Quim. Nova, Vol. 27, No.

5, 771-780, 2004 VALIDAO EM MTODOS CROMATOGRFICOS E ELETROFORTICOS Marcelo Ribani Instituto de Tecnologia do Paran, Rua Prof. Algacir M. Mader, 3775, 81350-010 Curitiba - PR Carla Beatriz Grespan Bottoli, Carol H. Collins e Isabel Cristina Sales Fontes Jardim* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP Lcio Flvio Costa Melo Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6066, 13081-971 Campinas - SP Recebido em 11/6/03; aceito em 2/12/03; publicado na web em 17/6/04

VALIDATION FOR CHROMATOGRAPHIC AND ELECTROPHORETIC METHODS. The validation of an analytical method is fundamental to implementing a quality control system in any analytical laboratory. As the separation techniques, GC, HPLC and CE, are often the principal tools used in such determinations, procedure validation is a necessity. The objective of this review is to describe the main aspects of validation in chromatographic and electrophoretic analysis, showing, in a general way, the similarities and differences between the guidelines established by the different Brazilian and international regulatory agencies. Keywords: validation; legislation; separation methods.

INTRODUO A necessidade de se mostrar a qualidade de medies qumicas, atravs de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, est sendo cada vez mais reconhecida e exigida. Dados analticos no confiveis podem conduzir a decises desastrosas e a prejuzos financeiros irreparveis. Para garantir que um novo mtodo analtico gere informaes confiveis e interpretveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliao denominada validao. A validao de um mtodo um processo contnuo que comea no planejamento da estratgia analtica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferncia. Para registro de novos produtos, todos os rgos reguladores do Brasil e de outros pases exigem a validao de metodologia analtica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido documentos oficiais que so diretrizes a serem adotadas no processo de validao1-15. Um processo de validao bem definido e documentado oferece s agncias reguladoras evidncias objetivas de que os mtodos e os sistemas so adequados para o uso desejado. As tcnicas de separao, tais como cromatografia gasosa (GC), cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) e eletroforese capilar (CE), vm se destacando na qumica analtica pela capacidade de realizarem anlises qualitativas e quantitativas em amostras ambientais, farmacuticas, biolgicas e em alimentos. Neste contexto, esta reviso tem como objetivo comentar os principais aspectos da validao em mtodos cromatogrficos e eletroforticos, mostrando as diferenas e similaridades entre as diretrizes estabelecidas pelas diferentes agncias reguladoras internacionais e do Brasil. CONCEITOS BSICOS DO PROCESSO DE VALIDAO Vrios autores definem validao de mtodos e pode-se dizer que os conceitos continuam evoluindo e esto constantemente sob considerao pelas agncias reguladoras. Algumas definies podem ser transcritas:

*e-mail: icsfj@iqm.unicamp.br

A validao deve garantir, atravs de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (ANVISA)4. Validao o processo de definir uma exigncia analtica e confirmar que o mtodo sob investigao tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicao requer (Eurachem Working Group)9. Confirmao por testes e apresentao de evidncias objetivas de que determinados requisitos so preenchidos para um dado uso intencional (ISO/IEC 17025)13. A validao de mtodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidncia documentada de que o mtodo realiza aquilo para o qual indicado para fazer (USP)14. Avaliao sistemtica de um procedimento analtico para demonstrar que est sob as condies nas quais deve ser aplicado (WHO)15. Vrios artigos e revises tm sido publicados a respeito de validao de mtodos analticos10,12,16-24, os quais descrevem definies, procedimentos, parmetros e estratgias de validao. Dentro do mbito geral de validao de mtodos possvel distinguir dois tipos10,21,25,26: O primeiro, chamado de validao no laboratrio (in house validation), consiste das etapas de validao dentro de um nico laboratrio, seja para validar um mtodo novo que tenha sido desenvolvido localmente ou para verificar que um mtodo adotado de outras fontes est bem aplicado. A validao no laboratrio utilizada nas etapas preliminares do desenvolvimento de uma metodologia e na publicao de artigos para revistas cientficas, em que so avaliadas todas as caractersticas de desempenho da validao da metodologia, porm sem verificar a reprodutibilidade. Pode-se considerar esta etapa como sendo preliminar validao completa (full validation)10. O segundo tipo, validao completa, envolve todas as caractersticas de desempenho e um estudo interlaboratorial que utilizado para verificar como a metodologia se comporta com uma determinada matriz em vrios laboratrios, estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia e a incerteza expandida associada metodologia como um todo. S assim a metodologia pode ser aceita como uma

Reviso

772

Ribani et al.

Quim. Nova

metodologia oficial para uma determinada aplicao. Protocolos internacionalmente aceitos tm sido estabelecidos para a validao completa, mais precisamente o Protocolo Harmonizado Internacional27 e o procedimento ISO (International Standard Organization)28. Estes protocolos requerem um nmero mnimo de laboratrios e materiais testes para serem includos no estudo interlaboratorial para validao completa do mtodo analtico. No Brasil os estudos de comparaes interlaboratoriais so coordenados pelo Instituto de Pesquisas Tecnolgicas (IPT), atravs do Programa Brasileiro de Metrologia em Qumica. LEGISLAO Existem razes legais, tcnicas e comerciais que justificam a implantao da validao de mtodos analticos de separao, apesar de no haver uma norma estabelecida de mbito nacional ou internacional. Atualmente, para mostrar competncia tcnica, os laboratrios que executam as anlises devem submeter-se a um credenciamento (accreditation) de um rgo vigente de mbito nacional ou internacional. No Brasil, h duas agncias credenciadoras para verificar a competncia de laboratrios de ensaios, a ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria) e o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial). Estes rgos disponibilizam guias para o procedimento de validao de mtodos analticos, respectivamente, a Resoluo ANVISA RE no 899, de 29/ 05/20034 e o documento INMETRO DOQ-CGCRE-008, de maro/ 200311. Suas similaridades e diferenas podem ser melhor visualizadas na Tabela 1. importante esclarecer que resolues so documentos com poder de lei, que devem ser obedecidas e guias so documentos que sugerem uma linha a ser seguida e so, portanto, abertos para interpretao. Os guias so recomendaes e so intencionalmente vagos para deixar aos analistas a flexibilidade de adapt-los de acordo com o mtodo a ser usado29. Os parmetros para validao de mtodos tm sido definidos em diferentes grupos de trabalho de organizaes nacionais ou internacionais. Infelizmente algumas definies so diferentes entre as diversas organizaes. Uma tentativa para harmonizar estas diferenas foi feita para aplicaes farmacuticas, atravs da ICH (International Conference on Harmonization)2,3, na qual representantes das indstrias e agncias reguladoras dos EUA, Europa e Japo definiram parmetros, requerimentos e, em alguns casos, tambm metodologias para validao dos mtodos analticos.

A IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) tambm redigiu um documento tcnico que define um guia para validao de mtodos analticos que tem sido utilizado pela ISO10. A norma internacional ISO/IEC 17025, que uma norma especfica para laboratrios de ensaio e de calibrao, no item 5.4.5, apresenta a validao de mtodos como um dos requisitos tcnicos importantes na qualidade assegurada dos laboratrios de ensaio, bem como a documentao do trabalho de validao13. O US-FDA (United States Food and Drug Administration) tambm tem proposto guias sobre validao de mtodos30,31. Assim, rgos como ICH, IUPAC, ISO, ANVISA, INMETRO e outros exigem o item validao de mtodos analticos como um requisito fundamental no credenciamento para qualidade assegurada e demonstrao de competncia tcnica2-7,10,11. O que se pode observar que no h um procedimento normatizado que estabelea como executar a validao de mtodos instrumentais de separao. Como estes organismos so responsveis por acompanhar e credenciar a competncia de laboratrios de ensaios, importante ressaltar que as diferentes terminologias e at algumas caractersticas de desempenho do mtodo tm, em sua maior parte, o mesmo significado, porm descrito de uma maneira distinta, para aplicaes diferentes. PROCESSO DE VALIDAO essencial que os estudos de validao sejam representativos e conduzidos de modo que a variao da faixa de concentrao e os tipos de amostras sejam adequados. Um mtodo para um composto majoritrio requer um critrio de aceitao e uma abordagem diferente de um mtodo desenvolvido para anlise de traos. A freqncia com que o mtodo ser utilizado (muitas vezes em um dia, uma vez em um dia para um estudo rpido, uma vez em um ms, etc.) tambm influencia o tipo de estudo de validao que necessrio. Os parmetros analticos devem ser baseados na inteno do uso do mtodo. Por exemplo, se um mtodo ser usado para anlise qualitativa em nvel de traos, no h necessidade de testar e validar a linearidade do mtodo sobre toda a faixa linear dinmica do equipamento. O objetivo do mtodo pode incluir tambm os diferentes tipos de equipamentos e os lugares em que o mtodo ser utilizado, ou seja, se o mtodo desenvolvido para ser utilizado em instrumento e laboratrio especficos, no h necessidade de usar instrumentos de outras marcas ou incluir outros laboratrios nos experimentos de validao. Desta forma, os experimentos podem ser limitados para o que realmente necessrio.

Tabela 1. Parmetros de validao do INMETRO11 e ANVISA4 INMETRO Especificidade/Seletividade Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho Linearidade Limite de Deteco (LD) Limite de Quantificao (LQ) Sensibilidade (inclinao da curva) Exatido e tendncia (bias) Preciso Repetitividade Preciso Intermediria Reprodutibilidade Robustez Incerteza de medio ANVISA Especificidade/Seletividade Intervalos da curva de calibrao Linearidade Curva de Calibrao Limite de Deteco (LD) Limite de Quantificao (LQ) Exatido Preciso Repetibilidade (preciso intra-corrida) Preciso intermediria (preciso inter-corrida) Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial) Robustez -

Vol. 27, No. 5

Validao em Mtodos Cromatogrficos e Eletroforticos

773

PARMETROS ANALTICOS PARA VALIDAO DE MTODOS Os parmetros analticos normalmente encontrados para validao de mtodos de separao so: seletividade; linearidade e faixa de aplicao; preciso; exatido; limite de deteco; limite de quantificao e robustez. Estes termos so conhecidos como parmetros de desempenho analtico22, caractersticas de desempenho10,11 e, algumas vezes, como figuras analticas de mrito22. Seletividade A seletividade de um mtodo instrumental de separao a capacidade de avaliar, de forma inequvoca, as substncias em exame na presena de componentes que podem interferir com a sua determinao em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferncia de espcies como outro ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradao, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse14,32. Se a seletividade no for assegurada, a linearidade, a exatido e a preciso estaro seriamente comprometidas. O mesmo significado tem sido freqentemente utilizado para o termo especificidade3,12,14,20,21. Esta situao gera confuso desnecessria e isto pode ser evitado utilizando somente o termo seletividade, como sugerido pela IUPAC32. Um mtodo instrumental de separao que produz resposta para uma nica substncia de interesse, normalmente um dado elemento, pode ser chamado de especfico e um mtodo que produz resposta para vrios compostos qumicos, com uma caracterstica em comum, pode ser chamado de seletivo16,20. Desde que h poucos mtodos cromatogrficos que respondem a apenas uma substncia, o termo seletividade mais apropriado, como sugerido pela IUPAC. A seletividade o primeiro passo no desenvolvimento e validao de um mtodo instrumental de separao e deve ser reavaliada continuamente durante a validao e subseqente uso do mtodo. Algumas amostras podem sofrer degradao, gerando compostos que no foram observados inicialmente, que podem coeluir com a substncia de interesse. A seletividade pode ser obtida de vrias maneiras. A primeira forma de se avaliar a seletividade comparando a matriz isenta da substncia de interesse e a matriz adicionada com esta substncia (padro), sendo que, nesse caso, nenhum interferente deve eluir no tempo de reteno da substncia de interesse, que deve estar bem separada dos demais compostos presentes na amostra1,3,12,22. Uma segunda maneira atravs da avaliao com detectores modernos (arranjo de diodos, espectrmetro de massas), que comparam o espectro do pico obtido na separao com o de um padro e utiliza-se isto como uma indicao da presena do composto puro16,18,32. Estas duas maneiras so as mais utilizadas. O mtodo de adio padro tambm pode ser aplicado para os estudos de seletividade14,18, porm este mtodo utilizado quando no possvel obter a matriz isenta da substncia de interesse. Neste caso feita uma curva analtica com adio da substncia de interesse na amostra e comparada com uma curva analtica sem a presena da matriz. Comparam-se ento as duas curvas analticas e caso elas sejam paralelas, pode-se dizer que no h interferncia da matriz na determinao da substncia de interesse, portanto o mtodo seletivo. Outro procedimento para avaliar a seletividade atravs da coleta do composto de interesse e realizao de nova anlise por outra tcnica cromatogrfica, ou com mtodos e tcnicas que so especficos para a estrutura da substncia de interesse como, por exemplo, espectrometria de massas, resso-

