14/06/12

Anvisa - Legislai;:80 - Resolucoes

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- RE n° 899, de 29 de maio de 2003

D.O.U. 02/06/2003

o Adjunto da Diretoria Colegiada da Agencia Nacional de Vigilancia Portaria n.? 238, de 31 de marco de 2003,

Sanitaria, no uso da atribuicao, que Ihe confere a

considerando 0 disposto no art.111, inciso II, alfnea "a" § 3° do Regimento Interno aprovado pela Portaria n° 593, de 25 de agosto de 2000, republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, considerando que a materia foi submetida a apreciacao da Diretoria Colegiada, que a aprovou em reuniao realizada em 6 de marco de 2003, resolve: Art. 1° Determinar a publicacao do "Guia para validaC;80 de rnetodos analiticos e bioanalfticos" Art. 2° Fica revoqada a Resoluy80 RE no 475, de 19 de marco de 2002. Art. 3° Esta Resolucao entra em vigor na data de sua publicacao, DAVI RUMEL anexo

ANEXO GUIA PARA VALlDAC;Ao METODOS ANALiTICOS 1. Consideracoes gerais DE METODOS ANALiTICOS E BIOANALiTICOS

1.1. As informacoes contidas nesse Anexo apresentam as caracterfsticas a serem consideradas durante a validacao de procedimentos analiticos. 0 objetivo de uma validacao e demonstrar que 0 rnetodo e apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinacao qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de farmacos e outras substancias em produtos farmaceuticos. 1.2. Essas informacoes aplicam-se a: gasosa (CG) ou cromatografia Ifquida de alta

1.2.1. tecnicas analfticas que facarn uso de rnetodos de cromatografia eficiencia (CLAE); 1.2.2. rnetodos nao-cromatoqraficos, espectrofotometria UV-VIS); 1.2.3. testes imunol6gicos estas tecnicas,

desde que estes ofere yam uma seletividade aceltavel (por ex. titulometria,

ou microbiol6gicos,

desde que observado 0 grau de variabilidade usual mente associado que 0 rnetodo atenda as exiqencias das

a

1.3. A validacao deve garantir, por meio de estudos experimentais,
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm

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Limite de quantificacao 1. conforme a Tabela 1. No caso de metodologia analftica descrita em farmacopeias pela ANVISA. Precisao 1.7. Limite de deteccao (sensibilidade) 1. Para efeito desse guia. desde que sejam avaliados as parametres de precisao. Para a garantia da qualidade analftica dos resultados. a metodologia sera considerada validada.7. Robustez 1. todos as equipamentos utilizados na valldacao devem estar devidamente calibrados e as analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados.htm para a validacao do metoda analftico. C6pia de toda a docurnentacao original da validacao da metodologia devera ser anexada. 1. a metodologia sera considerada validada. 1.br/legis/resol/2003/re/899_03re.6.Resolucoes aplicacoes analfticas.8. deve apresentar especificidade. linearidade. Para tanto.Legislai.7.7.3.7. local.:80 .anvisa. Ensaios necessaries www. Exatidao 1. llberacao do ativo) Testes de identificacao na Tabela 2.1. Interval a 1. par outros c6digos autorizados pela leqislacao vigente. como prova de que a metodologia foi original mente validada e devera canter. e Seletividade dos testes. a metodologia sera considerada validada. 1. instrumentacao. devidamente reconhecidos 1.14/06/12 Anvisa .6. Classiflcacao Categoria Finalidade em 4 categorias. adequados a analise. 1.10. desde que sejam avaliados as parametres relacionados a seguir.7. limite de quantificacao.7. conforme especificado nas Tabelas 1 e 2. No caso de metodologia analftica nao descrita em farmacopeias au formularies oficiais. especificidade e linearidade. 1. todos as parametres relacionados no item 1. analista. condicoes de utilizacao e em intervalo de tempo curto entre as medicoes.gov. no mfnimo. exatidao.7. Linearidade 1. segundo sua finalidade: 2/13 . No caso da transferencia de metodologias da matriz para suas subsidiarias no Brasil e/ou das empresas nacionais para as centro de estudos de equivalencia farmaceutica.8. relacionados Tabela 2. segundo sua finalidade: do teste I II III IV Testes quantitativos para a deterrninacao do principia atbo em produtos farmaceuticos au materias-primas Testes quantitativos au ensaio limite para a determinacao de impurezas e produtos de deqradacao em produtos armaceuticos e rnaterias-prirnas Testes de performance (par exemplo: dissolucao. considera-se corrida analftica as rnedicoes sucessivas de um mesmo anal ito.7. intervalo.2.11.4. 1. desde que a identidade e a tear sejam devidamente comprovados. Os testes sao classificados Tabela 1. assegurando a confiabilidade dos resultados. No caso da inexistencia dessas substancias.9.5. efetuadas nas mesmas condicoes: metoda. Especificidade 1.7.7. na ausencia destas. sera admitido a usa de pad roes de trabalho. precisao. Deve-se utilizar substancias de refer€mcia oficializadas pela Farmacopeia Brasileira au.4. devidamente reconhecidos pela ANVISA. Para cada categoria sera exigido um conjunto de testes. sensibilidade. 1. au formularies oficiais.5.

