A P P L I E D M I C R O B I O L O G Y , M a r c h , 1 9 6 5

C o p y r i g h t 1 9 6 5 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
V o l . 1 3 , N o . 2
P r i n t e d i n U . S . A .
R o l e o f L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s i n L e a v e n i n g t h e
B a t t e r o f I d l i , a F e r m e n t e d F o o d o f I n d i a 1
S . K . M U K HE R JE E , M . N . A L B U R Y , C . S . P E D E R S O N , A . G . V A N V E E N , A N D K . H. S TE I N K R A U S
N e w Y o r k S t a t e A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n , C o r n e l l U n i v e r s i t y , G e n e v a , N e w Y o r k
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 N o v e m b e r 1 9 6 4
A B S TR A C T
_M U K HE R JE E , S . K . ( C o r n e l l U n i v e r s i t y , G e n e v a , N . Y . ) , - ' I . N . A L B U R Y , C .
S . P E D E R S O N , A . G . V A N V E E N , A N D K . H. S TE I N K E R A U S . R o l e o f L e u c o n o s t o c m e s e n -
t e r o i d e s i n l e a v e n i n g o f t h e b a t t e r o f i d l i , a f e r m e n t e d f o o d o f I n d i a .
A p p l .
M i c r o b i o l .
1 3 : 2 2 7 - 2 3 1 . 1 9 6 5 . - Th e f e r m e n t a t i o n o f t h e b a t t e r o f i d l i , a f e r m e n t e d f o o d o f I n d i a ,
wa s s t u d i e d . Th e m i c r o o r g a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h e c h a r a c t e r i s t i c c h a n g e s i n t h e
b a t t e r we r e i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d . A l t h o u g h t h e r e i s a s e q u e n t i a l c h a n g e i n t h e b a c -
t e r i a l f l o r a , t h e p r e d o m i n a n t m i c r o o r g a n i s m r e s p o n s i b l e f o r s o u r i n g , a s we l l a s f o r g a s
p r o d u c t i o n , wa s f o u n d t o b e L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s . I n t h e l a t e r s t a g e s o f f e r m e n t a -
t i o n , g r o wt h o f S t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s a n d , s t i l l l a t e r , o f P e d i o c o c c u s c e r e v i s i a e b e c o m e s
s i g n i f i c a n t . Th e f e r m e n t a t i o n o f i d l i d e m o n s t r a t e s a l e a v e n i n g a c t i o n c a u s e d b y t h e
a c t i v i t y o f t h e h e t e r o f e r m e n t a t i v e l a c t i c a c i d b a c t e r i u m , L . m e s e n t e r o i d e s . A s f a r a s
i s k n o wn , t h i s i s t h e f i r s t r e c o r d o f a l e a v e n i n g a c t i o n p r o d u c e d e x c l u s i v e l y b y t h e
a c t i v i t y o f a l a c t i c a c i d b a c t e r i u m .
I d l i i s o n e o f t h e v e r y wi d e l y u s e d f e r m e n t e d
f o o d s o f I n d i a , p a r t i c u l a r l y i n t h e S o u t h . I t i s
p r e p a r e d f r o m r i c e a n d b l a c k g r a m m u n g o
( P h a s e o l u s m u n g o ) , a l e g u m e . Th e i n g r e d i e n t s a r e
c a r e f u l l y wa s h e d , s o a k e d i n wa t e r s e p a r a t e l y ,
t h e n g r o u n d , m i x e d , a n d f i n a l l y a l l o we d t o f e r -
m e n t o v e r n i g h t . Wh e n t h e b a t t e r h a s b e e n r a i s e d
s u f f i c i e n t l y , i t i s c o o k e d b y s t e a m i n g a n d s e r v e d
h o t . Th e p r o d u c t h a s a v e r y s o f t a n d s p o n g y
t e x t u r e a n d a d e s i r a b l y s o u r f l a v o r a n d t a s t e .
L e wi s a n d Jo h a r ( 1 9 6 3 ) r e p o r t e d t h e s p e c i e s o f
L a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i , L . l a c t i s , S t r e p t o c o c c u s
l a c t i s , a n d a n u m b e r o f y e a s t s
i n t h e f e r m e n t i n g
b a t t e r . R a d h a k r i s h n a m u r t y e t a l . ( 1 9 6 1 ) i n d i -
c a t e d t h e i m p o r t a n c e o f b l a c k g r a m a s t h e m a j o r
c o n t r i b u t i n g c o m p o n e n t
i n t h e f e r m e n t a t i o n o f
t h e b a t t e r .
