UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Bethnia Alves de Avelar

DETECO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMTICAS (INTERFERON GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL, INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA 10) EM LEUCCITOS HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUDO DE Euphorbia tirucalli

Diamantina 2010

Bethnia Alves de Avelar

DETECO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMTICAS (INTERFERON GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL, INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA 10) EM LEUCCITOS HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUDO DE Euphorbia tirucalli

Dissertao apresentada ao curso de Mestrado do Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincias Fisiolgicas. rea de concentrao: Farmacologia de produtos naturais e plantas medicinais. Orientador: Dr. Gustavo Eustquio Brito Alvim de Melo - UFVJM Coorientador: Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes UFMG

Diamantina 2010

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo cuidado;

Ao meu pai Amrico e minha me Lcia, pelo exemplo de perseverana, amizade, apoio e dedicao;

Ao meu irmo Amrico, pelo companheirismo;

Aos meus tios, Lucimar, Lucinia, Lucilene, Estanislau e Luciano, pela bondade, incentivo e prontido em ajudar;

Ao Professor Dr. Gustavo Eustquio Brito Alvim de Melo, pelo auxlio na formao acadmica, pela amizade e o exemplo de Pesquisador;

Professora Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes, pela disposio em coorientar;

Ao Professor Dr. Herton Helder Rocha Pires (Tim), pelo incentivo e confiana desde a iniciao cientfica;

equipe do Programa Multicntrico em Cincias Fisiolgicas da UFVJM pelos conselhos e apoio;

Ao Dr. Olindo Martins Filho, pelas contribuies ao trabalho;

Aos funcionrios da Pr-reitoria de Pesquisa e Ps-Graduao, pelo comprometimento;

equipe do laboratrio de Imunologia da UFVJM, pelo incentivo e apoio, e trabalho em equipe;

A todos que contriburam de alguma forma para a realizao deste trabalho.

Uma paixo forte por qualquer objeto assegurar o sucesso, porque o desejo pelo objetivo mostrar os meios. William Hazlitt

RESUMO

O uso de plantas da famlia Euphorbiaceae, principalmente do gnero Euphorbia, tem sido popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenas de natureza infecciosa, tumoral e inflamatria. Entre as espcies desse gnero, a Euphorbia tirucalli uma planta de uso difundido no Brasil e em algumas regies, tal como a do Vale do Jequitinhonha. H indcios de que o ltex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e antiviral, porm, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nessa ao. provvel que o mecanismo de ao para tais atividades envolva a ativao de leuccitos e a produo de citocinas para o direcionamento de uma resposta antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso, o presente trabalho avaliou a produo de citocinas TNF-, IFN-, IL-4 e IL-10 nas populaes e subpopulaes leuccitrias do sangue perifrico estimulados com o ltex bruto da referida planta. Para tal, leuccitos do sangue perifrico de vinte indivduos hgidos foram incubados por 4 horas com o ltex bruto de E. tirucalli diludo em Dimetilsulfoxido (DMSO) e constituiu o grupo ltex (Lt). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO, utilizandose o mesmo perodo de incubao, constituram as culturas controle no estimuladas (CC) e controle de solvente (DMSO), respectivamente. Aps o perodo de incubao, as clulas foram marcadas com anticorpos monoclonais especficos para receptores de superfcie celular CD4, CD8 e CD14, bem como para as citocinas intracitoplasmticas TNF-, IFN-, IL-4 e IL10. A aquisio e anlise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram um aumento significativo (p < 0,05) no percentual de linfcitos T e sua subpopulao T CD4 positivos para as citocinas do tipo 1, TNF- e IFN-. Essas citocinas so responsveis por ativar o sistema imune para respostas imunoprotetoras frente s infeces virais e processos tumorais. J os neutrfilos e linfcitos T CD8, nas culturas estimuladas com o ltex da planta, apresentaram um perfil misto de produo de citocinas do tipo 1 e 2. Esses resultados evidenciaram uma resposta do tipo 1 predominante, in vitro, e uma provvel ativao de mecanismos moduladores, mediados por linfcitos T CD8 e neutrfilos. Este estudo sugere que a utilizao popular da planta em infeces virais e processos tumorais pode ter algum fundamento, tendo em vista a produo preferencial de citocinas do tipo 1 em clulas estratgicas da resposta imune celular, fundamental no combate s patologias mencionadas. No entanto, os estudos in vitro aqui realizados no so suficientes para garantir que a utilizao da planta no contexto in vivo possa, de fato, apresentar tais propriedades.

Assim, estudos adicionais, incluindo outros ensaios in vitro, bem como ensaios pr-clnicos, so fundamentais para o avano das pesquisas envolvendo a utilizao de E. tirucalli para fins teraputicos.

Palavras-chave: Euphorbia tirucalli, imunomodulao, planta medicinal, proinflamatria.

ABSTRACT
The use of plants in the family Euphorbiaceae, especially of the genus Euphorbia, has been popularly circulated for the treatment of a variety of infectious, tumoral and inflammatory illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is a the plant with widespread use in Brasil and in some regions, such as the Vale do Jequitinhonha. There is evidence that the latex of E. tirucalli has antiviral and antitumor activity, but little is known about the mechanisms involved in this action. It is likely that the mechanism of action for such activities involves leukocyte activation and cytokine production for directing an effective antitumor and antiviral response. Thus, the present study evaluated the production of cytokines TNF-, IFN-, IL-4 and IL-10 in the populations and subpopulations in peripheral blood leukocytes stimulated with crude latex of this plant. For such, peripheral blood leukocytes of twenty healthy subjects were incubated for 4 hours with crude latex of E. tirucalli diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) and was the latex group (Lt). Cell cultures incubated with saline and DMSO, using the same incubation period, represent the control cultures that were not stimulated (CC) and solvent control (DMSO), respectively. After the incubation period, cells were stained with monoclonal antibodies specific to cell surface receptors CD4, CD8 and CD14, as well as for TNF- intracytoplasmic cytokines, IFN-, IL-4 and IL-10. The acquisition and analysis were performed by flow cytometry. The results showed a significant increase (p <0.05) in the percentage of T lymphocytes and their subpopulation T CD4 positive for type 1 cytokines, TNF- and IFN-. These cytokines are responsible for activating the immune system to immunoprotective responses against viral infections and tumor processes. However the neutrophils and T CD8 lymphocytes, in cultures stimulated with the latex of the plant, showed a mixed profile of cytokine production of type 1 and 2.These results showed a response of the type 1 predominant, in vitro, and a probable activation of modulatory mechanisms mediated by T CD8 lymphocytes and neutrophils.This study suggests that the popular use of plant in viral infections and tumor processes may have some foundation, in order to preferential production of type 1cytokines in strategic cells of the cellular immune response, that is essential in combating the diseases mentioned. However, in vitro studies conducted here are not sufficient to ensure that the use of the plant in vivo context may, in fact, possesses such properties.

Thus, further studies including other in vitro tests and preclinical trials are fundamental to the advancement of research involving the use of E. tirucalli for therapeutic purposes.

Keywords: Euphorbia tirucalli, Immunomodulation, Medicinal plant, Pro-inflammatory.

LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1Figura 2Figura 3Figura 4Figura 5Figura 6Figura 7Etapas do desenvolvimento de um novo frmaco .............................. Imagens da E. tirucalli ....................................................................... Principais funes atribudas citocina INF- ................................... Principais funes atribudas citocina TNF- ................................. Coleta do ltex .................................................................................... Estratgia de anlise por citometria de fluxo ..................................... Percentual de clulas viveis em leuccitos mononucleares circulantes 2 9 14 14 20 24

do sangue perifrico de indivduos hgidos nos tempos 24 horas, 48 horas e 72 horas e estimulados com deve ficar salina, DMSO, e Ltex de E. tirucalli nas concentraes de deve ficar 5%, 10%, 20% e 30% ................................................................................ Figura 8Anlise do percentual mdio de neutrfilos-IFN-+ e neutrfilos-TNF+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ............................................................................................................. Figura 9Anlise do percentual mdio de neutrfilos-IL-4+ e neutrfilos-IL-10+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO ............................................................................................................. Figura 10Anlise do percentual mdio de moncitos-TNF-+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt .................................... Figura 11Anlise do percentual mdio de moncitos-IL-4+ e moncitos-IL-10+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO ............................................................................................................. Figura 12Anlise do percentual mdio de linfcitos-IFN-+ e linfcitos-TNF-+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ............................................................................................................. Figura 13Anlise do percentual mdio de linfcitos-IL-4+ e linfcitos-IL-10+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ............ Figura 14Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD8-IFN-+ e linfcitosT CD8-TNF-+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ................................................................................. Figura 15Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD8-IL-4+ e linfcitosT CD8-IL-10+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ................................................................................. Figura 16Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD4-IFN-+ e linfcitosT 34 33 32 31 e Lt 30 29 e Lt 28 27 26

CD4-TNF-+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ................................................................................. Figura 17Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD4-IL-4+ e linfcitosT CD4-IL-10+ de culturas de leuccitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ................................................................................. Figura 18Resumo dos resultados obtidos na expresso de citocinas nas populaes e subpopulaes estudadas, quando estimulados com o ltex bruto de E. tirucalli diludo 10% em DMSO .......................... Figura 19Vias envolvidas na transcrio gnica para sntese de citocinas prinflamatrias ....................................................................................... 42 37 36 35

LISTA DE TABELAS
123Espcies do gnero Euphorbia com atividade citotxica/ antitumoral ........... Posio sistemtica da Euphorbia tirucalli ..................................................... Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de populaes leucocitrias e marcao de citocinas ...................................... 23 6 9

SUMRIO
1 1

INTRODUO ...............................................................................

2 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.1.1 2.3.1.2 2.3.1.3 2.3.1.4 2.3.1.5 2.3.1.6 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.5 2.6 2.7

REVISO DE LITERATURA ....................................................

O estudo de plantas medicinais ............................................................. A famlia Euphorbiaceae ...................................................................... O gnero Euphorbia .............................................................................. Estudos das atividades biolgicas de plantas do gnero Euphorbia ..... Atividade antitumoral ........................................................................... Atividade antimicrobiana ...................................................................... Ao antiviral ........................................................................................ Aes que interferem em processos alrgicos e inflamatrios ............. Atividade antiinflamatria .................................................................... Modulao das Protenas associadas mltipla resistncia drogas ... Euphorbia tirucalli ............................................................................... Constituintes qumicos do ltex de E. tirucalli ..................................... Toxicologia associada E. tirucalli ...................................................... Atividades atribudas ao ltex de E. tirucalli ........................................ Sistema imune contra infeces virais .................................................. Sistema imune no combate clulas tumorais ..................................... Resposta imune do tipo 1 e do tipo 2 ....................................................

2 2 4 4 5 5 6 7 7 7 8 8 10 10 11 12 15 16

3
4 4.1 4.2

JUSTIFICATIVA ............................................................................ OBJETIVO.........................................................................................

Objetivo geral ....................................................................................... Objetivos Especficos ...........................................................................

17

18 18 18

5
5.1 5.2 5.3 5.4

MATERIAIS E MTODOS .........................................................

Populao estudada ............................................................................... Amostras de sangue .............................................................................. Certificao botnica ............................................................................ Coleta das amostras de ltex de Euphorbia tirucalli ............................

19 19 19 19 19

5.5

Triagem da citotoxicidade in vitro do ltex bruto de E. tirucalli leuccitos mononucleares do sangue perifrico ................................... 20 21 23 24

5.6 5.7 5.8

Anlise de citocinas intracitolasmticas por citometria de fluxo ......... Estratgia de Anlise ............................................................................ Anlise Estatstica .................................................................................

6
6.1

RESULTADOS ................................................................................
Anlise da viabilidade de clulas mononucleares do sangue perifrico humano in vitro aps estimulao com o ltex bruto de Euphorbia tirucalli ..................................................................................................

26

26

6.2

Perfil de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli .......................... 27

6.2.1

Anlise de citocinas intracitoplasmticas em neutrfilos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli .......................... 27

6.2.2

Anlise de citocinas intracitoplasmticas em moncitos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli .......................... 29

6.2.3

Anlise de citocinas intracitoplasmticas em linfcitos e subpopulaes linfocitrias T CD8 e T CD4 do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli .......................................... 31

7 8

DISCUSSO DOS RESULTADOS .......................................... CONCLUSO

.................................................................................

38

44

REFERNCIAS ............................................................................... ANEXO ................................................................................

