 sem 50 3 sem 50 5 sem 50 5 sem 40 3 sem 40 3 sem 40 5 com 40 5 sem 50 5 com 40 3 sem 40 3 com 40 3 com 40 3 com 40 5 sem 40 5 sem 40
* AR = Atividade Remanescente.

AR (%) 52,01 52,32 55,36 56,08 57,75 58,27 58,52 59,74 59,84 60,20 60,40 61,29 61,61 61,81 62,36 62,61 62,78 63,32 63,62 63,72 63,84 64,38 65,41 66,06 66,21 67,51 67,67 67,69 69,08 69,25 69,78 71,40 72,27 73,71 74,05 75,12

Sorbitol 1,0 M Umectante Tipo de Tempo agitao (g/L) (min) 5 sem 60 5 sem 60 5 sem 50 5 sem 40 5 sem 50 5 sem 40 5 sem 50 5 sem 40 5 sem 60 3 sem 50 3 sem 50 3 sem 40 3 sem 40 3 com 40 3 sem 60 3 sem 40 3 sem 60 3 sem 50 3 com 40 3 com 50 3 com 60 3 com 60 3 com 50 3 com 60 5 com 40 3 com 50 3 sem 60 3 com 40 5 com 40 5 com 40 5 com 50 5 com 50 5 com 50 5 com 60 5 com 60 5 com 60

AR (%) 85,80 85,91 89,41 89,64 89,65 90,00 90,81 90,93 92,21 92,42 92,57 93,28 93,36 93,58 93,75 93,79 93,96 94,26 94,44 94,58 94,73 95,54 95,54 95,63 95,84 96,35 96,48 96,49 97,90 98,87 104,16 107,92 108,40 110,15 111,15 111,85

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A justificativa para esse comportamento observado reside na dificuldade da aplicao do mtodo de determinao de atividade (Miller, 1959), pois a presena do umectante nas amostras, conferiu opacidade e assim dificultou a reprodutibilidade dos resultados.

Tabela 4.18. Estatstica descritiva da melhor combinao de umectante, tipo de agitao, tempo de incubao e concentrao do estabilizante sorbitol (0,5 e 1,0 M) para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Umectante Tipo de (g/L) agitao 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 sem sem sem sem sem sem com com com com com com sem sem sem sem sem sem com com com com com com Sorbitol (M) 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 Tempo (min) 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mdia 68,32 64,54 58,88 93,48 93,08 94,73 72,46 62,38 58,49 94,84 95,49 95,30 71,79 65,11 60,77 90,19 89,96 87,97 66,75 60,97 55,21 97,54 106,83 111,05 Erro padro 0,73146 0,46052 0,48704 0,15836 0,58992 0,87710 0,67357 0,67248 2,05432 0,86314 0,51157 0,28618 2,80870 2,60677 2,36306 0,38432 0,43226 2,11857 1,77475 0,92321 3,04298 0,89335 1,34051 0,49329 IC IC -95,00% +95,00% 65,17 62,56 56,78 92,80 90,55 90,96 69,56 59,49 49,65 91,12 93,29 94,07 59,71 53,90 50,60 88,54 88,10 78,86 59,12 57,00 42,11 93,69 101,06 108,93 71,47 66,52 60,97 94,16 95,62 98,50 75,36 65,27 67,33 98,55 97,69 96,53 83,88 76,33 70,94 91,84 91,82 97,09 74,39 64,95 68,30 101,38 112,59 113,17

* IC = Intervalo de Confiana.

Na Tabela 4.19 apresentado o teste de Tukey para a concentrao de umectante utilizado sobre a atividade remanescente (%), em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH

80

9,0. Percebe-se que a concentrao do umectante no promove grande diferena sobre a atividade. Na Tabela 4.20, percebe-se que a mudana da concentrao de sorbitol de 0,5 M para 1,0 M representou uma grande mudana na atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, como esperado, indicando que a maior concentrao de sorbitol melhorou a estabilidade da enzima. A Tabela 4.21 apresenta o teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de agitao na atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Verifica-se que apresenta diferena entre as respostas. Na Tabela 4.22, verifica-se que os dados esto muito tendenciosos quanto ao erro, dificultando a anlise, pois o efeito real do tempo 60 minutos pode ser encontrado em qualquer ponto do seu enorme intervalo de confiana. Como esperado ocorre um decrscimo, constante (linear), da atividade remanescente (%) com o tempo, possibilitando a afirmao de que todas as respostas para todos os tempos avaliados so estatisticamente diferentes, sendo que na mdia o tempo de 60 minutos apresenta a menor atividade. A Figura 4.12 apresenta a anlise da interao entre os efeitos umectante e tempo na atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Observa-se que quanto maior o tempo menor a atividade remanescente, porm quando se considera o mesmo tempo variando as concentraes de umectante, verifica-se que a atividade remanescente maior com 5 g/L de umectante, para 50 e 60 minutos. Na Figura 4.13 a anlise da interao entre os efeitos tipo de agitao e tempo, na atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, observa-se que a presena de agitao tem efeito positivo. A Figura 4.14 apresenta a anlise da interao entre os efeitos concentrao de sorbitol e tempo, na atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Nota-se que o maior efeito, dentre umectante, agitao e concentrao de sorbitol, ocorre com a concentrao de sorbitol, pois apresenta elevada inclinao.

Tabela 4.19. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do umectante utilizado sobre a atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Umectante (g/L) 3,0 5,0 Atividade remanescente (%) 79,33222 80,34528 1 **** ****

81

Tabela 4.20. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos da concentrao de sorbitol utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Concentrao sorbitol (M) 0,5 1,0 Atividade remanescente (%) 63,80667 95,87083 1 **** **** 2

Tabela 4.21. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de agitao utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tipo de agitao sem com Atividade remanescente (%) 78,23556 81,44194 1 **** **** 2

Tabela 4.22. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tempo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tempo (min) 40 50 60 Atividade remanescente (%) 81,92083 79,79583 77,79958 **** 1 2 **** 3 ****

A Figura 4.15 mostra a anlise da interao entre trs efeitos: agitao, umectante e tempo na atividade remanescente (%) do caldo bruto estabilizado em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0. Os resultados mostram que a atividade remanescente mais sensvel a agitao e concentrao de umectante, enquanto o tempo demonstra menor importncia sob as condies estudadas. A Figura 4.16 apresenta a interao entre os efeitos concentrao de sorbitol, umectante e tempo e na Figura 4.17 os efeitos de interao entre a concentrao de sorbitol, agitao e tempo. Observa-se, em ambas as figuras que a atividade remanescente (%) mais sensvel concentrao de sorbitol. A Figura 4.18 mostra a anlise de interao entre todos os efeitos: umectante, agitao, concentrao de sorbitol e tempo. Nota-se, para 0,5 M de sorbitol, que existe efeito sinergistico positivo para o umectante e a agitao, no tempo 40 minutos, pois ocorre uma

82

mudana significativa na inclinao das linhas. Para 1,0 M de sorbitol, as linhas no so paralelas e apesar de no se cruzarem, indicam efeito de interao.
85 84 Atividade remanescente (%) 83 82 81 80 79 78 77 76 75 3 Umectante (g/L) 5 Tempo 40 min Tempo 50 min Tempo 60 min

Figura 4.12. Anlise da interao entre os efeitos umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 2,1461, p = 0,12803]

84 Atividade remanescente (%) 82 80 78 76 74 72 70 sem Tipo de agitao com Tempo 40 min Tempo 50 min Tempo 60 min

Figura 4.13. Anlise da interao entre os efeitos tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 1,4820, p = 0,23739]

A Tabela 4.23 apresenta a anlise de varincia dos efeitos umectante, ausncia ou presena de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto estabilizado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Observa-se que a concentrao de 0,5 M e 1,0 M de sorbitol o efeito da variao da quantidade de umectante

83

no foi significativa sobre a atividade, a um alfa de 5% (p > 5%). J os fatores agitao, sorbitol e tempo se mostraram significativos. Dentre as interaes relevantes sobre a atividade remanescente em tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, esto: agitao com sorbitol, sorbitol com tempo, agitao com sorbitol e tempo. O efeito do umectante e das interaes umectante x tempo, agitao x tempo, umectante x sorbitol x tempo, e o umectante x sorbitol x agitao x tempo no foram significativos.

105 100 Atividade remanescente (%) 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 0,5 Sorbito l (M) 1,0 Tempo 40 min Tempo 50 min Tempo 60 min

Figura 4.14. Anlise da interao entre os efeitos concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 53,462, p = 0,00000]

88 86 Atividade remanescente (%) 84 82 80 78 76 74 72 70 3 5 3 5 3 5 Um ectante (g/L) Tempo: 40 m in Um ectante (g/L) Tem po: 50 min Um ectante (g/L) Tempo: 60 m in

Semagitao Comagitao

Figura 4.15. Anlise da interao entre os efeitos tipo de agitao, umectante e tempo sobre a atividade remanescente em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,
48) = 6,9704, p = 0,00220]

84

110 Atividade remanescente (%) 100 90 80 70 60 50 3 5 3 5 3 5 Um ectante (g/L) Tempo: 40 m in Um ectante (g/L) Tem po: 50 min Um ectante (g/L) Tempo: 60 m in

Sorbitol 0,5 M Sorbitol 1,0 M

Figura 4.16. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2, 48) = 1,3413, p = 0,27113]

110 Atividade remanescente (%) 100 90 80 70 60 50 sem com sem com sem com Tipo de agitao Tempo: 40 m in Tipo de agitao Tem po: 50 min Tipo de agitao Tempo: 60 m in

Sorbitol 0,5 M Sorbitol 1,0 M

Figura 4.17. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2, 48) = 6,7721,
p = 0,00257]

85

110 Atividade remanescente (%) 100 90 80 70 60 50

3 5 3 5

Tempo: 40 min

110 Atividade remanescente (%) 100 90 80 70 60 50

3 5 3 5

Tempo: 50 min

Atividade remanescente (%)

110 100 90 80 70 60 50 3 Umectant e Sorbitol 0,5 M 5 3 Umectante Sorbitol 1,0 M 5 Tempo: 60 min Semagitao Comagitao

Figura 4.18. Anlise da interao entre todos os efeitos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.
[F(2, 48) = 2,8739, p = 0,06624]

86

A Figura 4.19 apresenta os resduos em funo dos valores preditos da atividade remanescente (%) para o efeito umectante, agitao, concentrao de sorbitol e tempo, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Percebe-se que existe diferena entre as mdias do sorbitol 0,5 M e 1,0 M e as varincias. Tentou-se realizar a verificao das suposies: as observaes so independentes; a varivel dependente deve ter distribuio normal; homogeneidade de varincias. As observaes so independentes, pois houve aleatorizao dos dados. A homogeneidade de varincias foi um pouco afetada. Os resduos para 0,5 M esto muito mais dispersos do que os resduos para 1,0 M de sorbitol e isto prejudica a anlise.

Tabela 4.23. ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo da combinao para combinao de todos os efeitos em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0.
Causa de variao Constante Umectante Agitao Sorbitol Tempo Umectante*Agitao Umectante*Sorbitol Agitao*Sorbitol Umectante*Tempo Agitao*Tempo Sorbitol*Tempo Umectante*Agitao* Sorbitol Umectante*Agitao*Tempo Umectante*Sorbitol*Tempo Agitao*Sorbitol* Tempo Umectante*Agitao*Sorbitol*Tempo Erro/Resduos Total GL 1 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 2 2 48 71 SQ 458944,30 18,50 185,10 18506,00 203,90 88,60 55,50 524,60 26,60 18,40 662,00 439,40 86,30 16,60 83,90 35,60 297,20 21248,10 QM 458944,30 18,50 185,10 18506,00 101,90 88,60 55,50 524,60 13,30 9,20 331,00 439,04 43,20 8,30 41,90 17,80 6,20 F 74123,91 2,98 29,89 2988,90 16,46 14,31 8,97 84,73 2,15 1,48 53,46 70,97 6,97 1,34 6,77 2,87 p 0,00E-01 9,05E-02 1,62E-06 0,00E-01 3,59E-06 4,30E-04 4,33E-03 3,55E-12 1,28E-01 2,37E-01 6,12E-13 5,07E-11 2,20E-03 2,71E-01 2,57E-03 6,62E-02

* GL = Graus de Liberdade, SQ = Soma dos Quadrados, QM = Quadrado Mdio.

87

A Figura 4.20 mostra o diagrama de disperso das mdias e desvios padres da atividade remanescente (%) para o efeito umectante, agitao, concentrao de sorbitol e tempo, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Observa-se que no existe correlao entre as mdias e os desvios padres, ou seja, no ocorre aumento da disperso dos dados quando as mdias aumentam, porm observa-se que o desvio padro elevado entre o intervalo de 50 e 80% de atividade remanescente mdia, correspondente menor concentrao de sorbitol testada.

6 4 2 Resduos 0 -2 -4 -6 50 60 70 80 90 100 110 120

Valo res preditos

Figura 4.19. Resduos em funo dos valores preditos da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para todos os efeitos.

A Figura 4.21 apresenta o perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) para o efeito umectante, agitao, concentrao de sorbitol e tempo. Verifica-se que o mximo da resposta obtido na concentrao de umectante equivalente a 5 g/L, com agitao, sorbitol 1,0 M e tempo de 60 minutos, condies nas quais se deve obter um valor de 111% na reposta (atividade enzimtica).

88

6 5 4 3 2 1 0 50

Desvio padro

60

70

80

90

100

110

120

Mdias

Figura 4.20. Diagrama de disperso: mdias e desvios padres da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos, em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0.

Umectante (g/L)
130,00

Tipo de agitao

Sorbitol (M)

Tempo (min)

Desejabilidade
114,44 1,

111,05

,5

0, 30,000

,95104

sem

com

0,5

1,0

40

60

Figura 4.21. Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

Desejabilidade

45,240

Atividade remanescente (%)

79,839

89

A Tabela 4.24 apresenta o teste de Tukey aplicado s mdias da atividade remanescente (%), em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para os efeitos umectante, agitao, concentrao de sorbitol e tempo.

Tabela 4.24. Teste de Tukey aplicado s mdias da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para os tratamentos, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Umectante Tipo de Sorbitol Tempo AR (%) (g/L) agitao (M) (min) 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 3 3 3 5 5 5 com com sem sem com com sem sem com sem sem com sem sem sem sem sem sem com com com com com com 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 60 60 60 60 50 50 50 50 40 40 40 40 60 50 40 50 40 60 40 60 50 40 50 60 55,2067 58,4900 58,8767 60,7700 60,9733 62,3800 64,5433 65,1133 66,7533 68,3200 71,7933 72,4600 87,9733 89,9567 90,1900 93,0833 93,4767 94,7300 94,8367 95,3000 95,4900 97,5367 106,8267 111,0500 1
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** ****

* AR = Atividade Remanescente.

O teste de Tukey de comparao de mdias serve como indicao de onde se encontra o mximo da reposta. Os resultados de mximo so semelhantes aos obtidos no

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intervalo 1,0 e 2,0 M, apresentados no item 4.5.1.2. O teste de Tukey mostra que os menores valores da varivel reposta (atividade remanescente - %) foram obtidos nos casos em que a concentrao de sorbitol foi 0,5 M, com agitao, no tempo de 60 minutos, com 3 ou 5 g/L de umectante, embora tenha ocorrido muita coincidncia entre o intervalo de confiana. J o valor mximo da reposta aparece nitidamente para 5 g/L de umectante, com agitao, 1,0 M de sorbitol nos tempos de 50 ou 60 minutos. Esses valores no se confundem com mais nenhum outro intervalo de confiana. Com base na funo de desejabilidade obtida, mostrada na Figura 4.20, se observa a necessidade de fazer dois experimentos usando estes dois ltimos pontos para se poder afirmar, com certeza, que o mximo no tempo de 60 e no 50 minutos, pois como foi observado na anlise do efeito do tempo, o intervalo de confiana e o desvio padro no tempo de 60 minutos so muito elevados, o que pode ter afetado a obteno dos timos.

4.5.1.2. Anlise para a Concentrao de 1,0 e 2,0 M de Sorbitol

A anlise para avaliar a influncia da concentrao 1,0 ou 2,0 M de sorbitol na estabilidade do caldo bruto centrifugado foi realizada pelo planejamento fatorial completo, 4 fatores, misto de 2 e 3 nveis. Foi realizada a anlise sobre o R do modelo considerando as replicatas como blocos e verificou-se que no foi significativo o efeito do bloco sobre o modelo. Ento foi considerada a ausncia e presena de agitao, como bloco, tambm se verificou que no foi significativo o efeito do bloco sobre o modelo, e continuou com baixo ajuste. Usando 3 ou 5 g/L de umectante como blocos, foi observado efeito do bloco significativo sobre o modelo, embora continuasse a falta de ajuste. Ser verificado a seguir que considerar o umectante como bloco no muito correto, j que um fator quantitativo, mensurvel e controlvel. Foram vrias as transformaes algbricas usadas sobre a varivel resposta na tentativa de melhorar o ajuste da curva, no foi obtido xito com nenhuma das transformaes e nem com a reposta original quanto a um bom ajuste do modelo. Dentre as transformaes testadas pode-se destacar log(y), log (1/y), Raiz y, tang(y), cos y, sqrt(log(y)), y^1/3. A falta de ajuste do modelo considervel, sendo o R ajustado mximo encontrado igual a 0,68 para a transformao y1/3, um valor muito baixo para um ajuste de curva, no foi possvel estabelecer uma superfcie de resposta sobre as variveis neste intervalo entre 1,0 M e 2,0 M de sorbitol. Isso provavelmente se deve grande disperso dos dados (alto desvio padro), ou at mesmo pela inadequao do planejamento utilizado, ou pela combinao de ambos.