nncia magntica nuclear, espectroscopia no infravermelho ou bioensaios especficos18. Linearidade e faixa de aplicao A linearidade corresponde capacidade do mtodo em fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicao3,14,22. A correlao entre o sinal medido (rea ou altura do pico) e a massa ou concentrao da espcie a ser quantificada muito raramente conhecida a priori. Na maior parte dos casos, a relao matemtica entre o sinal e a concentrao ou massa da espcie de interesse deve ser determinada empiricamente, a partir de sinais medidos para massas ou concentraes conhecidas dessa espcie33. Essa relao matemtica, muitas vezes, pode ser expressa como uma equao de reta chamada de curva analtica34. Um exemplo de curva analtica pode ser visto na Figura 1a. Embora somente dois pontos definam uma reta, na prtica as linhas devem ser definidas por no mnimo cinco pontos que no incluam o ponto zero na curva, devido aos possveis erros associados10. Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analtica a partir de um conjunto de medies experimentais pode ser efetuada usando o mtodo matemtico conhecido como regresso linear35. Alm dos coeficientes de regresso a e b, tambm possvel calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlao r36. Este parmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais prximo de 1,0, menor a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regresso estimados. Para verificar se a equao de regresso estatisticamente significativa podem ser efetuados os testes de ajuste do modelo linear, validade da regresso, sua eficincia e sua eficincia mxima36,37. Um coeficiente de correlao maior que 0,999 considerado como evidncia de um ajuste ideal dos dados para a linha de regresso12,18,38. A ANVISA4 recomenda um coeficiente de correlao igual a 0,99 e o INMETRO11 um valor acima de 0,90. Em qualquer tcnica instrumental, a relao linear simples, descrita pela equao y = ax + b, s vlida em um determinado intervalo de massa ou concentrao da espcie medida. Este intervalo de massas ou concentraes, no qual se pode construir uma curva analtica linear, a faixa linear dinmica33. Ainda que as causas para a perda de linearidade sejam caractersticas de cada tcnica, este um fenmeno que pode ocorrer com qualquer conjunto de dados. Assim, o clculo dos coeficientes de regresso de uma curva analtica deve ser acompanhado de uma cuidadosa inspeo, para verificar se todos os pontos a serem usados esto dentro da faixa linear dinmica correspondente. Augusto et al.33 descreveram uma forma de calcular se os pontos de uma curva analtica esto inseridos na faixa linear, baseando-se em relaes geomtricas do grfico de regresso. Uma terceira abordagem dividir os dados do sinal pelas suas respectivas concentraes, fornecendo as respostas relativas16. Um grfico construdo com as respostas relativas no eixo y e as concentraes correspondentes em escala logartmica no eixo x. A linha obtida deve ser horizontal sobre toda a faixa linear. So desenhadas outras linhas horizontais paralelas no grfico, para 95 e 105% da linha da faixa linear. Conclui-se que o mtodo linear at o ponto onde a resposta relativa intercepta a linha de 95 ou 105%. A Figura 1 mostra uma comparao da determinao do intervalo linear dinmico atravs da curva analtica clssica (Figura 1a) e da sua representao logartmica (Figura 1b). A construo da curva com a concentrao em escala logartmica permite melhor visualizao da faixa linear. A faixa de aplicao corresponde ao intervalo entre o valor superior e inferior da substncia em exame, que atenda aos requisitos

774

Ribani et al.

Quim. Nova

centraes; obtm-se o cromatograma correspondente a cada uma delas e, em um grfico, relacionam-se as reas obtidas com as concentraes. Utilizando este grfico ou a equao da curva resultante, pode-se calcular a concentrao desta substncia na amostra a partir da rea da substncia obtida no cromatograma resultante de uma injeo separada. Este mtodo sensvel a erros de preparo das amostras e dos padres e de injeo das solues padro e das amostras40,41 e por isso deve ser feito a cada anlise. Padronizao interna O mtodo de padronizao interna consiste na preparao das solues padro de concentraes conhecidas da substncia de interesse, s quais se adiciona a mesma quantidade conhecida de um composto chamado padro interno. Aps anlise dessas solues, constri-se um grfico, relacionando a razo de reas (rea da substncia/rea do padro interno que tem concentrao constante) com a concentrao (variada) da substncia. A amostra tambm analisada aps a adio da mesma quantidade conhecida do padro interno. Atravs da razo de reas obtidas no cromatograma tem-se a concentrao da substncia na amostra. Idealmente, a substncia usada como padro interno deve ser similar substncia a ser quantificada, ter tempo de reteno prximo a esta substncia, no reagir com a substncia ou outro componente da matriz, no fazer parte da amostra e, quando cromatografada, ficar separada de todas as demais substncias presentes na amostra40,41. Este ltimo requisito no necessrio quando a deteco feita por espectrometria de massas, na qual cada composto produz um espectro caracterstico. O mtodo de padronizao interna extremamente til, especialmente pelo fato de que independe de pequenas mudanas em variveis experimentais, como temperatura da coluna e tamanho da amostra. Este mtodo bastante til em cromatografia gasosa, na qual se usa seringa para injeo de amostra42 e por isso deve ser feito a cada anlise. Superposio de matriz O mtodo de superposio de matriz (matrix-matched) consiste na adio do padro da substncia em diversas concentraes em uma matriz similar da amostra, isenta da substncia, e construo do grfico de calibrao relacionando as reas obtidas com as concentraes dos padres. O mtodo de superposio de matriz pode ser utilizado para calibrao, tanto com a padronizao interna como com a padronizao externa. Este mtodo usado para compensar o efeito da matriz ou de possveis interferentes e de suma importncia em determinaes quando a matriz pode interferir na pr-concentrao, extrao, separao ou deteco da substncia de interesse. Sua principal vantagem sobre o mtodo de padronizao externa que fornece uma melhor correspondncia com a composio da amostra. Por exemplo, se algumas substncias so determinadas em soro humano e uma soluo padro aquosa for usada na calibrao, resultados errneos podem ser obtidos por causa do efeito da matriz; para tais medies, uma matriz de soro humano seria melhor para realizar a calibrao do que a soluo aquosa41. O mtodo de superposio de matriz tem o inconveniente de no proporcionar a magnitude do efeito de co-extratos, alm de aumentar o custo e o tempo das anlises43. Alguns autores acreditam que o efeito dos coextratos sobre a resposta da substncia de interesse deveria ser avaliado pela comparao do mtodo de superposio de matriz com a padronizao externa (padres preparados nos solventes)25. Apesar de se obter uma calibrao confivel com o mtodo de superposio da matriz, ele somente uma forma para compensar efeitos da matriz, mas no elimina situaes analticas tpicas: a intensidade de um efeito e a concentrao de interferentes na matriz podem diferir de uma matriz ou amostra para outra44. Assim, em amostras nas quais pode ocorrer o efeito da matriz e no se tem disponvel uma matriz

Figura 1. Determinao grfica das curvas de linearidade atravs da: (a) curva analtica clssica; (b) grfico da razo sinal/concentrao vs. concentrao em escala logartmica

de preciso e exatido22. A faixa de aplicao normalmente expressa nas mesmas unidades dos resultados obtidos pelo mtodo, e depende do uso em questo. Vrias recomendaes so encontradas na literatura. Por exemplo, a ANVISA especifica um intervalo compreendido entre 80-120% da concentrao terica para frmacos e medicamentos e de at 120% do limite mximo especificado para determinao de impurezas4. Para resduos, o GARP (Associao Grupo de Analistas de Resduos de Pesticidas)39 recomenda uma faixa de concentrao com valores variando entre a metade e o quntuplo da concentrao do limite de quantificao. A IUPAC especifica que os pontos da curva analtica devem ser igualmente espaados sobre a faixa de concentrao de interesse e que esta faixa compreenda 0 150% ou 50150% do valor esperado, dependendo de qual destas duas opes for mais adequada10. Para produtos formulados, a ICH, entre outros, recomenda uma variao de 20% do valor declarado ou esperado3,7,12. As diretrizes da ICH3 e da ANVISA4 especificam um mnimo de cinco nveis de concentrao, juntamente com certos mnimos de variao especificados. O GARP tambm sugere cinco concentraes que devem ser injetadas em ordem crescente de concentrao, no mnimo trs vezes cada, com estimativa do desvio padro relativo (RSD) entre as injees inferior a 5%. A IUPAC recomenda seis ou mais nveis de concentrao10. A quantificao do composto de interesse em validao pode ser obtida atravs dos seguintes mtodos: padronizao externa; padronizao interna; superposio de matriz; adio padro. Padronizao externa O mtodo de padronizao externa compara a rea da substncia a ser quantificada na amostra com as reas obtidas com solues de concentraes conhecidas preparadas a partir de um padro. Preparam-se solues da substncia a ser quantificada em diversas con-