Th e p u r p o s e o f t h i s s t u d y wa s t o d e t e r m i n e t h e
n a t u r e o f t h e f e r m e n t a t i o n a n d t h e m i c r o o r g a n -
i s m s r e s p o n s i b l e f o r t h e l e a v e n i n g a c t i o n .
M A TE R I A L S A N D M E THO D S
I n t h e m e t h o d o f p r e p a r a t i o n o f i d l i t h e r e s e e m s
t o e x i s t s o m e v a r i a t i o n i n t h e p r o p o r t i o n s
o f b l a c k
g r a m a n d r i c e u s e d . A n i d l i o f a c c e p t a b l e q u a l i t y
wa s p r e p a r e d i n t h e l a b o r a t o r y wi t h b l a c k g r a m
a n d r i c e i n a 1 : 1 p r o p o r t i o n .
A h i g h e r p r o p o r t i o n
o f r i c e wa s a v o i d e d , a s i t i n d u c e s a s t a r c h y
f l a v o r .
B l a c k g r a m , o b t a i n e d f r o m I n d i a , wi t h a p r o t e i n
1
Jo u r n a l p a p e r
n o . 1 4 1 4 ,
N e w Y o r k S t a t e
A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n ,
C o r n e l l U n i -
v e r s i t y , G e n e v a .
c o n t e n t o f 2 4 . 8 % , wa s u s e d i n a l l t h e e x p e r i m e n t s .
P a r b o i l e d r i c e o f t h e U n c l e B e n t r a d e m a r k wa s
p r o c u r e d f r o m l o c a l m a r k e t s . I t wa s f o u n d t h a t
b e t t e r r e s u l t s we r e o b t a i n e d wi t h p a r b o i l e d r i c e
t h a n wi t h m i l l e d wh i t e r i c e . I t wa s e v i d e n t , f r o m
t h e p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , t h a t t h e f e r m e n t a -
t i o n o f r i c e s e m o l i n a wa s m u c h d e l a y e d , c o m p a r e d
wi t h t h a t o f t h e b l a c k g r a m , a n d t h a t o n l y t h e
g r o u n d b l a c k g r a m i n c r e a s e s i n v o l u m e wh e n t i l e
t wo i n g r e d i e n t s a r e f e r m e n t e d s e p a r a t e l y . Th e
p l a s t i c - l i k e o r g l u t i n o u s c o n s i s t e n c y o f t h e b a t t e r
i s d e s i r a b l e i n o r d e r t o r e t a i n t h e g a s e v o l v e d .
Th e b l a c k g r a m wa s wa s h e d s e v e r a l t i m e s , f i r s t
wi t h t a p wa t e r a n d f i n a l l y wi t h d i s t i l l e d wa t e r .
Th i s r e m o v e d s o m e o f t h e s u r f a c e m i c r o o r g a n i s m s .
Th e s e we r e f o u n d t o p r o d u c e o f f - f l a v o r i n t h e i d l i
u n l e s s t h e y we r e wa s h e d o u t . Th e g r a i n s we r e
s o a k e d f o r 8 h r i n d i s t i l l e d wa t e r , t h e n g r o u n d t o a
f i n e p a s t e i n a Wa r i n g B l e n d o r , a n d m i x e d wi t h
r i c e s e m o l i n a ( 3 0 m e s h ) a n d 1 % s a l t , c a l c u l a t e d
f r o m t h e we i g h t o f b a t t e r . Th e b l a c k g r a m s o a k
wa t e r wa s s a m p l e d a t 0 - , 4 - , a n d 8 - h r i n t e r v a l s .
A f t e r t h e g r o u n d b l a c k g r a m a n d r i c e b a t t e r wa s
p r e p a r e d , i t wa s a l l o we d t o f e r m e n t i n a 3 0 C
i n c u b a t o r . S a m p l e s we r e t a k e n a t 4 - h r i n t e r v a l s f o r
t h e d e t e r m i n a t i o n o f p H a n d f o r p l a t e c o u n t s o f
m i c r o o r g a n i s m s . Th e i n c r e m e n t s i n b a t t e r v o l u m e
we r e a l s o n o t e d a t t h o s e i n t e r v a l s . To t a l a c i d a n d
p H we r e d e t e r m i n e d i n a d u p l i c a t e b a t t e r a t 4 - h r
i n t e r v a l s , s o t h a t t h e b a t t e r u s e d f o r v o l u m e
d e t e r m i n a t i o n a n d p l a t i n g wo u l d b e a l t e r e d a s
l i t t l e a s p o s s i b l e .