metodologia analitica devera ser revalidada nas seguintes circunstancias: 1. e deve-se tomar as precaucoes necessarias para garantir a pureza dos picos cromatoqraficos. 2.1.1. e 2. 2. 2.12. pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou produtos de deqradacao com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia farrnacopeica ou outro procedimento validado). 11 nterme iana Li mite de deteccao Limite de quantificacao Exatidao Robustez * pode ser necessario. 1. Para analise quantitativa (teor) e analise de impurezas.1.2. para demonstrar que 0 resultado do teste nao afetado por esses materiais. mas compostos estruturalmente semelhantes.1. 1.14/06/12 Anvisa . Para analise qualitativa (teste de identificacao) necessario demonstrar a capacidade de selecao do rnetodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. luz.Legislai. que a linearidade seja determinada pela analise de. calor umidade. Em rnetodos cromatoqraflcos.sa d" . rnudancas na cornposicao do produto acabado. hidr61ise acida/basica.2. no rnlnirno.3.htm . Sim Sim Sim Sim ** Nao Nao Sim Sim Sim Sim Sim Sim ** Nao Sim Sim Sim limite Sim Nao . Metodologia outras rnudancas podem requerer valldacao tarnbern. dependendo da natureza das mudancas. Linearidade E a capacidade de uma metodologia analitica de demonstrar que os resultados obtidos sao diretamente proporcionais a concentracao do anal ito na amostra. _ _lRepetibilidade rec. Determinadas 2. Isto deve ser confirmado pela obtencao de resultados posithos (preferivelmente em relacao ao material de referencia conhecido) em amostras contendo 0 farmaco. 1. e 2.1. a especificidade pode ser determinada pela cornparacao dos resultados obtidos de amostras (farmaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras nao contaminadas. Especificidade e Seletividade tais E a capacidade que 0 rnetodo possui de medir exatamente um composto em presenca de outros componentes como impurezas. comparativamente com resultados neqativos obtidos com amostras que nao contern 0 farmaco. A utilizacao de testes de pureza de pico (por exemplo.br/legis/resol/2003/re/899_03re. dentro de um intervalo especificado.3. oxidacao). * Nao Nao Sim Nao Sim · · · · · · Sim Nao Nao Nao Nao Nao Nao Nao Nao ** Sim Nao dependendo da natureza do teste especffico.2.:80 .1. rnudancas no procedimento analitico. Quando a impureza ou 0 padrao do produto de deqradacao nao estiverem disponiveis.12.12.gov. produtos de deqradacao e componentes da matriz. 3/13 2. rnudancas na slntese da substancia ativa. nao ** se houver cornprovacao da reprodutibilidade e necessaria a cornprovacao da Precisao lntermediaria. Estas cornparacoes devem incluir amostras armazenadas sob condicoes de estresse (por ex. com auxilio de detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas) sao interessantes para demonstrar que 0 pico cromatoqrafico atribuido a um s6 componente.Resolucoes Pararnetre Categoria Categoria I II Categoria Categoria III IV Ensaio Quantitativo Especificidade Linearidade Intervalo P .2.anvisa.1.12. 5 concentracoes diferentes. Recomenda-se www.

9 (nove) determinacoes.4. 2. 2. os limites de quantiflcacao e deteccao devem ser adequados as quantidades de impurezas a serem controladas De 70% a 130% da concentracao Uniformidade de conteudo eorica do teste De ±20% sobre 0 valor especificado para 0 intervalo. ou seja. Limites porcentuais do teor do anal ito que devem estar contidos no intervalo de linearidade para alguns rnetodos analiticos.2. precisao e linearidade adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substancias dentro do intervalo especificado. baixa.Legislar.4. = 0. media e alta. 2. entre os resultados dentro de um curto perfodo de tempo A repetibilidade do rnetodo e verificada por.2.4.2. os resultados dos testes deverao ser tratados por rnetodos estatfsticos apropriados para determlnacao do coeficiente de correlacao. mas obtidos em dias diferentes. matemattco). contemplando 0 intervalo linear do rnetodo. Caso a especificacao para a dissolucao envolva mais que Ensaio de dissolucao um tempo.htm .Resolucoes Estas concentracoes devem seguir os intervalos da Tabela 3. 0 criterio mfnimo aceitavel do coeficiente de correlacao (r) deve ser 2. e a resultante do tratamento o intervalo 2. Tabela 3. 2. com 3 (tres) replicas cada ou mfnimo de 6 determinacoes a 100% da concentracao do teste. Repetibilidade (precisao intra-corrida): concordancia com 0 mesmo analista e mesma instrurnentacao. no mfnimo.gov. 5e houver relacao linear aparente apos exame visual do grafico. Esta e considerada em tres nfveis.anvisa. Para a deterrninacao da precisao intermediaria recomenda-se um mfnimo de 2 dias diferentes com analistas 4/13 www.99. Normalmente e derivado do estudo de linearidade e depende da aplicacao pretendida do rnetodo (Tabela 3).:ao . E estabelecido pela confirmacao de que 0 rnetodo apresenta exatidao. Quando apresentarem irnportancia oxicoloqica ou efeitos farmacoloqicos Determinacao de impurezas inesperados.3.14/06/12 Anvisa . Ensaio Alcance Determ ina980 quantitativa do De 80% a 120% da concentracao anal ito em rnaterias-primas ou em eorica do teste ormas farmaceuticas Do nfvel de impureza esperado ate 120% do limite maximo especificado.1.4.2. realizar transformacao rnaternatica. Precisao intermediaria (precisao inter-corridas): concordancla entre os resultados do mesmo laboratorio. p alcance do rnetodo deve incluir _ ~O% sobre 0 menor valor e +20% sobre 0 maior valor.br/legis/resol/2003/re/899_03re.3. tnterseccao com 0 eixo Y. soma residual dos quadrados mfnimos da reqressao linear e desvio padrao relative. Precisao A precisao e a avaliacao da proximidade dos resultados obtidos em uma serie de medidas de uma amostragem multi pia de uma mesma amostra. Intervalo especificado e a faixa entre os limites de quantificacao superior e inferior de um rnetodo analftico. 5e n80 houver relacao linear.2. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental 2. 3 (tres) concentracoes. coeficiente angular. com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