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Talvez um planejamento central composto com ponto central em 1,0 M fosse mais adequado para a obteno de um modelo mais apropriado. Ao analisar a disperso dos dados, mdias das replicatas e seus respectivos desvios padro, mostrado na Figura 4.22, percebe-se uma grande disperso e variabilidade dos dados, sendo o maior desvio padro obtido de 3,67. Embora a variabilidade dos resduos deva existir para um bom ajuste de modelo, uma variabilidade to grande como esta dificulta o ajuste do modelo. O ideal que os desvios padro oscilassem de maneira aleatria em torno do zero. Como a transformao da varivel reposta no causou uma mudana significativa sobre os resultados obtidos na anlise de varincia e ajuste de curva, optou-se em trabalhar com a varivel resposta original, sem qualquer transformao. Logo, os resultados apresentados referem-se melhor condio obtida para a varivel resposta na sua forma original. Como no foi possvel determinar um modelo adequado, foi considerado mais adequado determinar quais os fatores que afetam a resposta de interesse. O que feito pela anlise de varincia apresentada a seguir. A Tabela 4.25 apresenta o planejamento experimental utilizado para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol, 1,0 ou 2,0 M, capaz de garantir a estabilidade trmica da enzima.

4.0 3.5 3.0 Desvio padro 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 75 80 85 90 95 Mdia 100 105 110 115

Figura 4.22. Diagrama de disperso: mdias e desvios padres da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para todos os efeitos.

A Tabela 4.26 mostra a estatstica descritiva dos parmetros umectante, tipo de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente. Contm as mdias

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das replicatas, os desvios padro, e o intervalo de confiana dessas mdias, de onde se pode ver o efeito do desvio padro sobre o intervalo de confiana. Embora os diferentes tipos de obteno das mdias (ponderadas e no ponderadas) resultem no mesmo valor de mdias, o desvio do padro das mdias no o mesmo nos dois casos, sendo que na mdia ponderada pode-se ver o efeito do aumento da variabilidade do erro quando se muda de um nvel para outro da mesma varivel, o que se reflete no valor do intervalo de confiana. Os grficos que sero apresentados, a seguir, mostram o intervalo de confiana de cada mdia, no ponderada.

Tabela 4.25. Resposta do planejamento fatorial completo 4 fatores, misto de 2 e 3 nveis, utilizado para determinar a melhor concentrao do estabilizante sorbitol, 1,0 ou 2,0 M, para o caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Ensaio 1 Umectante (g/L) Tipo de agitao 3,0 com 3,0 com 3,0 com 5,0 com 5,0 com 5,0 com 3,0 sem 3,0 sem 3,0 sem 5,0 sem 5,0 sem 5,0 sem 3,0 com 3,0 com 3,0 com 5,0 com 5,0 com 5,0 com 3,0 sem 3,0 sem 3,0 sem 5,0 sem 5,0 sem 5,0 sem 3,0 com 3,0 com 3,0 com 5,0 com 5,0 com Sorbitol (M) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Tempo (min) 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 AR (%) 94,44 93,58 96,49 97,90 98,87 95,84 93,28 93,79 93,36 89,64 90,00 90,93 104,11 103,84 104,85 101,18 101,57 99,64 99,66 95,53 100,47 98,39 102,51 96,67 95,54 94,58 96,35 108,40 107,92

9 10

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Continuao da Tabela 4.25. 10 5,0 3,0 11 3,0 3,0 5,0 12 5,0 5,0 3,0 13 3,0 3,0 5,0 14 5,0 5,0 3,0 15 3,0 3,0 5,0 16 5,0 5,0 3,0 17 3,0 3,0 5,0 18 5,0 5,0 3,0 19 3,0 3,0 5,0 20 5,0 5,0 3,0 21 3,0 3,0 5,0 22 5,0 5,0 3,0 23 3,0 3,0 5,0 24 5,0 5,0
* AR = Atividade Remanescente.

com sem sem sem sem sem sem com com com com com com sem sem sem sem sem sem com com com com com com sem sem sem sem sem sem com com com com com com sem sem sem sem sem sem

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0 60,0

104,16 94,26 92,57 92,42 89,41 89,65 90,81 79,47 77,83 80,47 96,74 95,16 94,40 98,04 102,63 101,30 100,80 99,31 97,93 95,54 95,63 94,73 110,15 111,15 111,85 93,75 96,48 93,96 85,91 92,21 85,80 77,83 80,36 79,12 94,07 95,40 93,67 99,35 101,37 104,38 99,77 99,89 99,66

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Tabela 4.26. Estatstica descritiva da melhor combinao de umectante, tipo de agitao, tempo de incubao e concentrao do estabilizante sorbitol (1,0 ou 2,0 M) sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Umectante (g/L) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Tipo de agitao sem sem sem sem sem sem com com com com com com sem sem sem sem sem sem com com com com com com Sorbitol (M) 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 Tempo (min) 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 40 50 60 N 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Erro IC IC padro -95,00% +95,00% 93,4767 0,158360 92,80 94,16 Mdia 93,0833 0,589925 94,7300 0,877097 98,5533 1,529644 100,6567 1,363504 101,7000 1,461381 94,8367 0,863140 95,4900 0,511566 95,3000 0,286182 104,2667 0,301901 79,2567 0,769531 79,1033 0,730396 90,1900 0,384318 89,9567 0,432255 87,9733 2,118571 99,1900 1,732667 99,3467 0,828700 99,7733 0,066416 97,5367 0,893352 106,8267 1,340514 111,0500 0,493288 100,7967 0,589190 95,4333 0,689186 94,3800 0,522909 90,55 90,96 91,97 94,79 95,41 91,12 93,29 94,07 102,97 75,95 75,96 88,54 88,10 78,86 91,73 95,78 99,49 93,69 101,06 108,93 98,26 92,47 92,13 95,62 98,50 105,13 106,52 107,99 98,55 97,69 96,53 105,57 82,57 82,25 91,84 91,82 97,09 106,65 102,91 100,06 101,38 112,59 113,17 103,33 98,40 96,63

* IC = Intervalo de Confiana.

A anlise do efeito da varivel tempo sobre a reposta nos mostra uma tendncia do aumento da variabilidade da reposta com o aumento do tempo (Tabela 4.27). Parece haver uma tendncia de diminuio da mdia da resposta com o aumento do tempo. Aplicando o teste de tukey sobre as mdias, percebe-se que, na mdia, o efeito da varivel tempo quando este de 40 minutos maior que dos outros tempos e o intervalo de confiana deste tempo

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no se confunde com nenhum dos outros tempos. J os tempos de 50 e 60 minutos, tem em mdia, um efeito menor sobre a reposta, sendo que seus intervalos de confiana se confundem, a um nvel de confiana de 5%. A Tabela 4.28 apresenta o teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos da concentrao de sorbitol. A anlise do efeito da concentrao de sorbitol sobre a reposta, mostra uma maior variabilidade de dados na concentrao de 2,0 M. As mdias de ambos so muito semelhantes, induzindo que a alterao do nvel de sorbitol tem pouca ou nenhuma influncia na anlise dos intervalos de confiana mostra que estes dois grupos so homogneos. A anlise dos nveis do fator tipo de agitao revela que a desvio padro para o efeito com agitao bastante superior ao efeito sem agitao. Alm disso, suas mdias so muito prximas, o que mostra no haver efeito significativo do fator agitao sobre a reposta. O teste de Tukey sobre as mdias que afirma esta ideia apresentado na Tabela 4.29. A anlise da concentrao de umectante revela que ambos os casos tem variabilidade semelhante e que, em mdia, as respostas so mais elevadas usando 5 g/L de umectante. O teste de tukey, apresentado na Tabela 4.30, mostra que os efeitos destes dois grupos no so coincidentes, que os grupos no so homogneos.

Tabela 4.27. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tempo utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tempo (min) 40 50 60 Atividade remanescente (%) 97,36 95,01 95,50 **** **** 1 2 ****

Tabela 4.28. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos da concentrao de sorbitol utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Sorbitol (M) 1,0 2,0 Atividade remanescente (%) 95,87 96,04 1 **** ****

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Tabela 4.29. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do tipo de agitao utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Agitao sem com Atividade remanescente (%) 95,72 96,19 1 **** ****

Tabela 4.30. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos do umectante utilizado sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Umectante (g/L) 3,0 5,0 Atividade remanescente (%) 94,20 97,70 1 **** **** 2

A seguir, so apresentados os grficos de efeito de interao entre combinaes quadrtica, cbica e qudrupla dos parmetros. Na Figura 4.23 apresentada a interao entre os parmetros tipo de agitao e umectante. Nota-se que existe efeito sinergistico positivo entre esses dois parmetros, pois ocorre uma mudana na inclinao das linhas. A Figura 4.24 mostra a anlise da interao entre o efeito umectante e tempo e que o efeito de interao pequeno ou nenhum. Na Figura 4.25 apresentada a anlise de interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e umectante. Nota-se que para essa combinao no existe interao entre os efeitos. Para os efeitos de concentrao de sorbitol e tipo de agitao (Figura 4.26); tipo de agitao e tempo (Figura 4.27) e concentrao de sorbitol e tempo (Figura 4.28) observa-se que existe interao entre esses efeitos. Dentre as possibilidades de combinaes entre trs parmetros para avaliar se existe interao tem-se na Figura 4.29 a interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e umectante. Nota-se que em 1 M existe interao, pois ocorre a mudana de inclinao entre as linhas, enquanto a 2 M as linhas so praticamente paralelas, indicando que no existe efeito de interao. A Figura 4.30 mostra a combinao entre os parmetros: efeito umectante, tipo de agitao e tempo, sobre a atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Observa-se que no existe interao entre os efeitos em 40 minutos, mas existe entre 50 e 60 minutos.

97

Os efeitos da concentrao de sorbitol, umectante e tempo no apresentam interao (Figura 4.31) mas quando a concentrao de sorbitol e tempo combinado com o tipo de agitao (Figura 4.32), em 40 minutos no existe interao entre os efeitos, mas a 50 e 60 minutos verificado efeito sinergistico positivo.

102 Atividade remanescente (%) 100 98 96 94 92 90 sem Tipo de agitao com Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L

Figura 4.23. Anlise da interao entre os efeitos do tipo de agitao e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(1, 48) = 243,25, p = 0,0000]

100 Atividade remanescente (%)

98

96

94

92

Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L 40 50 Tempo (min) 60

90

Figura 4.24. Anlise da interao entre o efeito umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 30,729, p = 0,00000]

98

99 Atividade remanescente (%) 98 97 96 95 94 93 1 Sorbitol (M) 2 Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L

Figura 4.25. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(1,48) = 3,4568, p = 0,06913]

102 Atividade remanescente (%) 100 98 96 94 92 90 1 Sorbito l (M) 2 Sem agitao Com agitao

Figura 4.26. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e tipo de agitao sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(1,48) = 428,58, p = 0,0000]

99

100 Atividade remanescente (%) Semagitao Comagitao 98

96

94 40 50 Tempo (min) 60

Figura 4.27. Anlise da interao entre os efeitos do tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 20,344, p = 0,00000]

102 Atividade remanescente (%) 100 98 Sorbitol 1 M Sorbitol 2 M

96 94 92 40 50 Tempo (min) 60

Figura 4.28. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48)=69,327, p = 0,00000]

100

110 Atividade remanescente (%) 105 100 95 90 85 sem com sem com Tipo de agitao Sorbitol 1 M Tipo de agitao Sorbitol 2 M Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L

Figura 4.29. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e umectante sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(1,48) = 6,8863,
p = 0,01161]

105 Atividade remanescente (%)

100

95

90

Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L

sem com sem com sem com

85 Tipo de agitao Tempo: 40 m in Tipo de agitao Tem po: 50 min Tipo de agitao Tempo: 60 m in

Figura 4.30. Anlise da interao entre o efeito umectante, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 53,875, p = 0,00000]

101

104

Atividade remanescente (%)

100

96

92

Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L

88 1 2 1 2 1 2 Sorbitol (M) Tem po: 40 m in Sorbitol (M) Tem po: 50 m in Sorbitol (M) Tem po: 60 m in

Figura 4.31. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, umectante e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 2,8823, p = 0,06574]

Atividade remanescente (%)

108 106 104 102 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 1 2 Sorbitol (M) Tem po: 40 m in

Sem agitao Com agitao

1 2 1 2

Sorbitol (M) Tem po: 50 m in

Sorbitol (M) Tem po: 60 m in

Figura 4.32. Anlise da interao entre os efeitos da concentrao de sorbitol, tipo de agitao e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. [F(2,48) = 99,882,
p = 0,0000]

Na Figura 4.33 so mostrados os efeitos de interao entre todos os parmetros. Observa-se que ocorre efeito sinergistico, para a concentrao de sorbitol 1,0 M, pois ocorre a mudana de inclinao das linhas. Para a concentrao de sorbitol 2,0 M, observa-se efeito sinergistico positivo quando o tempo de incubao varia entre 50 e 60 minutos.

102

110

Atividade remanescente (%)

105

100

95

90 Tempo: 40 min 85
110 105 Tempo: 50 min

Atividade remanescente (%)

100 95 90 85 80 75

115 Atividade remanescente (%) 110 105 100 95 90 85 80 75 sem com sem com Tipo de agitao Sorbitol 1 M Tipo de agitao Sorbitol 2 M Umectante 3 g/L Umectante 5 g/L Tempo: 60 min

Figura 4.33. Anlise da interao entre todos os efeitos sobre a atividade remanescente (%) do caldo centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

103

A anlise da varincia, apresentada na Tabela 4.31, mostra que os efeitos do fator tipo de agitao e dos nveis do fator concentrao de sorbitol no foram significativos sobre o resultado. Como visto, anteriormente, nos grficos de anlise dos efeitos. A interao entre o efeito umectante x concentrao de sorbitol e umectante e concentrao de sorbitol e tempo tambm no foram significativos sobre a reposta. Os efeitos de maior magnitude sobre a reposta foram o umectante, umectante e agitao (enorme), umectante e concentrao de sorbitol, concentrao de sorbitol e tempo. O efeito da alterao dos nveis do fator concentrao de sorbitol e agitao sobre a varivel reposta no foi significativo. Tambm no foi significativa, a interao entre umectante e concentrao de sorbitol e umectante e concentrao de sorbitol e tempo.

Tabela 4.31. ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para combinao de todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Efeito Constante Umectante Agitao Sorbitol Tempo Umectante*Agitao Umectante*Sorbitol Agitao*Sorbitol Umectante*Tempo Agitao*Tempo Sorbitol*Tempo Umectante*Agitao*Sorbitol Umectante*Agitao*Tempo Umectante*Sorbitol*Tempo Agitao*Sorbitol*Tempo Umectante*Agitao*Sorbitol*Tempo Erro/Resduos Total GL 1 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 2 2 2 2 48 71 SQ 220,50 3,99 0,50 73,64 676,02 9,61 1191,05 170,80 113,07 385,33 19,14 299,44 16,02 555,16 33,04 133,40 3900,68 MQ 220,50 3,99 0,50 36,82 676,02 9,61 1191,05 85,40 56,54 192,66 19,14 149,72 8,01 277,58 16,52 2,78 F 79,34 1,43 0,18 13,25 243,25 3,46 428,58 30,73 20,34 69,33 6,89 53,87 2,88 99,88 5,94 p 0,00E-01 9,71E-12 2,37E-01 6,72E-01 2,62E-05 0,00E-01 6,91E-02 0,00E-01 2,56E-09 3,99E-07 6,99E-15 1,16E-02 5,39E-13 6,57E-02 0,00E-01 4,94E-03

662922,39 662922,39 238541,62

* GL = Graus de Liberdade, SQ = Soma Quadrtica, MQ = Mdia Quadrtica.

104

Quanto maior for a frao descrita pela regresso, significa que melhor ser o ajuste do modelo. Assim, se o coeficiente de determinao (R2) foi calculado como:

R2 =

SS mod elo 3.767,28 = = 0,9658. onde SSerro = SStotal SSmodelo SSmodelo = 3900,68 SS total 3.900,68
Devido ao fato de que o R2 sempre aumenta medida que se adicionam termos ao

133,40 = 3767,28. modelo, o uso do R2 ajustado prefervel, pois em geral, este nem sempre vai aumentar com o acrscimo de termos no modelo. De fato, se termos desnecessrios so adicionados ao modelo o valor de R2 ajustado frequentemente diminui. Quando o R2 e o R2 ajustado so muito diferentes, existe a possibilidade de que termos no significativos tenham sido adicionados ao modelo. O R2 ajustado foi calculado pela frmula (4.1).