M i c r o b i o l o g i c a l a n a l y s e s o f t h e b l a c k g r a m
s o a k
wa t e r a n d t h e b a t t e r . Th e s a m p l e s t a k e n f o r m i c r o -
b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n we r e p l a t e d
wi t h a Tr y p -
2 2 7
M U K HE R JE E E T A L .
t o n e - g l u c o s e - y e a s t e x t r a c t a g a r , c o n t a i n i n g A a n d
B s a l t s a n d Twe e n 8 0 . ( Tr y p t o n e - g l u c o s e - y e a s t
e x t r a c t b r o t h wa s m a d e u p o f t h e f o l l o wi n g : 5
g o f Tr y p t o n e ; 1 5 g o f g l u c o s e ; 2 . 5 g o f y e a s t e x t r a c t ;
1 m l o f Twe e n 8 0 ; a n d 5 m l e a c h o f A a n d B s a l t s ,
m a d e t o 1 , 0 0 0 m l wi t h d i s t i l l e d wa t e r . A s a l t s
c o n t a i n e d 1 0 0 g o f K 2 HP 0 4 a n d 1 0 0 g o f K H2 P O 4
p e r l i t e r , a n d B s a l t s c o n t a i n e d 4 0 g o f
M g S O 4 - 7 H2 0 , 2 g o f N a C l , 2 g o f F e S 0 4 - 4 H2 0 ,
a n d 2 g o f M n S O 4 - 7 H2 0 p e r l i t e r . To p r e p a r e a g a r ,
1 5 g o f a g a r we r e a d d e d . ) A f t e r i n c u b a t i o n a t
3 0 C f o r 4 8 h r , t h e c o l o n i e s we r e c o u n t e d . R e p -
r e s e n t a t i v e c o l o n i e s o f m i c r o o r g a n i s m s we r e
i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d . Th e r e l a t i v e p o p u l a t i o n o f
e a c h s p e c i e s wa s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e
m e t h o d o f P e d e r s o n a n d A l b u r y ( 1 9 5 0 ) .
G r a m - p o s i t i v e c o c c i o r s h o r t r o d s , wh i c h p r o -
d u c e d g a s a n d 0 . 2 5 % o r m o r e a c i d i n Tr y p t o n e -
g l u c o s e - y e a s t e x t r a c t b r o t h , we r e t e n t a t i v e l y
c o n s i d e r e d a s s t r a i n s o f L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s .
Th e i r i d e n t i f i c a t i o n wa s f u r t h e r c o n f i r m e d b y t h e i r
a b i l i t y t o u t i l i z e t h e s e v e r a l s u g a r s , a n d b y t h e i r
c h a r a c t e r i s t i c g r o wt h i n s u c r o s e - g e l a t i n s t a b t u b e s .
L . m e s e n t e r o i d e s p r o d u c e s a d e x t r a n , c h a r a c t e r i z e d
b y a m u c o i d o r wo o l y a p p e a r a n c e i n t h e s u c r o s e -
g e l a t i n i n c u b a t e d a t 2 1 C .
G r a m - p o s i t i v e c o c c i i n s h o r t s t r e p t o c o c c u s
f o r m , wh i c h f a i l e d t o p r o d u c e g a s a n d p r o d u c e d
l e s s t h a n 0 . 3 5 % a c i d i n t h e s a m e b r o t h , we r e
t e n t a t i v e l y c h a r a c t e r i z e d a s S . f a e c a l i s . F o r
f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n , c u l t u r e s we r e t r a n s f e r r e d
i n t o s u g a r b r o t h s , l i t m u s m i l k , a n d 6 . 5 % s o d i u m
c h l o r i d e b r o t h , a n d i n c u b a t e d a t 3 2 C . C u l t u r e s
we r e a l s o t r a n s f e r r e d i n t o Tr y p t o n e - g l u c o s e - y e a s t
e x t r a c t b r o t h f o r i n c u b a t i o n a t 4 5 C .