ate 0 menor nivel detectasel: porern n80 conhecidas e 2.gov. partes por rnilhao) na amostra. 2. concentracao 2. www.5.1.:80 .5. IC e a inclinacao da curva de callbracao.2. 2. a concentraeao amostra. A precisao pode ser expressa como desvio padrao relative (DPR) ou coeficiente de variacao (CV%).anvisa.6. onde 0 limite de deteccao e 0 menor valor de concentracao capaz de produzir 0 efeito esperado (rnudanca de cor. a concentracao o valor maximo aceitavel deve ser definido de acordo com a metodologia empregada. porcentagem pIp ou p/V.Resolucoes diferentes. etc).br/legis/resol/2003/re/899_03re. Este desvio padrao pode ainda ser obtido a partir da curva de calibracao proveniente da analise de um nurnero apropriado de amostras do branco.3. para ensaios quantitativos de impurezas. CG.6. No caso de rnetodos n80 instrumentais (CCD. para inclusao de metodologia em farmacopeias. Limite de Ouantificacao a menor quantidade do anal ito em uma amostra que pode ser determinada as condicoes experimentais estabelecidas. n80 se admitindo valores superiores a 5%. 0 limite de quantificacao e estabelecido por meio da analise de solucoes contendo concentracoes decrescentes do farmaco ate 0 menor nivel determinavel com precisao e exatidao aceitaveis. 0 limite de deteccao e estabelecido por meio da analise de solucoes de concentracoes decrescentes do anal ito.1.4. por exemplo. absorcao at6mica). 2. Pode ser determinado pela equacao. Pode ser expresso pela equacao. geralmente aplicados padronizacao de metodologia analitica. DPR _D_P-xlOO CMD media determinada.5. Estes dados n80 precisam ser apresentados para a concessao de registro. 3 curvas de calibracao construidas contendo concentracoes do farmaco pr6ximas ao suposto limite de quantificacao. No caso de rnetodos instrumentais (CLAE.Legislai.5. segundo a formula. esta determinacao pode ser feita visual mente. do anal ito na em que. principalmente.3. sob as condicoes experimentais estabelecidas. DP eo desvio padrao e CMD. titulacao. Limite de Deteccao Limite de deteccao e a menor quantidade do anal ito presente em uma amostra que pode ser detectado. produtos de deqradacao em farmacos e produtos de deqradacao em formas farmaceuticas e e expresso como do anal ito (por exemplo. a A precisao de um rnetodo analftico pode ser expressa como 0 desvio padrao ou desvio padrao relative (coeficiente de variacao) de uma serie de medidas.14/06/12 Anvisa . 0 tipo de matriz e a finalidade do rnetodo.htm 5/13 . LD DPax3 Ie em que: DPa e 0 desvio padrao do intercepto com 0 eixo do Y de. turvacao. cornparacao de cor). necessariamente quantificado. 2. no minimo. 2. Reprodutibilidade (precisao inter-laboratorial): concordancia entre os resultados obtidos em laborat6rios diferentes como em estudos colaborativos. a estimativa do limite de deteccao pode ser feita com base na relacao de 3 vezes 0 ruldo da linha de base. E com precisao e exatidao aceitaveis sob o limite de quantificacao e um pararnetro determinado.

Forma Farmaceutica de uma segunda metodologia bem 2.-.--.2.-.br/legis/resol/2003/re/899_03re.7.7. 9 (nove) determinacoes contemplando 0 intervalo linear do procedimento. comparacao dos resultados obtidos com aqueles resultantes caracterizada.2.~. no minimo.7. Exatidao A exatidao de um rnetodo analftico e a proximidade valor verdadeiro. analise pelo rnetodo de adicao de padrao.8.Legislai. Impurezas 2.7.2. do intervalo linear e da especificidade do mesmo.htm teo rica x 100 6/13 . Ie e a inclinacao da curva de calibracao.3.7. 2. cuja exatidao tenha side estabelecida.1.1. -.1. no qual adiciona-se quantidades conhecidas do anal ito (padrao de referencia) ao medicamento.6.1. 2.-... Tambern pode ser determinado por meio do ruido. ou seja. sendo verificada a partir de.1.7.2. quantidades conhecidas de impurezas e/ou 2. media e alta. --.2.----..7. -_. ou como a diferenca porcentual entre as medias e 0 valor verdadeiro aceito. aceita-se a analise pelo metodo de adicao de padrao.7. Robustez www.Exattd:a 0 . A exatidao e calculada como porcentagem de recuperacao da quantidade conhecida do anal ito adicionado amostra. Varias metodologias 2.:80 .7. 3 curvas de calibracao construidas contendo concentracoes do farmaco pr6ximas ao suposto limite de quantificacao. baixa. determina-se 0 ruido da linha de base e considera-se como limite de quantificacao aquela concentracao que produza relacao sinal-ruido superior a 10: 1.1. Farrnaco 2.7. Neste caso.gov. concertracac 2. aplicando-se reterencla): a metodologia analftica proposta na analise de uma substancia de pureza conhecida (padrao de para a determinacao dos resultados obtidos pelo rnetodo em estudo em relacao ao da exatidao estao disponiveis: 2. no caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de deqradacao. 3 (tres) concentracoes. nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento estao indisponiveis. A exatidao e expressa pela relacao entre a concentracao media determinada experimentalmente e a concentracao te6rica correspondente: a e oncentr:2~aO medi a e:. na analise de uma amostra.2.----. --.2._-.---. aceita-se a cornparacao dos resultados obtidos com um segundo rnetodo bem caracterizado (metodologia farmacopeica ou outro procedimento analitico validado). 2. Este desvio padrao pode ainda ser obtido a partir da curva de calibracao proveniente da analise de um apropriado nurnero de amostras do branco. acrescida dos intervalos de confianca. A exatidao do rnetodo deve ser determinada ap6s 0 estabelecimento da linearidade.:peri mental . no qual adiciona-se produtos de deqradacao ao medicamento ou ao farmaco.14/06/12 Anvisa . na qual quanti dade conhecida de farmaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado).anvisa. 2.3. no minimo. com 3 (tres) replicas cada. -.Resolucoes LD em que: DPa e 0 desvio padrao do intercepto com 0 eixo do Y de.---.3. 2.