2 Rajustado

SS erro n- p = 1- SS total n -1

(4.1)

Assim, R2ajustado = 0,94941. A Tabela 4.32 mostra o R2 ajustado do modelo obtido considerando-se todos os efeitos acima, mesmo os que no so significativos. Esta no uma regresso propriamente dita, com base num modelo de superfcie de resposta. apenas uma anlise da variabilidade dos dados que pode ser explicada com base nos efeitos significativos da ANOVA. Assim todos os efeitos apresentados na ANOVA, cerca de 95% dos dados puderam ser explicados por eles e suas interaes. Os valores do R2 mltiplo e R2 ajustado so elevados. Essa alta correlao da varivel dependente com as variveis independentes indicam que o modelo ajustado explica bem a variabilidade do valor da atividade remanescente. Portanto 94,94% da variao na atividade remanescente pode ser explicada atravs das variaes nas variveis e 5,06% da atividade remanescente so explicados por outras variveis que no constam no modelo. Para verificao da preposio da normalidade dos resduos calculou-se R2 ajustado. Esse explica 93,80% da variabilidade dos dados, evidenciando que o modelo proposto adequado para os dados. Retirando-se os efeitos no significativos do modelo e adicionado-se os valores dos seus SQ ao SQerro
puro,

o valor do SQerro

puro

foi 163,52 (133,40+16,02+9,61+0,50+3,99 =

163,52). Com este valor, foi recalculado o valor do R2 (0,9581) e R2 ajustado (0,9380) o que um valor razovel, pois cerca de 94% de variabilidade foi explicada em funo dos efeitos

105

significativos (Tabela 4.33). Assim, o modelo com base nos efeitos significativos e suas interaes foi significativo. No foi possvel calcular a falta de ajuste do modelo, pois a ANOVA, usou todos os graus de liberdade disponveis para calcular os efeitos significantes. Na Figura 4.34 so apresentados os resduos deixados pelo modelo. Observa-se que os resduos flutuam aleatoriamente em torno do zero, implicando que a varincia dos erros constante e a mdia igual a zero. Aplicando o teste de Tukey para comparar mdias, foi obtida a Tabela 4.34. Embora este teste seja mais usado para a ANOVA unifatorial na comparao de mdias, tambm pode ser usado como um mtodo adicional que permite observar os mximos e mnimos obtidos neste planejamento. Observa-se que as menores mdias foram obtidas com 3 g/L de umectante, com agitao, com 2,0 M de sorbitol e tempo 50 e/ou 60 minutos, embora pela anlise do intervalo de confiana destas mdias, no seja possvel afirmar que as os resultados destas duas mdias foram diferentes para estes dois tempos.

Tabela 4.32. Teste de significncia do modelo para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Varivel Dependente R mltiplo R mltiplo R2 ajustado Modelo SQ Modelo GL Modelo MQ
2

AR (%) 0,982752 0,965802 0,949416 3767,289 23 163,7952

Varivel Dependente SQ residual GL residual MQ residual F p

AR (%) 133,3951 48 2,779064 58,93897 0,00E-01

* AR = Atividade Remanescente; GL = Graus de Liberdade, SQ = Soma Quadrtica, MQ = Mdia Quadrtica.

Tabela 4.33. Teste de significncia do modelo da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, aps retirada dos efeitos no significativos. Varivel Dependente Modelo SQ Modelo GL Modelo MQ F
* AR = Atividade Remanescente.

AR (%) 3.767,289 23 163,7952 58,93897

Varivel Dependente Erro puro SQ Erro puro GL Erro puro MQ p

AR (%) 133,3951 48 2,779064 0,00E-01

106

4 3 2 Resduos 1 0 -1 -2 -3 75 80 85 90 95 100 105 110 115

Valores preditos

Figura 4.34. Resduos em funo dos valores preditos dos efeitos umectante, tipo de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

Por outro lado, tem-se a maior reposta com 5 g/L de umectante, com agitao, 1 M de sorbitol, nos tempos de 50 e/ou 60 minutos. Devido ao alto desvio padro apresentado no tempo de 60 minutos (ver anlise do efeito da temperatura) no possvel afirmar exatamente que o tempo de 60 minutos apresenta uma reposta significativamente maior que no tempo de 50 minutos, embora os dados nos mostrem esta tendncia. Nota-se que neste caso no foi feita uma superfcie de resposta, e, portanto no possvel obter informaes sobre caractersticas quadrticas do efeito do tempo sobre a resposta, e nem realizar extrapolaes e concluses sobre onde estaria o mximo ou o mnimo da resposta usando nveis internos dos fatores que no esto presentes no planejamento experimental. Desta forma, a funo desejabilidade est limitada aos nveis dos fatores do planejamento. Fazendo uma anlise da funo desejabilidade da resposta, com base nos efeitos apresentados pela anlise de varincia, obtm-se a Figura 4.35. Da anlise da funo de desejabilidade, percebe-se que se obtm um mximo na atividade remanescente, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, de cerca de 111% usando os nveis 5 de umectante, com agitao, 1,0 M de sorbitol e um tempo de 60 minutos. Fazendo uma corrida com estes nveis e verificando se a reposta obtida experimentalmente aproxima-se do valor esperado de 111% seria o ideal para se ter uma comprovao da validade dessa anlise. Mas como visto no teste de tukey, o efeito dos nveis do tempo de 50 e 60 minutos so muito semelhantes, e a reposta tima poderia ser obtida no tempo de 50

107

minutos. Isso poderia ser elucidado se o desvio padro no tempo de 60 minutos no fosse o maior de todos.

Tabela 4.34. Teste de Tukey aplicado anlise dos grupos homogneos de todos os parmetros utilizados sobre a atividade remanescente, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.
Umectante Tipo de Sorbitol Tempo AR (%) (g/L) agitao (M) (min)
1
**** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** **** *** * *** *

10 11 12 13

3 3 5 5 5 3 3 5 3 3 3 5 3 5 3 5 5 5 3 5 3 3 5 5

com com sem sem sem sem sem com sem com com com com com sem sem sem sem sem com sem com com com

2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1

60 50 60 50 40 50 40 60 60 40 60 50 50 40 40 40 50 60 50 40 60 40 50 60

79,10 79,26 87,97 89,96 90,19 93,08 93,48 94,38 94,73 94,84 95,30 95,43 95,49 97,54 98,55 99,19 99,35 99,77 100,66 100,80 101,70 104,27 106,83 111,05

*AR = Atividade Remanescente.

108

Umectante (g/L)
120, 00 112, 99 111, 05 109, 11

Tipo de agitao

Sorbitol (M)

Tempo (min)

Desejabilidade Atividade remanescente (%)

1,

,5

0,

70, 000

1, 0000

sem com

40

60

Figura 4.35. Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para todos os efeitos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

O teste de Levene (Tabela 4.35) no mostrou bons resultados quanto homogeneidade de varincia dos dados. A anlise das mdias e desvio padro, segundo o diagrama de disperso da Figura 4.20, mostra um alto desvio padro para uma mdia de 87,97 com 3,67 de desvio padro e esse foi o principal fator para o teste de Levene ter mostrado a falta de homogeneidade de varincias, j que no h visualmente indcios de uma correlao linear entre mdias e desvio padro. Desta forma, como no h fortes indcios sobre a violao desta hiptese, no h razo para no se aplica estatstica F do teste de anlise de varincia. A Figura 4.36 mostra que a suposio de normalidade dos resduos satisfeita. A Figura 4.37 apresenta os valores residuais da combinao de todos os fatores em funo da ordem em que foram realizados. Observa-se uma disposio dos erros de forma aleatria, que conforme explicado anteriormente, garante a independncia dos erros.

Desejabilidade

81,130

95,954

110,78

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Tabela 4.35. Teste de Levene para homogeneidade de varincias. Mdia quadrtica efeito 1,416847 Mdia quadrtica erro 0,477469 F 2,967411 p 7,3754E-04

3.0 2.5 2.0 Valor normal esperado 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 ,01 ,75 ,55 ,35 ,15 ,05 ,95 ,99

Resduos

Figura 4.36. Grfico da probabilidade normal esperada dos resduos para o modelo da atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0.

2 Resduos

-2

-4 0 10 20 30 40 O rdem 50 60 70 80

Figura 4.37. Resduos em funo da ordem do umectante, tipo de agitao, concentrao de sorbitol e tempo sobre a atividade remanescente (%) em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0.

110

4.6. EFEITO DE AGENTES QUMICOS

A influncia dos agentes qumicos (ons) sobre a atividade remanescente, em soluo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, do caldo bruto da xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, na concentrao final de 5mM, apresentada na Tabela 4.36. As mdias, intervalo de confiana, erro e desvio padro foram calculados pelo pacote STATISTICA 7. Observa-se que os ons K+, Na+ e NH4+ promovem um leve aumento na atividade para os ons e os ons Ca2+, Mn+2 e EDTA promovem inibio moderada, de aproximadamente 25-35%, enquanto o Mg2+, Zn2+ e Cu2+ a uma inibio bastante expressiva, reduzindo a atividade para menos de 30%. justificado na literatura que os ctions interagem com os resduos de aminocidos dos stios ativos da enzima, aumentando (modulao positiva) ou diminuindo (modulao negativa) a atividade enzimtica (Damaso et al., 2002). Nota-se que alguns dos efeitos, inibitrios (Ca2+, Mg2+ e Zn2+) e ativadores (Na+), observados sobre a atividade do caldo bruto da xilanase de B. pumilus CBMAI 0008 tambm foram observados em mesma ordem de grandeza para xilanase de T. lanuginosus IOC-4145, na concentrao final de 5mM (LEMOS et al., 2000).

Tabela 4.36. Estatstica descritiva da influncia dos aditivos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Fatores Total CaCl2 MnSO4 MgSO4 ZnSO4 CuSO4 KCl NaCl (NH4)2SO4 EDTA N 27 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ARM 64,4233 73,7533 69,2100 26,9100 12,3667 2,4033 101,4333 104,7400 126,7733 62,2200 Desvio padro 41,56593 0,44523 0,23065 1,79669 0,28746 0,30616 2,49885 2,63046 0,97623 0,98423 Erro 7,999368 0,257056 0,133167 1,037320 0,165965 0,176761 1,442710 1,518695 0,563629 0,568243 -95,00% 47,9804 72,6473 68,6370 22,4468 11,6526 1,6428 95,2259 98,2056 124,3482 59,7750 +95,00% 80,8663 74,8594 69,7830 31,3732 13,0808 3,1639 107,6408 111,2744 129,1984 64,6650

* ARM = Atividade Remanescente Mdia.

111

4.7. EFEITO DOS AGENTES TENSOATIVOS

O planejamento 33 realizado para avaliar o efeito dos agentes tensoativos e tempo de processo sobre a atividade enzimtica remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH, pH 9,0, apresentado na Tabela 4.37 e na Tabela 4.38, a estatstica descritiva. Tabela 4.37. Resposta do planejamento experimental 33 utilizado para avaliar a influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Tempo (min) 60 60 60 30 30 60 30 30 60 45 30 30 45 45 60 60 30 30 30 30 60 30 30 60 60 60 60 Emulsificante (g/L) 1,0 1,0 2,0 1,0 1,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,5 1,0 2,0 1,5 1,5 2,0 1,0 1,0 2,0 2,0 1,0 2,0 1,0 2,0 1,0 1,0 1,0 2,0 Umectante (g/L) 1,0 5,0 5,0 1,0 5,0 5,0 1,0 1,0 5,0 3,0 5,0 5,0 3,0 3,0 1,0 1,0 1,0 5,0 5,0 5,0 1,0 1,0 1,0 5,0 5,0 1,0 1,0 AR (%) 24,07 36,71 45,91 55,01 58,86 33,74 51,07 51,78 33,74 56,13 56,91 54,56 55,07 57,27 24,88 33,52 65,34 56,99 57,46 61,76 14,56 47,15 51,07 31,76 25,68 17,37 24,17

* AR = Atividade Remanescente.

112

A ideia na anlise da influncia dos tensoativos, emulsificante e umectante, sobre a atividade, se deve avaliao da influncia da composio desses agentes na atividade, mais especificamente o umectante. O umectante contm em sua composio lcoois alifticos e esses poderiam ter efeito protetivo e, portanto estabilizante semelhante ao dos poliis para as enzimas utilizadas, principalmente o caldo bruto centrifugado.

Tabela 4.38. Estatstica descritiva da influncia dos agentes tensoativos sobre a atividade remanescente (%) em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para o caldo bruto centrifugado. Tempo Emulsificante Umectante N (min) (g/L) (g/L) 30 30 30 30 45 60 60 60 60 3 3 3 3 3 3 3 3 3 27
* IC = Intervalo de Confiana.

Mdia 55,83333 59,17667 51,30667 56,33667 56,15667 27,73333 31,38333 21,20333 38,48667 44,17963

Desvio Padro 9,12291 2,44046 0,40992 1,55648 1,10024 5,07021 5,52464 5,76424 6,51158 14,59925

IC -95,00% 33,17 53,11 50,29 52,47 53,42 15,14 17,66 6,88 22,31 38,40

IC +95,00% 78,50 65,24 52,32 60,20 58,89 40,33 45,11 35,52 54,66 49,95

1,0 1,0 2,0 2,0 1,5 1,0 1,0 2,0 2,0

1,0 5,0 1,0 5,0 3,0 1,0 5,0 1,0 5,0

Na ANOVA do projeto fatorial, houve falta de ajuste do modelo linear simples, sem combinaes e com combinaes lineares. Por isso, testou-se um modelo quadrtico dos efeitos principais e combinaes lineares, que no apresentou mais a falta de ajuste do modelo. A Tabela 4.39 mostra que as combinaes lineares no foram significativas. Os efeitos quadrticos dos agentes tensoativos, emulsificante e umectante, mostraram-se combinaes lineares de outros efeitos e no foram computados. Na ANOVA do modelo quadrtico e linear apenas com efeitos principais no houve falta de ajuste.Eliminando os efeitos de combinaes lineares e o efeito quadrtico de umectante e emulsificante e o efeito linear do emulsificante, que no foram significativos, tem-se a Tabela 4.40. A ANOVA

113

apresenta a estatstica lack-of-fit. Essa foi usada para testar a adequao e eficincia do modelo obtido. Infelizmente o coeficiente de determinao (R2) no mostrou alta concordncia (0,85898), devido dificuldade de representar a interao entre os fatores, principalmente o decrscimo de atividade com o aumento do tempo e concentrao de umectante. O lack-of-fit no significante, pois o valor de p de 0,138 excede o valor limite (0,05).

Tabela 4.39. ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo dos agentes tensoativos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Parmetro (1) Tempo (min) (L) Tempo (min) (Q) (2) Emulsificante (g/L) (L) (3) Umectante (g/L) (L) 1L by 2L 1L by 3L 2L by 3L Lack of Fit Erro puro Total SS SQ 4044,049 484,142 17,306 322,080 23,641 59,158 88,013 53,521 449,680 5.541,591 GL 1 1 1 1 1 1 1 1 18 26 MQ 4044,049 484,142 17,306 322,080 23,641 59,158 88,013 53,521 24,982 F 161,8769 19,3794 0,6927 12,8924 0,9463 2,3680 3,5230 2,1424 p 1,96E-10 3,44E-04 4,16E-01 2,09E-03 3,44E-01 1,41E-01 7,68E-02 1,61E-01

* SQ = Soma Quadrtica; GL = Graus de Liberdade; MQ = Mdia Quadrtica; R-sqr = 0,9092; R2 ajustado = 0,8757.

Os coeficientes estimados para o modelo significante so mostrados na Tabela 4.41 e Tabela 4.42. Na Tabela 4.42 o primeiro termo, constante, se refere ao intercepto. Tambm se observa que o efeito do tempo na atividade remanescente quadrtico e que tm grande efeito no modelo. O tempo tambm apresenta influncia de no-linearidade do modelo com o umectante. Com base na magnitude dos efeitos (Tabela 4.41), pode-se notar que o tempo tende a diminuir a atividade enquanto o umectante tende a elevar suavemente a atividade. No foi observada anormalidade no grfico de normalidade de erros (Figura 4.40) e dos resduos (Figura 4.41) indicando que o modelo consistente.

114

Tabela 4.40. ANOVA da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em funo dos agentes tensoativos em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, aps excluir os termos no significantes. Parmetro (1) Tempo (min) (L) Tempo (min) (Q) (3) Umectante (g/L) (L) Lack of Fit Erro puro Total SS SQ 4.044,049 484,142 322,080 241,639 449,680 5.541,591 GL 1 1 1 5 18 26 MQ 4.044,049 484,142 322,080 48,328 24,982 F 161,8769 19,3794 12,8924 1,9345 p 1,96E-10 3,44E-04 2,09E-03 1,38E-01

* SQ = Soma Quadrtica; GL = Graus de Liberdade; MQ = Mdia Quadrtica; R-sqr = 0,8753; R2 ajustado = 0,8590.

Tabela 4.41. Coeficientes estimados no modelo emprico para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, depois da excluso dos termos no significantes. Parmetro Constante (1) Tempo (min)(L) Tempo (min)(Q) (3) Umectante (g/L)(L) Efeito 56,16 -25,96 -26,95 7,33 Erro padro Erro puro 2,89 2,04 6,12 2,04
2

t(18) 19,46 -12,72 -4,40 3,59

p 1,54E-13 1,96E-10 3,44E-04 2,09E-03

IC -95,00% 50,09 -30,25 -39,81 3,04

IC +95,00% 62,22 -21,67 -14,09 11,61

* IC = Intervalo de Confiana; R-sqr = 0,8753; R ajustado = 0,8590.

Tabela 4.42. Coeficientes estimados no modelo de regresso para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, depois da excluso dos termos no significantes.
Parmetro Constante (1) Tempo (min)(L) (3) Umectante (g/L)(L) Tempo (min)(Q) Coeficiente de regresso -31,66 4,52 1,83 -0,06 Erro padro Erro puro 25,07947 1,22620 0,51013 0,01360
2

t(18) -1,26252 3,68968 3,59059 -4,40221

p 0,222874 0,001677 0,002090 0,000344

IC -95,00% -84,35 1,95 0,76 -0,09

IC +95,00% 21,027 7,100 2,903 -0,031

* IC = Intervalo de Confiana; R-sqr = 0,8753; R ajustado = 0,8590.