45

54

1 INTRODUO

As plantas da famlia Euphorbiaceae so amplamente utilizadas na cultura tradicional popular para fins teraputicos. Algumas espcies identificadas contm compostos bioativos que conferem a essas plantas potencial para o tratamento de doenas (PUSZTAI et al., 2007; LAGE et al., 2009). Alguns desses compostos demonstraram ter atividade sobre o comportamento funcional de leuccitos do sangue perifrico. Porm, embora seja possvel sugerir que extratos de plantas do gnero Euphorbia interfiram na funcionalidade de populaes e subpopulaes leucocitrias, os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos ainda no esto bem elucidados (BANI et al., 2007). Estudos prvios tm mostrado que as plantas do gnero Euphorbia apresentam a capacidade de alterar alguns parmetros celulares e moleculares do sistema imunolgico. Amirghofran e colaboradores (2008) demonstraram um aumento da citocina mitognica Interleucina-2 (IL-2) no sobrenadante de culturas de leuccitos do sangue humano estimuladas com extrato metanlico de Euphorbia cheiradenia. Essa capacidade de alterar a produo de citocinas tambm foi demonstrada em estudos que avaliaram a capacidade antialrgica de Euphorbia hirta L.. Segundo Singh e colaboradores (2006), o extrato da planta foi capaz de aumentar a produo de Interferon-gamma (IFN-) e diminuir a produo de IL4, e regular negativamente a resposta imune humoral, prevenindo os efeitos indesejveis da resposta alrgica. As citocinas so fatores solveis que, uma vez liberadas no meio extracelular, promovem a ativao de vrios componentes do sistema imune tais como a produo de anticorpos e citotoxicidade. Nenhum estudo at ento verificou o perfil de produo de citocinas nas populaes especficas de leuccitos estimulados com o ltex bruto de Euphorbia tirucalli numa anlise celular individualizada. Tendo em vista a utilizao popular de E. tirucalli no tratamento de algumas doenas que necessitam da participao efetiva do sistema imunolgico, tais como tumores e infeces virais, o presente estudo avaliou o perfil de produo de citocinas do tipo 1 (prinflamatrias: IFN- e Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-)) e do tipo 2 (IL-4 e IL-10) em populaes e subpopulaes leucocitrias do sangue perifrico humano, submetidos estimulao rpida (4 horas) com o ltex bruto de E. tirucalli.

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 O estudo de plantas medicinais

O conhecimento tradicional sobre as propriedades curativas de plantas medicinais contribui para a formulao de frmacos e auxilia as prticas teraputicas (SCHMIDT et al., 2008). Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), 80% da populao mundial fazem uso de plantas medicinais na ateno primria sade (OMS, 2002). No entanto, muitas dessas plantas ainda no foram estudadas, nem o seu uso foi padronizado. Isto impede o uso racional e seguro de muitas destas plantas medicinais. Uma vez que o uso popular das plantas medicinais fornece evidncias de algumas atividades biolgicas, a investigao cientfica atravs de modelos experimentais adequados torna-se necessria em todas as etapas envolvidas na formulao de um novo frmaco. Por meio do desenvolvimento dessas etapas experimentais possvel validar o uso tradicional de algumas plantas, bem como indicar os parmetros que permitam a sistematizao do uso (HEINRICH e GIBBONS, 2001). O relato de experincias bem sucedidas do uso de plantas no tratamento e cura de doenas pela populao instiga a pesquisa cientfica na formulao de frmacos, contribuindo para a fase de descoberta. Esta fase envolve triagens experimentais na pesquisa bsica. Na FIG. 1 esto apresentadas as fases de desenvolvimento de um novo frmaco (CHIN e FERREIRA, 1999).

Pesquisa bsica Triagem e Descoberta

Pesquisa Prclnica Modelos animais, ensaios in

Pesquisa Clnica Fase I

Pesquisa pscomercializap Farmacovigilncia (Fase IV)

Fase II Fase III

vitro

FIGURA 1- Etapas do desenvolvimento de um novo frmaco

Muitos compostos bioativos foram descobertos e isolados a partir de fontes naturais e so hoje utilizados nas formulaes alopticas (ITOKAWA et al., 2008). Dos medicamentos utilizados na clnica mdica, 25% tm sua origem nas plantas (PHILLIPSON et al., 2007). Embora a descoberta de muitas molculas com propriedades curativas tenha se originado de investigaes com produtos naturais de origem vegetal, a produo em larga escala de muitos desses frmacos requer processos de obteno de princpios ativos alm de modelagem molecular e sntese qumica. Como exemplo disso, o uso popular dos extratos da Catharanthus roseus, conhecida como Pervinca ou Vinca rsea, no tratamento da Diabetes mellitus, levou a investigao de suas aes teraputicas. Ensaios em modelos animais demonstraram que os extratos causavam a granulocitopenia e a supresso da medula ssea, bloqueando clulas em mitose (HANSEN & NISSEN, 1972). Esses extratos produziram quatro alcalides dimricos ativos conhecidos como alcalides da vinca: a vimblastina, a vincristina, a vinleurosina e a vinrosidina. Os alcalides purificados causaram regresso da leucemia linfoctica aguda em camundongos. A vimblastina e a vincristina so agentes clnicos importantes no tratamento de leucemias, linfomas e do cncer testicular (NOBLE et al., 2009). O Brasil, um pas tropical, possui uma biodiversidade em sua flora com plantas nativas e exticas adaptadas que lhe conferem um grande potencial para desenvolvimento de fitoterpicos e outros frmacos a partir de insumos vegetais. As culturas tradicionais brasileiras utilizam com frequncia as plantas medicinais com propriedades curativas, e esse conhecimento transmitido ao longo de geraes. Na atualidade, o Sistema nico de Sade brasileiro (SUS) busca o fortalecimento do uso dos fitoterpicos na ateno bsica da sade (Brasil, 2006). Considerando o uso de plantas medicinais e a fitoterapia como prticas teraputicas complementares sade, em 2006, o governo federal brasileiro aprovou junto ao ministrio da sade a Poltica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos (PNPMF) que visa propor formas alternativas teraputica e incentivar o desenvolvimento comunitrio, a solidariedade e a participao social na sade. Uma das diretrizes dessa poltica incentivar grupos de pesquisa com atuao voltada para a farmacologia de plantas medicinais, principalmente no enfrentamento das principais necessidades epidemiolgicas identificadas no pas.

2.2 A famlia Euphorbiaceae

A famlia compreende plantas com cerca de 300 gneros e 6000 espcies, distribudas predominantemente em regies tropicais. No Brasil, ocorrem cerca de 70 gneros e 1000 espcies, o que a torna uma famlia comum na formao da flora brasileira e uma das mais complexas do ponto de vista taxonmico (SOUZA e LORENZI, 2008). Em geral, as espcies apresentam ltex custico que, quando em contato direto com mucosas, principalmente dos olhos, pode causar leses graves (SHLAMOVITZ et al., 2009). Algumas plantas da famlia Euphorbiaceae tm importncia econmica como a mamona, espcie africana Ricinus communis L, cujas sementes so utilizadas na produo do leo de rcino e de biodiesel, e a seringueira da Amaznia, Hevea brasiliensis, importante na produo de borracha e extensamente cultivada na Malsia e Indonsia (SOUZA e LORENZI, 2008). Espcies dessa famlia so conhecidas tambm pelo seu potencial teraputico. Destacam-se o quebra-pedras, designao comum a vrias espcies do gnero Phyllantthus reconhecidas, popularmente, por suas propriedades diurticas, sendo utilizadas na eliminao de litases renais (BAGALKOTKAR et al., 2006; KARUA et al., 2009). As plantas do gnero Euphorbia apresentam diversas atividades teraputicas, e entre tais atividades destacam-se as atividades antivirais e antitumorais.

2.3 O gnero Euphorbia

O gnero Euphorbia o maior gnero da famlia Euphorbiaceae (SHLAMOVITZ et al., 2009). As Euphorbias so encontradas nos continentes africano, asitico e na Amrica do Sul. Como possuem uma predileo por regies ridas, no so comuns em lugares de clima frio (RAVIKANTH et al., 2003). Algumas espcies do gnero so encontradas como ervas daninhas, em jardins, ou como elementos decorativos, em casas. Uma vez que possuem vrios compostos bioativos em suas constituies, tais como alcalides, flavonides, taninos e terpenos (PUSTZTAI et al., 2007; ZHANG et al., 2008; WANG et al., 2006), as plantas do gnero Euphorbia so tradicionalmente utilizadas pela cultura popular como plantas medicinais. Como exemplos, a espcie E. hirta utilizada em doenas respiratrias (SINGH et al., 2006), e a E. tirucalli comumente utilizada no tratamento de doenas virais (BENTACUR-GALVIS et al., 2002). Muitos estudos tm sido

conduzidos no sentido de comprovar as atividades de plantas do gnero Euphorbia e validar seu uso.

2.3.1 Estudos das atividades biolgicas de plantas do gnero Euphorbia

2.3.1.1 Atividade antitumoral

Muitas espcies do gnero Euphorbia tm demonstrado atividade citotxica a diversas linhagens tumorais. A TAB. 1 apresenta algumas dessas espcies. O extrato metanlico de E. cheradenia pulverizado e diludo em Dimetilsulfxido (DMSO) foi capaz de induzir a apoptose de clulas leucmicas das linhagens K562 e Jurkat (AMIRGHOFRAN et al., 2006). A apoptose foi analisada por meio de testes de viabilidade celular e por fragmentao do DNA. O Putranjivain, um tanino extrado de E. jolkini inibiu a proliferao do adenocarcinoma de mama humano da linhagem MCF-7, bloqueando a diviso celular, mantendo as clulas estacionrias nas fases G0 ou G1 do ciclo celular (KUO et al., 2006). Uma frao de E. peplus induziu apoptose em clulas de melanoma humano, linhagens Me 4405 e Me 1007 (GILLESPIE et al., 2004). Essa apoptose foi observada por ativao das vias mitocondrial e caspase dependente. Um diterpeno extrado de E. fischeriana demostrou ser um inibidor da via NF-B (Fator Nuclear Kappa-B) (YAN et al., 2008). O fator de transcrio NF-B apresenta, entre outras funes, a ativao de genes necessrios para o processo de angiognese, necessrio para a sobrevida e metstase do tumor. Assim, com a inibio dessa via, possivelmente o tumor no ter progresso. Para a avaliao da ao antimutagnica do ltex de E. tirucalli, foi utilizado um modelo do sistema metionina no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. O tratamento com o ltex de E. tirucalli diminuiu a taxa de mutao (REZENDE et al., 2004). A ao antimutagnica do ltex positiva porque minimiza o surgimento espontneo de clulas tumorais. O extrato de E. tirucalli diludo em salina exibiu uma atividade mielomoduladora e inibiu crescimento tumoral em animais com clulas de tumor asctico. O tratamento com extrato de E. tirucalli tambm aumentou a sobrevida dos ratos (VALADARES et al., 2006). O aumento da mielopoiese pode ser um possvel mecanismo para a atividade antitumoral da

planta, uma vez que aumenta a produo de granulcitos, bem como sua atividade funcional importante na imunovigilncia.

TABELA 1 Espcies de Euphorbias com atividade citotxica/ antitumoral. Espcie E. peplus E. jolkini E. fischeriana E. cheiradenia E. tirucalli E. helioscopia E. salicifolia E. serrulata E. poisonii Linhagem tumoral e/ou tipo de tumor* Me 4405 e Me 1007 MCF-7 U937, Jurkat, CoLo205, HGc, MCF-7, A549, H460, HepG2 Jurkat, K562 Ehrlich ascite HL-60 L5178, L5178Y L5178, L5178Y Referncia (GILLESPIE et al., 2004) (KUO et al., 2006) (YAN et al., 2008; Wang et al., 2006) (AMIRGHOFRAN et al., 2006) (VALADARES et al., 2006) (TAO et al., 2008) (HOHMANN et al., 2002) (HOHMANN et al., 2002)

A-498, MCF-7, PACA-2, A(FATOPE et al., 1996) 549, PC-3 * Me 4405 e Me 1007: Linhagem de clulas de melanoma humano/ MCF-7: Linhagem celular de adenocarcinoma mamrio humano/ U937: Linhagem celular leucmica monoctica humana/ Jurkat: Linhagem celular leucmica de clulas T humana/ CoLo20: Linhagem celular de cncer coloretal humano/ HGc: Linhagem celular de carcinoma gstrico humano/ A549: Linhagem celular de adenocarcinoma alveolar humano/ H460: Linhagem celular de cncer pulmonar humano/ HepG2: Linhagem celular de hepatocarcinoma humano/ K562: Linhagem celular leucmica eritroblstica humana/ HL-60: Linhagem celular leucmica eritroblstica humana/ L5118, L5118Y: Linhagens de clulas leucmicas linfoblsticas murinas/ A-498: Linhagem de clulas de carcinoma renal humano/ PACA-2: Linhagem celular de tumor pancretico humano/ PC-3: Linhagem celular de cncer de prstata humano. 2.3.1.2 Atividade antimicrobiana O extrato etanlico das partes areas de E. hirta exibiu atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa pelo mtodo de difuso (SUDHAKAR et al., 2006) . J a mistura complexa de quatro glicocerebrosdeos extrados de E. peplis tiveram atividade antifngica contra Candida spp. E. Cryptococcus neoformans (CATENI et al., 2003). Utilizando o mtodo de difuso, pesquisadores observaram que o extrato aquoso das partes frescas de E. tirucalli teve ao antimicrobiana contra Erwinia carotovora pv carotovoea, Xanthomonas campestris pv campestris, e Pseudomonas solanacearum (LIRIO et al., 1998).