amostras processadas e desconhecidas. Corrida analitica (au late) .representa a grau de concordancia referencla.. . tais como metab6litos.. podendo ser a farmaco nao-transformado. __ . Indica sua confianca durante a usa normal. usada para monitorar a desempenho de um metoda bioanalitico e para avaliar a integridade e validade dos resultados das amostras desconhecidas analisadas numa corrida individual. compostos de deqradacao au componentes da matriz. A Tabela 4 relaciona as principais parametres que podem resultar em variacao na res posta do metoda. especificidade do metoda bioanalitico. concentracao).anvisa. _ _ .. com um nurnero apropriado de padroes e CQs para sua validacao e que tem sua analise completa nas mesmas condicoes...__ . seu derivado.:80 . devem Preparo das Amostras Espectrofotometria Cromatografia Uquida Cromatografia Gasosa ·Estabilidade das solucoes analiticas ·Tempo de extracao -Variacao do pH da solucao ·Temperatura ·Diferentes fabricantes de solventes -Variacao do pH da fase m6vel -Variacao na cornposicao da fase m6vel ·Diferentes lotes au fabricantes de colunas ·Temperatura ·Fluxo da fase m6vel ·Diferentes lotes au fabricantes de colunas ·Temperatura -Velocidade do gas de arraste METODOS BIOANALiTICOS 1.. _ _ inalterado numa dada matriz entre as resultados individuais encontrados e um valor ace ito como . Constatando-se a susceptibilidade do metoda a variacoes nas condicoes analfticas.. metab61ito au prod uta de deqradacao em uma matriz biol6gica... deve-se considerar a avaliacao da robustez.:.::.._ www..14/06/12 Anvisa ...J_ .. . brancos. __ ...J . Fatores que devem ser considerados na determinacao da robustez do metoda analitico. que pode ser confiavel e .. Faixa de quantificacao ._ . "':... __ :_ incluindo a LSQ e a UQ. _1 __ ...amostra biol6gica que e objeto de analise.....corresponde :+. Amostra de Controle de Qualidade (CQ) .. ..::.._ ..composto quimico especifico a ser mensurado.amostra de uma matriz biol6gica na qual nenhum anal ito foi adicionado. extracao. Amostra processada . utilizada para avaliar a Amostra branco .. Especificidade . _ . impurezas....conjunto completo de amostras em estudo.... .amostra de matriz biol6gica adicionada do anal ito..: diluicao.. _ .. __ . .J. em determinados intervalos de tempo.__ : .gov... I a uma faixa de concentracao...habilidade do metoda bioanalitico de medir e diferenciar a anal ito de componentes que possam estar presentes na amostra...termo geral que abrange: controles...pararnetro que visa determinar se um anal ito rnantem-se quimicamente sob condicoes especificas.br/legis/resol/2003/re/899_03re. estas deverao ser controladas e precaucoes ser incluidas no procedimento.1.extrato final (anterior analise instrumental) manipulacoes (ex.... Tabela 4.. Amostra desconhecida .. Exatidao . biornolecula au a de uma amostra que foi submetida a varias Analito ...... ..._ ......::.Legislai.. em resistir a pequenas e deliberadas variacoes dos Durante a desenvolvrnento da metodologia.. .... Estabilidade . Definicoes Amostra ..Resolucoes A robustez de um metoda analitico e a medida de sua capacidade parametres analiticos.htm 7/13 .. __ 1 .::.