G r a m - p o s i t i v e c o c c i , s h o wi n g c h a r a c t e r i s t i c
t e t r a d a p p e a r a n c e i n a c i d e n v i r o n m e n t a n d p r o -
d u c i n g 0 . 5 % o r m o r e a c i d , b u t n o g a s , i n t h e s a m e
Tr y p t o n e - g l u c o s e - y e a s t e x t r a c t b r o t h , we r e t e n -
t a t i v e l y c o n s i d e r e d a s s t r a i n s o f P e d i o c o c c u s
c e r e v i s i a e . F o r f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n , c u l t u r e s we r e
t r a n s f e r r e d t o s u g a r b r o t h s .
R E S U L TS
Th e m a j o r c h a n g e s o c c u r r e d s i m u l t a n e o u s l y
a n d r e a c h e d t h e i r p e a k v a l u e s wi t h i n a p e r i o d o f
2 4 h r a f t e r s t a r t i n g t h e s o a k i n g o f t h e b l a c k g r a m
b e a n s ( Ta b l e 1 ) . Th e b a t t e r v o l u m e r e a c h e d i t s
m a x i m u m i n 2 4 h r . Th e g e n e r a l a p p e a r a n c e a n d
t h e a r o m a we r e t h e n t y p i c a l o f a g o o d i d l i b a t t e r .
Th e h i g h e s t c o u n t wa s a t t a i n e d a f t e r t h e 2 0 - h r
p e r i o d ( Ta b l e 1 , F i g . 1 ) . Th e g r e a t e s t c h a n g e i n
t o t a l a c i d i t y a n d p H o c c u r r e d a t 2 8 h r ( F i g . 1 ) .
TA B L E 1 . B a c t e r i o l o g i c a l a n d p h y s i c o c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e i d l i b a t t e r
E s t i m a t e d n o . o f e a c h s p e c i e s X 1 0 6 D u p l i c a t e b a t t e r 6
Ti e
V o l o f
To t a l
c o u n t M i r a o p l c s e i s
b a t t e r
p e r g o f d r y M c o e p h i c s c e s p H
To t a l a c i d i t y b a t t e r
g r a i n s X 1 0 6 A e r o b i c
p H
( g o f l a c t i c
s p e c i e s L e u c o n o s t o c
S t r e p t o c o c c u s P e d i o c o c c u s
a c i d p e r g
o f
m e s e n t e r o i d e s f a c c a l i s c e r e v i s i a c
h r m l
O a 0 . 0 3 7 2 0 . 0 1 5 0 . 0 0 6 0 . 0 1 6 0 6 . 1 6 . 2 0 . 0 6
O b 0 . 0 1 1 7 0 . 0 0 3 0 . 0 0 2 0 . 0 0 7 0 6 . 2 6 . 2 0 . 0 4
4 b _ 0 . 1 8 3 0 0 . 1 7 4 0 . 0 0 9 0 6 . 2 6 . 2 0 . 1 2
8 b 1 2 0 0 1 1 4 6 0 6 . 2 5 6 . 2 0 . 2 4
8 c 1 9 8 0 1 8 8 1 0 0 6 . 3 5 6 . 3 0 . 9 3
9 d 5 0 5 3 2 6 0 3 2 6 0 0 6 . 0 0 6 . 1 0 . 7 7
1 2 5 0 5 1 , 2 6 0 0 1 , 1 7 0 1 9 0 0 5 . 7 0 5 . 7 5 1 . 2
1 6 6 4 5 2 , 5 2 0 0 1 , 8 9 0
6 3 0 0 5 . 2 0 5 . 1 0 2 . 2 3
2 0 7 0 5 3 , 0 0 0 0 1 , 5 0 0 1 5 0 0 0 4 . 8 5 4 . 7 0 2 . 5 0
2 4 7 4 5 2 , 5 5 0 0 1 , 5 3 0 1 , 0 2 0 0 4 . 6 5 4 . 5 5 2 . 7 1
2 8 7 4 5
4 . 7 2 4 . 5 0 3 . 1 4
3 2 5 2 5 2 , 6 4 0
0 1 , 3 2 0 1 , 1 9 0 1 3 0 4 . 7 0 3 . 1 4
3 6 4 5 0 2 , 4 1 0 0 8 4 6 3 6 2 6 0 2 4 . 5 5 4 . 3 5 3 . 1 4
4 0 3 8 0 2 , 1 3 0 0 8 5 2 8 5 2 4 2 6 4 . 5 0 4 . 3 0 3 . 2 1
4 4 3 8 0 1 , 6 5 0
0 9 9 0 3 3 0 3 3 0 4 . 4 5 4 . 3 0 3 . 2 8
4 8 3 8 0 1 , 7 8 0 0 9 8 0 0 8 0 0 4 . 4 5 4 . 2 5 3 . 4 3
5 2 3 8 0 2 , 0 9 0 0 4 2 0 1 , 2 5 0 4 2 0 4 . 5 0 4 . 2 0 3 . 4 3
5 6 3 8 0 2 , 2 0 0 0 8 8 0 3 3 0 9 9 0 4 . 4 0 4 . 1 5 3 . 5 7
7 1 3 8 0 7 7 0 0 4 6 0 0 3 1 0 4 . 3 5 4 . 1 0 3 . 7 0
4 6 0 3 8 0 2 1 3 0 0 0 2 1 3 4 . 0 0
a
U n wa s h e d b l a c k g r a m wa s h wa t e r .