115

A Metodologia da Superfcie de Resposta (MRS) foi utilizada para otimizar as condies de manter a atividade enzimtica do caldo bruto estabilizado elevada. Os resultados experimentais analisados pela MRS geraram um modelo emprico, quadrtico, para a melhor resposta (equao 4.2), onde x1 = tempo (minuto) e x2 = umectante (g/L). E com base nos valores reais das variveis obtm-se a equao 4.3. Atividade remanescente (% ) = 56,16 - 12,98 x1 - 13,47 x12 + 3,66 x2

(4.2)

Atividade remanescente (% ) = -31,66 + 4,52 tempo - 0,06 tempo 2 + 1,83 umec tan te (4.3)

A superfcie de resposta e as curvas de nvel para a superfcie de resposta gerada pelo modelo obtido so apresentadas na Figura 4.38. ATabela 4.43 apresenta a resposta predita mxima de cada efeito no modelo proposto e Tabela 4.44 apresenta a influncia dos fatores sob a atividade remanescente a partir das respostas preditas para cada nvel de fator, mantendo-se os outros fatores constantes. Observa-se que o tempo apresenta atividade mxima a 37,5 minutos, sendo a atividade em tempos anteriores ou posteriores a esse, menores. Nota-se que o emulsificante independente da concentrao testada no influncia a atividade, enquanto o umectante medida que sua concentrao sofre incremento a atividade tambm aumenta. O que induz supor que a premissa de sua composio com lcoois alifticos influncia a estabilidade enzimtica, e, portanto sua atividade remanescente. Com base nos dados pode-se afirmar que as condies ideais, para atividade remanescente mxima (62,94%) ocorrem com 37,5 minutos de incubao, com 1 g/L de agente emulsificante e 5 g/L de agente umectante.

Tabela 4.43. Resposta predita de cada efeito no modelo para atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tempo Emulsificante Umectante (min) (g/L) (g/L)
37,5 2,00 5,00
* IC = Intervalo de Confiana.

Valor desejvel
0,8992

Valor predito
62,9419

IC -95,00%
57,7741

IC +95,00%
68,1096

116

Como os fatores tempo e concentrao umectante apresentam efeito sobre a atividade, na Tabela 4.45 so apresentados os valores preditos para a atividade remanescente considerando esses dois fatores. O grfico de Pareto (Figura 4.42) mostra os valores do teste t student para cada parmetro que demonstrou afetar a atividade remanescente (%). A linha tracejada indica a magnitude da significncia estatstica dos efeitos com um nvel de significncia de 95%. O grfico mostra que somente o umectante apresenta efeito significante na atividade enzimtica.

Tabela 4.44. Respostas preditas para cada nvel de cada fator mantendo todos os outros fatores constante. Fator Nvel do fator 30,0 37,5 Tempo (min) 45,0 52,5 60,0 1,0 1,3 Emulsificante (g/L) 1,5 1,8 2,0 1,0 2,0 Umectante (g/L) 3,0 4,0 5,0 Valor desejvel 0,847524 0,899170 0,854571 0,713729 0,476643 0,899170 0,899170 0,899170 0,899170 0,899170 0,794503 0,820670 0,846836 0,873003 0,899170 Valor predito 59,327 62,942 59,820 49,961 33,365 62,942 62,942 62,942 62,942 62,942 55,615 57,447 59,279 61,110 62,942 IC -95,00% 55,614 57,774 53,390 44,793 29,652 57,774 57,774 57,774 57,774 57,774 50,447 52,624 54,576 56,287 57,774 IC +95,00% 63,039 68,110 66,250 55,129 37,078 68,110 68,110 68,110 68,110 68,110 60,783 62,270 63,981 65,933 68,110

117

60 50 40 30

(a)

5.0 4.5 4.0 Umectante (g/l) 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 60 55 50 45 40 35 30

Tempo (min)
(b) Figura 4.38. (a) Superfcie de resposta que mostra o efeito das diferentes concentraes de umectante e tempo na atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado. (b) Curva de nvel para a superfcie do item (a).

118

Tempo (min) 90,000 68,110 62,942 57,774

Emulsificante (g/L)

Umectante (g/L)

Desejabilidade Atividade remanescente (%)

1,

70,00

,5

35,00

0,

0,00

-20,00

,89917
Desejabilidade

30, 37,5

60,

1,

2,

1,

5,

Figura 4.39. Perfil para os valores preditos e desejabilidade da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado para os agentes tensoativos.

2.5 2.0 1.5 Valor normal esperado 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -15 -10 -5 0 Resduos 5 10 ,75 ,55 ,35 ,15 ,05 ,01 15 Probabilidade ,99 ,95

Figura 4.40. Grfico de normalidade dos erros, da atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, em funo dos agentes tensoativos.

119

15 10 5 Resduos 0 -5 -10 -15 0 5 10 15 Ordem 20 25 30

Figura 4.41. Resduos em funo da ordem para a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, para os agentes tensoativos.

Time (L) Time (Q) Agente umectante (L) X2 (L) by X3 (L) X1 (L) by X3 (L) X1 (L) by X2 (L) Agente emulsificante (L) -4,40 3,59 1,88 1,54 0,97 -0,83 p = 0,05

-12,72

Figura 4.42. Grfico de Pareto dos efeitos estimado (valor absoluto) sobre a atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado.

Tabela 4.45. Valores preditos para a atividade remanescente (%). Fator Constante (1) Tempo (min)(L) Tempo (min)(Q) (3)Umectante (g/L)(L) Predito -95,00% Confiana +95,00% Confiana -95,00% Predito -95,00% Predito CR -31,6633 4,5243 1,8317 Valor VR CR -31,6633 37,500 169,6604 4,5243 3,000 5,4950 60,1944 59,2785 54,5763 47,7729 70.7842
2

Valor

VR

CR -31,6633

Valor

VR

CR -31,6633

Valor 37,500 4,500

VR 169,6604 8,2425 62,0260 57,0566 66,9955 50,4086 73,6434

37,500 169,6604 4,5243 3,500 6,4108 60,1944 55,4617 64,9271 48,6763 71,7125 1,8317

37,500 169,6604 4,5243 4,000 7,3267 61,1102 56,2874 65,9330 49,5548 72,6656 1,8317

-0,0599 1406,250 -84,2135 -0,0599 1406,250 -84,2135 -0,0599 1406,250 -84,2135 -0,0599 1406,250 -84,2135 1,8317

CR = Coeficiente de Regresso, VC = Valor do Coeficiente, R-sqr = 0,87525; R ajustado = 0,85898, 3 fatores, 1 bloco, 27 corridas, Mdia Quadrtica Erro Puro = 24,98224.

121

4.8. EFEITO DO CARBONATO-BICARBONATO USADO COMO TAMPO

A estabilizao da xilanase de B. pumilus CBMAI 0008, tem por finalidade possibilitar a sua aplicao no processo de biopurga de tecidos em malha 100%. Nos testes realizados em laboratrio, utilizado soluo tampo glicina-NaOH, entretanto para sua aplicao industrial esse tipo de correo de pH deve ser realizado com produtos que confiram alcalinidade, como carbonato de sdio, ou hidrxido de sdio, por isso so apresentados na Tabela 4.46 o comportamento da atividade do caldo bruto centrifugado utilizando uma mistura de carbonato-bicarbonato de sdio 100 mM, que conferisse pH 9,0. Observa-se que a atividade, independente da temperatura, apresenta uma forte inibio da atividade com o uso deste produto para a correo do pH (9,0).

Tabela 4.46. Efeito do carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0, sobre a atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado. Temperatura (C) 40 45 50 55 Ae (U/mL) 22,46 23,72 21,06 12,19 Temperatura (C) 60 70 80 90 Ae (U/mL) 7,28 2,29 1,27 1,38

*Ae = Atividade enzimtica, mdia, em soluo tampo glicina-NaOH a 50C, 120 U.

4.9. ENSAIOS DE BIOPURGA EM MALHA COM XILANASE

Os resultados apresentados, a seguir, so dos ensaios preliminares, antes do estudo de estabilizao do caldo bruto e dos ensaios com o caldo bruto aps determinadas as condies de estabilidade, para avaliar se ocorreu alguma alterao significativa nos resultados obtidos.

4.9.1. Ensaios Preliminares Caldo Bruto sem Estabilizao

Para avaliar o desempenho do caldo bruto centrifugado no substrato txtil, tecido de malha 100% algodo cru, foi realizado ensaio de biopurga nas temperaturas de 50C e 60C,

122

variando-se o tipo de biopurga empregado: com preparao e all in, conforme descrito na seo 3.5.1. Tambm foi testado o efeito dos auxiliares qumicos e da soluo tampo para avaliar a efetividade da enzima. A preparao enzimtica Pulpzyme HC tambm foi submetida biopuga com preparao e all in, conforme descrito na seo 3.6.1, para a temperatura 50C. Com o objetivo de avaliar o efeito da biopurga na malha, bem como comparar com o processo convencional de purga (alcalina), testes de hidrofilidade, grau de alvura e perda de massa foram realizados. Na Tabela 4.47 apresentada a mdia de hidrofilidade para os tipos de purga estudados e do algodo cru. Observa-se que tanto a malha bruta apresentou hidrofilidade em um tempo superior a 3 minutos, quanto os corpos de prova utilizados como controle dos testes dos auxiliares qumicos. Os corpos de prova citados como teste de tampo e teste de auxiliares qumicos foram submetidos ao processo de biopurga com preparao, sendo que no controle do teste de tampo foi utilizado somente gua e no chamado tampo somente o tampo. Para o teste dos auxiliares qumicos, o controle foi utilizado somente tampo e no chamado auxiliares foi utilizado, conforme a etapa, gua ou tampo, adicionado de auxiliares qumicos. O corpo de prova submetido purga alcalina apresentou hidrofilidade instantnea. A biopurga all in, para xilanase, no apresentou hidrofilidade instantnea, tanto para a temperatura testada a 50C quanto para a 60C, indicando que permaneceu material hidrofbico na superfcie da fibra, entretanto o menor tempo para a umectao ocorreu com o processo no qual foi utilizado a Pulpzyme HC, a 50C. A biopurga com preparao, utilizando xilanase apresentou hidrofilidade instantnea somente a 60C, entretanto deve-se considerar que no tempo de processo utilizado este resultado se deve somente ao tampo e produtos qumicos utilizados, pois a xilanase apresentou estabilidade num tempo mximo de 15 minutos. Os corpos de prova submetidos biopurga com preparao a 50C utilizando Pulpzyme HC, apresentaram hidrofilidade instantnea. Resultado semelhante ao encontrado por Hartzell e Hsieh (1998) quando aplicado pr-tratamento com gua a 100C antes da etapa enzimtica. Deve-se considerar que, num tempo de processo de 30 minutos, ocorreu aumento da hidrofilidade das enzimas na biopurga com preparao, comparativamente all in, sendo o efeito desejado de hidrofilidade instantnea obtido com a Pulpzyme HC. Supe-se que este aumento ocorra devido remoo de sais das fibras e do material graxo, pela etapa de

123

preparao. Na biopurga all in, estas substncias permanecem em suspenso no mesmo banho que a enzima, o que corrobora a hiptese anterior.

Tabela 4.47. Mdia de hidrofilidade para os tipos de purga estudados.

Purga Teste do Tampo Teste dos auxiliares qumicos Enzimtica all in Corpo de prova Controle Tampo Controle Auxiliares Controle Xilanase Xilanase Controle Pulpzyme HC Pulpzyme HC Controle Xilanase Enzimtica com preparao Xilanase Controle Pulpzyme HC Pulpzyme HC Tempo de hidrofilidade 50C 60C HI 2 s 11 centsimos HI HI > 3 minutos > 3 minutos HI HI 2 s 46 centsimos 16 s 81 centsimos 2 s 82 centsimos 2 s 52 centsimos 1 s 18 centsimos 1 s 29 centsimos 3 s 08 centsimos HI HI 14 s 02 centsimos HI HI -

* Malha crua hidrofilidade > 3 minutos; malha aps purga alcalina (padro) teve hidrofilidade instantnea, HI = Hidrolifidade instantnea.

A Figura 4.43 ilustra as variaes encontradas no grau de alvura, para os corpos de

prova, aps os processos de biopurga com substncias qumicas auxiliares, soluo tampo glicina-NaOH - pH 9,0 - e xilanase, realizada a 50C e 60C, utilizando a purga alcalina como padro. Observa-se que todos os processos de biopurga, a 50C e 60 apresentaram grau de alvura inferior ao do padro (purga alcalina) e trs vezes maior que o da malha bruta, que foi, em mdia, 11,27Berger. Os testes com tampo e auxiliares, a 50C e 60C, tambm apresentaram grau de alvura inferior ao padro. A biopurga all in mostrou grau de alvura inferior a biopurga com preparao. Na Figura 4.44 apresentado o grau de alvura, aps processamento a 50C, dos corpos de prova utilizados na biopurga com auxiliares qumicos, soluo tampo glicinaNaOH - pH 9,0, xilanase e Pulpzyme HC, comparado ao padro. Observa-se que a biopurga com preparao, para ambas as enzimas, apresentou um pequeno aumento no grau de alvura em relao biopurga all in, entretanto os resultados foram inferiores ao obtido para o padro.

124

40,00
Grau de alvura (Berger)

Controle Amostra

35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00

M alha crua

Teste do tampo 50C

Teste dos Biopurga auxiliares com 50C preparao - 50C

Biopurga "all in" 50C

Teste do tampo 60C

Teste dos Biopurga auxiliares com 60C preparao - 60C

Biopurga "all in" 60C

Padro

Tipo de processo

Figura 4.43. Grau de alvura nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, sob diversas condies, tendo os corpos de prova da purga alcalina como padro.

40,00
Grau de alvura (Berger) .

35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00

Controle Amostra

Biopurga com preparao Xilanase

Biopurga com preparao Pulpzyme HC

Biopurga "all in" Xilanase

Biopurga "all in" Pulpzyme HC

Padro

Tipo de processo testado a 50C

Figura 4.44. Grau de alvura nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, com preparao e all in, sendo a purga alcalina o padro.

A perda de massa nos corpos de prova, realizada a 50C e 60C, aps os processos de biopurga com substncias qumicas auxiliares, soluo tampo glicina-NaOH - pH 9,0 - e xilanase, utilizando os corpos de prova da purga alcalina como padro apresentada na Figura 4.45. Observa-se que os processos de biopurga e testes com tampo e substncias qumicas auxiliares apresentaram menor perda de massa que o padro. A purga alcalina utilizada como

125

padro apresentou a maior perda de massa. A maior perda de massa da biopurga all in a 50C em relao a 60C, se deve desativao da enzima nos primeiros 15 minutos de processo, a 60C. Observa-se a influncia da temperatura empregada no processo no teste dos auxiliares, pois a perda de massa foi maior a 60C.

4,50% 4,00% 3,50% 3,00% 2,50% 2,00% 1,50% 1,00% 0,50% 0,00%

Controle Amostra

Perda de massa (%)

Teste do tampo - 50C

Teste dos auxiliares 50C

Biopurga com Biopurga "all Teste do preparao in" - 50C tampo - 60C 50C

Teste dos Biopurga com Biopurga "all auxiliares - preparao in" - 60C 60C 60C

Padro

Tipo de processo

Figura 4.45. Perda de massa nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, sob diversas condies, sendo a purga alcalina o padro.

A Figura 4.46 mostra que a perda de massa nos corpos de prova aps o processo de biopurga com xilanase e Pulpzyme HC, realizado a 50C, foi inferior aos da purga alcalina, sendo a perda de massa do processo de purga alcalina utilizada como padro. Quanto perda de massa devido ao processo enzimtico, verifica-se que no houve diferena significativa entre a biopurga all in, com xilanase e Pulpzyme HC, em relao ao controle. Para a biopurga com preparao, verifica-se que ocorreu diferena na perda de massa entre o controle e os corpos de prova que tiveram atuao da xilanase e Pulpzyme HC. Esta pequena variao entre o tampo e enzima, tambm foi verificado por Csiszr et al. (2001a), quando utilizou Pulpzyme HC (Novozymes), com atividade endoxilanase, sob as condies pH 7,0 (tampo fosfato), 50C, agitao mecnica de 402 rpm, 1 g/L de surfactante no inico. Entretanto em outro trabalho Csiszr et al. (2001b), utilizando as mesmas condies experimentais, verificaram a perda de massa significativa entre o controle e a enzima.

126

4,50% 4,00%
.

Controle Amostra

3,50%
Perda de massa (%)

3,00% 2,50% 2,00% 1,50% 1,00% 0,50% 0,00%

Biopurga com preparao - Xilanase Biopurga com preparao Pulpzyme HC Biopurga "all in" Xilanase Biopurga "all in" Pulpzyme HC Padro

Tipo de processo testado a 50C

Figura 4.46. Perda de massa nos corpos de prova aps os ensaios preliminares de biopurga, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, com preparao e all in, sendo a purga alcalina o padro.