.. _ ......... LC-MS-MS. quando aplicado diversas vezes numa mesma amostra hornoqenea. 0 procedimento e Recuperacao .J_ ... pode-se observar um alto grau de variabilidade.. geralmente com caracterfsticas estruturais similares ao anal ito..J . .anvisa. -1 .... : • I:. cromatografia Ifquida de alta eficlencla (CLAE) e estas combinadas com espectrometria de massa (MS) tais como LC-MS.composto.Legislai.material distinto de origem biol6gica..._ ... -I_ . assegurando a confiabilidade dos resultados...Resolucoes e j.representa 0 grau de repetibilidade entre os resultados de analises individuais..J_ I. 2..gov.htm 8/13 ..... Tambern representa a precisao do rnetodo sob as mesmas condicoes operacionais..1.. para facilitar a deterrninacao do anal ito. utilizados na determinacao quantitativa de farrnacos e/ou metab61itos em matrizes biol6gicas.... 2._ . estabilidade e recuperacao adequadas a analise... tais como cromatografia gasosa (CG)..modlficacao no rnetodo bioanalftico validado que nao requer a necessidade de uma revalldacao Validacao total . nestes casos. Padrao Interno (PI) . 1 . deve apresentar precisao.. ....br/legis/resol/2003/re/899_03re. exatidao. obtida da cornparacao dos resultados analfticos de amostras branco acrescidas de padrao e submetidas ao processo de extracao..Jrt:lir~i:lU. que pode ser amostrado e processado Metodo .. Desse modo. j. .. plasma ou urina. linearidade.. 2.i:llrUi:lU Anvisa .. As informacoes contidas neste guia aplicam-se a rnetodos bioanalfticos. adicionado aos padrnes de calibracao e amostras em concentracoes conhecidas e constantes........ Oonsideracoes gerais de todos os parametres de validacao de um rnetodo bioanalftico. 1 .:::...eficiencia de extracao de um rnetodo analftico.estabelecimento analise das amostras. : .... -1 . tais como sangue.. www...... CG-MS.. _1 . Reprodutibilidade ._ : . us ados em analises de amostras.J: .. parcial . do rnetodo de fornecer resultados diretamente proporcionais a concentracao Matriz biol6gica .matriz biol6gica a qual foi adicionada uma quantidade conhecida de anal ito... Deve-se utilizar substancias quimicas de referencla e lou padroes biol6gicos oficializados pela Farmacopeia Brasileira ou por outros c6digos autorizados pela leqislacao vigente.maior quanti dade de um anal ito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisao e exatidao. expressa como a porcentagem da quantidade conhecida de um anal ito. :I:.2... Limite de Deteccao (LD) . em identicas condicoes de ensaio.._: . que 0 rnetodo atenda as exigencias das aplicacoes analfticas._I~ ... com a qual sao determinadas as concentracoes do anal ito nos CQs e nas amostras desconhecidas em estudo.:_.14/06/12 reprouuuveuuetue 4Ui:lrrllfflii:lUi:lliUrrr t:Jl.. :1:..menor concentracao confiavelrnente do rufdo de fundo. de um anal ito que 0 procedimento bioanalftico consegue diferenciar Limite Inferior de Ouantiflcacao (UQ) . aplicaveis a 2.. Para tanto. Precisao ... especificidade..... com os resultados analfticos de solucoes padrao nao extraidas. e importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devern apresentarse devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados.... ou para outras matrizes biol6gicas.. Linearidade . na ausencia de substancias qufmicas de referencta e/ou padroes biol6gicos farmacopeicos. Limite Superior de Ouantificacao (LSQ) .JU~li:l.precisao entre dois laborat6rios. por meio de estudos experimentais.. A validacao de\te garantir. tais como rnetodos microbiol6gicos e imunol6gicos. soro. Os padroes de calibracao sao usados para construir a curva de calibracao.... num curto perfodo de tempo. Padrao de calibracao .3. reprodutibilidade. vauoacao total.. _..menor quantidade de um anal ito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisao e exatidao aceitaveis...descricao com preens f\tel de todos os procedimentos de modo reprodutlvel.corresponde a capacidade da substancia em exame (anal ito).it n ...... "l. Tarnbem se aplica a outras tecnicas analfticas. : ...... CG-MS-MS. embora.... limite de deteccao e limite de quantificacao. Serao admitidos estudos utilizando pad roes secundarios desde que seja comprovada sua certificacao..:80 ..Jur rrrt:ru Ui:I rt:ri:lyi:lU liUrrlit:rrlli:lyi:lU-rt:~j.

3. 2.3.6. Exemplos de variacoes: 2. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes).6. 2. substituicao 2.6.1. Deve-se analisar amostras da matriz bioloqica (sangue. especificos. 2. rnudanca de anticoagulante na coleta das amostras. rnudancas de instrumentos 2.6. 2.€ ser realizada validacao total antes da irnplernentacao farrnaco e/ou metabolitos.3.7. de seletividade do anal ito na presence de rnedicacoes de seletividade do anal ito na presenca de metabolitos 2. A avaliacao da robustez de\. de um rnetodo bioanalitico 2. 2.1. ~t:rrrfJrt: que rnetodos crornatoqraficos forem utilizados. do sistema de deteccao. Constatando-se suscetibilidade a variacoes nas condicoes analiticas.4.€ ser testada utilizando orocedimento e as condicoas cromatonraficas www.6. transferenclas de rnetodos entre laboratorios e analistas.'+. dernonstracao e/ou "softwares".€Iocidade de fluxo. ou outra) obtidas de seis individuos. de plasma para urina.9.7.htm 0 9/13 orooostas. Validacao pre . Devern ser realizadas validacoes parciais quando ocorrerem modiflcacoes no rnetodo bioanalftico ja validado. 2. estabilidade das solucoes analiticas.2. para a quantificacao de um 2.anvisa. Os ensaios de validacao parcial podem ser desde uma pequena determinacao. 2. 2. ri::lri::l U~ t:~lUUU~ ue Anvisa . dernonstracao 2. como a deterrninacao da exatidao e precisao intra-ensaio.€-se justificar a impossibilidade de sua utilizacao.9.4. temperatura. por exemplo.5. sob condicoes controladas referentes ao tempo.5.7.7.7. Especificidade 3. Os resultados de\Sm ser comoarados com aaueles obtidos .7.7. soro.7. rnudancas relevantes na faixa de concentracao: 2. por exemplo. concomitantes. influencia da variacao da cornposlcao da fase rnoeel. Variacoes tipicas em cromatografia gasosa: 2. ate proximo de uma validacao total. alirnentacao e outros fatores importantes para 0 estudo.6.1. estas deverao ser adequadamente controladas ou precaucoes deverao ser incluidas no procedimento. plasma. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes). tempo de extracao.5.1. \. 2.1.7.7.6.€Iocidade de fluxo. rnudanca no procedimento de preparacao da amostra.6. Cada amostra branco de\.Legislai. 2. temperatura.7. entre outras: 2.7. urina. As rnudancas tipicas que podem requerer uma validacao parcial incluem. uma lipernica e uma hemolisada.6.br/legis/resol/2003/re/899_03re. Variacoes tipicas em cromatografia liquida: 2. 2.€ ser considerada durante a fase de desenvolvrnento do rnetodo.6.estudo 3.:80 . rnudanca de matriz.gov. sendo quatro amostras normais.2. De\.7.Resolucoes UIUUI~fJurIlUIIIUi::IUt: rt:li::IlIvd/ulut:llulvdlt:rllOli::I ut:Vt:-~t: UlIlILi::Ir fJi::Iuri::lu uueu to.10.8. \.6. De\.6.8.14/06/12 L. rnudancas na metodologia analitica. influencia da variacao de pH da fase movel.