Vol. 27, No. 5

Validao em Mtodos Cromatogrficos e Eletroforticos

775

isenta da substncia de interesse para utilizar o mtodo de superposio de matriz, deve-se utilizar o mtodo de adio padro44. Adio padro O mtodo de adio padro consiste na adio de quantidades conhecidas da substncia de interesse que est sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra, antes do seu preparo. Estas amostras com o padro incorporado so utilizadas para a obteno dos cromatogramas. Constri-se uma curva analtica relacionando as quantidades da substncia adicionada amostra com as respectivas reas obtidas. O ponto onde a reta corta o eixo das ordenadas corresponde rea do pico da substncia que est sendo determinada, sem qualquer adio do padro. A extrapolao da reta define, no eixo das abcissas, a concentrao da substncia na amostra analisada45. O mtodo de adio padro trabalhoso, mas especialmente importante quando a amostra muito complexa, quando as interaes com a matriz so significativas e quando houver dificuldade de encontrar um padro interno adequado ou uma matriz isenta da substncia de interesse24. A Figura 2 mostra a interrelao entre o mtodo de adio padro, superposio de matriz e padronizao externa. O comportamento paralelo entre as linhas de regresso mostra que o mtodo tem seletividade. De forma geral, pode-se dizer que o mtodo de padronizao externa realizado quando nenhum erro sistemtico proveniente da matriz suspeito, enquanto o mtodo de superposio de matriz compensa o efeito da matriz e o mtodo de adio padro corrige o efeito da matriz e as mudanas da resposta do instrumento. Os mtodos de quantificao no tm regras ou guias, exceto que o mtodo final selecionado deve fornecer a melhor exatido possvel e um alto nvel de preciso. O mtodo escolhido para quantificao deve atingir estes objetivos em um menor tempo possvel, com um mnimo de envolvimento do operador, alm de utilizar pouca quantidade de amostra. O mtodo de quantificao ideal depender da amostra especfica, do nmero de amostras, da complexidade da matriz, da possibilidade de automao e da disponibilidade de padres.

dem partir de uma nica soluo estoque, atravs de diluies sucessivas das solues de trabalho anteriormente preparadas ou atravs do preparo de todas as solues diludas, partindo sempre da soluo estoque. Este ltimo modo o mais recomendado, porm, dependendo da faixa de concentrao em questo, diluies diretamente da soluo estoque podem envolver medies de volumes to pequenas que o erro se torna grande. A Figura 3a mostra um esquema da seqncia utilizando este modo de preparo. Uma outra abordagem para o preparo das solues de trabalho mostrada na Figura 3b. Neste caso, so preparadas duas solues estoque de concentraes diferentes e as solues de trabalho so preparadas a partir destas duas solues, seja por diluies sucessivas ou partindo das solues estoque. Este modo de preparo das solues de trabalho mais adequado, pois permite avaliar atravs da curva analtica o erro embutido na soluo estoque, decorrente da pesagem dos padres. Uma outra maneira de se preparar as solues seria atravs da pesagem separada de cada concentrao do padro da substncia da curva analtica, ao invs da utilizao de diluies sucessivas de uma soluo mais concentrada40. Esta a maneira ideal de se preparar as solues, pois a preparao individual mostra o erro verdadeiro na

Figura 2. Interrelao entre os diferentes mtodos de construo da curva analtica

Quanto aos aspectos prticos, o preparo das solues padro pode ser realizado de diversas maneiras. Em uma delas, prepara-se uma soluo mais concentrada, a partir da pesagem do padro, denominada soluo estoque, que deve ser preparada de acordo com o tempo de estabilidade da substncia em soluo ou pelo menos a cada seis meses. As solues preparadas por diluio so chamadas solues de trabalho e recomenda-se que sejam preparadas pelo menos a cada duas ou trs semanas39. Duas abordagens ocorrem no preparo das solues por diluio. Na primeira, as solues de trabalho po-

Figura 3. Modos de diluio da soluo estoque: a) diluio a partir de uma soluo estoque e b) diluio a partir de duas solues estoques (1 e 2) preparadas com concentraes diferentes

776

Ribani et al.

Quim. Nova

preparao de todas as solues padro e no, erros de diluio. Entretanto, este mtodo torna-se invivel quando se trabalha com anlise de traos, j que a quantidade de padro a ser pesada to pequena que a sensibilidade da balana semi-microanaltica no permite tais pesagens, devido aos erros associados. Preciso Representa a disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, sob condies definidas3,11. A preciso avaliada pelo desvio padro absoluto (), que utiliza um nmero significativo de medies, normalmente maior que 20. Na prtica, em validao de mtodos, o nmero de determinaes geralmente pequeno e o que se calcula a estimativa do desvio padro absoluto (s).

amostra (tipicamente 10 ou mais vezes), seguida pela mdia dos valores da rea do pico ou altura do pico e determinao da estimativa do desvio padro relativo de todas as injees. Para a repetitividade, o INMETRO11 recomenda sete ou mais repeties para o clculo da estimativa do desvio padro. A ICH3 e ANVISA4 sugerem que a repetitividade seja verificada a partir de um mnimo de nove determinaes cobrindo o limite especificado do procedimento (ex.: trs nveis, trs repeties cada um), ou a partir de um mnimo de seis determinaes a uma concentrao similar ao valor esperado. Preciso intermediria Indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinao destes fatores3. A preciso intermediria reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um nico laboratrio e, como tal, mais aconselhvel de ser adotada. O objetivo da validao da preciso intermediria verificar que no mesmo laboratrio o mtodo fornecer os mesmos resultados. O nmero de ensaios necessrios para se avaliar a preciso intermediria segue a mesma recomendao da ICH3 e ANVISA4 para o clculo de repetitividade descrita acima. A preciso intermediria pode ser expressa atravs da estimativa do desvio padro relativo (RSD). Reprodutibilidade o grau de concordncia entre os resultados das medies de uma mesma amostra, efetuadas sob condies variadas (mudana de operador, local, equipamentos, etc.)46. A reprodutibilidade refere-se aos resultados dos estudos de colaborao entre laboratrios e deve ser considerada em situaes como a padronizao de procedimentos analticos a serem includos, por exemplo, em farmacopias, procedimentos do CODEX, etc. muito comum encontrar desacordo entre mtodos analticos. Isto aparece quando vrios laboratrios analisam uma amostra em comum, em estudos colaborativos. Freqentemente, altas variaes so observadas entre os resultados. Assim, os dados provenientes de apenas um laboratrio no so suficientes para avaliar a reprodutibilidade do mtodo. Estudos colaborativos no so somente indispensveis para avaliao da reprodutibilidade, eles tambm podem ser de grande ajuda para testar a exatido do mtodo47. A IUPAC no aconselha tirar concluses com menos de cinco laboratrios e recomenda oito laboratrios em seu guia atual10. Alm disso, mais crtico que o nmero de laboratrios envolvidos que estes possuam competncia e habilidades similares queles que usaro o mtodo em rotina. A documentao que apia os estudos de preciso em nvel de reprodutibilidade deve incluir estimativa do desvio padro absoluto, estimativa do desvio padro relativo e intervalo de confiana. Horwitz et al.48 estabeleceram uma relao matemtica para expressar a dependncia entre valores do RSD e concentrao da substncia, pelo exame de resultados cumulativos de estudos colaborativos envolvendo grande faixa de compostos de interesse, matrizes e tcnicas analticas. Os valores obtidos por esta relao matemtica so introduzidos em um grfico e originam a denominada Trombeta de Horwitz48. Exatido Representa o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referncia aceito como verdadeiro3,11. importante observar que um valor exato ou verdadeiro o valor obtido por uma medio perfeita e este valor indeterminado por natureza49.