4.9.2. Ensaios com o Caldo Bruto Estabilizado

Inicialmente foi feita a anlise estatstica dos planejamentos experimentais executados para determinar as condies efetivamente capazes de conferir estabilidade ao caldo bruto centrifugado, na biopurga. Aps os ensaios de biopurga os corpos de prova foram submetidos s anlises de grau de alvura, perda de massa e hidrofilidade. Os resultados de hidrofilidade so apresentados na Tabela 4.48. Nota-se que somente o controle da purga alcalina no apresentou hidrofilidade instantnea, aproximadamente 24 segundos e 44 centsimos. Para todas as biopurgas, tanto o controle como a amostra, apresentaram hidrofilidade instantnea, como a amostra da purga alcalina, que foi usado como padro de referncia. O grau de branco e as coordenadas de cor so apresentadas na Tabela 4.49. Para facilitar a visualizao da quantidade de cor removida das amostras, o grau de branco foi graficado e apresentado na Figura 4.47. O corpo de prova submetido purga enzimtica tem menor grau de branco que o submetido a purga alcalina, pois a purga alcalina mais agressiva e no especfica, removendo as ceras, pigmentos e piolhos da superfcie do corpo de prova.

127

Os corpos de prova biopurgados apresentaram valores similares de grau de alvura, bem como valores de a* e b*.

Tabela 4.48. Hidrofilidade conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo. Processo Controle Mdia Amostra Mdia PA 00:00:23.45 00:00:26.35 00:00:23.53 00:00:24.44 HI HI HI HI PE3CBX HI HI HI HI HI HI HI HI PE5CBX HI HI HI HI HI HI HI HI PE3P HI HI HI HI HI HI HI HI PE5P HI HI HI HI HI HI HI HI

* Malha crua hidrofilidade > 3 minutos; malha aps purga alcalina (padro) teve hidrofilidade instantnea, HI = Hidrolifidade instantnea; PA = purga alcalina; PE3CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 3 g/L de umectante; PE5CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 5 g/L de umectante; PE3P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante; PE5P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 5 g/L de umectante.

O branco ideal definido atravs das coordenadas colorimtricas do sistema CIE deve possuir valor de croma igual a 0 (a* e b*) e o de luminosidade (L*) igual a 100. Portanto a brancura de um tecido depende tanto de sua luminosidade quanto de sua tonalidade. A Tabela 4.49 apresenta o grau de alvura e coordenadas colorimtricas conferidas aos corpos de prova pela purga alcalina e enzimtica. Observa-se que todos os processos de purga aumentaram a luminosidade dos corpos de prova, e o maior valor foi alcanado pela purga alcalina. Dentre os valores de croma obtidos, o mais relevante para anlise o -b* a +b* (azul-amarelo), pois a cor azul confere, aspecto limpo e a cor amarela, aspecto sujo. Assim, o algodo bruto apresentou croma +b* = 14,70, portanto aspecto sujo (conferido pelos pigmentos e ceras presentes nas fibras do algodo bruto). Aps os processos de purga, nota-se que a amostra da purga alcalina apresentou o menor valor de +b* = 9,87, portanto um valor mais prximo do azul, e consequentemente do aspecto limpo. Dentre os processos de purga utilizados, a que apresentou esse aspecto limpo foi a amostra submetida a purga enzimtica com caldo bruto centrifugado. A mdia dos resultados de +b* foram bastante prximos, para 3 e 5 g/L de umectante, 10,08 e 10,06, respectivamente. Para a Pulpzyme HC, os resultados apresentaram um aspecto positivo para o aumento da concentrao de umectante utilizada, para 3 e 5 g/L de umectante, 10,39 e 10,17, respectivamente. Quanto ao grau de alvura, as amostras de purga enzimtica, demonstraram que o aumento da concentrao de umectante, teve efeito positivo. Tanto para o caldo bruto

128

centrifugado quanto para a Pulpzyme HC, o aumento da concentrao de 3 para 5 g/L aumentaram o grau de alvura, sendo mais expressivo esse aumento para a Pulpzyme HC.

Tabela 4.49. Grau de alvura e coordenadas de cor conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo. Tipo de processo Controle PA Amostra Dados L* 87,83 87,90 88,00 90,36 90,46 90,48 88,28 88,17 87,93 88,63 88,66 88,42 88,22 88,25 88,33 88,84 88,56 88,72 88,44 88,38 88,47 88,31 88,16 88,19 88,35 88,81 88,20 88,67 88,47 88,55 85,49 85,76 85,96 85,74 85,84 a* 1,79 1,78 1,73 1,12 1,10 1,15 1,43 1,44 1,54 1,36 1,36 1,38 1,43 1,42 1,40 1,32 1,36 1,28 1,36 1,47 1,40 1,37 1,45 1,45 1,14 1,32 1,46 1,34 1,35 1,42 2,34 2,21 2,21 2,26 2,16 b* 11,11 11,11 11,25 9,94 9,84 9,83 10,45 10,34 10,72 10,08 9,97 10,21 10,43 10,40 10,40 10,00 10,16 10,01 10,15 10,34 10,26 10,34 10,37 10,47 10,32 10,15 10,49 9,98 10,16 10,36 15,04 14,70 14,64 14,77 14,33 C* 11,25 11,25 11,38 10,01 9,90 9,90 10,55 10,44 10,83 10,17 10,07 10,30 10,52 10,50 10,50 10,08 10,25 10,09 10,24 10,44 10,36 10,43 10,47 10,57 10,42 10,23 10,60 10,07 10,25 10,46 15,22 14,87 14,81 14,94 14,49 Grau de alvura (CIE) 16,32 17,52 17,10 29,39 30,12 30,21 21,64 21,89 19,45 24,29 24,88 23,15 21,59 21,78 21,97 25,22 23,75 24,85 23,47 22,44 23,01 22,23 21,70 21,27 22,44 24,44 21,21 24,85 23,51 28,20 -7,84 -5,51 -4,67 -5,87 -3,46

Controle PE3CBX Amostra

Controle PE5CBX Amostra

Controle PE3P Amostra

Controle PE5P Amostra

Algodo bruto

Leituras de grau de alvura em Espectrofotmetro (Mtodo Ganz). Ensaios realizados em ambiente temperatura 20 2C e UR (%) = 65 2. Padro: porcelana. PA = purga alcalina; PE3CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 3 g/L de umectante; PE5CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 5 g/L de umectante; PE3P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante; PE5P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 5 g/L de umectante.

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35 30 Grau de alvura (CIE) . 25 20 15 10 5 0 -5 -10 Algodo bruto PA PE3CBX PE5CBX Tipo de processo PE3P

Controle Amostra

PE5P

Figura 4.47. Grau de alvura nos corpos de prova aps o processo enzimtico, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, purga enzimtica com caldo bruto centrifugado estabilizado contendo 3 g/L de umectante (PE3CBX) e 5 g/L de umectante (PE5CBX), com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante (PE3P) e 5 g/L de umectante (PE5P), tendo os corpos de prova da purga alcalina (PA) como padro.

A Tabela 4.50 mostra a perda de massa nos corpos de prova aps serem submetidos aos processos e a Figura 4.48 ilustra esses resultados de perda de massa na forma grfica. Percebe-se que a purga alcalina apresentou maior perda de massa e o corpo de prova denominado controle apresentou resultado semelhante aos obtidos para as biopurgas. Os resultados dos processos de biopurga se confundem. O controle, para todos os processo de biopurga, foram semelhantes, o que induz a afirmao que a concentrao de 1,0 M de sorbitol presente no banho no influenciou no processo. Nota-se que os resultados dos diferentes tratamentos, em funo da variabilidade, podem ser considerados semelhantes, e que o uso de 3 ou 5 g/L de umectante tem o mesmo resultado, portanto o seu uso em menor quantidade se torna economicamente vivel.

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Tabela 4.50. Perda de massa (%) conferida aos corpos de prova conforme o tipo de processo. Processo Controle Mdia Amostra Mdia PA 2,73 2,87 2,63 2,74 4,20 4,19 4,17 4,19 PE3CBX 2,84 2,46 2,52 2,61 2,82 2,81 2,97 2,87 PE5CBX 2,62 2,63 2,68 2,65 2,87 3,00 3,05 2,97 PE3P 2,67 2,64 2,53 2,61 3,16 3,00 3,27 3,15 PE5P 2,53 2,70 2,83 2,69 2,89 2,94 3,05 2,96

PA = purga alcalina; PE3CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 3 g/L de umectante; PE5CBX = purga enzimtica com caldo bruto centrifugado contendo 5 g/L de umectante; PE3P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante; PE5P = purga enzimtica com Pulpzyme HC contendo 5 g/L de umectante.

4.50 4.00 Perda de massa (%) 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 PA PE3CBX PE5CBX Tipo de processo PE3P

Controle Amostra

PE5P

Figura 4.48. Perda de massa nos corpos de prova aps o processo enzimtico, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, purga enzimtica com caldo bruto centrifugado estabilizado contendo 3 g/L de umectante (PE3CBX) e 5 g/L de umectante (PE5CBX), com Pulpzyme HC contendo 3 g/L de umectante (PE3P) e 5 g/L de umectante (PE5P), tendo os corpos de prova da purga alcalina (PA) como padro.

131

4.9.3. Avaliao dos Efeitos do Caldo Bruto Estabilizado na Biopurga

Apesar dos ensaios terem diferentes caractersticas de tempo de incubao e quantidade de agentes tensoativos, e no caso do ensaio com a enzima estabilizada, presena de 1,0 M de sorbitol, pode-se perceber que as mudanas realizadas aps os testes preliminares para a realizao dos ensaio com a enzima estabilizada atingiram os resultados esperados, ou seja: a hidrofilidade se tornou instantnea, independente do tipo de enzima utilizada na biopurga com preparao a 50C, durante 60 minutos. Entretanto, esse tempo, em processo industrial considerado longo, devendo ser determinado o menor intervalo tempo de processo que atenda aos padres mnimos de umectabilidade exigidos pela indstria. O grau de branco, apresentado nos ensaios preliminares como mdia, foram conferidos por processos que utilizaram as condies operacionais usadas no processo convencional e no mostraram diferena entre o controle e a amostra. Quando os ensaios foram realizados nas condies timas para atuao das enzimas nota-se diferenas significativas entre controle e resposta, principalmente para a xilanase. Nota-se que as mesmas condies utilizadas para a preparao enzimtica Pulpzyme HC no foram favorveis, indicando que mesmo que o componente enzimtico de uma preparao seja o mesmo, no significa que a condio determinada aplicvel. A perda de massa apresentou grande variabilidade tanto nos ensaios denominados preliminares quanto nos com caldo estabilizado. Essa variabilidade se deve a presena dos piolhos e fibras que acabam se desprendendo.

4.9.4. Consideraes

As principais contribuies desse trabalho nos estudos de estabilidade trmica e nos ensaios de estabilizao do caldo bruto centrifugado de B. pumilus CBMAI 0008 sero comentadas a seguir. Tambm sero apresentados os resultados da influncia de agentes tensoativos e qumicos sobre a atividade enzimtica, bem como a aplicao do caldo bruto nas condies timas do processo de biopurga com preparao. Observou-se que a atividade enzimtica mxima, em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, foi alcanada a 55C, enquanto a bibliografia cita como sendo 60C. Como a diferena entre os valores das atividades foi pequena, pode-se considerar praticamente a mesma atividade, mas deve-se considerar que o decaimento da atividade enzimtica, devido a

132

esse incremento de 5C, pode ser bastante significativo quando o tempo de incubao considerado. A Tabela 4.51 apresenta o resumo dos parmetros da estabilidade trmica para o caldo bruto centrifugado e para a Pulpzyme HC.

Tabela 4.51. Resumo dos parmetros da estabilidade trmica. Enzima Estabilidade 100% 50% pH 8,0 pH 9,0 Ed [cal/mol] t1/2 [min] pH 9,0 40C 50C Modelo de decaimento Caldo bruto centrifugado 40C - 90 min 50C - 45 min 7,23 10,25 19.969,54 551 38
Kd = 8,222932.103 exp(Ed/RT)

Pulpzyme HC 40C - 150 min 60C - 150 min 6,49 7,01 29.179,47 estvel 158
Kd = 9,334706.1018 exp(Ed/RT)

Ea [kcal/mol]

Nos testes que foram avaliados os efeitos de inibio ou ativao na atividade enzimtica quando submetidos incubao na presena de aditivos qumicos, na concentrao 5 mM, verificou-se que o CuSO4 apresentou o maior efeito inibitrio (atividade remanescente mdia 2,40%) enquanto o (NH4)2SO4 promoveu a maior ativao da atividade (atividade remanescente mdia 126,77%). Conforme se desejava comprovar dentre as substncias disponveis nos processos txteis para ajuste de pH alcalino, sem adio de estabilizantes, verificou-se que o pH ajustado com carbonato-bicarbonato de sdio apresenta efeito negativo e quase totalmente inibitrio da atividade (17,66 U e 6,59 U, antes e aps tratamento trmico de uma hora, respectivamente, dados apresentados no Anexo A) indicando que seu uso para correo do pH em processo enzimtico seria inadequado. Utilizando-se o NaOH a atividade remanescente mdia foi de 69,68% (112,97 U e 78,73 U, antes e aps tratamento trmico de uma hora, respectivamente, dados apresentados no Anexo A). A soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, utilizada como controle, foi de 43,69% (184,58 U e 80,57 U, antes e aps tratamento trmico de uma hora, respectivamente, dados apresentados no Anexo A). Para demonstrar que a correo do pH necessria e fundamental em processos enzimticos, gua destilada foi testada com seu pH natural (aproximadamente

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6,00). Verificou-se que a atividade sofre diminuio, mdia aproximada de atividade remanescente 67,84% (44,99 U e 30,50 U, antes e aps tratamento trmico de uma hora, respectivamente, dados apresentados no Anexo A), mas esta no to brusca como quando utilizado a mistura carbonato-bicarbonato de sdio. A partir da MSR obteve-se as condies ideais, com atividade mxima remanescente de 62,94%, em 37,5 minutos de incubao, com 2 g/L de agente emulsificante e 5 g/L de agente umectante. Assim, para os ensaios de biopurga foram testadas as condies: concentrao de sorbitol 1,0 M, com agitao, 3 e 5 g/L de umectante, em 60 minutos de incubao e como a influncia do emulsificante no foi significativa, utilizou-se nos ensaios 1 g/L. Os corpos de prova com caractersticas ideais devem apresentar hidrofilidade instantnea, o maior grau de alvura possvel e pouca perda de massa. Na avaliao do desempenho da biopurga, em relao ao processo de purga alcalina, os resultados mostraram que na purga alcalina os tecidos de algodo apresentam maior grau de alvura, mas tambm a maior perda de massa, em relao a biopurga, para as diferentes condies de processo utilizadas. O uso de 3 ou 5 g/L de umectante na purga enzimtica promove diferena significativa no grau de alvura.

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CAPTULO 5 CONCLUSES

Neste trabalho avaliou-se a possibilidade de estabilizao do caldo bruto de B. pumilus CBMAI 0008 para possibilitar sua aplicao na indstria txtil. Entretanto, verificouse que a aplicao individualizada desta enzima no gera resultados capazes de suprir as exigncias mnimas necessrias para o produto txtil acabado. Por isso, o enfoque do trabalho foi a avaliao da influncia da interao entre a enzima e os agentes tensoativos, possveis produtos qumicos utilizveis para correo de pH e tambm os efeitos inibitrios de ons, possivelmente presente nas fibras de algodo que afetariam a atividade da enzima. Os objetivos propostos foram atingidos, porm, muitos aspectos ainda devem ser estudados (apresentados no Captulo 6 Sugestes para trabalhos futuros). Com base nestes resultados sugere-se que a temperatura ideal para o processo de biopurga com o substrato txtil deve ser no intervalo de 40-50C. Entretanto, quanto menor a temperatura empregada no processo, maior dever ser o tempo de incubao utilizado ou a concentrao de enzima utilizada. Para o processo de inativao, a temperatura deve ser entre 70-90C, com um tempo mximo de 15 minutos. Os poliis utilizados, glicerol, sorbitol e xilitol conferiram aumento na estabilidade a 50C, sendo o sorbitol o que proporcionou melhor resultado dentre as condies estudadas. O efeito dos agentes qumicos testados (ons e EDTA), na concentrao 5 mM, sobre a atividade remanescente em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, mostrou que os ons divalentes apresentaram maior efeito inibitrio em relao aos ons monovalentes. O efeito mais inibitrio foi ocasionado pelo CuSO4 enquanto o (NH4)2SO4 promoveu a maior ativao na atividade remanescente mdia. Dentre as substncias testadas para ajuste de pH alcalino, sem adio de estabilizantes, verificou-se que o pH ajustado com carbonato-bicarbonato de sdio apresenta efeito negativo e quase totalmente inibitrio da atividade. Portanto seu uso para correo do pH em processo enzimtico seria inadequado. Assim, apesar de diminuir a atividade enzimtica o NaOH seria mais adequado. Dentre as vrias combinaes de efeitos estudadas, para os agentes tensoativos (emulsificante e umectante); o umectante e o tempo, apresentaram influncia significativa sobre a atividade remanescente. A condio tima foi determinada atravs da MSR. Assim,

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para os ensaios de biopurga foram testadas as condies: concentrao de sorbitol 1,0 M, com agitao, 3 e 5 g/L de umectante, em 60 minutos de incubao. Os corpos de prova resultantes da purga alcalina apresentaram maior grau de alvura, perda de massa. Todos os processos, nas condies testadas, conferiram hidrofilidade instantnea. O efeito positivo do aumento de concentrao de umectante de 3 para 5 g/L, foi observado com maior facilidade no grau de alvura. Esse efeito foi positivo tanto para o caldo bruto centrifugado quanto para a Pulpzyme HC.