3.1. A repetibilidade do metoda e verificada utilizando-se. Os interferentes podem ser componentes da matriz biol6gica.-. 5 (cinco) determinacoes par concentracao.. a qual sera usada para calcular a concentracao do farmaco nas amostras. a metoda de\e ser alterado visando elirninala. Curva de calibracao/Iinearidade 3. a coeficiente angular e a intercepto da reta. Procedimentos alternatives devern ser justificados. De\e-se gerar uma curva de calibracao para cada farmaco e corrida analitica.1.2. -_. . deve-se analisar amostras extraidas da matriz apropriada.1.. 3.5.--. desvio menor au igual a 20% (vinte par cento) em relacao a concentracao 3. realizando-se.2.3.. A curva de calibracao de\e incluir a analise da amostra branco (matriz biol6gica isenta de padrao do farmaco e do padrao interno).3. Os resultados devern ser analisados par metodos estatisticos apropriados como.4. no minima. da amostra zero (matriz biol6gica mais a padrao interno) e de._--_ .3..---.2.gov.htm 10/13 .2. metab6litos..br/legis/resol/2003/re/899_03re. nominal para a LlQ. A precisao deve ser determinada (preclsao inter-corridas).2.---~--' -. Caso uma au mais das amostras deste grupo apresentarem interferencia significativa no tempo de retencao do farmaco.3..1. 3. produtos de venda isenta de prescricao e metab61itos deve ser considerada sempre que necessaria..1.4. Caso a metoda seja destinado a quantificacao de mais de um farmaco..2.2. como na obtencao de uma correlacao nao-linear. Criterios de aceitacao da curva de calibracao: 3. no minima 6 (seis) concentracoes diferentes. 3. 3. 3. a coeficiente de correlacao linear deve ser igual au superior a 0. '_'y---.4...2. do LlQ ate 120% da concentracao mais alta que se pretende analisar. 3 (tres) concentracoes (baixa. As respostas de picas interferentes no tempo de retencao do farmaco e do padrao interno devern ser inferiores. a calculo de reqressao linear pelo metoda dos minimos quadrados. 3..3. cada um deve ser injetado separadamente para determinar as tempos de retencao individuais e assegurar que impurezas de um farmaco nao interfiram na analise do outro.. contemplando a faixa de variacao do procedimento.1.4.3. ~--_. media e alta). 6 (seis) amostras contendo padrao do farmaco e padrao interno.. _ . segundo a formula: www._---_ ._--_. exceto para a LlQ. Qualquer amostra branco que apresentar interferencia significativa no tempo de retencao do farmaco.-_. A resposta de picas interferentes no tempo de retencao do farmaco de\e ser inferior a 20% da resposta do LlQ. -_ .~------_ . no minima. -._-- com solucao aquosa do anal ito.2. a coeficiente de correlacao linear.2.14/06/12 . Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matematico).2. A interferencia da nicotina. no minima.98.2.:80 . Caso uma au mais das amostras analisadas apresentarem tal interferencia. 3. utilizando-se a mesma matriz biol6gica proposta para a estudo.Resolucoes . respectivamente. desvio menor au igual a 15 % (quinze par cento) em relacao concentracoes da curva de calibracao. 3.4.--'-'-.4. 3.2.3...Legislai. par exemplo. contemplando a limite de variacao esperado. em uma mesma corrida (preclsao intra-corrida) e em corridas diferentes 3. para a qual se admite valores menores au iguais a 20%. cafeina. nominal para as outras a concentracao 3. Para a determinacao da curva de calibracao.. no minima quatro de seis concentracoes da curva de calibracao devern cumprir com as criterios anteriores. metab61ito au padrao interno.4. Pode ser expressa como desvio padrao relative (DPR) au coeficiente de variacao (CV%). a 20% e 5% da res posta na concentracao utilizada. -~-~. novas amostras de outros seis individuos devern ser testadas.anvisa. em concentracao proxima ao LlQ. nao se admitindo valores superiores a 15%. incluindo a LlQ e a maior concentracao da curva de calibracao.1. de\e ser rejeitada. em que um maior nurnero de concentracoes de padroes serao necessaries.- Anvisa . A curva de calibracao representa a relacao entre a res posta do instrumento e a concentracao conhecida do anal ito. Precisao 3. produtos de decornposicao e medicamentos utilizados concomitantemente ao estudo. 3.. 3.