x a mdia aritmtica de um pequeno nmero de medies (mdia das determinaes), sendo uma estimativa de , a mdia verdadeira (mdia da populao); xi o valor individual de uma medio e n o nmero de medies. A preciso tambm pode ser expressa atravs do intervalo de confiana da mdia, que uma faixa de valores no qual existe uma determinada probabilidade de se encontrar um certo valor de uma varivel, calculada pela equao: Intervalo de confiana da mdia = em que: tn-1 = valor crtico da distribuio de Student com n-1 graus de liberdade. O valor t tabelado e apresenta valores para diferentes nveis de confiana. Outra expresso da preciso atravs da estimativa do desvio padro relativo (RSD), tambm conhecido como coeficiente de variao (CV).

Normalmente, mtodos que quantificam compostos em macro quantidades requerem um RSD de 1 a 2%. Em mtodos de anlise de traos ou impurezas, so aceitos RSD de at 20%, dependendo da complexidade da amostra16. Uma maneira simples de melhorar a preciso aumentar o nmero de replicatas. A preciso em validao de mtodos considerada em trs nveis diferentes: repetitividade; preciso intermediria; reprodutibilidade. Repetitividade A repetitividade (repeatability) representa a concordncia entre os resultados de medies sucessivas de um mesmo mtodo, efetuadas sob as mesmas condies de medio, chamadas condies de repetitividade: mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas condies; mesmo local; repeties em um curto intervalo de tempo. O termo repetitividade adotado pelo Vocabulrio Internacional de Metrologia46, sendo utilizado pelo INMETRO. Por outro lado, a ANVISA utiliza o mesmo conceito para o termo repetibilidade4. A repetitividade envolve vrias medies da mesma amostra, em diferentes preparaes e , algumas vezes, denominada preciso intraensaio12,38 ou intra-corrida4 e pode ser expressa atravs da estimativa do desvio padro relativo (RSD). No se deve confundir repetitividade com preciso instrumental, a qual medida pelas injees repetitivas, seqenciais da mesma

Vol. 27, No. 5

Validao em Mtodos Cromatogrficos e Eletroforticos

777

A exatido sempre considerada dentro de certos limites, a um dado nvel de confiana (ou seja, aparece sempre associada a valores de preciso). Estes limites podem ser estreitos em nveis de concentrao elevados e mais amplos em nveis de traos. O nmero de ensaios varia segundo a legislao ou diretriz adotada e tambm com as caractersticas da pesquisa. A ICH3 estabelece que um mnimo de nove determinaes envolvendo um mnimo de trs diferentes nveis de concentrao deve ser obedecido. Por exemplo, ensaios em triplicata para trs nveis de concentrao. Esta recomendao tambm adotada pela ANVISA4. Os processos mais utilizados para avaliar a exatido de um mtodo so: materiais de referncia; comparao de mtodos; ensaios de recuperao; adio padro. Materiais de referncia certificados (CRM) Os CRM so materiais de referncia acompanhados de um certificado que possui o valor de concentrao de uma dada substncia, ou outra grandeza para cada parmetro e uma incerteza associada. Os materiais de referncia certificados so fornecidos por organismos reconhecidos e confiveis, como NIST (National Institute of Standards and Technology - USA), LGC (Laboratory of the Government Chemist - UK), USP, FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme - UK), etc. Os valores obtidos pelo laboratrio (a mdia e a estimativa do desvio padro de uma srie de replicatas) da mesma amostra padro devem ser comparados com os valores certificados do material de referncia, para verificar a exatido do mtodo. Comparao de mtodos Consiste na comparao entre resultados obtidos empregandose o mtodo em desenvolvimento e os resultados conseguidos atravs de um mtodo de referncia, avaliando o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois mtodos, ou seja, o grau de exatido do mtodo testado em relao ao de referncia. Esta abordagem assume que a incerteza do mtodo de referncia conhecida. As anlises so efetuadas em replicata, utilizando os dois mtodos em separado (o mtodo em desenvolvimento e o mtodo de referncia), sobre as mesmas amostras, em uma faixa de concentraes em que se pretende validar o mtodo. Ensaios de recuperao A recuperao (ou fator de recuperao), R, definida como a proporo da quantidade da substncia de interesse, presente ou adicionada na poro analtica do material teste, que extrada e passvel de ser quantificada50. A informao de recuperao pode ser estimada de CRM (em que a quantidade de substncia previamente conhecida), quando disponveis, ou de um composto substituto (surrogate). O substituto definido como um composto ou elemento puro adicionado ao material teste, no qual o comportamento qumico e fsico representativo da substncia de interesse na forma nativa41. Diz-se que o composto um substituto porque este transferido para a amostra e pode no estar efetivamente no mesmo equilbrio que se encontra a substncia na forma nativa, ento determina-se a recuperao do substituto, fazendo uma correo de recuperao para a substncia de interesse50. Os compostos substitutos, adicionados nas amostras, podem ser de vrios tipos: padro da substncia adicionado matriz isenta da substncia ou amostra (fortificao, incorporao, dopagem, enriquecimento, termos provenientes do ingls spiking); o US-FDA reconhece duas categorias de padres de referncia: compendiais e no compendiais. Os padres de referncia compendiais so obtidos de fontes como a USP e no necessitam de caracteriza-