136

CAPTULO 6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Sugere-se para a continuidade desse trabalho a avaliao dos seguintes aspectos: Testar a xilanase combinada com as enzimas celulase, pectinase e lipase, na biopurga, para determinar as melhores condies operacionais (concentrao de enzima, pH (cido e neutro), temperatura, tempo, concentrao de agentes tensoativos, etc.) que possibilitem obter produtos acabados com melhor grau de alvura, toque, resistncia, etc. Comparar o efeito do tingimento dos corpos de prova tratados pelo processo enzimtico (empregando pool enzimtico) e alcalino, quanto solidez a luz e a lavao; Imobilizar a enzima xilanase de B. pumilus CBMAI 0008 em diversos suportes (xido de estanho, polmeros, emulses, etc) e determinar as propriedades catalticas, nas condies de processo, aps a imobilizao com a finalidade de reutilizao; Comprovar a reduo da toxicidade do efluente da purga enzimtica em relao ao efluente da purga alcalina, atravs de testes com bioindicadores; Realizar a anlise do ciclo de vida do produto, tanto aquele submetido ao processo enzimtico quanto o submetido ao processo alcalino; Testar o nmero de ciclos que a enzima pode ser empregada sem perder a estabilidade e conseqentemente a atividade. Testar a adio de protenas para melhorar a estabilidade.

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148

GLOSSRIO

AGENTE EMULSIFICANTE: diminui a diferena de tenso superficial (repulso mtua) entre as duas fases, de modo que uma passe a molhar a outra (BITTENCOURT FILHA et al., 1999). AGENTE UMECTANTE: substncia surfactante, que aumenta a hidrofilidade do tecido, por meio da reduo da tenso superficial do lquido e causam seu espalhamento sobre a superfcie das fibras, deslocando o ar (LEO et al., 2002). ALONGAMENTO: uma deformao longitudinal, ou seja, a extenso que a fibra sofre sob o efeito de uma fora de tenso. Quando a fibra submetida ao total de alongamento que ocorre, at o ponto de ruptura da fibra, tem-se o alongamento quebra. O total de alongamento um fator importante na avaliao da elasticidade, por isso o alongamento e a elasticidade devem ser considerados conjuntamente na avaliao da fibra (AGUIAR NETO, 1996). BRILHO: ou lustro o fator que determina se a fibra brilhante ou fosca, ou seja, o resultado do total de luz refletida por uma fibra (AGUIAR NETO, 1996). DEFEITOS POUCO FREQUENTES: caracterizado como ponto grosso e fino, que s ocorrem raramente e, para sua determinao, precisa-se ensaiar, no mnimo, 100.000 m de fio (MALUF e KOLBE, 2003). DENSIDADE: Representa a relao entre massa e volume (g/cm3). Deve-se considerar que fibras com diferentes densidades e dimetros iguais, apresentam diferentes poderes de cobertura capacidade da fibra de cobrir uma superfcie. Dependendo da fibra usada, tecidos feitos com fios de mesmo ttulo mesmo nmero de fios de trama e urdume e mesma massa por rea, possuem diferena na aparncia, flexibilidade, permeabilidade ou passagem do ar e cobertura (GALHANI, 1993; AGUIAR NETO, 1996). FIABILIDADE: ou qualidade para a fiao ou coeso, a habilidade apresentada pelas fibras de se manterem unidas durante o processo de manufatura do fio, como resultado do perfil longitudinal da fibra ou da forma da seo transversal, que a habilita a manter-se unida e a aderir adequadamente umas s outras. Esta coeso das fibras confere ao fio determinadas caractersticas como finura e ao tecido, finura, aparncia, textura, volume, durabilidade, facilidade de manuteno, etc (AGUIAR NETO, 1996). FIO CARDADO: o fio fabricado sem passar pela penteadeira, portanto possui mais fibras curtas, por isso propicia maior formao de pilling (bolinhas no tecido) e neps (defeito na

149

regularidade do fio). (MALUF e KOLBE, 2003). FLEXIBILIDADE: ou maleabilidade a capacidade da fibra dobrar-se com pequenos esforos, sem quebra (GALHANI, 1993; AGUIAR NETO, 1996). FORMA FSICA: confere certas diferenas no fio e nas propriedades dos tecidos. A relao comprimento-dimetro, forma da seo transversal, contorno da superfcie e irregularidades so bases para a descrio tanto da aparncia macroscpica quanto microscpica da fibra (AGUIAR NETO, 1996). IMPERFEIES: dos fios so defeitos casuais e peridicos que acontecem com bastante frequncia. Geralmente, so causadas pela matria-prima do fio ou no processo de preparao inadequado e afetam a aparncia dos tecidos planos e de malhas e tambm informam se o fio que est sendo adquirido igual, inferior ou superior ao fio normalmente utilizado. O nep (ponto grosso acentuado cujo comprimento inferior a 4 mm) uma imperfeio, que afeta consideravelmente a aparncia dos tecidos planos e de malhas. Causam problemas na malharia e tingimento (no tingem por grande nmero de corantes, aparecendo como pontos claros no tecido tingido) (MALUF e KOLBE, 2003). MOTES: sementes abortadas com fibras verdes e imaturas (COSTA et al., 2005). NAPS: minsculos detritos da calaza das sementes que vm aderidos s fibras (COSTA et al., 2005). NEPS: minsculos ns de fibras adelgaadas e verdes (COSTA et al., 2005). PILLING: So pequenas bolinhas que se formam na superfcie do tecido (CUNHA et al., 2000). PIOLHO: constitudo de pequenos entrelaamentos de fibras de algodo de vrios tamanhos, em mistura com caroos, fragmentos de cascas e de outras substncias eliminadas durante o descaroamento (PORTARIA M. A. n 055). PILOSIDADE: A pilosidade a relao de dois comprimentos (comprimento das fibras protradas/comprimento do campo de medida). A pilosidade H (Hairiness, em ingls ou Haarigkeit, em alemo) corresponde ao comprimento total de fibras protradas dentro do campo de medida de 1 cm de comprimento. Na unidade de medida da pilosidade do Regulmetro Uster Tester 3, considera-se a pilosidade de cerca de 1 cm de fio (MALUF e KOLBE, 2003). PREPARAO: Convencionou-se como a etapa de lavao com gua quente, com ou sem adio de tensoativos, visando melhorar a umectao da fibra para a etapa de pr-tratamento enzimtico. PR-TRATAMENTO: Convencionou-se como a etapa de tratamento da fibra, de forma

150

convencional ou enzimtica, para a etapa de tingimento. REGAIN: o massa da gua num material, expresso como porcentagem em relao ao massa seco em estufa da amostra. O teor de umidade o massa da gua num material expresso como porcentagem em relao o massa como recebido (amostra mida) (MALUF e KOLBE, 2003). RESISTNCIA: uma das principais caractersticas das fibras. A fora necessria para romper a fibra de algodo varia bastante, dependendo da parede da fibra e das avarias sofridas anteriormente. Somente 30 a 50% da resistncia individual da fibra transferida para o fio. Quando o algodo molhado, sua resistncia aumenta entre 10 e 20%, portanto os cuidados e as tcnicas de processo a mido no necessitam de modificaes para compensar uma possvel reduo da resistncia a mido. A toro necessria para produzir fios de fibras, e dar-lhes integridade e compacidade, eliminar salincias e melhorar a resistncia abraso dos mesmos. O ideal que cada fibra do fio apresente o caminho de uma espiral cilndrica perfeita. Deve-se considerar a toro como um parmetro determinante em muitas etapas do processo de beneficiamento, pois um dos fatores que regula a penetrabilidade dos corantes e a sua difuso no interior das fibras no fio e no artigo txtil (AGUIAR NETO, 1996; RHODIA-STER; MALUF e KOLBE, 2003). RELAO COMPRIMENTO-LARGURA: considera-se como relao comprimentolargura, quando os materiais fibrosos, possui o comprimento (dimenso linear da fibra contnua) consideravelmente maior do que o dimetro, numa razo mnima de 100, embora, a maioria das fibras apresentam uma relao muito maior. As fibras, especialmente as naturais, apresentam dimetro irregular ao longo do comprimento. Essa finura ou dimetro das fibras influncia as caractersticas funcionais de fios e tecidos. A indicao do ttulo das fibras apresenta trs formas usuais: (g/polegada, dado pelo aparelho Micronaire; dtex, g/10.000 m de fibras; den, g/9.000 m de fibras (GALHANI, 1993; AGUIAR NETO, 1996; MALUF e KOLBE, 2003). TENACIDADE: um termo usado para a resistncia de fibras individuais. definida, como a resistncia tenso expressa como a fora por unidade de densidade linear (g/tex ou N/tex) de uma amostra. Quanto resistncia trao de uma fibra depende do tipo de fibra, do processo de fabricao (fibras manufaturadas de tenacidade normal, mdia ou elevada), da espessura (ou dimetro) e distncia entre garras do dinammetro (quanto menor a distncia inicial entre as garras do dinammetro maior a resistncia da fibra, fio ou tecido, devido ao efeito do ponto fraco) (GALHANI, 1993; AGUIAR NETO, 1996; MALUF e KOLBE, 2003). TTULO: do fio define a relao entre a massa do fio e seu comprimento (MALUF e

151

KOLBE, 2003). UNIFORMIDADE: em fios e na construo de tecidos pode ser assegurada com mesclas de fardos, pois se consegue garantir similaridade no comprimento e na largura, na qualidade da fiao e na flexibilidade (AGUIAR NETO, 1996).

152

APNDICE

153

APNDICE A Atividades remanescentes

Tabela A1. Atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado no pH corrigido com NaOH, denominado soluo tampo NaOH 0,1 M, pH 9,0. Tipo de estabilizante Tempo de incubao (h) 0 Sem 1 0 Glicerol 1 0 Sorbitol 1 0 Xilitol 1

109,95 76,93 112,19 64,60 104,81 54,65 112,13 83,06 Atividade enzimtica (U) 111,96 76,51 110,31 61,80 111,47 49,91 108,67 87,05 117,00 82,75 110,54 67,15 109,73 50,08 107,90 84,10

Tabela A2. Atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado na soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0. Tipo de estabilizante Tempo de incubao (h) 0 Sem 1 0 Glicerol 1 0 Sorbitol 1 0 Xilitol 1

190,67 81,68 181,95 127,54 186,33 178,96 202,48 143,94 Atividade enzimtica (U) 185,27 78,36 179,88 125,36 191,60 178,96 194,18 150,58 177,80 81,68 179,58 127,54 191,42 179,17 201,03 156,60 Tabela A3. Atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado no pH corrigido com a mistura carbonato-bicarbonato, denominado soluo tampo carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH 9,0. Tipo de estabilizante Sem Tempo de incubao (h) 0 17,29 Atividade enzimtica (U) 17,23 18,47 Glicerol 1 6,63 6,91 6,24 0 20,82 20,46 19,42 1 13,34 13,13 12,72 0 20,92 19,57 20,04 Sorbitol 1 16,04 16,82 16,00 0 17,42 18,03 19,26 Xilitol 1 14,16 15,59 15,65

Tabela A4. Atividade enzimtica do caldo bruto centrifugado em gua destilada, pH 6,0. Tipo de estabilizante Tempo de incubao (h) 0 Sem 1 30,75 29,85 30,90 0 35,33 42,57 38,14 Glicerol 1 20,42 20,20 21,61 0 33,47 39,20 40,21 Sorbitol 1 31,74 27,64 29,91 0 34,86 37,93 43,33 Xilitol 1 24,10 25,93 26,80

45,65 Atividade enzimtica (U) 42,84 46,49

154

Tabela A5. Atividade remanescente (%) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicina-NaOH 0,1 M, pH 9,0, na presena de 5 mM de agentes qumicos. CaCl2 MnSO4 MgSO4 ZnSO4 CuSO4 KCl 73,30 69,03 25,16 12,41 2,17 100,65 74,19 69,13 26,82 12,06 2,29 99,42 73,77 69,47 34,37 12,63 2,75 104,23 * Atividade enzimtica (U): 122,18; 124,68; 124,27. NaCl (NH4)2SO4 106,81 125,77 101,78 126,83 105,63 127,72 EDTA 63,35 61,76 61,55

Tabela A6. Atividade enzimtica (U) do caldo bruto centrifugado em soluo tampo glicinaNaOH 0,1 M, pH 9,0, com as condies estudadas segundo o planejamento experimental para os agentes tensoativos. Condio Tempo (min) Umectante (g/L) Emulsificante (g/L) 0 72,64 67,32 30 47,46 31,74 71,64 39,41 45 29,83 25,22 23,65 60 24,35 11,69 17,24

Ensaio I

1,0

1,0

84,44 43,07 31,05 20,41 Ensaio II 1,0 2,0 73,18 37,37 24,37 18,21 70,35 36,43 23,99 10,24 73,23 45,23 28,60 23,26 Ensaio III 5,0 1,0 76,98 45,31 37,91 28,26 70,36 40,04 33,74 18,07 78,94 45,36 43,82 36,24 Ensaio IV 5,0 2,0 78,45 44,71 30,26 28,10 73,10 39,88 35,42 24,66 70,14 43,72 40,17 21,60 Ensaio V 3,0 1,5 71,49 46,38 40,13 21,81 74,08 45,24 40,80 24,05 *Enzima utilizada para atividade enzimtica de 75 U em soluo tampo glicina-NaOH.

155

ANEXO

156

ANEXO A Caractersticas das fibras e beneficiamento txtil

A.1. FIBRAS

As fibras txteis so elementos filiformes caracterizados pela flexibilidade, finura e grande comprimento em relao dimenso transversal mxima (comprimento da ordem de 1.000 vezes o dimetro), sendo aptas para aplicaes txteis. As fibras txteis podem ter vrias origens, que so usadas para sua classificao. As fibras so de origem natural de procedncia animal, vegetal ou mineral e de origem no natural produzidas por processos industriais (sintticas, inorgnicas e regeneradas) (AGUIAR NETO, 1996; ARAJO E MELO E CASTRO, 1986; MALUF e KOLBE, 2003). A estrutura das fibras apresenta nveis de organizao molecular que possuem relao estreita com certos aspectos do comportamento das fibras e das suas propriedades. O nvel primrio da estrutura molecular definido pela composio qumica e estrutura molecular da unidade repetitiva, bem como da ligao polimrica. Essa estrutura est diretamente relacionada com as propriedades qumicas, como a afinidade tintorial (corante fibra), hidrofilidade, inchamento, e est indiretamente relacionado com todas as propriedades fsicas. O nvel de estrutura macromolecular est relacionado com o arranjo das cadeias de polmeros no espao tridimensional, ou seja, com o comprimento das cadeias, distribuio de comprimento em regies amorfas e cristalinas, rigidez, dimenso e forma da molcula. Nas fibras naturais, devem-se considerar outro nvel de organizao estrutural relacionado como o crescimento e desenvolvimento, advindo da morfologia complexa de fibrilas, microfibrilas e matrizes de configuraes compostas (USSMAN e GUILLN, 2000).

A.1.1. Grau de Polimerizao

As fibras txteis so obtidas de muitas polimolculas unidas. Essas polimolculas so compostas por muitas unidades monomricas, normalmente acima de 100, e muitas vezes, entre 200 a 15.000. Essas polimolculas so resultantes da polimerizao, que uma reao qumica, na qual ocorre a repetio de uma unidade monomrica ou pela repetio de unidades compostas por dois ou trs monmeros diferentes um nmero n de vezes em uma distribuio sistemtica (AGUIAR NETO, 1996).

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A descrio de um polmero, em parte, pelo seu grau de polimerizao, em portugus GP e ingls DP, de Degree Polimerization, sendo a primeira a nomenclatura que ser adotada, o qual identifica o nmero de unidades moleculares ou monomricas necessrias para formar uma poli ou macromolcula. O GP tambm influncia a resistncia das fibras celulsicas, bem como pela distribuio molecular. Quanto maior o GP, mais resistente a fibra (AGUIAR NETO, 1996). A Tabela A.1 apresenta o grau de polimerizao em diferentes etapas de beneficiamento da fibra celulsica do algodo tipo egpcio.

Tabela A.1. Grau de polimerizao (GP) em diferentes etapas de beneficiamento da fibra celulsica do algodo tipo egpcio. Algodo Egpcio Purificado, no mercerizado Mercerizado sem tenso Mercerizado com tenso e seco ao ar Mercerizado com tenso, seco a 100C e lavado com sabo Mercerizado por 60 minutos e lavado com sabo Mercerizado por 120 minutos e lavado com sabo Lnter de algodo cru Lnter de algodo alvejado
FONTE: MALUF e KOLBE, (2003) adaptado.

GP 2.560 1.775 2.006 2.056 2.210 1.206 ~1.400 700

A.1.2. Propriedades das Fibras

As caractersticas das fibras influnciam a sua aplicao e a qualidade do produto final. As chamadas caractersticas ou propriedades essenciais, so compostas por: propriedades primrias e propriedades secundrias. As propriedades primrias incluem uma elevada relao comprimento-largura, tenacidade ou adequada resistncia, flexibilidade ou maleabilidade, fiabilidade ou coeso e uniformidade. As propriedades secundrias visam elevao do conforto e melhoria da manuteno, como forma fsica, densidade ou gravidade especfica, brilho ou lustro, regain, alongamento, recuperao elstica (elasticidade), resilincia, comportamento trmico, resistncia a microrganismos, resistncia ao meio ambiente e luz, resistncia abraso, etc. Deve-se considerar que as propriedades secundrias variam de fibra para fibra (AGUIAR NETO, 1996).