2. realizando-se. devendo-se especificar a metoda utilizado para determinacao do LlQ. A exatidao do metoda deve ser determinada utilizando-se.1. contemplando a faixa de linearidade do metoda. utilizar a razao de 5: 1 entre a sinal e a rufdo da linha de base.:ao te6rica (LlQ) x 100 3. 5 (cinco) amostras de padroes. 3. admite-se valores menores.3. A exatidao deve ser determinada diferentes (exatidao inter-corridas).0 desvio nao deve exceder 15%.7. contemplando a faixa de variacao do procedimento.5. exceto para a limite de quantiflcacao.7. 3.4. no mfnimo. no mfnimo.2. decrescentes do farmaco ate a 3. Limite inferior de quantificacao 3.4. no mfnimo. em uma mesma corrida analftica (exattdao intra-corrida) e em corridas 3. no mfnimo.br/legis/resol/2003/re/899_03re. porern. 0 LlQ deve ser. 0 pica de resposta do farmaco no LlQ deve ser identificavel e reprodutfvel com precisao de 20% (vinte par cento) e exatidao de 80 . Estabelecido par meio da analise de matriz biol6gica contend a concentracoes menor nfvel quantificavel com precisao e exatidao aceitaveis. ate a menor nfvel detectavel. D Pea desvio padrao e C M D.14/06/12 Anvisa . 3.3. 3.2.4. Recomenda-se que a LD seja de 2 a 3 vezes superior ao rufdo da linha de base. 3.anvisa. Porcentagens de recuperacao do anal ito e do padrao interno pr6ximos a 100% sao desejaveis. Este teste deve ser realizado comparando-se as resultados analfticos de amostras extrafdas a partir de tres concentracoes (baixa.5.1.gov.6. 3. Recuperacao A recuperaeao mede a eficiencia do procedimento de extracao de um metoda analftico dentro de um limite de variacao.4.5. 3 (tres) concentracoes (baixa. A exatidao e expressa pela relacao entre a concentracao concentracao te6rica correspondente: para a qual se admite desvios menores media determinada experimentalmente ea Exatidao = --------------- co ncentracao m ed ia experim ental concentra-. 3.120 % (oitenta a cento e vinte par cento).5. Pode-se.4. desde que a recuperacao seja precisa e exata.4.X 100 onde.8. a concentracao media determinada. 5 (cinco) determinacoes par concentracao.:80 . 3. 0 calculo da recuperacao deve ser feito em funcao da relacao de area do padrao extrafdo e nao extrafdo.4. 3.5. tanto para a anal ito quanta para a padrao interno separadamente. 3. Limite de deteccao (LD) Estabelecido par meio da analise de solucoes de concentracoes conhecidas e decrescentes do farmaco. com as resultados obtidos com solucoes padrao nao extrafdas. Exatidao 3. cinco vezes superior a qualquer interferencia da amostra branco no tempo de retencao do farmaco. tambern.Resolucoes OPR = OP -C-M-O. que representam 100% de recuperacao. atraves da analise de.Legislai. media e alta). media e alta).1.7. Controle de qualidade (CQ) www.htm 11/13 . au iguais a 20%.