o posterior. Os padres de referncia no compendiais so substncias com elevado teor de pureza, que podem ser obtidas atravs de um esforo razovel e devem ser cuidadosamente caracterizados para garantir sua identidade, potncia e pureza. recomendvel que fatores de correo de pureza sejam includos em qualquer clculo existente no mtodo. uma verso da substncia modificada isotopicamente e composto quimicamente diferente da substncia de interesse, mas representativo de seu comportamento. Algumas vezes este composto denominado padro interno23,41. A limitao do procedimento de recuperao a de que a substncia adicionada no est, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra. Isso pode implicar, por exemplo, na presena de substncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor deteco, ocasionando avaliaes excessivamente otimistas da recuperao. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem interferir na separao, deteco ou na quantificao da substncia, efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados. importante considerar como a eficincia do mtodo varia em funo da concentrao da substncia. Na maioria dos casos, a disperso dos resultados aumenta com a diminuio da concentrao e a recuperao pode diferir substancialmente a altas e baixas concentraes. Por esse motivo, a recuperao deve ser avaliada na faixa de concentrao esperada para o composto de interesse. Isto pode ser feito adicionando a substncia em pelo menos trs diferentes concentraes, por exemplo, prximo ao limite de quantificao, prximo concentrao mxima permitida pelo mtodo em teste e em uma concentrao prxima mdia da faixa de uso do mtodo. Para anlises em nvel de resduos, o GARP recomenda que se trabalhe nos nveis de adio de 1, 2 e 10 vezes o valor de limite de quantificao39. Para componentes em maiores concentraes, os nveis de adio podem ser 50, 75, 100, 125 e 150% do nvel esperado para a substncia24. As medies de recuperao so as mais comuns devido dificuldade em se obterem CRM (que, para certas aplicaes, nem existem) e so expressas em termos de porcentagem da quantidade medida da substncia em relao quantidade adicionada na matriz (branco ou placebo), em um determinado nmero de ensaios51. Os intervalos aceitveis de recuperao para anlise de resduos geralmente esto entre 70 e 120%, com preciso de at 20%39. Porm, dependendo da complexidade analtica e da amostra, este valor pode ser de 50 a 120%, com preciso de at 15%39. Adio padro Este mtodo usado quando for difcil ou impossvel preparar um branco da matriz sem a substncia de interesse. Um exemplo seria a anlise de -caroteno em amostras de mamo, nas quais o caroteno sempre estar presente. No mtodo de adio padro, quantidades conhecidas da substncia so adicionadas em diferentes nveis numa matriz da amostra, antes do procedimento de preparo da amostra, que j contenha quantidades (desconhecidas) da substncia52. A concentrao da substncia de interesse na amostra original pode ser determinada grfica e matematicamente, como j mostrado anteriormente. Em geral, para adio padro, uma boa abordagem adicionar 25, 50 e 100% da concentrao esperada da substncia na matriz24. A amostra sem adio do padro e cada uma das amostras com o padro adicionado devem ser analisadas e as quantidades medidas relacionadas com a quantidade adicionada. Limite de Deteco (LD) O limite de deteco (LD) representa a menor concentrao da substncia em exame que pode ser detectada, mas no necessaria-

778

Ribani et al.

Quim. Nova

mente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental3,11. O LD pode ser calculado de trs maneiras diferentes: mtodo visual, mtodo relao sinal-rudo, mtodo baseado em parmetros da curva analtica. Mtodo visual utilizado para determinar o limite de deteco utilizando a matriz com adio de concentraes conhecidas da substncia de interesse, de tal modo que se possa distinguir entre rudo e sinal analtico pela visualizao da menor concentrao visvel (detectvel). Este procedimento tambm pode ser feito atravs do instrumento utilizando parmetros de deteco no mtodo de integrao. Mtodo da relao sinal-rudo Este mtodo pode ser aplicado somente em procedimentos analticos que mostram o rudo da linha de base. Para determinar a relao sinal-rudo, feita a comparao entre a medio dos sinais de amostras em baixas concentraes conhecidas do composto de interesse na matriz39 e um branco (matriz isenta do composto de interesse) destas amostras. Assim, estabelecida uma concentrao mnima na qual a substncia pode ser facilmente detectada. A relao sinal-rudo pode ser de 3:1 ou 2:1, propores geralmente aceitas como estimativas do limite de deteco. Mtodo baseado em parmetros da curva analtica O limite de deteco (LD) pode ser expresso como:

prximos ao LQ, a partir da equao:

O mtodo mais utilizado o da relao sinal-rudo para tcnicas analticas em geral, porm em tcnicas analticas de separao, como as cromatogrficas e eletroforticas, a medio do rudo no trivial e s vezes subjetiva (j que a curva analtica construda com a rea e no somente o sinal do detector). Alm disso, tanto o LD quanto o LQ podem ser afetados pelas condies cromatogrficas. Picos maiores aumentam a relao sinal-rudo, resultando em LD e LQ mais baixos. Alm disso, a determinao cromatogrfica desses parmetros deve considerar tanto o tipo quanto o tempo de uso da coluna. O melhor caminho para resolver este problema do clculo do LD e LQ utilizar o mtodo baseado nos parmetros da curva analtica, que estatisticamente mais confivel. A curva analtica deve conter a concentrao correspondente ao LQ. Robustez De acordo com o INMETRO 11, a robustez de um mtodo (robustness) mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes. Diz-se que um mtodo robusto quando ele no afetado por uma modificao pequena e deliberada em seus parmetros. A robustez de um mtodo cromatogrfico avaliada, por exemplo, pela variao de parmetros como a concentrao do solvente orgnico, pH e fora inica da fase mvel em HPLC, programao da temperatura, natureza do gs de arraste em GC, bem como o tempo de extrao, agitao, etc. As mudanas introduzidas refletem as alteraes que podem ocorrer quando um mtodo transferido para outros laboratrios, analistas ou equipamentos55. Para determinar a robustez de um mtodo, o INMETRO recomenda o teste de Youden11. Trata-se de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes. Por este teste so realizados oito ensaios com uma combinao fatorial dos efeitos e verifica-se qual o efeito ou combinao de efeitos que apresentam variaes. A IUPAC10 utiliza o mesmo conceito de robustez para a palavra ruggedness. A USP tambm utiliza o termo ruggedness, mas com uma definio diferente, que lembra reprodutibilidade: A robustez de um mtodo analtico o nvel de reprodutibilidade dos resultados dos testes obtidos pelas anlises de algumas amostras sob uma variedade de condies normais de teste, tais como diferentes laboratrios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, diferentes lotes de reagentes, diferentes dias, etc.14. Em HPLC, a robustez pode ser avaliada, por exemplo, variando o contedo de metanol na fase mvel em 2%, o pH da fase mvel em 0,1 unidades de pH ou a temperatura da coluna em 5 C. Se estas mudanas estiverem dentro dos limites de exatido,e preciso e seletividade aceitveis, ento o mtodo possui robustez e tais variaes podem ser incorporadas ao procedimento. Em trabalhos nos quais h mudanas de fornecedores, marcas ou equipamentos ao longo do desenvolvimento e validao das metodologias, sem alterao significativa nos resultados, pode-se dizer que o mtodo possui uma robustez intrnseca, pois manteve sua resposta em meio a mudanas de ambiente de anlise. ESTABILIDADE DOS PADRES E DAS AMOSTRAS Para gerar resultados confiveis e reprodutveis, as amostras, os padres e reagentes usados devem ser estveis por um perodo razo-

onde s a estimativa do desvio padro da resposta, que pode ser a estimativa do desvio padro do branco, da equao da linha de regresso ou do coeficiente linear da equao e S a inclinao (slope) ou coeficiente angular da curva analtica. Para calcular estes dados, uma curva analtica dever ser feita utilizando a matriz contendo o composto de interesse na faixa de concentrao prxima ao limite de deteco. Softwares como Microsoft Excel ou Microcal Origin podem calcular os parmetros da curva e a estimativa do desvio padro relativo destes parmetros. Para adquirir melhor compreenso dos clculos envolvidos, pode-se consultar livros de estatstica37,53,54. Limite de Quantificao (LQ) O limite de quantificao (LQ) representa a menor concentrao da substncia em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental3,11. Como o LD, o LQ expresso como uma concentrao, sendo que a preciso e exatido das determinaes tambm devem ser registradas. Esse critrio uma boa regra a ser seguida, porm no se deve esquecer que a determinao do LQ representa um compromisso entre a concentrao, a preciso e a exatido exigidas. Isto significa que, quando decresce o nvel de concentrao do LQ, a medio torna-se menos precisa. Se houver necessidade de maior preciso, uma concentrao maior deve ser registrada para o LQ. O mtodo analtico e seu respectivo uso ditam esse compromisso. Os mesmos critrios de LD podem ser adotados para o LQ, utilizando a relao 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado utilizando o mtodo visual, a relao sinal-rudo ou a relao entre a estimativa do desvio padro da resposta (s) (que pode ser a estimativa do desvio padro do branco, da equao da linha de regresso ou do coeficiente linear da equao) e a inclinao da curva analtica (S), em nveis