2.3.1.3 Ao antiviral

As euphorbias E. cotinifolia e E. tirucalli exibiram ao antiherptica (BENTACURGALVIS et al., 2002), em que a eficincia desses extratos diludos em gua/metanol foi sete vezes superior ao frmaco Aciclovir tratado no grupo controle, usualmente utilizado no tratamento de herpes simples. O extrato etanlico de E. thimifolia tambm apresentou atividade antiherptica por inativar o vrus Herpes simplex 2 e diminuir sua infectividade (YANG et al., 2005). J diterpenoides isolados de E. paralias demonstraram moderada atividade contra a replicao do vrus da imunodeficincia humana (HIV-1) em culturas celulares (ABDELGALEIL et al., 2001).

2.3.1.4 Aes que interferem em processos alrgicos e inflamatrios

Euphorbia hirta tem a capacidade de evitar reaes alrgicas do tipo tardias (hipersensibilidade do tipo 4). Isso foi observado em modelo animal de ratos sensibilizados com ovalbumina em que o tratamento com E. hirta atenuou a liberao de (IL-4) e aumentou a secreo de INF- (SINGH et al., 2006). Isso demonstra que constituintes qumicos de E. hirta favorece uma resposta imune do tipo celular em detrimento da resposta imune humoral. Alm disso, steres extrados de E. tirucalli exibiram efeito inflamatrio em orelha de ratos, e essa inflamao foi caracterizada por uma irritao e aumento do rubor, que um sinal clssico da inflamao (KINGHORN et al., 1979). De forma semelhante, dierpenos isolados de E. peplus tiveram um efeito inflamatrio em orelha de ratos, caracterizado pelo rubor (HOHMANN et al., 1999).

2.3.1.5 Atividade anti-inflamatria

J a frao biopolimrica de polissacardeos presentes no ltex de E. tirucalli inibiu a inflamao provocada pela artrite em modelo animal. Os sinais para essa ao antiinflamatria foram: reduo da permeabilidade vascular e migrao leucocitria, supresso dos linfcitos T CD4+ e T CD8+ e suas citocinas intracitoplasmticas pr-inflamatrias INF- e IL-2 (BANI et al., 2007). De forma semelhante, uma frao do extrato de E. royleana tambm exibiu ao anti-inflamatria em modelo animal, caracterizada pela reduo do edema e da migrao leucocitria (BANI et al., 2000). O tratamento com extrato etanlico de

E. hirta em modelo animal de anafilaxia, uma reao inflamatria exacerbada ocasionada pela liberao de mediadores inflamatrios, dentre os quais se destaca a histamina liberada por mastcitos e basfilos, foi capaz de diminuir a gravidade da reao, reduzindo o edema e os nveis plasmticos das citocinas pr-inflamatrias, IL-6 e o TNF- (YOUSSOUF et al., 2007). J a aplicao tpica de tirucallol, um triterpeno isolado do ltex de E. lctea, diminuiu o edema e inibiu a expresso da enzima xido ntrico sintetase (iNOS), de forma semelhante dexametasona, um potente anti-inflamatrio (FERNANDEZ-ARCHE et al., 2010).

2.3.1.6 Modulao das Protenas associadas mltipla resistncia a drogas (MDR)

Produtos de algumas plantas do gnero Euphorbia parecem ter a capacidade de modular a expresso dos MDRs, protenas que diminuem a concentrao intracelular de frmacos antibiticos e quimioterpicos, e assim promovem um prejuzo eficcia teraputica (HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2010). O tratamento com compostos isolados de E. lagascae e E. tuckeyana reduziu a expresso dos genes que comandam a sntese de MDRs, porm, os mecanismos para essa modulao ainda no foram descritos. Dessa forma, tais plantas poderiam ser teis no campo quimioterpico de diversas doenas, uma vez que proporcionariam a manuteno dos frmacos no interior das clulas (WESOLOWSKA et al., 2007).

2.4 Euphorbia tirucalli

A planta, tambm conhecida como rvore-lpis, aveloz, mata-verruga e cega-olho, tem como sinonmia botnica o nome Euphorbia rhipsaloides Lem. A planta originria da frica e foi trazida para os pases tropicais, incluindo o Brasil, onde encontrada no estado do Amazonas, em Minas Gerais, na regio Nordeste e tambm na costa do Estado de So Paulo (CORREIA, 1984). A TAB. 2 estabelece a posio sistemtica da E. tirucalli.

TABELA 2 Posio sistemtica da Euphorbia tirucalli Reino Diviso Classe Subclasse Ordem Famlia Gnero Espcie Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Magnoliidae Malpighiales Euphorbiaceae Euphorbia Euphorbia tirucalli

A Euphorbia tirucalli um arbusto, semilenhoso, medindo em torno de 4 metros de altura, lactescente, com inmeros ramos verdes, suculentos, cilndricos, com poucas folhas e flores pequenas e raras (FIG. 2). O arbusto bem adaptado em solos pobres e secos e frenquetemente encontrado em regies de clima quente e solo arenoso. No Brasil, o ltex da planta utilizado na cultura popular como agente laxante, para controle de parasitoses intestinais, para tratar asma, verrugas e cncer (BENTACUR-GALVIS et al., 2002).

FIGURA 2 - Imagens da E. tirucalli. (A) Planta inteira (B) Detalhamento dos ramos

2.4.1 Constituintes qumicos do ltex de E. tirucalli

O ltex bruto de E. tirucalli contm em torno de 53,8 a 79,9% de gua e seus principais constituintes qumicos so: 12-0-22-octadieno-4-deoxiforbol-13-acetato, cido metil elgico; -sitosterol; cido ctrico; eufol; euforona, glicose; hentriacontanol; isoeuforal; cido mlico; sapogenina; cido succnico; taraxasterol; e tirucalol (FURTENBERGER et al., 1986). Achados posteriores caracterizaram quatro terpenos (KHAN et al., 1987) extrados do ltex e do caule da planta, um triterpeno pentaciclico euphorcinol (KHAN et al., 1989), bem como um novo diterpeno macrocclico (KHAN et al., 1990). Esses constituintes qumicos so biologicamente ativos. Outros steres de phorbol sabidamente tm ao em processos biolgicos como a inflamao e a modulao da expresso de citocinas (BISHAYI et al., 2002; KERR et al., 1987; SIERAKOWSKI et al., 1988; SMITH et al., 1998). Alguns terpenos tm tambm a ao biolgica estudada na induo da apoptose de clulas tumorais, bem como na modulao da expresso das MDRs (ABDELGALEI et al, 2001; DUARTE et al., 2009).

2.4.2 Toxicologia associada E. tirucalli

E. tirucalli uma fonte de acidentes txicos. Devido natureza custica do ltex, uma vez ingerido em grandes quantidades, pode causar irritao gastrintestinal. Alm disso, uma vez em contato com a pele ou mucosas, o ltex pode provocar leses do tipo eritematosas com processo inflamatrio associado. H relatos na literatura de leses oculares provocadas pela E. tirucalli em que comum a ceratoconjutivite com irritao inicial e posterior perda da acuidade visual (HSUEH et al, 2004; SHLAMOVITZ et al., 2009). Estudos com ratas grvidas demonstraram que o tratamento por via oral com extrato de E. tirucalli, diludo em salina, durante 15 dias, no alterou parmetros como a sobrevida, sinais clnicos, e o peso dos animais e seus rgos internos. O tratamento nem mesmo afetou a implantao e desenvolvimento do embrio (SILVA et al., 2007). Tais resultados demonstraram que, nas concentraes testadas, o ltex da planta no exibiu toxicidade aos embries. Avaliando a atividade antiherptica in vitro de E. tirucalli, foi observado que o extrato inibiu o crescimento viral e seu ciclo ltico na concentrao de 100mg/mL diludo em gua/metanol sem apresentar toxicidade s clulas no infectadas. Esse resultado demonstrou

um bom ndice teraputico do extrato, uma vez que a dose que exibiu atividade antiviral foi muito inferior menor dose txica da ordem de 1000 mg/mL (BENTACUR-GALVIS et al., 2002)

2.4.3 Atividades atribudas ao ltex de E. tirucalli

O ltex de E. tirucalli apresenta diversas atividades biolgicas j estudadas e relatadas na literatura, como atividades moluscicida e larvicida, que conferem planta potencial controle vetorial de doenas endmicas de pases tropicais (JURBERG et al., 1985; RAHUMA et al., 2008; RAMOS et al., 2009; YADAV et al., 2002). Os autores sugerem que o controle vetorial com utilizao do extrato seria menos agressivo ao ambiente do que as substncias utilizadas para o controle atualmente. As aes com futuras aplicaes teraputicas incluem a atividade antimicrobiana (LIRIO et al., 1998), antiviral (BENTACURGALVIS et al., 2002), pr-inflamatria (KINGHORN et al., 1979) e anti-inflamatria (BANI et al., 2007), conforme relatado no texto. De acordo com os trabalhos relatados at ento, possvel verificar que, embora a E. tirucalli seja utilizada em diversos modelos experimentais que possam comprovar a sua utilidade teraputica contra doenas de natureza infecciosa, inflamatria ou tumoral, os mecanismos moleculares envolvidos em tais processos ainda no foram devidamente esclarecidos. As investigaes realizadas limitam-se, na maioria das vezes, apresentao descritiva dos resultados obtidos com produtos da planta em comparao a controles experimentais. Pouco se sabe em que vias metablicas os princpios ativos da planta poderiam estar atuando. Por isso, alguns questionamentos poderiam ser levantados: ser que os componentes bioativos da planta estariam atuando diretamente nos processos relacionados perpetuao dos agentes infecciosos? Ser que tais substncias tambm poderiam atuar em mecanismos que levam regresso ou controle de tumores? Ou ser que tais princpios ativos poderiam atuar de maneira indireta, alterando os elementos da resposta imunolgica e proporcionando assim uma resposta eficiente contra agentes infecciosos e clulas tumorais? Tendo em vista que o presente trabalho pretende demonstrar se os princpios ativos do ltex bruto de E. tirucalli alteram alguns parmetros imunolgicos, faz-se necessrio realizar uma breve exposio das bases celulares e moleculares relacionadas ao estabelecimento de uma resposta imune durante as infeces virais e durante os processos tumorais.

2.5 Sistema imune contra infeces virais

Os vrus so organismos intracelulares obrigatrios, que se replicam dentro das clulas. Os mecanismos da imunidade inata contra os vrus envolvem basicamente a inibio da replicao viral pelas clulas infectadas e a morte das clulas infectadas pelas clulas Natural Killer (NK). As clulas NK lisam as clulas infectadas e so importantes no incio e no decorrer da infeco (BIRON et al., 1999; BIRON & BROSSAY, 2001;). J a resposta da imunidade adquirida aos vrus mediada principalmente pelos linfcitos T CD8, tambm conhecidos como linfcito T citotxicos. As clulas infectadas por vrus so especificamente reconhecidas por linfcitos T citotxicos que, aps se tornarem ativados, lisam diretamente as clulas infectadas por meio da liberao dos seus grnulos (ZHOU, 2010). O mecanismo de lise envolve ativao de enzimas conhecidas como caspases, que culminam com a clivagem do DNA viral e tambm da clula hospedeira. O efeito dos linfcitos T dependente das interaes com as clulas alvos que desencadeiam respostas antgenos especficas (CHAVEZ-GALAN et al., 2009). Essa interao ocorre entre o receptor de clula T e o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) da clula alvo. O MHC composto por protenas de membrana cujos domnios extracelulares formam uma fenda na qual se liga o fragmento de peptdeo, que ser reconhecido pelo receptor do linfcito T. As molculas de MHC de classe I recrutam peptdeos derivados de protenas sintetizadas no citosol celular (GOULDER & WATKINS, 2008). Dessa forma, em infeces intracelulares, como infeces virais, o MHC de classe I capaz de expor os peptdeos virais aos linfcitos T citotxicos na superfcie celular (DELVAL & LOPEZ, 2002). Para que os peptdeos se liguem fenda do MHC I no citosol da clula, as protenas precisam ser degradadas em um complexo enzimtico conhecido como proteossoma. Existe tambm a apresentao cruzada de antgeno, quando partculas virais podem ser endocitadas e, ainda assim, se unirem s vesculas contendo o MHC I (SNYDER et al., 2010). O linfcito T citotxico reconhece os peptdeos vrais nas clulas-alvo associados s molculas de MHC I, desencadeando a morte da clula infectada. J a molcula de MHC II se liga a peptdeos derivados de vesculas intracelulares, e assim expe peptdeos de patgenos que foram endocitados por clulas fagocticas, que so os macrfagos, as clulas dendrticas e os linfcitos B (BANGHAM et al., 2009). O MHC II apresenta os antgenos aos linfcitos T CD4 (Th), tambm conhecidos como linfcitos T auxiliares. Clones Th1 so efetivos em potencializar respostas protetoras contra as infeces virais, por liberarem