b
Wa s h e d b l a c k g r a m
s o a k wa t e r .
e G r o u n d b l a c k g r a m .
d
G r o u n d b l a c k g r a m , r i c e s e m o l i n a ,
a n d s a l t .
e D a t a o n a s e c o n d b a t c h .
2 2 8 A P P L . M I C R O B I O L .
R O L E O F L . M E S E N TE R O I D E S I N L E A V E N I N G
T7 5
6 0 0
5 0 0
6
4
P H /% A C I D
. . . . . . . . . . . . . - . . . .
-
* A TTE R I V O I U M E
' - - A C TE R A L C O U N T
. . . . . - - - A C I D I TY 2 N D B A TC H
# - - - P H
.
0 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 3 6 4 0 4 6 4 8 5 2 5 6
TI M E I N HO U R S
3 0 0
o
X
z
0
2 0 0
1
1 0 0
x
XI
F I G . 1 . C h a n g e s i n b a t t e r v o l u m e , b a c t e r i a l c o u n t ,
t o t a l a c i d i t y , a n d p H d u r i n g i d l i f e r m e n t a t i o n .
Th e b a t t e r v o l u m e , wi t h t h e a i r i n c o r p o r a t e d
d u r i n g m i x i n g , m e a s u r e d 5 0 5 m l f o r t h e b a t c h o f
i d l i c o n t a i n i n g 7 5 g o f r i c e , 7 5 g o f b l a c k g r a m ,
3 7 0 m l o f wa t e r , a n d 4 . 7 g o f s a l t . Th e b a t t e r
v o l u m e wa s o b s e r v e d t o b e 3 8 0 m l a f t e r 4 0 h r o f
f e r m e n t a t i o n . Th e m a x i m a l v o l u m e o f 7 4 5 m l
wa s r e a c h e d a f t e r 2 4 h r o f f e r m e n t a t i o n . Th e
b a t t e r d i d n o t d e v e l o p a t y p i c a l s o u r a r o m a
u n t i l a p e r i o d o f 1 6 h r h a d e l a p s e d , b e f o r e wh i c h
t h e a r o m a s o f r a w b e a n a n d r i c e we r e a p p a r e n t .
O n l y a f t e r a p e r i o d o f 4 0 h r wa s a s l i g h t o f f - a r o m a
n o t e d . Th e r e wa s l i t t l e c h a n g e i n a r o m a i n s t i l l
l a t e r s t a g e s o f f e r m e n t a t i o n . B l a n d f l a v o r a n d a
d e c r e a s e o f s o u r o d o r t y p i f i e d t h e e n d o f f e r m e n -
t a t i o n . Th e c o n s i s t e n c y o f t h e b a t t e r wa s a l s o
s o f t e r , t h i n n e r , a n d l e s s g l u t i n o u s a t t h i s s t a g e .
Th e p H a n d t o t a l a c i d i t y c h a n g e d s h a r p l y i n
t h e m o s t a c t i v e p e r i o d o f f e r m e n t a t i o n . Th e b a t -
t e r wa s f a i r l y we l l b u f f e r e d a t t h e i n i t i a l a n d f i n a l
s t a g e s o f f e r m e n t a t i o n ( F i g . 2 ) . Th e a c i d i t y wa s
r e l a t i v e l y h i g h a t t h e s t a g e o f c o n s i s t e n c y s u i t a b l e
f o r i d l i m a k i n g . A t t h e 2 0 - h r i n t e r v a l , t h e s e c o n d
b a t c h s h o we d a p H v a l u e o f 4 . 7 0 a n d a t o t a l a c i d
o f 2 . 5 0 % , a s l a c t i c a c i d , b a s e d o n t h e we i g h t o f
d r y g r a i n s . Th e p H o f t h e b a t t e r o f b o t h b a t c h e s
wa s wi t h i n r e a s o n a b l e a g r e e m e n t a f t e r 2 0 h r .