Vol. 27, No. 5

Validao em Mtodos Cromatogrficos e Eletroforticos

779

vel (por ex. um dia, uma semana, um ms, dependendo da necessidade)12. Freqentemente, em equipamentos automatizados, as corridas cromatogrficas so realizadas durante a noite para melhor aproveitamento do funcionamento do laboratrio. Esta prtica requer maior estabilidade das solues. A estabilidade das amostras e padres importante em termos de temperatura e tempo. Se uma soluo no for estvel em temperaturas ambientes, a diminuio da temperatura pode aumentar a estabilidade das amostras e padres. Com relao ao tempo, estabilidade de dias ou meses mais desejvel, entretanto em alguns casos, as solues precisam ser preparadas cada vez que forem realizadas as anlises24. Em certos tipos de amostras, faz-se necessrio avaliar a estabilidade da substncia para determinar o tempo de estocagem das amostras38. Tempos longos de estocagem de amostras biolgicas, por exemplo, aumentam a probabilidade de degradao dos compostos de interesse, com subseqente formao de metablitos. Conhecendo a estabilidade, as anlises podem ser completadas antes de ocorrer a degradao. CONFORMIDADE DO SISTEMA Antes de realizar experimentos de validao ou mesmo anlises de amostras, deve-se avaliar se o sistema utilizado para a anlise capaz de fornecer dados de qualidade aceitvel. Esta avaliao alcanada com experimentos de conformidade do sistema (system suitability), que pode ser definida como um conjunto de testes para garantir que o equipamento utilizado est apto a gerar resultados de exatido e preciso aceitveis. A conformidade do sistema pode causar dvidas quanto ao seu alcance e, por isso, encontrada em duas abordagens. A primeira considera que a resoluo e a repetitividade do sistema cromatogrfico sejam adequadas para a anlise a ser realizada. Assim, a conformidade do sistema verificada antes que o desenvolvimento do mtodo e a validao tenham sido completados. Os critrios selecionados so baseados no desempenho do mtodo determinado durante a validao. Por exemplo, se o tempo de reteno da amostra fizer parte do critrio de conformidade do sistema, a sua variao (estimativa do desvio padro) pode ser determinada durante a validao, que pode ter uma variao de 3%, por exemplo (baseado nos resultados de validao) durante o uso rotineiro. A segunda abordagem considera o sistema como um todo e inclui, alm do sistema cromatogrfico, a calibrao e manuteno dos equipamentos e instrumentos utilizados em todo o procedimento analtico, dentro das especificaes. Neste caso, a conformidade do sistema baseia-se no conceito de que o equipamento, componentes eletrnicos, operaes analticas e amostras constituem um sistema integral que pode ser avaliado como um todo. Pode-se dizer, ento, que a conformidade do sistema a verificao de um sistema para garantir a sua qualidade antes ou durante a anlise de amostras desconhecidas. Alguns autores consideram que, se o sistema estiver qualificado, a validao do mtodo pode ser desenvolvida. Algumas vezes os critrios para avaliao da conformidade do sistema so definidos antes da validao e, quando realizados durante as anlises, estes testes garantem que o desempenho do sistema est apropriado para o uso. Os parmetros a serem medidos e seus limites recomendados, de acordo com a US-FDA, esto na Tabela 26. Tipicamente, no mnimo dois destes critrios so requeridos para garantir a conformidade do sistema. REVALIDAO Dentro de um laboratrio provvel que, aps um perodo de tempo, certos reagentes e equipamentos possam ter sofrido altera-

Tabela 2. Parmetros de conformidade do sistema e recomendaes6 Parmetro Fator de reteno (k) Recomendao O pico deve estar bem separado de outros picos e do pico correspondente ao tempo de reteno de um composto no retido (tM), k > 2 RSD < 1% para n > 5 Rs > 2 entre o pico de interesse e o interferente potencial mais prximo (impureza, produto de degradao) TF 2 Em geral deve ser > 2000 para HPLC

Repetitividade (RSD) Resoluo (Rs)

Fator de alargamento (TF) Nmero de pratos da coluna (N)

es, seja por mudana de fornecedor, troca de componentes ou desgaste do equipamento provocado pelo uso constante. possvel que o desempenho do mtodo e, ento, a validade dos resultados gerados pelo mtodo sejam afetados por estas mudanas. A revalidao, que pode ser necessria em tal situao, a reavaliao de um mtodo analtico validado em resposta a uma mudana em algum aspecto do mtodo18,25. impraticvel e provavelmente desnecessrio revalidar um mtodo que tenha sofrido pequenas mudanas. Prope-se que estas pequenas variaes sejam avaliadas durante a validao, no parmetro de robustez, e que a revalidao de mtodo seja limitada s situaes como mudanas de maiores extenses. Para mtodos de separao, alteraes significativas poderiam ser devido a mudanas no produto para o qual o mtodo foi validado, no instrumento, no reagente (tipo ou fabricante) ou no procedimento. A revalidao tambm deve ser considerada quando a proposta e/ou o nvel de qualidade desejado do mtodo so alterados, o procedimento modificado, ou mesmo quando um mtodo usado novamente aps um certo perodo de tempo. Com respeito a quais parmetros devem ser inclusos na revalidao, pode-se dizer que quanto maiores as alteraes no mtodo, maior deve ser a abrangncia da revalidao. CONCLUSO Os conceitos de validao de mtodos continuam a evoluir e esto sempre sob considerao. A proposta deste trabalho foi fornecer ao leitor uma viso dos conceitos e procedimentos de validao utilizados no desenvolvimento de mtodos instrumentais de separao pelos laboratrios industriais, acadmicos e governamentais. Vrias discusses foram inseridas no decorrer do texto, mas alguns pontos devem ser enfatizados para finalizar este tema. As tcnicas cromatogrficas e eletroforticas so alvos primordiais dos procedimentos de validao, pois envolvem monitoramentos que dizem respeito a aspectos como sade pblica, monitoramento ambiental, comrcio exterior e controle de qualidade de produo. A legislao, no que diz respeito validao de metodologias, tem vrias nuances e diferentes interpretaes. Parte desta caracterstica intencional, pois permite a adaptao para cada tipo de problema. A legislao brasileira tem sido melhor definida nos ltimos dois anos, atravs de resolues e recomendaes do INMETRO e ANVISA, inspiradas em diretrizes da ICH e do grupo EURACHEM. Para que um estudo de validao seja conduzido com sucesso, necessrio que se tenha amplo conhecimento da legislao referente s

780

Ribani et al.