citocinas que faro predominar uma resposta pr-inflamatria caracterizada por ser uma resposta imune celular. As citocinas do tipo 1 so importantes nesses processos de ativao da resposta imune ao combate aos patgenos intracelulares, bem como no reconhecimento de molculas consideradas estranhas no interior de clulas. O IFN- favorece o aumento da apresentao de antgeno, uma vez que induz uma modificao no proteossoma que permite o aumento da produo de peptdeos antignicos. Clulas tratadas com a IFN- aumentam a transcrio de cadeias do MHC I (SELIGER et al., 2008). Os linfcitos T CD4 realizam suas funes efetoras por meio da liberao de citocinas. O IFN- liberados por linfcitos Th1 ativam macrfagos e ativam clulas Natural Killer (NK) (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001). A FIG. 3 apresenta as principais funes atribudas citocina IFN- . O TNF- tambm um mediador importante da resposta imune celular, sendo os macrfagos sua principal fonte celular (YAMAUCHI & NIITSU, 1997). Alm disso, o TNF- favorece o recrutamento de leuccitos para o stio da infeco, por estimular o endotlio a expressar molculas de adeso e tambm por estimular os macrfagos e clulas endoteliais a secretarem quimiocinas, importantes no recrutamento tecidual de leuccitos (APOSTOLAKI et al., 2010; WAJANT, 2009). Os receptores de TNF- pertencem a uma famlia que ativa protenas intracelulares associadas que induzem apoptose celular (SCREATON & XU, 2000). As principais funes do TNF- esto ilustradas na FIG. 4.

Aumento da expresso de molculas de MHC

Granzimas e Perforinas

NK Ativao de clulas NK
TNF- NO

Ativao de Macrfagos
Th1 Diferenciao de linfcitos Th em Th1

FIGURA 3 - Principais funes atribudas citocina IFN- .

Aumento da expresso de molculas de adeso do endotlio

Aumento da permeabilidade do endotlio

TNF-

Apoptose via estimulao de receptores

FIGURA 4 - Principais funes atribudas citocina TNF-.

2.6 Sistema imune no combate a clulas tumorais

Os tumores desencadeiam respostas imunes especficas que inibem a sua existncia ou suprimem seu crescimento. Os mecanismos para controle e combate de clulas tumorais so conhecidos como imunovigilncia. Os tumores expressam antgenos que podem desencadear uma resposta do sistema imune (WHITESIDE et al., 2010). Em alguns casos, protenas que so expressas somente em fases embrionrias so expressas por clulas tumorais. Tais protenas ao serem apresentadas, via MHC I, aos linfcitos T citotxicos no tolerantes a esses autoantgenos respondem a eles como se fossem molculas estranhas ou no prprias (BEATTY & VONDERHEIDE, 2008). H casos em que protenas prprias so expressas e apresentadas em quantidades excessivas e levam ao que chamamos de quebra da tolerncias dos linfcitos T e, ento, desencadeiam uma resposta citotxica. Porm, as clulas tumorais apresentam mecanismos de escape do sistema imune, tais como a inibio direta de clulas T e a perda da expresso de antgenos que desencadeiam o escape dos tumores ao sistema imune (GARCIA-LORA et al., 2003). O principal mecanismo da imunidade contra clulas tumorais a morte destas clulas pelos linfcitos citotxicos (BENCHETRIT et al., 2003; JAGER et al., 2001). Os linfcitos T CD4, conhecidos como Linfcitos T auxiliares, fornecem por meio da produo de citocinas especficas, tais como IFN- e TNF-, um microambiente de citocinas que favorece o recrutamento celular e at mesmo o aumento da expresso do MHC I nas clulas tumorais. Os linfcitos T auxiliares (Th) tambm podem propiciar a morte de clulas tumorais por meio da secreo de TNF-, e sua ao direta sobre tais clulas (HOLOCH E GRIFFITH, 2009). O TNF- secretado em grandes quantidades provoca alteraes sistmicas como a queda de glicose e a trombose vascular (CHEN et al., 2009; ZHANG et. al, 2009). As citocinas do tipo 2, como IL-4 e IL-10 que antagonizam o TNF-, so importantes por fornecerem um equilbrio da resposta imune, de forma que a resposta do tipo 1 seja predominante, porm no exacerbada (FIORENTINO et al., 1991; HOLUB et al., 2009). As clulas NK so potencialmente ativadas pelo IFN- e podem destruir clulas tumorais que possuam a expresso reduzida de molculas de MHC I ou que estejam opsonizadas por anticorpos tumor-especficos (PEGRAM et al., 2010). Estudos mostraram que animais que tinham a expresso de IFN- deficiente ou no apresentavam o receptor para a citocina no respondiam ao tratamento antitumoral quimioterpico (GHIRINGHELLI et al., 2009), indicando a necessidade da citocina para o xito do tratamento antitumoral.

2.7 Resposta Imune do tipo 1 e do tipo 2

Uma resposta imune do tipo 1, tambm conhecida como resposta celular, caracterizada principalmente pela diferenciao de linfcitos T helper (Th0) em linfcitos Th1 (ZINFANG et al., 2010). Esses linfcitos produzem citocinas conhecidas como citocinas do tipo 1, das quais podem ser citadas o IFN-, TNF- e IL-1. O IFN- a citocina que caracteriza uma clula Th1, e por consequncia a resposta do tipo 1 (ELYAMAN et al., 2009). Alm de linfcitos Th, outros leuccitos tambm contribuem para o predomnio da resposta imune do tipo 1 com a produo de citocinas que iro compor o microambiente. A produo e liberao de citocinas do tipo 1 leva imunidade mediada por clulas, com ativao de macrfagos, linfcitos T citotxicos e produo de anticorpos

predominantemente do isotipo IgG pelos linfcitos B. Esses anticorpos so opsonizantes, favorecendo a resposta citotxica (DUFFIELD et al., 2003). Esta resposta necessria para combate efetivo de patgenos intracelulares. Citocinas do tipo 2, como IL-4, IL-5 e IL-10, que podem ser liberadas por linfcitos Th2 e outros leuccitos, so inibidoras da resposta do tipo 1, e teis no controle da resposta citotxica (MCCOY et al., 2010). Porm, uma resposta predominantemente do tipo 2 ser um resposta humoral, em que anticorpos produzidos por clulas B desencadeiam a destruio de patgenos extracelulares (GARSIDE et al., 1998). E o direcionamento de uma resposta Th2, em infeces intracelulares, pode constituir um mecanismo de escape de patgenos como bactrias intracelulares e vrus (WIGGINTON et al.,2001).

3 JUSTIFICATIVA

A Euphorbia tirucalli uma planta abundante no Vale do Jequitinhonha e amplamente conhecida na regio como uma planta com propriedades anti-helmnticas, cicatrizante e antiinflamatria. A planta tambm tem seu uso popular difundido para fins teraputicos contra infeces virais e doenas tumorais, alm do uso no tratamento local de verrugas. De fato, algumas dessas propriedades tm sido estudadas por diversos pesquisadores, no entanto, pouco se sabe se as aes desempenhadas pelos princpios ativos da planta agem de maneira direta sobre os mecanismos envolvidos nos processos patolgicos, anteriormente citados, ou se tais princpios ativos poderiam alterar a resposta imune do hospedeiro frente ao estmulo, seja ele de natureza infecciosa ou tumoral. Tendo em vista os altos nveis de compostos bioativos presentes nas plantas do gnero Euphorbia, provvel que algumas espcies possam realmente apresentar atividades biolgicas capazes de promover uma melhora clnica em algumas situaes patolgicas (LAGE et al, 2009; PUSZTAI et al, 2007). Considerando a importncia da produo de citocinas no desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra os processos patolgicos associados infeco, a tumores e a processos inflamatrios, possvel que muitas das funes teraputicas atribudas s Euphorbiceaes possam ser consequncia da ao dos princpios ativos das plantas sobre o sistema imune, e no somente derivar de uma ao direta dos mesmos elementos causadores de tais patologias. Como as aes do sistema imune no combate s infeces virais e nos processos de eliminao de tumores possuem mecanismos semelhantes, tais como a citotoxicidade antgeno-dependente e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), caractersticas de uma resposta imune do tipo celular (tipo 1), o presente trabalho buscou avaliar a ao in vitro do ltex bruto de E. tirucalli na produo de citocinas em populaes e subpopulaes especficas de leuccitos do sangue perifrico.

4 OBJETIVO

4.1 Objetivo geral

Analisar o perfil de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do sangue perifrico de indivduos estimulados in vitro com o ltex bruto de Euphorbia tirucalli.

4.2 Objetivos especficos

- Construir uma curva dose-resposta da viabilidade das clulas monucleares do sangue perifrico estimuladas pelo ltex bruto de E. tirucalli diludo em DMSO nas concentraes de 5, 10, 20 e 30% in vitro nos tempos de incubao de 24, 48 e 72 horas. - Analisar o perfil das citocinas intracitoplasmticas IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10 in vitro nas populaes de neutrfilos, moncitos, linfcitos e nas subpopulaes de linfcitos T CD4+ e T CD8+ do sangue perifrico de indivduos estimulados com o ltex bruto de Euphorbia tirucalli 10% diludo em DMSO.

5 MATERIAL E MTODOS

5.1. Populao estudada

Para o estudo funcional dos leuccitos circulantes, foram coletadas amostras de sangue venoso de 20 indivduos voluntrios com idade variando de 21 a 56 anos (37 12), sendo 6 mulheres e 14 homens. Os voluntrios foram submetidos triagem na clnica hematolgica Romeu Ibrahim de Carvalho, tendo sorologia negativa para hepatite B e C, HIV, sfilis, doena de Chagas e HTLV e estando, assim, aptos doao de sangue. As culturas celulares e as anlises fenotpicas foram realizadas no laboratrio de Imunologia da UFVJM e no Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitoramento do Centro de Pesquisa Ren Rachou FIOCRUZ. Todos os indivduos includos neste estudo assinaram o termo de consentimento aprovado pelo Comit de tica da UFVJM, sob registro permanente 002/09.

5.2 Amostras de sangue

A amostra biolgica constituiu-se de 8 a 15 mL de sangue total, utilizando-se a heparina como anticoagulante. Aps a coleta, num prazo mximo de 24 horas, foram feitas as culturas celulares e posteriores anlises da produo de citocinas intracitoplasmticas em populaes e subpopulaes de leuccitos perifricos, por citometria de fluxo.

5.3 Certificao botnica Euphorbia tirucalli

A identificao botnica do exemplar utilizado nos experimentos foi realizada por botnicos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri UFVJM por meio de estudos anatmicos. O material testemunho foi depositado no herbrio da referida instituio nmero de registro 1897.

5.4 Coleta das amostras de ltex de Euphorbia tirucalli

O ltex de Euphorbia tirucalli foi coletado por meio de pipeta automtica com ponteira descartvel, aps inciso na base do ramo da planta adulta, com altura mnima de 2 metros. O material foi coletado pela manh, entre 8 e 9 horas, e diludo imediatamente em

DMSO, nas concentraes de 5, 10, 20 e 30% v/v. Nessas concentraes, foi possvel obter boa diluio em DMSO, alm de baixa toxicidade em leuccitos mononucleares nas primeiras 24 horas. A qualidade da soluo foi determinada pela ausncia de cogulos e pela sua homogeneidade.