no minimo. na amostra processada para analise. 3.3. na www.2.htm 12/13 . previamente validados.4.9.2.Resolucoes 3.3. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do rnetodo analftico. 3.1. limite de varlacao e robustez. 0 tempo de armazenamento para 0 estudo de estabilidade de longa duracao deve exceder 0 intervalo de tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra e a analise da ultima. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do rnetodo analftico. Deve ser avaliada a estabilidade do anal ito durante a coleta e manuseio da amostra. quantificando-se 0 farmaco nas amostras ap6s 0 terceiro cicio. Estabilidade p6s-processamento Em caso de utilizacao de equipamentos que empregam sistemas autornaticos de amostraqern/injecao.4.9. ate contemplar os tres ciclos. As concentracoes de todas as amostras de estabilidade devem ser comparadas com a media dos valores anteriormente calculados para as amostras do primeiro dia do teste. da matriz biol6gica e do material de acondicionamento utilizado. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recem-preparadas.8. assim sucessivamente.9. no minimo. especificidade. linearidade. CQ de baixa concentracao 3. limite de deteccao. (CQB): menor ou igual 3 x LlQ.3. sendo entao submetidas ao descongelamento a temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas. Deve-se incluir tarnbern avaliacao da estabilidade do anal ito nas solucoes-padrao.9. Consideracoes especificas relevantes Para a realizacao do estudo de estabilidade devem ser observados os parametres de exatldao.8.9. deve-se realizar estudo de estabilidade do farmaco. As determinacoes de estabilidade devem utilizar um conjunto de amostras. Estabilidade ap6s ciclos de congelamento e descongelamento Deve-se testar a estabilidade do farmacc ap6s tres ciclos de congelamento e descongelamento.br/legis/resol/2003/re/899_03re.8.1. Estudo de estabilidade do farmaco em Ifquidos biol6gicos: 3.9.9.8. 3.anvisa. nas seguintes condicoes: as amostras devem ser congeladas a temperatura indicada para 0 armazenamento e mantidas por 24 horas. precisao. utilizando-se. Estabilidade de curta duracao Para veriflcacao dessa estabilidade utilizam-se. Estabilidade de longa duracao 3. preparadas com solvente apropriado em concentracoes conhecidas.gov.:80 . Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recernpreparadas. a 3. incluindo 0 padrao interne.14/06/12 Anvisa . de acordo com 0 cronograma apresentado no protocolo de estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalencia. as amostras devem ser novamente congeladas a temperatura indicada para 0 armazenamento. As condicoes de realizacao dos ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condicoes de manuseio e analise das amostras. A estabilidade do farmaco em Ifquidos biol6gicos depende de suas propriedades qulrnicas. Cada uma delas devera permanecer temperatura ambiente de 4 (quatro) a 24 (vinte e quatro) horas (baseado no tempo em que as amostras do estudo serao mantidas a temperatura ambiente) e analisadas. A temperatura utilizada no ensaio deve reproduzir a recomendada para armazenamento normal mente igual a -20 DC.1. ap6s ciclos de congelamento e descongelamento e nas condicoes de analise.2. Para verificacao dessa estabilidade utilizam-se. CQ do limite inferior de quantlficacao 3.5. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validayao do rnetodo analftico.4. CQ de alta concentracao (CQ-LlQ): mesma concentracao de LlQ. das amostras. preparadas a partir de uma solucao estoque recente do farmaco em analise.4.4. por 12 a 24 horas e. CQ de media concentracao 3. (CQA): 75 a 90% da maior concentracao 3. 3.Legislai. adicionado a matriz biol6gica isenta de interferencia. limite de quantificacao.9. A estabilidade determinada para um tipo de matriz e de material de acondicionamento especffico nao pode ser extrapolada para outros.9. no minimo. 3. ap6s armazenagem de longa curacao (congelamento) e curta duracao (a temperatura ambiente). (CQM): aproximadamente a media entre CQB e CQA da curva de calibracao.

9.6. com excecao do LlQ.4. 3. 4.3.gov.2. 3.6.6. Deve ser avaliada a estabilidade das solucoes-padrao do farmaco e do padrao interno. a curva deve ser redefinida au as amostras de concentracoes superiores devem ser diluidas e re-analisadas. www.htm 13/13 . No minima.14/06/12 Anvisa .2. as resultados desse teste devem ser comparados preparadas do farmaco e do padrao interno. Qualquer que seja a metoda estatistico utilizado para avaliar as resultados dos estudos de estabilidade. 4. este desera estar descrito claramente no procedimento operacional padrao (POP). contemplando a temperatura e a periodo de armazenamento das mesmas.Legislai. 3. Uma corrida analitica deve canter: amostras de CQ. As amostras de CQ devem ser incorporadas em intervalos adequados.7. sempre em igual nurnero de replicatas de cada concentracao (CQB. Para atingir este objetivo.Resolucoes temperatura sob a qual a teste sera realizado e par period a de tempo superior a curacao da corrida analitica. E prefe riveI que todas as amostras de um mesmo voluntario sejam analisadas numa (mica corrida.6. CQM e CQA). para a qual se aceita desvio de ate 20%. Nao e permitido estimar a concentracao das amostras atraves de extrapolacao da curva de calibracao abaixo do LlQ au acima do maior padrao.9. as resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recem-preparadas. 3. pelo menos 6 (seis) CQs (uma duplicata de cada concentracao) devem estar presentes. 4.br/legis/resol/2003/re/899_03re. amostras de CQ devem ser analisadas juntamente com as demais amostras. padrnes de calibracao e amostras desconhecidas de um au mais voluntaries do estudo. a estabilidade deve ser avaliada. para 4. em cada corrida analitica.7.9. Em vez disso. A analise de todas as amostras de um anal ito em matriz biol6gica deve ser concluida dentro do periodo de tempo para a qual a estabilidade tenha sido determinada. exceto para a LlQ. Em caso de tais solucoes serem armazenadas sob refriqeracao au congelamento. Utilizase.:80 . no minima. mantidas temperatura ambiente par.3. Criterios de aplicacao do metoda bioanalitico validado 4.5. Estabilidade das solucoes-padrao 3. 67% (quatro de seis) das amostras de CQ devem estar dentro de mais au menos 15% dos seus respectivos valores nominais. Analise dos resultados com aqueles obtidos utilizando-se a tarnbern solucoes recentemente As amostras serao consideradas estaveis quando nao se observar desvio superior a 15% do valor obtido das amostras recern-preparadas. 4.anvisa.9. 4. mas nao para a mesma concentracao.9.1. no minima. para a qual se admite desvios menores au iguais a 20%. dependendo do nurnero total de amostras da corrida. sua precisao e exatidao devem ser monitoradas regularmente assegurar a continuidade do desempenho satisfat6rio. Para corridas analiticas constituidas de ate 120 amostras. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do metoda analitico. as resultados das amostras de CQ servrao de base para aceitacao au rejeicao da corrida analitica. 33% (duas de seis) amostras de CQ podem estar fora destes limites. 6 (seis) horas ap6s preparacao. No usa rotineiro do metoda analitico validado. 4.1.6. a nurnero de amostras de CQ (em multiples de tres) a ser incorporado em cada corrida analitica nao deve ser inferior a 5% (cinco par cento) do nurnero de amostras desconhecidas.

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