Th e r e i s a n e x c e e d i n g l y h i g h r a t e o f g r o wt h o f
m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s d u r i n g t h e s o a k i n g a n d
e a r l y f e r m e n t a t i o n p e r i o d , r i s i n g f r o m a t o t a l
c o u n t o f 0 . 0 1 1 7 X 1 0 6 t o 3 , 0 0 0 X 1 0 6 p e r g o f d r y
g r a i n s , i n 2 0 h r ( Ta b l e 1 ) . Th i s wa s f o l l o we d ,
h o we v e r , b y a g r a d u a l d e c r e a s e , a s s h o wn b y a
p o p u l a t i o n o f 1 , 7 8 0 X 1 0 6 a t 4 8 h r .
A t o t a l o f 2 9 0 b a c t e r i a l s p e c i e s we r e i s o l a t e d
f r o m s a m p l e s o f b a t t e r a t p e r i o d i c i n t e r v a l s . O f
t h e s e , 1 2 7 p r o d u c e d a c i d a n d c a r b o n d i x o i d e , a s
we l l a s t h e t y p i c a l m o r p h o l o g y a n d m u c o i d
g r o wt h o f L . m e s e n t e r o i d e s . R e p r e s e n t a t i v e s t r a i n s
f e r m e n t e d g l u c o s e , f r u c t o s e , g a l a c t o s e , m a n n o s e ,
s u c r o s e , m a l t o s e , a n d x y l o s e , wi t h t h e a m o u n t o f
a c i d n o r m a l l y p r o d u c e d b y t h a t s p e c i e s . Ho we v e r ,
t h e y f a i l e d t o f e r m e n t a r a b i n o s e , a n d t h e r e f o r e
a r e c o n s i d e r e d a s a r a b i n o s e - n e g a t i v e
s t r a i n s o f
1 2 3 4
A C I D I TY
G M L A C TI C A C I D P E R 1 0 0 G M O F G R A I N
F I G . 2 . To t a l a c i d i t y , p H r e l a t i o n s h i p s d u r i n g
f e r m e n t a t i o n o f i d l i , s e c o n d b a t c h .
L . m e s e n t e r o i d e s . A n a d d i t i o n a l 9 3 s t r a i n s p r o -
d u c e d a c i d wi t h n o c a r b o n d i o x i d e g a s , a n d r e p r e -
s e n t a t i v e s t r a i n s g r e w i n 6 . 5 % s o d i u m c h l o r i d e
b r o t h a t 4 5 C ; t h e y f e r m e n t e d g l u c o s e , f r u c t o s e ,
g a l a c t o s e , m a n n o s e , a r a b i n o s e , s u c r o s e , m a l t o s e ,
l a c t o s e , r a f f i n o s e , a n d m a n n i t o l , a n d we r e , t h e r e -
f o r e , c o n s i d e r e d s t r a i n s o f S . f a e c a l i s . A n u m b e r o f
s t r a i n s ( 5 6 ) g r e w i n t y p i c a l t e t r a d f o r m a t i o n ,
p r o d u c e d a c i d b u t n o t c a r b o n d i o x i d e , a n d
s h o we d o t h e r c h a r a c t e r i s t i c s o f P . c e r e v i s i a e . Th e
r e m a i n i n g 1 4 c u l t u r e s , i s o l a t e d f r o m t h e f e r m e n t -
i n g b e a n s , we r e a e r o b i c , a n d we r e n o t i d e n t i f i e d
f u r t h e r .