FIGURA 5 - Coleta do ltex de E. tirucalli 5.5 Anlise da viabilidade de clulas mononucleares do sangue perifrico estimuladas in vitro com o ltex bruto de E. tirucalli

Tendo em vista o conhecimento prvio sobre a toxicidade do ltex de E. tirucalli, foi realizado um teste de viabilidade celular a fim de indicar a concentrao ideal a ser utilizada nos ensaios de anlise das citocinas intracitoplasmticas, sem prejuzo s clulas em cultura. Para a realizao desse teste, foram coletados 15mL de sangue venoso de trs indivduos jovens, aptos doao. O sangue foi centrifugado utilizando-se um gradiente de concentrao de Ficoll-Paque (Pharmacia, Upsalla - Sweeden), na proporo de 2/1, por 20 minutos a 600g. Posteriormente, retirou-se o anel de leuccitos mononucleares que foram depositados em tubos cnicos de 50mL. O volume do tubo foi completado para 40 mL de salina tamponada PBS (PBS 0,015 M pH 7,4) e a soluo foi ento centrifugada novamente. Essa etapa de lavagem foi repetida. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi descartado, mantendo-se um volume de 1mL, seguido de ressuspenso das clulas. 10L dessa suspenso celular foram

incubados por cinco minutos com 190L de azul de tripam a 0,4% em PBS. Para ajustar a concentrao da suspenso celular para 1 x 107 clulas/mL, foi feita a contagem das clulas viveis utilizando-se Cmara de Neubauer. 50L da suspenso celular, totalizando 500000 clulas/poo, foram incubados com 1925L de RPMI completo e 25L das solues estoque de ltex diludas em DMSO, em diferentes concentraes, sendo elas: Ltex a 5% (Lt 5%), Ltex a 10% (Lt 10%), Ltex a 20% (Lt 20%) e Ltex a 30% (Lt 30%). Como o volume em cada poo foi 2mL nas culturas chamadas de Lt 5%, Lt 10%, Lt 20% e Lt30%, o ltex de E. tirucalli estaria na concentrao final, em cada poo, de 0,0625%, 0,125%, 0,25% e 0,5% respectivamente. Culturas celulares estimuladas com salina e DMSO foram realizadas e constituram os grupos controle (CC) e controle do solvente (DMSO, respectivamente. As culturas foram realizadas em triplicata, utilizando placas de 24 poos, sendo cada replicata reservada para a anlise dos tempos 24, 48 e 72 horas de incubao. Ao fim da incubao, as clulas foram colocadas em tubos de fundo redondo de 5mL e lavadas com 2mL de PBS. 10L das suspenses celulares foram incubados com 190L de azul de tripam por 5 minutos. Foi feita, ento, a contagem das clulas viveis e inviveis utilizando-se Cmara de Neubauer. A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de clulas viveis no coradas no universo de clulas totais, coradas (inviveis) e no coradas (viveis).

5.6 Anlise de citocinas intracitoplasmticas por citometria de fluxo

A deteco de citocinas intracelulares por citometria de fluxo um mtodo rpido, fcil e semiquantitativo, que permite a deteco de citocinas em uma nica clula, sendo um instrumento muito til para o estudo da contribuio de clulas imunocompetentes na produo de citocinas em populaes celulares heterogneas, bem como para o estudo do padro de citocinas em populaes celulares homogneas (FOSTER et al., 2007). Para avaliao do potencial de produo de citocinas em diferentes populaes celulares, foi utilizado o seguinte protocolo: alquotas de 500L de sangue total foram adicionadas a 500L de RPMI-1640, em quatro tubos distintos. O tubos utilizados nas culturas eram de fundo em U e de polipropileno. O primeiro tubo correspondeu cultura controle no estimulada (CC). Ao segundo tubo foram adicionados 25L de Dimetilsulfoxido, correspondendo ao grupo controle do solvente (DMSO). Ao terceiro tubo foram adicionados 25L de ltex da Euphorbia tirucalli diludo a 10% v/v em DMSO (Lt). Como o volume final no tubo corresponde a 1mL, a concentrao do extrato no tubo foi de 0,25% v/v. Essa

concentrao foi escolhida tendo em vista resultados prvios que demonstraram ser essa a concentrao tima para uso experimental. Em todos os tubos foram adicionados 10L de Brefeldina-A a 1mg/mL, para interromper o processo de transporte de protenas, mantendo-as no citosol celular. As culturas celulares foram ento incubadas por 4 horas, em estufa mida a 37oC, contendo 5% CO2. Aps esse tempo, as amostras foram lavadas com 6mL de PBS-W (PBS 0,015 M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sdica) e centrifugadas a 600 g por 10 minutos a 18oC. Um volume de 1mL das culturas CC, DMSO e Lt foi adicionado a 4 tubos contendo 5L de anticorpos monoclonais especficos para os receptores celulares CD4, CD8, CD14 para a anlise de linfcitos T auxiliares (Th), linfcitos T citotxicos e moncitos, respectivamente. As amostras foram incubadas por 30 minutos, temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Aps incubao, as culturas foram submetidas lise por adio de 4,5ml de soluo de lise eritrocitria (Optilyse-B, Immunotec-USA) e incubadas por 10 minutos temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 600g por 10 minutos a 18oC, o sobrenadante aspirado e as clulas ressuspendidas em 4ml de PBS-W, e o volume completado at 12ml com PBS-P (PBS 0,015 M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sdica e 0,5% de saponina). Aps incubao por 10 minutos temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a suspenso de clulas foi novamente centrifugada. O sobrenadante foi aspirado e as clulas ressuspendidas em 3ml de PBS-W. Fez-se nova centrifugao, aspirao do sobrenadante e ressuspenso celular em 250l de PBS-W. Aps a homogeneizao da suspenso celular, o volume de cada tubo foi distribudo em quatro novos tubos contendo 20l de anticorpos anti-IFN-, anti-TNF-, antiIL-4 e anti-IL-10 (diludos 1/20 em PBS-P), seguido de incubao por 30 minutos, temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Terminada a incubao, as clulas foram ressuspensas em 3 ml de PBS-P e centrifugadas. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspensas em PBS-W. Aps essa etapa foram adicionados aos tubos 2ml de PBS-W seguido de centrifugao a 400g por 10 minutos a 18oC. Aps o descarte do sobrenadante, as clulas foram ressusas em 300l de soluo fixadora FACS fix solution(10 g/L paraformaldedo, 1% de cacodilato sdico, 6,65 g/L cloreto de sdio e 0,01% de azida sdica). As amostras foram avaliadas quanto aos parmetros fenotpicos celulares e produo de citocinas, por citometria de fluxo (FACScan Becton-Dickinson USA), procedendo-se a aquisio de 30.000 eventos por tubo utilizando o programa Cell-Quest para o estoque dos dados. Os anticorpos utilizados para a identificao das populaes leucocitrias, bem como

para a marcao das citocinas por citometria de fluxo e suas especificidades esto listados na TAB. 3.

TABELA 3 Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de populaes leucocitrias e marcao de citocinas. Anticorpos monoclonais Especificidade Anti-CD4 humano marcado com PerCP1 Subpopulao de Linfcitos T Anti-CD8 humano marcado com PerCP Subpopulao de Linfcitos T Anti-CD14 humano marcado com PerCP Populao de moncitos Anti-INF- humano marcado com PE2 Interferon gamma Anti TNF- humano marcado com PE Fator de necrose tumoral alfa Anti IL-4 humano marcado com PE Interleucina 4 Anti IL-10 humano marcado com PE Interleucina 10 Anticorpos monoclonais (Becton-Dickinson, USA). 1 PerCP: Protena Clorofila Peridina 2 PE: Ficoeritrina

5.7 Estratgia de anlise

As populaes leucocitrias de interesse foram selecionadas mediante a anlise de grficos de distribuio pontual em funo do tamanho e granulosidade (FSC x SSC), conforme FIG. 6A e 6C . Para a anlise das populaes de moncitos e as subpopulaes de linfcitos T CD4 e T CD8 foram utilizados anticorpos anti-CD14, anti-CD4 e anti-CD8, respectivamente, todos marcados com PerCP (FL3). Uma vez que a populao de neutrfilos negativa para o marcador anti-CD14, essa populao foi selecionada com base no perfil de tamanho e granulosidade, bem como na negatividade para a marcao com anti-CD14.Aps a seleo das clulas de interesse, por meio de grficos de tamanho versus granulosidade, foi realizada a anlise das citocinas intracitoplasmticas em grficos de distribuio pontual de fluorescncia 3 (FL3) versus fluorescncia 2 (FL2), tanto nas culturas controle quanto nas culturas estimuladas com ltex de E. tirucalli, conforme exemplificado nas figuras 6B e 6D, respectivamente. Os dados primrios obtidos em cada quadrante dos grficos de disperso FL3 x FL2 corresponderam aos valores percentuais, tendo como referncia a populao selecionada nos grficos de disperso SSC x FSC (FIG. 6B e 6D).

A
Granulosidade - SSC

1 3 40 54

Tamanho - FSC

TNF-alpha-PE

CD4-PerCP

C
Granulosidade - SSC

15 13 27 45

Tamanho - FSC

TNF-alpha-PE

CD4-PerCP

FIGURA 6 - Estratgia de anlise por citometria de fluxo. Sequncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de populaes celulares por citometria de fluxo. Grfico de distribuio pontual FSC x SSC so utilizados para a seleo das populaes desejadas nas culturas do grupo controle CC (A) e grupo Lt (C). Em seguida so utilizados grficos de distribuio pontual FL3 x FL2 para avaliar a expresso de citocinas nas populaes e subpopulaes especficas (B) CC, (D) Lt.

5.5 Anlise estatstica

Para verificar a diferena entre os grupos, utilizou-se a anlise de varincia, seguida pelo teste de mltipla comparao de mdia de Tukey. A tabulao e anlise dos dados foi realizada utilizando-se o Software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Adotou-se como nvel de significncia um p < 0,05.

6 RESULTADOS 6.1 Anlise da viabilidade de clulas mononucleares do sangue perifrico humano in vitro aps estimulao com ltex bruto de Euphorbia tirucalli

A FIG. 7 representa a anlise de viabilidade em valores percentuais dos leuccitos mononucleares incubados com o ltex de E. tirucalli diludo em DMSO nas concentraes de 5, 10, 20 e 30%, nos tempos 24 (A), 48 (B) e 72 horas (C). Os dados obtidos revelaram que o tratamento com o ltex de E. tirucalli, na concentrao de 5%, no alterou o percentual de clulas viveis e inviveis em nenhum dos tempos avaliados, quando comparados aos grupos CC e DMSO. O ltex nas concentraes 10 e 20% reduziu a viabilidade celular a partir das 48 horas de incubao. J o extrato da planta na concentrao de 30% apresentou citotoxicidade desde as primeiras 24 horas. Esses dados evidenciam que a citotoxicidade aumenta em funo do tempo de exposio ao ltex nas concentraes acima de 5%. De acordo com os dados apresentados, o ltex bruto da planta parece no interferir nos processos citotxicos na concentrao de 5% em todos os tempos avaliados e nas concentraes de 10 e 20% em tempos inferiores a 24 horas, porm, so necessrios outros estudos para a confirmao da toxicidade do extrato, uma vez que o ensaio com o azul de tripam avalia apenas a perda da seletividade da membrana celular, um evento tardio da clula em processo de morte.

A 100

50

Viabilidade %

B 100

50

C 100

50

CC

DMSO

Lt 5%

Lt 10%

Lt 20%

Lt 30%

FIGURA 7 - Percentual de clulas viveis em leuccitos mononucleares circulantes do sangue perifrico de indivduos hgidos nos tempos 24 horas (A), 48 horas (B) e 72 horas (C) e estimulados com salina (grupo controle) , DMSO e Ltex de E. tirucalli nas concentraes de 5 , 10 , 20 e 30% . A contagem das clulas foi feita com auxlio da cmara de neubauer, segundo o protocolo de viabilidade celular descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos com a disperso dos dados e o valor mdio da viabilidade nos diferentes grupos. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

6.2 Perfil de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli 6.2.1 Anlise de citocinas intracitoplasmticas em neutrfilos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli O percentual de neutrfilos positivos para as citocinas IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10 est apresentado nas figuras 8 e 9. De acordo com os resultados, o percentual de neutrfilosIFN-+ (FIG. 8A) e neutrfilos-TNF-+ (FIG. 8B) das culturas celulares do grupo Lt apresentou um aumento significativo em relao aos grupos CC e DMSO (IFN-: Lt: 0,25 0,25, CC 0,05 0,02, DMSO: 0,45 0,03 e TNF-: Lt: 0,50 0,29, CC: 0,2 0,11, DMSO: 0,15 0,08).

0.6

IFN-
1

TNF-

a, b
% Neutrfilos+ Citocina + /Neutrfilos +

a, b
0.45 0.75

0.3

0.5

0.15

0.25

FIGURA 8 - Anlise do percentual mdio de neutrfilos-IFN-+ (A) e neutrfilos-TNF-+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

A anlise das citocinas do tipo 2 revelou que o grupo Lt apresentou um aumento no percentual de neutrfilos-IL-4+ quando comparado aos grupos CC e DMSO (Lt: 7,18 3,02, CC 2,26 1,17, 3,60 1,77) (FIG. 9A). Nenhuma diferena foi observada nos valores percentuais de neutrfilos-IL-10+ entre os grupos avaliados (FIG. 9B). .