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A definio de cada propriedade, primria e secundria, apresentada no glossrio em anexo. Na Tabela A.2, so apresentadas quantitativamente algumas propriedades essenciais da fibra.

Tabela A.2. Caractersticas da fibra de algodo. Caracterstica Absoro de umidade 7-11 Reteno de gua aps centrifugao (5 minutos) (%) 40-50 Extenso (%) ~0 Intumescimento Seco (%) 20-25 Com. 20-25 Tenacidade (gf/tex) mido 22-28 Com. 7-9 Alongamento ruptura (%) mido 10-12 Decompe-se em cidos concentrados a cidos frio e a quente. Intumesce em soda custica acima de Sensibilidade a agentes lcalis 18B (mercerizao), com aumento do qumicos brilho e resistncia. Oxidantes Pouco sensvel Enzimas Pouco sensvel Sensibilidade Ao calor luz solar
FONTE: RHODIA-STER; MALUF e KOLBE (2003).

Amarela aps 5 horas a 120C; decompe-se a 180C; no funde, carboniza. H elevada perda da resistncia e amarelamento.

A.1.3. Algodo

A fibra de algodo do tipo fibrilar e com teor cristalino elevado, de 65 a 70%. Possui estrutura monocelular, composta por lmen, parede primria e secundria, em forma de fita torcida sobre si mesma (circunvolues). A fibra imatura apresenta parede delgada, a toro pouco ou muito irregular e concentrada em curto segmento (RHODIA-STER). Os diversos tipos de variedades de algodo distinguem-se, principalmente, pela altura da planta, finura e o comprimento das fibras. Conforme a variedade, o comprimento das fibras pode variar desde curtas, chamadas de lnter, com 4 mm, at longas, com 60 mm. Todas

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as espcies de algodoeiros selvagens e cultivados filiam-se ao gnero Gossypium Linn, que ocorrem selvagens nas regies tropicais e subtropicais de ambos os hemisfrios. Esse gnero compreende 20 espcies de plantas herbceas, arbustivas e arborescentes, das quais apenas quatro so de valor comercial (MALUF e KOLBE, 2003): - Gossypium barbadense Linn: so espcies de crescimento anual e perene ou arbreo. Produz os algodes comerciais conhecidos por egpcios, de fibra longa e fina. - Gossypium hirsutum Linn: uma espcie herbcea, conhecida pela designao Upland. Produz uma fibra de comprimento e finura bastante varivel, que geralmente intermediria entre aquela dos algodes asiticos e egpcios. - Gossypium herbaceum Linn e Gossypium arboreum: produzem algodes comerciais denominados indianos ou asiticos, que se caracterizam pelas fibras curtas e grossas. Como a composio das fibras de algodo varia conforme a maturidade, a seguir ser descrito o desenvolvimento da fibra de algodo em cada fase. A partir da etapa de florescimento at a formao da fibra de algodo madura, so necessrios aproximadamente 90 dias. No florescimento da planta Gossypium, clulas individuais na epiderme das sementes que esto contidos no capulho comeam a crescer na direo longitudinal at seu comprimento ter aumentado cerca de mil vezes. Estas clulas consistem essencialmente de seiva envolvida por uma membrana ou cutcula contendo pectina, protena e cera. Esta membrana desenvolve internamente uma fina camada de celulose, para formar a parede primria da fibra. A parede primria responsvel pela falta de umectabilidade da fibra no preparada. Esta fase de desenvolvimento dura aproximadamente 20 dias. Aps a fibra ter crescido at seu comprimento final, ocorre a formao de uma segunda parede, chamada de parede secundria, que engrossa rapidamente por depsito de celulose em camadas concntricas at sua maturidade, da parte externa para a interna. Ao atingir a maturidade h uma cavidade central ou lmen cheio de protoplasma, que ocupa cerca de um tero da seco transversal da fibra. Durante esta fase que dura entre 35 a 50 dias, diminui o teor de pectina e aumenta o teor de cera; acompanhado por um aumento de sua resistncia longitudinal. A deposio de celulose na parte interna da fibra no uniforme e varia no s para as fibras de sementes diferentes, como tambm entre fibras de mesma semente e fibras de mesmas clulas ao longo de seu comprimento. Quando o capulho abre, ocorre o colapso da fibra, ou seja, comea a secar e perde a forma cilndrica e fica espalmada, torcendo-se sobre o seu prprio eixo, adquirindo assim a sua imagem microscpica tpica. A cavidade interna contm resduos do protoplasma, ou seja, protenas, sais minerais e corantes naturais como clorofila, xantofila e caroteno (ARAJO E MELO e CASTRO, 1986, HOONDAL et al., 2002, MALUF e KOLBE, 2003).

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Quimicamente, as fibras de algodo, so constitudas por celulose pura, contendo pequena porcentagem de impurezas, na sua maioria essas esto localizadas na superfcie externa das fibras, tais como ceras, pectinas, cidos orgnicos, protenas, polissacardeos no celulsicos e cinzas, como tambm substncias lignificadas. A quantidade total de impurezas depende da origem do algodo e da maturidade das fibras. Essas impurezas devem ser removidas antes da tinturaria e do acabamento, pois a presena destas impurezas limita fortemente a absorbncia de gua e alvura das fibras de algodo (ARAJO E MELO e CASTRO, 1986; HOONDAL et al., 2002; PACHECO, 2004). A Tabela A.3 apresenta a composio da parede primria com cutcula e a fibra como um todo. A variao na composio do algodo em funo da maturidade apresentada na Tabela A.4. A Figura A.1 apresenta o esquema e corte transversal da fibra de algodo.

Tabela A.3. Composio percentual da fibra (total) e da parede primria com cutcula do algodo. Componente Celulose Pectinas(a) Protenas(b) Ceras(c) Acares Cinzas(d) Outros componentes orgnicos(e) Composio em base seca (%) Fibra total 88,0-96,0 0,7-1,2 1,1-1,9 0,4-1,0 0,2-0,3 0,7-1,6 0,5-1,0 Parede primria 52 12 7 12 3 14 -

Nota: (a) cidos poligalacturnicos e seus sais de Ca, Mg ou Fe; (b) lcoois graxos (C24C30), cidos graxos, seus steres (colesterol), carboidratos; (c) cidos poliaminocarboxlicios; (d) fosfatos e carbonatos de Ca, Mg, K e Na; (e) oligmeros, cidos orgnicos. FONTE: MALUF e KOLBE, 2003.

Segundo Maluf e Kolbe, (2003), as variaes de composio nas fibras naturais dependem de muitos fatores, relacionados com a origem, por exemplo, as fibras vegetais tm a composio alterada por fatores genticos (diferentes cultivares), climticos, solo e beneficiamento (purga - algodo ou macerao - linho e juta - e alvejamento). As fibras animais dependem de fatores genticos (diferentes raas), climticos e solo (alimentao), sade e beneficiamento. Quanto fibra de origem mineral (amianto crisotila) seriam: o solo e as condies climticas. Os produtos gerados pela hidrlise do algodo, segundo anlises cromatrogrficas, so cidos glutmico e asprtico, leucinina, valina, alanina e, possivelmente, serina e arginina.

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Porm verificada a presena de outros aminocidos no identificados no cromatrograma (AGUIAR NETO, 1996). A Tabela A.5 apresentada o efeito de extrao de constituintes da fibra de algodo, quando se emprega algum solvente, geralmente utilizado, nas etapas a mido do processo de beneficiamento.

Tabela A.4. Composio do algodo em funo da maturidade. Dias aps a florao 20 30 40 50 60 Fibras maduras Teor (%) Celulose 81,00 88,10 89,20 92,60 94,20 94,50 Umidade 7,80 6,30 5,90 6,20 5,50 5,50 Cinza 3,08 2,20 2,06 1,76 1,14 1,14 Ceras 1,50 0,90 0,90 0,72 0,60 0,63 Nitrognio 0,64 0,38 0,17 0,15 0,15 0,15

FONTE: MALUF e KOLBE, 2003.

A.1.3.1. Celulose

A celulose um carboidrato, presente nas fibras de algodo, consiste de resduos Dglucose unidos por ligaes b-(1,4)-glicosdicas formando cadeias lineares de polmeros de mais de 10.000 resduos de glucose. As molculas de celulose paralelas e adjacentes esto interligadas, por meio de ligaes de hidrognio, conferindo s fibras de algodo grande resistncia trao e estabilidade dimensional. A presena de elevado nmero de grupos hidrxidos responsvel por algumas das propriedades do algodo, como a grande capacidade para absorver gua (cerca de 50% do seu massa) e a facilidade de tingimento, assim como de lavagem em meio aquoso. Se as fibras de algodo forem adequadamente processadas, a degradao da celulose praticamente nula (ARAJO E MELO e CASTRO, 1986; AGUIAR NETO, 1996; DA-SILVA et al., 1997; TEERI, 1997). As fibras de celulose so formadas por regies cristalinas, poro resistente, e amorfas, poro hidrolisvel por enzimas. A celulose misturada com emulso enzimtica sofre quebra nas ligaes b-glucose e gera celobiose (composta por duas unidades glicosdicas). Isto indica que as unidades de glicose possuem configurao , portanto, as ligaes entre os grupos hidroxila nas posies 1:4, gira cada unidade em um ngulo de 180. Assim, os grupos OH para o mesmo lado do plano da configurao molecular, e por isso

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adjacente para cada outra configurao (TROTMAN, 1984; DA-SILVA et al., 1997). A Figura A.2(a) apresenta a configurao b-glicose e a Figura A.2(b) a estrutura da celulose.

(a)

(b)

Figura A.1. Vista esquemtica (a) e corte transversal (b) da fibra de algodo. FONTE: AGUIAR
NETO, 1996.

A celulose nativa difere em sua cristalinidade quanto localizao na parede celular, pois a camada secundria contm celulose altamente cristalina, enquanto a camada primria contm principalmente celulose amorfa. A celulose nativa ou celulose I demonstra um padro de difrao que reconhecivelmente diferente das formas cristalinas das celuloses II, III e IV produzidas artificialmente (man-made), conhecidas como, que tambm demonstram padres distintos. O principal ponto de interesse relacionado ao polimorfismo surgiu da observao que a celulose I ocorre apenas como produto natural, resultado de biosntese. Uma vez que tenha sido mercerizada ou solubilizada ou regenerada, a transformao (para celulose II) permanece irreversvel. A celulose I tpica das estruturas de cadeias paralelas, e a celulose II tpica de estruturas de cadeias antiparalelas (YOUNG e ROWELL, 1986, DA-SILVA et al., 1997). A Tabela A.6 apresenta o contedo de celulose presente em plantas. Verifica-se que o algodo apresenta a maior porcentagem.

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Tabela A.5. Efeito da extrao de algodo cru com vrios solventes. Solvente Ao sobre matria contida no algodo cru. Extrato total Extravel No extravel (%) Cera; 70-90% de 84% de cinza; sais de protenas; pectina; potssio; sais de sdio; 2,5 sais de clcio, fosfato; acares ferro e alumnio Cera; acares Protena; pectina 25% de cinza Cera 97% de cinza; acares Pectinas; acares 90% de cinza; 90% de protena; 69% de cera; 100% de pectina; acares Protena; pectina; cinza Cera; 65-85% de protena Cera 0,6 2,7 -

gua lcool etlico 95% (a quente) Clorofrmio, benzeno, solventes imiscveis com gua cidos 0,1 N (a frio) Citrato ou oxalato de amnio (a quente) NaOH diludo (a fervura)
FONTE: MALUF e KOLBE, 2003.

CH2 OH H C H C OH H C OH C H O OH

H OH C C OH H

OH C H H C O O C

CH2 OH H C H OH C H H C C O O

H C OH H

OH C H H C O O

CH2 OH H C H C OH C H O OH H C

OH C H

H C

C H OH

H C

C H OH

CH2 OH

CH2 OH

n
(a) (b) Figura A.2 (a) b-glicose (b) Frmula estrutural da celulose. FONTE: TROTMAN, 1984.

Tabela A.6. Contedo de celulose de plantas. Planta Algodo Ramie Madeira % Celulose 95-99 80-90 40-50 Planta Casca Musgo Alga marrom e vermelha % Celulose 20-30 25-30 1-10

FONTE: YOUNG E ROWELL, 1986.

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Sob a ao da luz, a celulose oxidada pelo oxignio atmosfrico formando-se oxicelulose, reduzindo a resistncia trao e da viscosidade da fibra, e um aumento no nmero de cobre e iodo da celulose que a compe. Essa fotoxidao da celulose depende do comprimento de onda da luz (sendo que o raio ultravioleta so os mais ativos), da umidade e temperatura do meio ambiente, da estrutura do material (tecidos pesados so mais resistentes que tecidos leves) e por diferentes impurezas contidas no ar e no tecido. Para o algodo, verifica-se que a resistncia luz maior no tecido cru que no alvejado (MALUF e KOLBE, 2003). O grupo hidroxila (OH-) da celulose, sendo esta modificao na estrutura qumica mais favorvel aplicao de corantes e acabamentos. A substituio ocorre quando um ou mais grupos hidroxila so removidos e outros ons ou radicais (tomos ou grupos de tomos) atacam o tomo de carbono no lugar do grupo hidroxila. A remoo do radical hidroxila pode tambm resultar na formao de crosslinking (ligaes cruzadas) das molculas de celulose, o que ajuda na formao de fibras de celulose, que so altamente resistentes dobra e dela se recuperam facilmente (AGUIAR NETO, 1996).

A.1.3.2. Ceras

As ceras esto localizadas na superfcie da fibra de algodo. Agem como um agente lubrificante e conferem hidrofobicidade s fibras. Por isso, as ceras, so consideradas o maior obstculo para a umectao das fibras, apesar de no ter sido encontrado correlao entre a absoro aquosa da fibra de algodo e seu contedo natural de ceras. A remoo das ceras das fibras dificulta a fiao adequada do algodo, pois o coeficiente de atrito triplica quando a cera removida (RHODIA-STER, PACHECO, 2004). As ceras constituem entre 0,4-1,2% da massa do algodo. So difceis de serem removidas, pois so substncias muito complexas, compostas por um ou mais lcoois de alta massa molecular e cidos graxos livres ou esterificados. Acredita-se que estes estejam ligados quimicamente celulose ou pectina, ou alternativamente a protenas residuais (PACHECO, 2004).

A.1.3.2. Substncias Pcticas

As substncias pcticas so formadas por duas fraes interligadas: a ramnogalacturonana e a homogalacturonana. A ramnogalacturonana um heteropolmero que

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tem a sua estrutura principal formada por repetidas unidades de cido galacturnico ligado ramnose e cadeias laterais consistindo de arabinose e galactose e no interagem com clcio. A homogalacturonana um polmero formado por unidades de cido galacturnico e/ou o seu metil ster unidos por ligaes glicosdicas b(1(4), com importncia tecnolgica, devido sua capacidade de ligar clcio, aumentar a viscosidade e formar gel (DA-SILVA et al., 1997) As substncias pcticas esto localizadas principalmente entre a lamela e a parede primria. Consistem principalmente de heteropolissacardeos, cidos e neutros, com diferentes massas moleculares e grau de esterificao. A cadeia central possui resduos de cido galacturnico ligados por ligaes b-(1,4)-glicosdicas. As cadeias laterais da molcula de pectina consistem de L-raminose, arabinose, galactose e xilose. Os grupos carboxila do cido galacturnico so parcialmente esterificados pelos grupos metila e parcialmente ou completamente neutralizado pelos ons sdio, potssio, ou amnio. Assim, conforme o tipo de modificaes na cadeia central, as substncias pcticas so classificadas em protopectina, cidos pcticos, cidos pectnicos e pectina. As protopectinas so insolveis em gua enquanto s outras trs substncias pcticas so parcialmente ou totalmente solveis em gua. As pectinas so cidos poligalacturnicos (galacturonanas) totalmente ou parcialmente esterificados. As protopectinas so substncias pcticas ligadas a outros componentes da parede celular. Os cidos pcticos so formados de cidos poligalacturnicos no esterificados. Associadas com ons de clcio, magnsio ou ferro, as substncias pcticas dificilmente so removidas por meios convencionais (BUSCHLE-DILLER, 2001b, KASHYAP et al., 2001, ALKORTA et al., 1998). A estrutura da molcula de pectina apresentada na Figura A.3. Os sais de pectina insolveis em gua servem para juntar as ceras e protenas para formar a barreira de proteo da fibra. A quantidade e composio desta barreira variam com as condies de crescimento, fatores climticos e variedade do algodo (HOONDAL et al., 2002).

Figura A.3. Estrutura da molcula de pectina. FONTE: CHUNG et al., (2004).

O residual de pectina no tecido pode ser analisado pelo tingimento com o corante Ruthenium Red, pois esse tinge apenas substncias pcticas e proticas na fibra de algodo.