Quim. Nova

substncias em estudo (pesticidas, frmacos, etc.) e das diretrizes propostas pelas agncias reguladoras que atuam na(s) rea(s) em questo. O ideal que se faa uma opo por uma linha a ser seguida e que a utilize durante todo o processo. Finalmente, importante esclarecer que a validao de mtodos deve ser planejada antes de seu desenvolvimento e execuo. A estratgia de validao especfica e influenciada pelo procedimento analtico utilizado, pela natureza e concentrao do composto de interesse e pela matriz. Correlacionando-se o desenvolvimento, otimizao e validao de mtodos de uma maneira lgica e organizada, os laboratrios podem gerar resultados bastante eficientes e produtivos. A validao de mtodos pode ser um processo tedioso, mas a qualidade dos resultados gerada est diretamente relacionada com a qualidade deste processo. REFERNCIAS
1. Codex Alimentarius Commission on Methods of Analysis and Sampling; Criteria for Evaluating Acceptable Methods of Analysis for Codex Purposes, CX/MAS 95/3, 1995. 2. International Conference on Harmonisation (ICH); Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology, Q2A (CPMP/ICH/381/95), 1995. 3. International Conference on Harmonisation (ICH); Validation of Analytical Procedures: Methodology, Q2B (CPMP/ICH/281/95), 1995. 4. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA); Resoluo RE n 899, de 29/05/2003. 5. United States Food and Drug Administration (US-FDA); Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, 2001. 6. United States Food and Drug Administration (US-FDA); Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, 2000. 7. United States Food and Drug Administration (US-FDA); Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods, 1994. 8. European Commission; Guidance Document on Residue Analytical Methods, SANCO/825/00, 2000. 9. Eurachem Working Group; The Fitness for Purpose of Analytical Methods, A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, 1998. 10. Thompson, M.; Ellison, S. L. R.; Wood, R.; Pure Appl. Chem. 2002, 74, 835. 11. Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (INMETRO); Orientaes sobre Validao de Mtodos de Ensaios Qumicos, DOQ-CGCRE-008, 2003. 12. Shabir, G. A.; J. Chromatogr., A 2003, 987, 57. 13. International Standard Organization; General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories, ISO/IEC 17025, 1999. 14. United States Pharmacopeia Convention; US Pharmacopeia 24, Validation of Compendial Methods <1225>, Rockville, 1999. 15. World Health Organization Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations; Thirty-second report, WHO Technical Report Series, No.823, Geneva, 1992. 16. Huber, L.; LC-GC Int. 1998, 11, 96. 17. Jenke, D. R.; Instrument. Sci. Technol. 1997, 25, 345. 18. Jenke, D. R.; Instrument. Sci. Technol. 1998, 26, 1. 19. Jenke, D. R.; Instrument. Sci. Technol. 1998, 26, 19. 20. Bruce, P.; Minkkinen, P.; Riekkola, M. L.; Mikrochim. Acta 1998, 128, 93.

21. Massart, D. L.; Smeyers-Verbeke, J.; Vandeginste, B.; Analusis 1994, 22, M14. 22. Swartz, M. E.; Krull, I. S.; Pharm. Technol. 1998, 2, 12. 23. Leite, F.; Validao em Anlise Qumica, 4a ed., Editora tomo: Campinas, 2002. 24. Snyder, L. R. ; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L.; Practical HPLC Method Development, 2a ed., Wiley: New York, 1997, cap. 15. 25. Hill, A. R. C; Reynolds, S. L.; Analyst 1999, 124, 953. 26. van der Voet, H.; van Rhijn, J. A. H.; van de Wiel, H. J.; Anal. Chim. Acta 1999, 391, 159. 27. Horwitz, W.; Pure Appl. Chem. 1995, 67, 331. 28. Internacional Standard Organization; Precision of Test Methods, ISO 5725, 1994. 29. Krull, I.; Swartz, M.; LC-GC 1998, 16, 464. 30. United States Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER); Review Guide: Validation of Chromatographic Methods, Rockville, 1993. 31. United States Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER); General Principles of Validation, Rockville, 1987. 32. Vessman, J.; Stefan, R. I.; Staden, J. F. V.; Danzer, K.; Lindner, W.; Burns, D. T.; Fajgelj, A.; Mller, H.; Pure Appl. Chem. 2001, 73, 1381. 33. Augusto, F.; Andrade, J. C.; Custdio, R.; http://www.chemkeys.com, acessada em Maio 2004. 34. Barros Neto, B.; Pimentel, M. F.; Arajo, M. C. U.; Quim. Nova 2002, 25, 856. 35. Custodio, R.; de Andrade, J. C.; Augusto, F.; Quim. Nova 1997, 20, 219. 36. Chui, Q. S. H.; Zucchini, R. R.; Lichtig, J.; Quim. Nova 2001, 24, 374. 37. Barros Neto, B.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E.; Como Fazer Experimentos: Pesquisa e Desenvolvimento na Cincia e na Indstria , Editora da Unicamp: Campinas, 2001. 38. Green, J. M.; Anal. Chem. 1996, 68, A305. 39. Associao Grupo de Analistas de Resduos de Pesticidas (GARP); Manual de Resduos de Pesticidas em Alimentos (apostila), 1999. 40. Krull, I.; Swartz M.; LC-GC 1998, 16, 1084. 41. Cuadros-Rodrguez, L.; Gmiz-Gracia, L.; Almansa-Lpez, E. M; BosqueSendra, J. M.; Trends Anal. Chem. 2001, 20, 620. 42. Lanas, F. M.; Cromatografia em Fase Gasosa, Acta: So Carlos, 1993. 43. Egea-Gonzlez, F. J.; Torres, M. E. H.; Lpez, E. A.; Cuadros-Rodrguez, L.; Vidal, J. L. M.; J. Chromatogr., A 2002, 966, 155. 44. Cuadros-Rodrguez, L.; Garcia-Campaa, A. M.; Almansa-Lpez, E. M; Egea-Gonzlez, F. J.; Cano, M. L. C.; Frenich, A. G.; Martinez-Vidal, J. L.; Anal. Chim. Acta 2003, 478, 281. 45. Berg, R. G.; Murta, A. L. M.; Kugler, W.; Quim. Nova 1988, 11, 288. 46. Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (INMETRO); Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 2 ed., 2000. 47. Vial, J.; Jardy, A.; Chromatographia 2001, 53, S-141. 48. Horwitz, W.; Kamps, L. R.; Boyer, K. W.; J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1980, 63, 1344. 49. International Standard Organization; Statistics-Vocabulary and SymbolsPart 1: Probability and General Statistical Terms, ISO 3534-1, 1993. 50. Thompson, M.; Ellison, S. L. R.; Fajgelj, A.; Willetts, P.; Wood, R.; Pure Appl. Chem. 1999, 71, 337. 51. Burns, D. T.; Danzer, K.; Townshend, A.; Pure Appl. Chem. 2002, 74, 2201. 52. de Andrade, J. C.; Quim. Nova 1987, 10, 159. 53. Miller, J. C.; Miller, J. N.; Statistics for Analytical Chemistry, 2 ed., Ellis Horwood: Chichester, 1988. 54. Box, G. E. P.; Hunter, W. G.; Hunter, J. S.; Statistics for Experimenters, Wiley: New York, 1987. 55. Heyden, Y. V.; Analusis 1994, 22, M27.