12

IL-4
0.4

IL-10

% Neutrfilos+ Citocina + /Neutrfilos +

a, b
9
0.3

0.2

0.1

FIGURA 9 - Anlise do percentual mdio de neutrfilos-IL-4+ (A) e neutrfilos-IL-10+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

6.2.2 Anlise de citocinas intracitoplasmticas em moncitos do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli

Nas FIG. 10 e 11 esto expressos os valores percentuais mdios de moncitos positivos para a expresso das citocinas estudadas. De acordo com os resultados, os grupos analisados no apresentaram diferenas estatisticamente significativas para os moncitos positivos, tanto para as citocinas do tipo 1 (TNF- ), quanto para as citocinas do tipo 2 (IL-4 e IL-10), respectivamente.

60

TNF-

% Moncitos+ Citocina + /Moncitos +

45

30

15

FIGURA 10 - Anlise do percentual mdio de moncitos-TNF-+ (A) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anticorpo anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

12

IL-4
12

IL-10

% Moncitos+ Citocina + /Moncitos +

FIGURA 11 - Anlise do percentual mdio de moncitos-IL-4+ (A) e moncitos-IL-10+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anticorpo anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

6.2.3 Anlise de citocinas intracitoplasmticas em linfcitos e subpopulaes linfocitrias T CD8+ e T CD4+ do sangue perifrico estimulados com ltex bruto de E. tirucalli

A FIG. 12 apresenta os valores percentuais de linfcitos positivos para as citocinas do tipo 1 INF- (A), TNF- (B). A expresso de linfcitos positivos para INF- TNF- quando estimulados com o ltex de E. tirucall foram cerca de 11 e 16 vezes maiores comparados ao grupo controle CC (INF-: Lt: 5,17 2,09, CC: 0,44 0,31, DMSO: 0,33 0,27 e TNF: Lt: 8,60 3,75, CC: 0,51 0,31, DMSO: 0,38 0,28), mostrando uma polarizao da expresso de citocinas do tipo 1 na populao linfocitria.

IFN-
16

TNF-

a, b
% Linfocitos T otais+ Citocina + /Linfocitos Totais +

a, b
6 12

FIGURA 12 - Anlise do percentual mdio de linfcitos-IFN-+ (A) e linfcitos-TNF-+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

Os resultados apresentados na FIG. 13 expressam os valores percentuais de linfcitos positivos para as citocinas IL-4 (A) e IL-10 (B). A anlise entre os grupos revelou que o ltex da planta no foi um estmulo para o aumento da expresso de citocinas do tipo 2.

2.8

IL-4
4

IL-10

% Linfocitos T otais+ Citocina + /Linfocitos Totais +

a
2.1 3

1.4

0.7

FIGURA 13 - Anlise do percentual mdio de linfcitos-IL-4+ (A) e linfcitos-IL-10+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

Nas FIG. 14 e 15 observamos que a subpopulao de linfcito T CD8+ quando estimulados com o ltex de E. tirucalli, apresentou um perfil misto na expresso de citocinas, dado que os valores de linfcitos TCD8+ positivos para as citocinas avaliadas, INF-, TNF-, IL-4 e IL-10, foi superior aos grupos CC e DMSO, respectivamente. Foram estes os valores de mdia e desvio para os respectivos grupos: INF-: CC: 0,76 0,77, DMSO: 070 0,64, Lt: 17,57 15,29; TNF-: CC: 1,24 1,62, DMSO: 0,82 0,67, Lt: 18,86 19,18; IL-4: CC: 1,03 0,96, DMSO: 1,25 0,82, Lt: 4,52 4,93; e IL-10: CC: 1,97 1,92, DMSO: 2,67 2,09, Lt: 7,83 9,88.

40

IFN-
50

TNF-

% Linfocitos T CD8+ Citocina + /Linfocitos T CD8 +

a, b

a, b
30
37.5

20

25

10

12.5

FIGURA 14 - Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD8-IFN-+ (A) e linfcitosT CD8-TNF-+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt .A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anti-CD8 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

12

IL-4
24

IL-10

% Linfocitos T CD8+ Citocina + /Linfocitos T CD8 +

a, b
9 18

a, b

12

FIGURA 15 - Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD8-IL-4+ (A) e linfcitosT CD8IL-10+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anti-CD8 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

A FIG. 16 mostra o resultado dos valores percentuais de linfcitos T CD4-INF-+ (A) e T CD4-TNF-+ (B). A anlise dos dados indicou que quando estimulados com o ltex da planta estudada, o percentual de linfcitos T CD4-INF-+ T CD4-TNF-+ teve um aumento, sendo este cerca de 8,5 e 11 vezes superior respectivamente (INF-: Lt: 3,23 1,33, CC: 0,37 0,43, DMSO: 0,29 0,29 e TNF-: Lt: 13,68 4,77, CC: 1,23 3,19, DMSO: 0,33 0,26).

IFN-
16

TNF-
a, b

% Linfocitos T CD4+ Citocina + /Linfocitos T CD4 +

a, b
4.5 12

1.5

FIGURA 16 - Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD4-IFN-+ (A) e linfcitosT CD4-TNF-+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt .A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anti-CD4 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

J a FIG. 17 mostra o resultado dos valores percentuais de linfcitos T CD4- IL-4+ (A) e T CD4-IL-10+ (B). Nenhuma diferena significativa foi observada no percentual de linfcitos T CD4 positivos para as citocinas do tipo 2 avaliadas, demonstrando que, assim como os linfcitos totais, os linfcitos T CD4+ contribuem para a polarizao da resposta imune para um perfil celular, conhecido tambm como pr-inflamatrio.

2.8

IL-4
6

IL-10

% Linfocitos T CD4+ Citocina + /Linfocitos T CD4 +

2.1

4.5

1.4

0.7

1.5

FIGURA 17 - Anlise do percentual mdio de linfcitos T CD4-IL-4+ (A) e linfcitosT CD4IL-10+ (B) de culturas de leuccitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A populao celular foi identificada atravs dos parmetros de tamanho e granulosidade e marcao com anti-CD4 e as citocinas intracitoplasmticas por marcao utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e mtodos. Os resultados foram expressos como percentual mdio de clulas positivas para as citocinas mais os valores de desvio padro. Diferena estatisticamente significativa: a = em relao ao grupo controle, b = em relao ao grupo DMSO. Mtodo estatstico utilizado ANOVA seguida de Tukey.

A figura abaixo (FIG. 18) sintetiza os resultados. Os dados apresentados demonstraram que o estmulo do ltex bruto de E. tirucalli induziu o aumento do percentual positivo para as citocinas do tipo 1, INF-, TNF-, nas populaes de neutrfilos e linfcitos, bem como nas subpopulaes de linfcitos TCD4+ e TCD8+. J os moncitos neste estudo no responderam ao estimulo do ltex da planta com o aumento da expresso de citocinas em nenhum dos perfis. O ltex de E. tirucalli tambm foi um estmulo para o aumento do percentual de neutrfilos IL-4+ e tambm linfcitos TCD8-IL-4+ e TCD8-IL-10+.

Neutrfilos

Moncitos

T CD8+

Linfcitos

T CD4+

FIGURA 18 - Resumo dos resultados obtidos na expresso de citocinas nas populaes e subpopulaes estudadas, quando estimulados com o ltex bruto de E. tirucalli diludo a 10% em DMSO.

7 DISCUSSO DOS RESULTADOS

Embora diversas funes biolgicas de E. tirucalli tenham sido mencionadas em diversos trabalhos da literatura cientfica, tambm sabido que o ltex bruto da planta possui propriedades custicas que podem promover leses graves quando em contato direto com tecidos humanos (SHLAMOVITZ et al., 2009). Diante disso, ao iniciarmos o presente estudo, fez-se necessrio saber qual seria a concentrao tima a ser utilizada nos experimentos com culturas de leuccitos humanos. Alm de determinar a concentrao ideal, foi preciso verificar se o tempo de exposio ao ltex poderia interferir na viabilidade dos leuccitos submetidos a tais culturas celulares. Para tanto, leuccitos do sangue perifrico de indivduos foram submetidos a culturas celulares na presena de diferentes concentraes do ltex, bem como a diferentes tempos de incubao (Figura 6). A anlise dos dados do teste de viabilidade com o azul de tripam revelou que as concentraes do ltex a 5, 10 e 20% diludo em DMSO, correspondendo a 0,0625%, 0,125% e 0,25% no volume final das culturas celulares, no foram txicas aos leuccitos mononucleares do sangue perifrico (moncitos e linfcitos) nas primeiras 24 horas. Uma vez que o tempo de incubao com o ltex no protocolo de anlise do perfil de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do sangue perifrico foi de 4 horas, as concentraes de 5,10 e 20% em DMSO poderiam ser utilizadas, uma vez que no alteraram de forma significativa a viabilidade dos leuccitos avaliados. Alm da anlise quantitativa aqui apresentada, foi possvel tambm acompanhar, qualitativamente, os parmetros de tamanho e granulosidade das clulas, em grficos de disperso (FSC x SSC), no momento da aquisio de dados pela citometria de fluxo. A escolha da concentrao do ltex diludo a 10% em DMSO, neste ensaio correspondendo a 0,25% no volume final da cultura, para a realizao das culturas celulares baseou-se em estudos preliminares realizados no laboratrio, onde tal concentrao mostrou-se como a concentrao mnima tima, capaz de levar a ativao e produo de citocinas intracitoplasmticas demonstradas no presente estudo. As plantas da famlia Euphorbiacea tm sido relatadas como plantas medicinais com atividade antiviral e antitumoral (AMIRGHOFRAN et al., 2006; KUO et al., 2006; YANG et al., 2005; LAGE et al., 2009). No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos ainda no esto bem elucidados. A anlise das citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do sangue perifrico revelou um aumento estatisticamente significativo no percentual de neutrfilos e linfcitos positivos para as citocinas do tipo1 quando estimulados

pelo ltex bruto de E. tirucalli (FIG. 8 e 12). Esse resultado condiz com algumas propriedades biolgicas atribudas a essa planta. A respeito das atividades antitumoral e antiviral atribudas a algumas espcies da famlia Euphorbiaceae, estudos sugerem que os princpios ativos envolvidos em tais processos podem atuar diretamente sobre o ciclo de replicao de alguns vrus e nos mecanismos moleculares envolvidos na manuteno de tumores (YANG et al., 2005; BETANCUR-GALVIS et al., 2002; TAO et al., 2008). No entanto, h relatos na literatura que sugerem que tais princpios ativos poderiam tambm interferir na resposta imunolgica e, dessa forma, favorecer a eliminao viral e tumoral por meio de uma ao indireta desses princpios sobre o sistema imune (DIAS-BARUFFI et al., 2000; AMIRGHOFRAN et al., 2008). De acordo com os dados obtidos em nosso estudo, as populaes especficas de leuccitos humanos do sangue perifrico comportam-se de maneira diferenciada quando submetidas estimulao com o ltex bruto de E. tirucalli. Os linfcitos T apresentaram um perfil de produo de citocinas predominantemente do tipo 1, demonstrado pelo aumento no percentual de clulas positivas para as citocinas IFN- e TNF- (pr-inflamatrias) quando estimulados com o ltex da planta. O aumento de linfcitos T produtores de citocinas do tipo 1 poderia favorecer elementos da resposta imune responsveis pela cicatrizao, fagocitose e aumento da citotoxicidade mediada por linfcitos T CD8 citotxicos e clulas Natural Killer, importantes nas respostas antiviral e antitumoral, como descrito anteriormente,bem como por Sasaki e colaboradores (2010). Essa capacidade de estimular a resposta imune do tipo 1, conhecida como resposta celular, tambm foi demonstrada por Kinghom e colaboradores (1979) quandoestudos utilizando steres de forbol extrados de E. tirucalli exacerbaram o processo inflamatrio em orelhas de ratos. Na anlise das subpopulaes de linfcitos T, observamos que os linfcitos T CD4+ e T CD8+ apresentaram o mesmo perfil de produo de citocinas do tipo 1. Os linfcitos T CD4+, conhecidos como linfcitos T helper, so responsveis por conduzir a resposta imune celular (tipo 1) ou humoral (tipo 2). A conduo predominante de uma ou outra resposta depende do perfil de citocinas produzidas pelos linfcitos T CD4 e pela predominncia dessas citocinas no microambiente do foco da leso (ZINFANG et al., 2010). A induo de citocinas do tipo 1 com o objetivo de modular a resposta imune utilizando plantas do gnero Euphorbia foi descrita por Singh (2006). No estudo, o

tratamento com extrato etanlico de Euphorbia hirta em animais com reao alrgica promoveu um aumento de IFN- e atenuao da resposta humoral. O IFN- tem a capacidade

de ativar macrfagos, clulas Natural Killer e linfcitos T CD8 e induzir a apresentao de antgenos por meio do aumento da expresso do complexo maior de histocompatibilidade do tipo I - MHC-I. Essa citocina tambm apresenta a capacidade de induzir a produo de subclasses de anticorpos tipo IgG2 e IgG3 (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001; SNAPPER & PAUL, 1987; DUFFIELD et al., 2003), uma caracterstica marcante em infeces virais. A ativao desses processos torna o IFN- imprescindvel na resposta antiviral e antitumoral. Os animais com tumor induzido por linhagens celulares EL4 ou EG7, e Knockout para o rIFN-, ou deficientes na produo de IFN- no respondiam ao tratamento quimioterpico ao