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Resumidamente, segundo Lenting et al., (2002), duas amostras so costuradas junto com um tecido cinza (funciona como controle, 100% pectina), e o tecido alvejado e purgado alcalinamente (funciona como controle, 0% de pectina) em formato circular com um dimetro de 8 cm. Esta amostra tratada com Ruthenium Red (0,2 g/L e 100 mL/g na presena de dois surfactantes (Silet L-77 e Tergitol 15-S-12) com concentrao de 1 g/L, durante 15 minutos numa sala climatizada, ento a amostra lavada durante 10 minutos a 60C. Aps medida a refletncia a 540 nm e o valor de K/S calculado pela equao conhecida como Kubelka Munk. Destes valores, determinado o percentual residual de pectina. A equao A.1 conhecida como Kubelka Munk: K/S = (1-R)2/2R* onde: K = coeficiente de absoro; R* = refletncia da amostra tingida no comprimento de onda de mxima absoro; S = coeficiente de disperso.

(A.1)

A.1.3.4. Minerais e Metais

A natureza e quantidade do material mineral encontrado no algodo dependem da composio do solo. Sendo que a exata natureza e proporo dos sais podem variar significativamente (TROTMAN, 1984). Quanto aos metais, como os alcalinos terrosos, clcio (Ca+2) e o magnsio (Mg+2) podem ser encontrados em quantidades apreciveis nas fibras de algodo, at 2.500 ppm de Ca+2 e 700 ppm de Mg+2. O ferro (Fe+2) tambm frequentemente encontrado nas fibras de algodo, em quantidades expressivas, atingindo 60-70 ppm de Fe+2. Esses metais tm diversos efeitos negativos sobre o tingimento, sendo a complexao dos corantes um dos piores, pelas consequncias negativas na igualizao, nuance da cor e s vezes nos ndices de solidez a frico. Particularmente o ferro, alm da corroso dos equipamentos, causa a degradao da fibra de algodo nos processos de alvejamento qumico (RHODIA-STER).

A.1.3.5. Cinzas

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As cinzas do algodo contm cido silcico, carbonatos de potssio, clcio, magnsio e mangans, cloretos, sulfatos e fosfatos, xidos de ferro e alumnio, sais de potssio e sdio, que formam cerca de 95% do total das cinzas. Os ndices de cinzas diminuem com a maturidade da fibra, ao mesmo tempo em que muda a sua composio (AGUIAR NETO, 1996). Na Tabela A.7 so apresentadas s variaes mdias de metais e sais presentes nas cinzas do algodo.

A.2. FIOS

Segundo Maluf e Kolbe, (2003), fio um termo genrico para uma mecha contnua de fibras txteis, filamentos ou outro material em forma adequada para a tecelagem, malharia ou outra forma de entrelaamento, para formao de um tecido. Os fios podem ser caracterizados pela umidade, ttulo, fiabilidade, toro (necessria para produo de fios de fibras e conferir integridade e compacidade, eliminar salincias e melhorar a resistncia abraso dos mesmos), resistncia trao (carga e alongamento de ruptura), irregularidade e imperfeies, defeitos pouco frequentes e pilosidade.

Tabela A.7. Variaes mdias dos componentes das cinzas de algodo. Material Al3+ Ca2+ Cl1Cu2+ ou Cu3+ Fe2+ ou Fe3+ PO43K1+ Massa (%) 24 5 10 3 10 Traos 13 35 20 40 Material Si3+ Na1+ SO42Mg2+ Mn3+ CO32Massa (%) 15 38 5 15 5 10 Traos 10 20 -

FONTE: MALUF e KOLBE, 2003.

A.3. TECIDOS

Os tecidos podem ser classificados, conforme a forma do entrelaamento dos fios que compem o tecido, como planos ou malhas (tubulares ou planas). O tecido, na tecelagem de malhas, formado pelo entrelaamento de um ou mais conjuntos de fios atravs de um conjunto de laadas, no formando ngulos ortogonais ente si, como ocorrem nos tecidos

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planos (LEO et al., 2002). Segundo Maluf e Kolbe (2003), os tecidos quando saem da tecelagem ou malharia no possuem boa aparncia e toque para uso, por isso precisam ser beneficiados para se tornarem mais apresentveis e aumentarem seu valor agregado. Estes processos de beneficiamento podem ser divididos em: pr-tratamento ou beneficiamento primrio; beneficiamento secundrio e acabamento ou beneficiamento final. O tratamento qumico das fibras de algodo, realizado a mido, visa basicamente remoo de cor e de substncias que causam hidrofobicidade, para aumentar a alvura e absorbncia (umectibilidade). Nas diversas etapas que compem o processo de beneficiamento de artigos txteis de algodo, como: desengomagem, purga ou cozimento, alvejamento, tingimento e acabamento, so usados vrios tipos de insumos qumicos, que alm de causarem danos as fibras tambm contribuem na carga poluente dos efluentes (ALY et al., 2004).

A.3.1. Beneficiamento

A.3.1.1. Pr-Tratamento

O pr-tratamento uma etapa do processo de beneficiamento txtil que envolve a chamuscagem, desengomagem, purga, alvejamento, mercerizao, aplicao do alvejante tico e termofixao. nesta fase de processamento do algodo (processo de chamuscagem, ausncia de relaxamento da fibra durante as vrias fases dos processamentos de prtratamento, os processos de desengomagem deficientes, a baixa absoro das fibras, a gerao de rugas e vincos, trechos que sofrem excessiva abraso, elevada perda do grau de polimerizao da fibra, grau de branco insuficiente, etc.) que acontecem os danos mais graves fibra de algodo, os quais influnciaro definitivamente os resultados finais dos acabamentos a serem executados (CIBA, 1994; MALUF e KOLBE, 2003). A chamuscagem um processo que visa eliminar mediante a queima a penugem superficial existente em fios e tecidos. A velocidade da passagem do tecido pelas chamas deve ser capaz de eliminar as fibras finas salientes sem deteriorar o tecido (MALUF e KOLBE, 2003). A desengomagem a eliminao de goma dos fios singelos de urdume de algodo que so engomados para melhorar o desempenho nas operaes de tecelagem (atrito). As principais gomas utilizadas so: amidos naturais (batata, arroz, maisena, mandioca, milho);

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amidos modificados (steres e teres de amidos, como as dextrinas); polmeros sintticos (acrilatos, lcoois polivinlicos, etc.); outros derivados celulsicos (carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, etc.); gelatinas e polmeros solveis em solventes orgnicos. Para os fios de algodo 100%, so utilizados os amidos e as dextrinas, pois so baratos e apresentam bom desempenho na tecelagem. A desengomagem pode ter maior ou menor dificuldade dependendo de fatores como: umectao, absoro da soluo (pick-up), tempo de repouso, intumescimento, solubilizao e lavagem da goma; capacidade de redissoluo da goma nos fios; teor de goma dos fios; natureza dos agentes lubrificantes; caractersticas construtivas do tecido como nmero de fios e batidas, padronagem, ttulo e toro dos fios, etc.; processo de desengomagem (enzimtica, alcalina ou ainda alcalina oxidativa) (RHODIA-STER). A purga ou descrude ou cozimento alcalino (especialmente tecidos de malhas de algodo, que no sofrem engomagem) a eliminao de material no celulsico da superfcie da fibra de algodo, para conferir fibra maior umectabilidade (absoro de gua) e a alvura dos materiais txteis, que o principal objetivo no processo de preparao do algodo. A remoo industrial mais comum das substncias no-celulsicas (lipdeos, ceras, substncias pcticas, cidos orgnicos, protenas, etc.) efetuada convencionalmente pelo tratamento com hidrxido de sdio. Geralmente a purga alcalina realizada com uma soluo diluda de hidrxido de sdio (1 a 4%) durante 30 a 60 minutos, sob condies atmosfricas ou presso. A maioria das purgas ocorre sob condies atmosfricas e a temperatura entre 75-100C. Quando realizado sob presso, a temperatura atinge entre 125-130C. Remove a hemicelulose e os produtos existentes na parede primria, como pectinas, ceras e protenas, saponificados ou degradados at sua solubilidade em gua, emulsionados e dispersos. O rigoroso pH e temperatura requeridos para a purga so danosos para muitas fibras. Apesar da purga alcalina ser efetiva e o custo do hidrxido de sdio ser baixo, o processo caro porque consome grandes quantidades de energia, gua e agentes auxiliares. A eficincia do processo de purga est diretamente relacionado ao sucesso das operaes de processamento mido subsequentes: alvejamento, tingimento, mercerizao e acabamento. A fibra purgada apresenta-se limpa, razoavelmente branca, com capacidade absorvente e possibilidade de dano oxidativo (TZANOV et al., 2001; PACHECO, 2001; AXT-MARTINELLI, 2002; MALUF e KOLBE, 2003; KARAPINAR e SARIISIK, 2004). As condies do descrude alcalino devem ser estritamente controladas, pois podem ocasionar inmeros inconvenientes, como a oxidao da celulose devido exposio ao ar durante o tratamento alcalino; mercerizao das fibras de algodo causada pelas solues concentradas de lcali; precipitados na superfcie do tecido, causados pela combinao dos

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ons clcio e magnsio com as molculas do banho, devido ausncia de sequestrantes. Esses inconvenientes causaro problemas nos processos de tingimento, estamparia e acabamento (PACHECO, 2001). O alvejamento visa remoo completa das cascas das sementes; extrao de impurezas coloridas de tipo indeterminado, causadas pelas condies de crescimento; hidrlise, oxidao e remoo de goma residual; obteno do grau de alvura necessrio, com o mnimo possvel de degradao das fibras; e melhoria da absorbncia do tecido e sua uniformidade. Considerando as vantagens tcnicas de alguns agentes alvejantes, como utilizao em processo a frio e a quente, prefere-se geralmente o perxido de hidrognio, pois, seu efeito de alvura apresenta solidez luz (MALUF e KOLBE, 2003). A mercerizao confere encolhimentos de 20-30% e aumento de propriedades como: brilho; resistncia trao; afinidade tintorial; maciez; hidrofilidade e melhoria da uniformidade tintorial e da estabilidade dimensional. Estas caractersticas so alcanadas quando se trata um fio ou tecido de algodo, tecido plano ou de malha com uma soluo de hidrxido de sdio de 28 a 33B (22 a 26%, ou 267,4 a 344,7 g/L de NaOH), pois causa a modificao da estrutura interna da fibra, pelo intumescimento de at 15% no dimetro, 12% de encolhimento no comprimento e a uma melhor orientao das regies cristalinas no sentido de seu eixo. A seo transversal ovalada inicial da fibra passa a ser circular, o lmen quase desaparece e a toro de convoluo tambm desaparece (MALUF e KOLBE, 2003). Os alvejantes pticos so substncias incolores que agem semelhantemente aos corantes, tendo certa reatividade com as fibras, as quais so aplicadas, para aumentar o grau de alvura. O uso de agentes de alvejamento ptico melhora a alvura dos txteis, at um valor mximo, depois ocorre diminuio, ou seja, medida que aumenta o teor do alvejante ptico sobre o tecido, aumenta a alvura, at se atingir um valor mximo. A partir deste, a adio de alvejante produz a diminuio da alvura, pois provoca um acmulo do alvejante no substrato, resultando num deslocamento da emisso para comprimentos de onda maiores. A natureza qumica da fibra deve ser considerada quando se escolhe os alvejantes, bem como a presena de sais e aditivos sobre o substrato, pois podem influnciar o efeito do alvejante ptico (MALUF e KOLBE, 2003).

A.3.1.2. Beneficiamento Secundrio

O beneficiamento secundrio composto pelas etapas de tingimento e estampagem, e objetiva tornar os tecidos mais atrativos e teis.

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O tingimento confere cor aos tecidos, que devem possuir boa solidez lavagem, luz e frico. O carter inico das fibras influncia fortemente seu tingimento. Se as cadeias do polmero nas fibras tiverem ou serem induzidas a ter cargas inicas, por meio da seleo adequada das condies do banho de tingimento, elas sero potencialmente capazes de interagir com cargas opostas de ons coloridos (MALUF e KOLBE, 2003). A estampagem consiste na aplicao pasta de estampagem colorida nos substratos txteis, com pigmentos insolveis em gua e principalmente no caso de pigmentos que no possuam afinidade pela fibra, formando figuras localizadas, que se repetem, formando uma padronagem. Esta pasta deve ser absorvida superficialmente, sem se espalhar demais para o interior do tecido e para reas adjacentes, no estampadas. Devendo permanecer no local de sua aplicao at o momento em que o tecido seco (MALUF e KOLBE, 2003).

A.3.1.3. Acabamento

O acabamento ou beneficiamento tercirio consiste de alguns tratamentos finais para deixar os tecidos prontos para o mercado, como recuperar efeitos perdidos e conferir novos efeitos artificiais (CLARIANT, 2001). Os acabamentos especiais, para aumentar sua durabilidade, conforto, atratividade esttica e para facilitar a lavagem. Existem diversas maneiras de se classificar o acabamento, como: permanentes (durveis) ou temporrios (renovveis); decorativos ou funcionais; ou qumicos ou mecnicos. Estes acabamentos visam contribuir com a durabilidade; conforto; easy-care (facilidade de cuidado) e melhoria esttica (MALUF e KOLBE, 2003).

A.3.1.3.1. Estonagem

O processo de desbotamento conhecido como stonewash ou estonagem tem como objetivo ocasionar a descolorao desigual de um artigo confeccionado, geralmente algodo, tingido com corantes sulfurosos, reativos ou ndigo artigo, para lhe conferir o aspecto de usado. O processo de desbotamento consiste em submeter o artigo ao erosiva de pedra pomes e um agente oxidante, geralmente permanganato de potssio, em uma lavadora (CEGARA, 2000). Segundo Andreaus (2001), para a lavagem de 1 kg de tecido necessrio aproximadamente 1 kg de pedra pomes. Dentre as numerosas desvantagens da utilizao de pedras na lavagem tem-se: desgaste de aproximadamente 50% da pedra; desgaste rpido e

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ruptura das mquinas de lavar, centrfugas e secadeiras, devido migrao de fragmentos de pedras; irregularidade no tamanho e na qualidade das pedras; excessiva abraso do artigo, piorando sua qualidade; problemas ambientais devido gerao de efluentes no biodegradveis; condies de trabalho insalubre, decorrente da poeira das pedras e rudo das mquinas; tempo de processo prolongado em virtude da necessidade de remoo das pedras dos bolsos dos artigos acabados.

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ANEXO B Material e mtodos para produo do caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008

B.1. MATERIAL

B.1.1. Microrganismo

A bactria Bacillus pumilus CBMAI 0008 foi isolada de material vegetal em decomposio em um estudo prvio (DUARTE et al., 1997).

B.1. 2. Meios de Cultura

B. 1. 2. 1. Meio para Manuteno da Bactria

O meio de xilana de btula, de acordo com Mandels e Stenberg (1976), com os nutrientes necessrios para a manuteno da bactria durante o cultivo apresentado na Tabela B.1. O pH foi acertado para 9,0 com NaOH 2N, e o meio esterilizado em autoclave a 121oC durante 15 min.

Tabela B.1. Nutrientes utilizados para manuteno da bactria durante o cultivo. Nutriente Xilana de btula Peptona Tween 80 Ureia (NH4)2SO4 KH2PO4 CaCl2 MgSO4.7H2O
* birchwood Sigma.

Quantidade (g/L) 10 1,0 1,0 0,3 1,4 2,0 0,3 0,3

Nutriente FeSO4.7H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O CoCL2 gar-gar -

Soluo (mg/L) 5,0 1,6 1,4 2,0 20 -

B. 1. 2. 2. Meio para Produo de Enzimas Xilanolticas

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Meio de xilana lquido, de acordo com Mandels e Stenberg (1976), citado acima, com concentrao otimizada de xilana e peptona, de acordo com Duarte et al. (1999).

B. 1. 3. Reagentes

Todos os reagentes utilizados possuem grau analtico, com exceo da xilana de btula (birchwood - Sigma X-0502).

B. 2. MTODOS

B. 2. 1. Mtodos de Cultivo

B.2.1.1. Preservao e Manuteno de B. pumilus CBMAI 0008

A bactria foi preservada em meio slido inclinado contendo xilana de btula. A manuteno das culturas foi feita por repicagem peridica no meio, seguido de incubao a 45oC at crescimento, e de estocagem sob refrigerao a 5oC. Rplicas das culturas foram preservadas em leo mineral e em criotubos com glicerol.

B.2.1.2. Padronizao de Inculo

Para preparo de inculo, clulas do meio de preservao foram transferidas para frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 25 mL do meio de xilana de btula lquido. Aps 20 horas de incubao a 45oC e 250 rpm, a densidade ptica da cultura foi ajustada para T =3% a 600 nm, com gua destilada esterilizada. Este procedimento foi conduzido com objetivo de padronizar o inculo referente a diferentes fermentaes para produo da enzima.

B.2.1.3. Obteno de Enzimas Xilanolticas

Para produo de xilanases foi utilizado o meio de Mandels e Stenberg (1976), contendo 1% de xilana de btula e 0,6% de peptona (pH 9,0). O inculo, preparado conforme descrito acima, foi utilizado na proporo de 20% (v/v). A fermentao foi conduzida em

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frascos de Erlenmeyer com capacidade para 250 mL, contendo 50 mL de meio, sob agitao 250 rpm e temperatura de 45oC durante cerca de 18 horas. O extrato enzimtico bruto obtido foi centrifugado a 10.000 rpm sob refrigerao a 5C, para separao das clulas bacterianas e pr-clarificao do material. Uma amostra foi armazenada a -25oC para determinao da atividade enzimtica no extrato bruto, ou liofilizada. Outra parte do material foi submetida ao processo de purificao e concentrao, conforme indicado no item 5.2.3.