Th e s e q u e n c e o f g r o wt h o f t h e o r g a n i s m s i s
a p p a r e n t i n Ta b l e 1 . S o m e o f t h e c o l o n i e s ( 4 0 % )
i s o l a t e d f r o m t h e o r i g i n a l s a m p l e o f b l a c k g r a m
we r e f o u n d t o b e a e r o b e s . Th i s s i t u a t i o n wa s
c h a n g e d r a p i d l y , h o we v e r , a n d a t 4 a n d 8 h r o f
p r e s o a k i n g o f t h e b e a n s , 9 5 % o f t h e i s o l a t e s we r e
f o u n d t o b e L . m e s e n t e r o i d e s . A t t h e 4 - h r p l a t i n g ,
a f e w a e r o b i c c o l o n i e s we r e s t i l l p r e s e n t .
Th e a e r o b i c c o l o n i e s o n t h e u n s o a k e d b l a c k
g r a m b e a n s a r e s h o wn i n F i g . 3 A . Th e p l a t i n g a t
4 h r ( F i g . 3 B ) s h o ws a f e wa e r o b i c c o l o n i e s , wi t h
t h e m a j o r i t y c o n s i s t i n g o f t y p i c a l l a c t i c a c i d - t y p e
c o l o n i e s . Th e p l a t i n g s a t 8 a n d 1 2 h r , a s s h o wn i n
F i g . 3 C a n d D , r e v e a l p r e d o m i n a n t l y t h e t y p i c a l
a c i d - t y p e c o l o n i e s .
Th e l o w- a c i d p r o d u c e r s , L . m e s e n t e r o i d e s a n d
S . f a e c a l i s , a p p e a r e d e a r l y
i n t h e f e r m e n t a t i o n ,
f o l l o we d b y t h e h i g h a c i d - p r o d u c i n g P . c e r e v i s i a e .
Th e r e a s o n f o r t h e g r e a t e r g r o wt h o f L . m e s e n -
t e r o i d e s t h a n t h a t o f S . f a e c a l i s , a l o we r a c i d -
p r o d u c e r , i n t h e b e g i n n i n g o f f e r m e n t a t i o n , i s n o t
c l e a r . A l t h o u g h L . m e s e n t e r o i d e s wa s p r e d o m i -
n a n t d u r i n g t h e u s e f u l s t a g e o f f e r m e n t a t i o n ,
S .
f a e c a l i s wa s f o u n d g r o wi n g
a t t h e s t a r t o f f e r m e n -
t a t i o n a n d c o m p r i s i n g 5 0 %
o f t h e t o t a l c o u n t i n
2 0 h r . P . c e r e v i s a e s t a r t e d g r o wi n g o n l y
a f t e r 2 8
h r ,
a
s t a g e wh e n t h e b a t t e r i s n o l o n g e r
s u i t a b l e
V O L . 1 3 , 1 9 6 5 2 2 9
4
I
C
<
M U K HE R JE E E T A L .
F I G . 3 . C o l o n i e s o n a g a r p l a t e s d u r i n g s o a k i n g o f b l a c k g r a m b e a n s : ( a ) 0 - h r wa s h e d b e a n s ; ( b ) 4 - h r
s o a k e d b e a n s ; ( c ) 8 - h r s o a k e d b e a n s ; ( d ) 1 2 - h r b a t t e r .
f o r t h e p u r p o s e o f i d l i m a k i n g . S p e c i e s o f y e a s t s
a n d t h e s p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a r e p o r t e d b y
L e wi s a n d Jo h a r ( 1 9 5 3 ) we r e n o t i s o l a t e d a t a n y
s t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n . Th e b a c t e r i a l s p e c i e s
t h e y d e s c r i b e d a r e h o m o f e r m e n t a t i v e , a n d wo u l d
n o t p r o d u c e l e a v e n i n g a c t i o n .
Th e p r e s e n c e o f L . m e s e n t e r o i d e s h a s p r e v i o u s l y
b e e n e s t a b l i s h e d i n m a n y f e r m e n t i n g v e g e t a b l e s .
P e d e r s o n a n d A l b u r y ( 1 9 5 4 ) s h o we d t h a t , a t
v a r i o u s s a l t c o n c e n t r a t i o n s , t h e f e r m e n t a t i o n o f
s a u e r k r a u t wa s a l wa y s i n i t i a t e d b y t h e s p e c i e s
L . m e s e n t e r o i d e s . Th e f e r m e n t a t i o n wa s e v e n t u a l l y
c o m p l e t e d , h o we v e r , b y t h e s p e c i e s L . p l a n t a r u m
a n d L . b r e v i s . P e d e r s o n a n d A l b u r y ( 1 9 5 6 ) a l s o
o b s e r v e d t h e p r e s e n c e o f L . m e s e n t e r o i d e s i n l o w-
s a l t c u c u m b e r b r i n e f e r m e n t a t i o n s . Th e y n o t e d
t h a t L . p l a n t a r u m wa s s o m e t i m e s d o m i n a n t i n
o n e b a t c h , wh e r e a s L . b r e v i s wa s o c c a s i o n a l l y
d o m i n a n t i n a n o t h e r . I n a l l t h e s e c a s e s , a c i d p r o -
d u c t i o n wa s m a r k e d .