contrrio dos animais do grupo controle que apresentavam a produo normal de tal citocina e do seu receptor (GHIRINGHELLI et al., 2009). Esse estudo aponta a importncia do IFN- para uma resposta quimioterpica efetiva. Tendo em vista que as respostas antitumoral e antiviral so dependentes da ativao da resposta imune celular, provvel que a produo de IFN- em linfcitos T helper, induzida pelo ltex de E. tirucalli, possa favorecer a apresentao de antgenos e assim contribuir para a eliminao de clulas tumorais, ou infectadas por vrus, por meio da ao antgeno especfica de linfcitos T CD8. Os trabalhos realizados por Valadares (2006) evidenciam uma ao antitumoral de E. tirucalli. Nesse estudo, o extrato da massa seca de Euphorbia tirucalli, diluda em salina, foi capaz de prolongar a sobrevida de animais com tumor asctico, alm de restabelecer a hematopoiese a valores normais e recuperar a esplenomegalia. No entanto, esse trabalho no avaliou a participao de citocinas ou outro parmetro imunolgico como mediador dessa resposta. A ao antitumoral de plantas do gnero Euphorbia foi tambm demonstrada na modulao da expresso de protenas associadas mltipla resistncia a drogas (MDR). Os MDR diminuem a concentrao intracelular de quimioterpicos promovendo a resistncia do tumor e de clulas infectadas (HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2009). Dessa forma, a reduo da expresso de MDRs um forte auxlio quimioterapia por permitirem a ao teraputica efetiva dos frmacos. As citocinas foram descritas como molculas importantes nessa regulao negativa de MDRs (STEIN e WALTHER, 1998). As citocinas IL-1 e TNF-, por exemplo, reduzem a expresso do gene mdr1 (STEIN et al., 1996). Tendo em vista os resultados deste trabalho, possvel que os princpios ativos encontrados nas plantas do gnero Euphorbia modulem a expresso de MDRs atravs do aumento na produo de TNF.

O linfcito T CD8+ induz apoptose de clulas alvo por meio da liberao das protenas, tais como perforina, granzimas e granulisina contidas em grnulos. Os linfcitos T CD8+ tambm so fontes secretoras de citocinas, que podem potencializar a resposta imune (JAGER et al., 2001). Como observado em nossos resultados, os linfcitos T CD8+ estimulados com ltex bruto de E. tirucalli apresentaram um aumento na produo das citocinas do tipo 1 (FIG. 14) o que favorece suas funes efetoras, principalmente a citotoxicidade. Outra citocina fundamental na resposta imune celular o TNF-. Essa

citocina capaz de ativar macrfagos, induzindo a produo de xido ntrico (NO) e induzir a expresso de molculas de adeso no endotlio, favorecendo o recrutamento celular (WAJANT et al., 2009; APOSTOLAKI et al., 2010). O TNF- tambm pode ser uma molcula efetora na apoptose de clulas tumorais, bem como em clulas infectadas, por meio da ligao aos receptores que possuem domnios de morte que sinalizaram os eventos apoptticos (SCREATON e XU, 2000). O aumento percentual de linfcitos TCD4+TNF+ e TCD8+TNF+ reforam a hiptese de que os princpios ativos de E. tirucalli conduzem a resposta predominantemente do tipo 1. Alguns estudos realizados evidenciaram a participao de princpios ativos encontrados em plantas do gnero Euphorbia sobre diversos processos biolgicos mediados por TNF-. Foi demonstrado que a frao ativa do extrato de Euphorbia peplus induziu apoptose em clulas de melanoma por vias dependentes da ligao do TNF em receptores que se ligam aos domnios de morte (GILLESPIE et al., 2004). J a lectina Euphorbin, extrada do latex de Euphorbia milii, induziu a migrao de neutrfilos em ratos (DIAS-BARUFFI et al., 2000). Embora a produo de citocinas no tenha sido avaliada no referido estudo, muito provavelmente houve a participao dessas molculas nesse recrutamento celular. Tendo em vista que a E. tirucalli possui, dentre outras substncias, steres de forbol em sua constituio, sendo esses capazes de ativar a protena quinase C, as possveis vias para a produo de citocinas pr-inflamatrias envolveriam os fatores de transcrio NF-kB, Elk e a juno de Jun e Fos, conhecido como AP1(DUMONT et al., 1998). Alm dessas, a via JAK/STAT tambm tem uma importncia na produo de citocinas do tipo 1. A figura 19 sintetiza as possveis vias de sinalizao para a transcrio das citocinas pr-inflamatrias. Uma perspectiva futura seria a anlise das vias de sinalizao e dos fatores de transcrio envolvidos nesse aumento da expresso de citocinas frente estimulao com o ltex bruto de E. tirucalli. No entanto, faz-se necessrio realizar tal investigao utilizando substncias isoladas ou fraes ricas em determinados compostos bioativos.

RNAm citocinas pr-inflamatrias

FIGURA 19 - vias envolvidas na transcrio de RNAm para sntese de citocinas proinflamatrias

Os neutrfilos apresentaram um aumento de IL-4, concomitantemente com o aumento das citocinas IFN- e TNF- (TAB. 2). No fgado tem sido descrita a importncia dos neutrfilos em moderar a resposta inflamatria dos moncitos em condies de infeco bacteriana sistmica (HOLUB et al., 2009). A importncia da IL-10 em inibir e modular a ativao de clulas da inflamao tambm j foi descrita (FIORENTINO et al., 1991). O aumento expressivo da IL-4 pelos neutrfilos, assim como o aumento de IL-10 e IL-4 em linfcitos TCD8+ se encaixa no contexto da moderao da resposta inflamatria estimulada pelo ltex de E. tirucalli, de forma que a resposta seja predominantemente inflamatria, porm moderada. Tais mecanismos de controle fazem parte da fisiologia da resposta imune e so necessrios para evitar uma resposta inflamatria exacerbada e prejudicial ao organismo. Os moncitos demonstraram no contribuir para o aumento de citocinas em nenhum dos dois perfis e portanto, parecem no serem alvos para a ao do ltex de E. tirucalli na produo de citocinas.

 possvel que a ao antitumoral e antiviral observada pelos extratos de E. tirucalli seja mediada pelo sistema imune. Estudos pr-clnicos realizados j demonstraram que, alm de baixa toxicidade em ratos (SILVA et al., 2007), o extrato de E. tirucalli apresentou um bom ndice teraputico para ao antiviral (BETANCUR-GALVIS et al., 2002), sugerindo-o como uma perspectiva para futuros ensaios clnicos.

8 CONCLUSO

Este estudo permitiu identificar, seletivamente, as populaes celulares nas quais o ltex bruto de E. tirucalli diludo em DMSO atuou promovendo o aumento da sntese de citocinas. O estmulo com ltex bruto da planta Euphorbia tirucalli sobre leuccitos do sangue perifrico, submetidos cultura rpida, in vitro, induziu um perfil de resposta imune predominantemente do tipo 1 por meio do aumento percentual de linfcitos T positivos para as citocinas IFN- e TNF-, principalmente em linfcitos T-CD4, Esse padro de resposta imune, conhecido como resposta imune celular poderia ter aplicaes futuras no campo da imunoterapia de tumores e infeces por patgenos intracelulares, uma vez que tais citocinas so importantes mediadores em tais processos. Estudos adicionais, utilizando-se substncias isoladas, preferencialmente, so necessrios para elucidar em que nvel metablico os princpios ativos estariam atuando para proporcionar os resultados aqui apresentados. Alm disso, investigaes in vivo, utilizando modelos de desenvolvimento tumoral, associados ao tratamento com a planta, sero essenciais para avaliar se a produo de citocinas observadas no contexto in vitro, poderia, no contexto in vivo, provocar alguma alterao em processos carcinognicos.

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ANEXO Anexo A Artigo cientfico The crude latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) modulates the cytokine response of leukocytes, especially CD4+ T lymphocytes.
1

Bethnia A Avelar, 1 Felipe JN Llis, 2 Renato S Avelar, 1 Mathias Weber, 3 Elaine M. SouzaFagundes, 2 Olindo A Martins-Filho, 3 Miriam TP Lopes, 1 Gustavo EA Brito-Melo*,1

Immunology laboratory Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM), 2 Biomarkers laboratory Ren Rachou Institute/Oswaldo Cruz Foundation (CPqRR/FIOCRUZ), 3 Biological Sciences Institute Federal University of Minas Gerais (UFMG)

RESUMO: O latex bruto de Euphorbia tirucalli L (Euphorbiaceae) modula a produo de citocinas por leuccitos, principalmente em linfcitos T CD4+.

O uso de plantas da famlia Euphorbiaceae, principalmente do gnero Euphorbia, tem sido popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenas de natureza infecciosa, tumoral e inflamatria. Entre as espcies desse gnero, a Euphorbia tirucalli uma planta de uso difundido em algumas regies brasileiras, tal como o Vale do Jequitinhonha. H indcios de que o ltex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e antiviral, porm, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nessa ao. provvel que o mecanismo de ao para tais atividades envolva a ativao de leuccitos e a produo de citocinas para o direcionamento de uma resposta antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso, o presente trabalho avaliou a produo das citocinas TNF-, IFN-, IL-4 e IL-10 nas populaes e subpopulaes leuccitrias do sangue perifrico estimulado com o ltex bruto da referida planta. Para tal, leuccitos do sangue perifrico de vinte indivduos saudveis foram incubados por 4 horas com o ltex bruto de E. tirucalli diludo em dimetilsulfoxido (DMSO). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO constituram as culturas controle e controle de solvente, respectivamente. Aps o perodo de incubao, as clulas foram marcadas com anticorpos monoclonais especficos para receptores de superfcie celular CD4,

CD8 e CD14, conjugados com FITC, bem como para as citocinas TNF-, IFN-, IL-4 e IL-10, conjugados com PE. A aquisio e anlise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no T CD4+ positivos para as citocinas TNF- e IFN-. J os neutrfilos e linfcitos T CD8+ apresentaram um perfil misto de produo de citocinas, caracterizado por aumento na frequncia de clulas positivas para IFN-, TNF- e IL-10. Os resultados evidenciam uma resposta predominante do tipo 1. Diante dos achados possvel sugerir que a ao atribuda a Euphorbia pelo uso popular possa estar relacionado a seu efeito sobre a produo preferencial das citocinas TNF- e IFN-. Contudo preciso investigar se o efeito in vitro de E. tirucali sobre a produo de citocinas est relacionado com sua potencial ao in vivo.

Unitermos: Euphorbia tirucalli, planta medicinal, citocinas tipo 1.

ABSTRACT: The plants of the Euphorbiaceae family, especially those of the genus Euphorbia, are frequently used by Brazilian folk communities to treat a wide variety of infectious, tumoral and inflammatory illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is widely used in some Brazilian regions, such as the Jequitinhonha River Valley. There is evidence that the latex produced by E. tirucalli has antiviral and antitumor activities, but little is known about the mechanisms involved in these actions. It is likely that the mechanism for such activities involves leukocyte activation and cytokine production. Here we aimed to evaluate the production of type 1 (TNF- and IFN-) and type 2 (IL-4 and IL-10) cytokines by circulating leukocyte subsets submitted to brief stimulation with the crude latex of E. tirucalli. Peripheral blood leukocytes of 20 healthy subjects were submitted to three conditions: i) four-hour incubation with crude E. tirucalli latex diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) (EUP group), ii) four-hour incubation in the presence of DMSO alone as the solvent control group (DMSO group) and iii) and four-hour incubation in the presence of saline as the saline control group (CC group). After the incubation period, the cells were stained with FITC-conjugated monoclonal antibodies specific to the cell surface receptors CD4,

CD8 and CD14 and PE-conjugated monoclonal antibodies specific to the cytokines TNF-, IFN-, IL-4 and IL-10. The acquisition and analysis of data were performed by flow cytometry. The results showed a significant increase (p<0.05) in the percentage of CD4+ T lymphocytes positive for the type 1 cytokines TNF- and IFN-. Neutrophils and CD8+ T lymphocytes showed a mixed profile of cytokine production, characterized by an increase in the percentage of cells positive for IFN-, TNF- and IL-10. The data indicate a predominant type 1 cytokine response. The findings presented suggest that the effect popularly attributed to Euphorbia usage may be attributed to its effect on the production of TNF- and IFN-. However, the relationship between the in vitro and in vivo effects of Euphorbia needs to be investigated.

Keywords: Euphorbia tirucalli, medicinal plant, type 1 cytokines.

*

E-mail: gustavomelo@ufvjm.edu.br; Tel. +55 38 3532 1235 Fax: +55 38 3532 6000

INTRODUCTION Plants from the Euphorbiaceae family, mainly from the Euphorbia genus, have been used by some Brazilian folk communities for the treatment of injuries, infectious illnesses, tumors and inflammatory diseases (Zhang et al., 2008; Yang et al., 2005; Uzair et al., 2009; Amirghofran et al., 2006; Fernandez-Arche et al., 2010). Regarding the high concentrations of terpenoid compounds in specific plants within this family, it is probable that some species have medicinal properties that can be exploited for therapeutic purposes (Pusztai et al., 2007; Lage et al., 2009). Euphorbia tirucalli is commonly used in popular medicine in the Jequitinhonha River Valley, one of the poorest regions of Minas Gerais, for therapeutic purposes to treat illness and tumors (Valadares et al., 2006; Betancur-Galvis et al., 2002; Lage et al., 2009). The in vivo antitumor effect of E. tirucalli has been demonstrated (Valadares et al., 2006), although the mechanisms responsible for such an effect have not been investigated. Cytokines are important mediators in the development of efficient and adequate immunological responses against pathogens and pathological processes. Studies have shown that plants from the Euphorbia genus can alter the molecular and cellular parameters of the immune system (Amirghofran et al., 2008; Singh et al., 2006), suggesting that the therapeutic actions attributed to E. tirucalli could be the consequence of immune response changes evoked by the plant and not its direct action on the elements that promote the disease. In the present study, we investigated the in vitro effect of the crude latex of E. tirucalli on the production of the type 1 cytokines IFN- and TNF- and the type 2 cytokines IL-4 and IL-10 by human leukocyte populations.

MATERIALS AND METHODS

Plant material

Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) latex was collected from a specimen on the campus of the Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM), located at MGT-367 road, Km-583, N 5000, Diamantina, Minas Gerais state, Brazil, (1812.152S, 4334.667W, 1.345 m alt) in January. The plant was identified by Fabiane Nepomuceno Costa. The collected samples were deposited in the UFVJM herbarium under the registration number 1897. E. tirucalli latex was collected in the morning by incision at the base of a branch. The latex was diluted immediately in dimethylsulfoxide (DMSO) at 10% v/v. The quality of the solution was determined by homogeneity and the absence of precipitates.

Specific monoclonal antibodies used in flow cytometry analysis

The specific monoclonal antibodies (MoAbs) used were purchased from Pharmingen (San Diego, CA, USA), including anti-human IgG1-fluorescein isothiocyanate (FITC) clone 6791Mc7, anti-human IgG2a-phycoerythrin (PE) clone U727, anti-human CD4FITC clone 13B82, anti-human CD8-FITC clone B911, and anti-human CD14-FITC (clone M0P9). The PE-labeled (PE) anti-human cytokine MoAbs included anti-TNF- (clone MOAB11), anti-IFN- (clone B27), anti-IL-4 (clone MP425D2) and anti-IL-10 (clone JES39D7).

Biological samples and short-term whole-blood culture

Leukocytes were obtained from the blood of 20 volunteers capable of blood donation with negative serology for relevant blood-borne pathogens, including HIV, hepatitis C virus, hepatitis B virus, syphilis and Chagas disease. Volunteers using corticosteroids or other immunosuppressive drugs were not considered for blood donation. Informed written consent was obtained from all participants. The study was approved by the Ethical Committee at the UFVJM, Diamantina, Minas Gerais, Brazil (protocol 02/009). Blood samples were collected in vacuum tubes containing sodium heparin (Vacutainer; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), and 500-l aliquots were dispensed into individual 17 x 100mm polypropylene tubes (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Samples were incubated for 4 h at 37C in a 5% CO2 humidified atmosphere in the presence of 500 l of RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) and Brefeldin A (BFA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) at a final concentration of 10 g/ml. The stimulation with crude E. tirucalli latex was performed by the addition of 25 l of 10% crude E. tirucalli latex diluted in DMSO (EUP group) to the cultures. A solvent control, i.e., cells treated on with DMSO (25 L), was performed in parallel (DMSO group). After solvent or latex treatment, the cultures were treated with 2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Sigma Chemical Co. and incubated at room temperature for 15 min.

Flow cytometric immunostaining for surface markers and intracellular cytokines

Samples were washed with 6 mL of phosphate-buffered saline (PBS) (0.015 M) containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% sodium azide (Sigma). Cells

were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min) and then resuspended in PBS/BSA/sodium azide. Aliquots (200 L) were distributed into two 12 x 75-mm

polystyrene tubes (Falcon 2052), and cells were individually stained with MoAbs directed against CD4, CD8 and CD14 for 30 min at room temperature in the dark. Stained samples were treated with 2 mL of FACS lysing solution (Becton Dickinson, San Jose, CA) by gentle vortexing. After re-incubation for an additional 10 min, the samples were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min), and the supernatant was discarded. The pellet was dissolved in 2 ml FACS permeabilizing solution, which contains PBS/BSA/sodium azide and 0.5% saponin (Sigma), and was incubated in the dark for 10 min at room temperature. After incubation, the samples were washed twice in PBS/BSA/sodium azide. Then 20 L of PE-labeled anti-cytokine MoAb was added to cells (20 L) in a 96-well U-bottom microplate (Thomas 9383-A90) for 30 min at room temperature. Cells were subsequently washed with 150 L of FACS permeabilizing

solution followed by 200 l of FACS buffer. Samples were then fixed in 200 mL of FACS fixing solution containing 10 g/l paraformaldehyde, 10.2 g/l sodium cacodylate and 6.63 g/l sodium chloride (Sigma) at pH 7.2. The samples were stored at 4C in the dark and analyzed by flow cytometry within 24 h.

Flow cytometry A total of 30,000 events were acquired using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson) correctly set up to measure forward (FSC) and side (SSC) light scattering and FITC (FL-1) and PE (FL-2) fluorescence. CellQuestTM software was used for data acquisition and analysis. Identification of the lymphocyte subsets was performed by the dual-color immunophenotyping method using specific FITC-labeled anti-surface MoAbs and PE-labeled anti-cytokine MoAbs (BRITO-MELO et al., 2006).

Initially, a lymphocyte scatter gate was set up, using FSC versus SSC dot plots, followed by the identification of cytokine-positive cells using FL-1/FITC-anti-cell marker versus FL-2/PE-anti-cytokine dot plots. All results were expressed as the percentage of cytokine-positive cells for the different gated leukocyte subpopulations analyzed in this study, selected as described above. The numbers of subjects displayed in the figures may differ due to methodological restrictions, including insufficient numbers of cells and autofluorescence interference in the flow cytometry data.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA) followed by Tukeys multiple comparison test using the GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Difference were considered statistically significant when P<0.05.

RESULTS AND DISCUSSION Plants from the Euphorbiaceae family have been reportedly used as medicinal plants because of their antiviral and antitumor proprieties (Kuo et al., 2006; Yan et al., 2008; Amirghofran, 2006; Yang et al., 2005; Lage et al., 2009). However, the biological pathways involved in these processes have not been identified.

In this study, we demonstrated that the expression profiles of human peripheral blood leukocytes changed after they were stimulated with crude E. tirucalli latex. As demonstrated in Table 1, lymphocytes predominantly expressed type 1 cytokines, and

the IFN- and TNF- expression levels in this cell population were 11 and 8 times higher than those of the control group, respectively. Studies have shown that phorbol esters obtained from E. tirucalli have an inflammatory effect in rat ears (Kinghorn, 1979). The CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets similarly presented increased expression of TNF- and IFN- (FIGURES 1 and 2). CD4+ T lymphocytes are key cells involved in antiviral and antitumor immune responses. This cell population secretes cytokines that improve the recognition and cell-mediated elimination of virus-infected cells and tumor cells (Sasaki et al., 2010).

The increase of type 1 cytokines mediated by plants of the Euphorbia genus was recently described. Singh et al. (2006) demonstrated that treatment with an ethanolic extract of E. hirta in allergic rats promoted an increase in the level of IFN- and decreased the severity of the allergic reactions. IFN- is an important type 1 cytokine because of its roles in macrophage and killer cell activation, in antigen presentation and cytotoxicity mediated by CD8+ T cells. Additionally, IFN- induces IgG1 and IgG3 production by B cells. Together, these immunological elements are able to efficiently eliminate and destroy infected and tumor cells (Levy & Garcia-Sastre, 2001; Duffield, 2003; Snapper & Paul, 1987).

Euphorbia tirucalli extract diluted in saline was able to increase the survival of animals with ascitic tumors. Additionally, the hematopoiesis and spleen size of these animals returned to normal after treatment with the plant extract. However, the study conducted neither a cytokine analysis nor a detailed evaluation of the molecular mechanisms involved in the process (Valadares et al., 2006). In another study, the author suggested that treatment with plants from the Euphorbia genus changes the expression of multidrug resistance (MDR) factors. These factors down-regulate the intracellular

concentrations of drugs used in chemotherapy to improve tumoral resistance (Hohmann et al., 2002; Lage et al., 2009). It seems that some antitumor mechanisms are cytokine dependent, primarily on IFN- (Stein et al., 1998). Ghiringhelli (2009) demonstrated that animals injected with EL4 or EG7 tumor cells and deficient in IFN- production could not be effectively treated with chemotherapy, whereas the wild-type control group responded to treatment.

The increased percentages of CD4+TNF+ and CD8+TNF+ T cells support our hypothesis that bioactive compounds from E. tirucalli improve the type 1 immune response (FIGURES 1 AND 2). TNF- is a cytokine that activates improved phagocytosis mediated by macrophages and that increases the expression of adhesion molecules on endothelial cells (Wajant, 2009; Apostolaki et al., 2010). Moreover, TNF may also be an effector molecule for the apoptosis of tumor or infected cells by binding to death domains that signal apoptotic events (Screaton & Xu, 2000).

Previous studies have demonstrated that plants from the Euphorbia genus have biological activities that could be mediated by TNF-. A lectin extracted from Euphorbia milii latex induced leukocyte migration (Dias-Baruffi et al., 2000), and an active fraction of a Euphorbia peplus extract induced apoptosis in melanoma cells via TNF family receptor-dependent pathways (Gillespie et al., 2004). Neutrophils presented an increase in IL-4, IFN- and TNF- expression (TABLE 1). The increase of IL-4 expression by neutrophils, along with the increase of type 2 cytokine expression by CD8+ T lymphocytes, could modulate inflammatory responses. Type 2 cytokines inhibit the activation of inflammatory cells (Fiorentino et al., 1999). Monocytes did not contribute to the increase in cytokine production in either of the two profiles (TABLE 1).

Crude E. tirucalli latex extract is potentially useful in antitumor and antiviral treatments. Pre-clinical studies indicate that the plant has low toxicity in mice (Silva et al., 2007) and a good therapeutic index for antiviral activity (Betancur-Galvis et al., 2002). Our data suggest that the antitumor protection provided by E. tirucalli extract observed by Valadares et al., (2006) may be mediated by type 1 cytokine (TNF- and INF-) expression in neutrophils and lymphocytes, mainly CD4+ T lymphocytes. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Prof. Dr. Etel Vieira for contributing to the writing of this manuscript.

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FIGURE 1. Percentages of CD4+ T lymphocytes positive for TNF-, INF-, IL-4 and IL-10. CC control group, DMSO solvent control group, EUP E. tirucalli latexstimulated group.

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FIGURE 2. Percentages of CD8+ T lymphocytes positive for TNF-, INF-, IL-4 and IL-10. CC control group, DMSO solvent control group, EUP E. tirucalli latexstimulated group. Table 1: Percentages of neutrophils and monocytes and lymphocytes positive for TNF, INF-, IL-4 and IL-10.
Neutrophils TNF- + IFN- + IL-4+ IL-10+ TNF- + IL-4 + IL-10+ TNF- + IFN- + IL-4+ IL-10+ CC 0.05 0.02 0.16 0.05 2.26 1.18 0.17 0.16 28.75 20.20 4.27 2.40 4.16 2.83 1.05 2.39 0.45 0.31 0.56 0.27 1.72 1.79 DMSO 0.05 0.03 0.15 0.08 3.60 1.77 0.11 0.12 24.29 18,42 4.26 2.42 4.25 3.55 0.38 0.28 0.330.27 1.19 0.91a 1.80 1.53 EUP 0.24 0.28a,b 0.50 0.29a,b 7.18 3.02a,b 0.17 0.11 16.56 14.60 6.38 3.22 5.18 3.48 8.59 3.75a,b 5.16 2.08a,b 1.05 0.73 1.17 0.61

Monocytes

Lymphocytes

Data are presented as the mean SD for n= 20. CC control group, DMSO solvent control group, EUP E. tirucalli latex-stimulated group. Statistically significant differences are denoted by a for comparison with the CC group and by b for comparison with the DMSO group.