Th e f e r m e n t a t i o n o f i d l i d e m o n s t r a t e s a l e a v e n -
i n g a c t i o n c a u s e d b y t h e a c t i v i t y o f t h e h e t e r o -
f e r m e n t a t i v e l a c t i c a c i d b a c t e r i u m , L . m e s e n -
t e r o i d e s . A s f a r a s i s k n o wn , t h i s i s t h e f i r s t r e c o r d
o f a l e a v e n i n g a c t i o n p r o d u c e d e x c l u s i v e l y b y t h e
a c t i v i t y o f a l a c t i c a c i d b a c t e r i u m . A l t h o u g h t h e
p r e s e n c e o f t h e h o m o f e r m e n t a t i v e l a c t i c a c i d
b a c t e r i u m , S . f a e c a l i s , m u s t h a v e s i g n i f i c a n c e i n
2 3 0 A P P L . M I C R O B I O L .
V O L . 1 3 , 1 9 6 5 R O L E O F L . M E S E N TE R (
a c i d i t y d e v e l o p m e n t , t h i s o r g a n i s m d o e s n o t p r o -
d u c e s u f f i c i e n t c a r b o n d i o x i d e t o a c t a s a l e a v e n -
i n g a g e n t .
A C K N O WL E D G M E N TS
Th i s i n v e s t i g a t i o n wa s s u p p o r t e d b y P u b l i c
He a l t h S e r v i c e t r a i n i n g g r a n t 5 TI - G M - 8 8 6 f r o m
t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f He a l t h , a n d b y t r a i n i n g
g r a n t 4 1 4 7 f r o m t h e Wi l l i a m s - Wa t e r m a n F o u n d a -
t i o n .
L I TE R A TU R E C I TE D
L E WI s , Y . S . , A N D D . S . JO HA R . 1 9 5 3 . M i c r o -
o r g a n i s m s i n f e r m e n t i n g g r a i n m a s h e s u s e d f o r
f o o d p r e p a r a t i o n s . B u l l . C e n t r a l F o o d Te c h n o l .
R e s . I n s t . M y s o r e ( I n d i a ) 2 : 2 8 8 .
O I D E S I N L E A V E N I N G 2 3 1
P E D E R S O N , C . S . , A N D M . N . A L B U R Y . 1 9 5 0 . E f f e c t
o f t e m p e r a t u r e u p o n b a c t e r i o l o g i c a l a n d c h e m -
i c a l c h a n g e s i n f e r m e n t i n g c u c u m b e r s . N . Y .
S t a t e A g r . E x p t . S t a . G e n e v a , N . Y . , B u l l . 7 4 4 .
P E D E R S O N , C . S . , A N D M . N . A L B U R Y . 1 9 5 4 . Th e
i n f l u e n c e o f s a l t a n d t e m p e r a t u r e o n t h e m i c r o -
f l o r a o f s a u e r k r a u t f e r m e n t a t i o n . F o o d Te c h n o l .
8 : 1 - 5 .
P E D E R S O N , C . S . , A N D M . N . A L B U R Y . 1 9 5 6 . V a r i a -
t i o n s i n t h e b a c t e r i a l f l o r a o f l o w s a l t c u c u m b e r
b r i n e s . A p p l . M i c r o b i o l . 4 : 2 5 9 - 2 6 3 .
R A D HA K R I S HN A M U R TY , R . , H. S . R . D E S I K A C HA R ,
M . S R I N I V A S A N , A N D V . S U B R A HM A N Y A N . 1 9 6 1 .
S t u d i e s o n i d l i f e r m e n t a t i o n : P a r t I I . R e l a t i v e
p a r t i c i p a t i o n o f b l a c k g r a m f l o u r a n d r i c e
s e m o l i n a i n t h e f e r m e n t a t i o n . J. S c i . I n d . R e s .
( I n d i a ) 2 0 c : 3 4 2 - 3 4 5 .