Desenvolvimento farmacutico e validao do mtodo analtico de uma suspenso contendo paracetamol

Ana Filipa Pinheiro Vilela Ferreira

Mestrado em Qumica Departamento de Qumica FCTUC
Setembro de 2010

Desenvolvimento farmacutico e validao do mtodo analtico de uma suspenso contendo paracetamol

Ana Filipa Pinheiro Vilela Ferreira

Dissertao apresentada para provas de Mestrado em Qumica, ramo de Controlo de Qualidade e Ambiente
Professor Doutor Jorge L. G. F. S. Costa Pereira Mestre Ricardo Filipe dos Reis Campante

Setembro de 2010 Universidade de Coimbra

ndice
Pg. 1. Introduo 1.1.Laboratrios Basi 2. Fundamentos tericos 2.1. Formas farmacuticas lquidas 2.2. Paracetamol 2.2.1. Caractersticas fsico-qumicas 2.2.2. Propriedades farmacolgicas 2.2.2.1. Indicaes teraputicas 2.2.2.2. Farmacocintica 2.2.2.3. Dosagem e administrao 2.3. Solubilidade 2.4. Mtodos instrumentais de anlise 2.4.1. Espectrofotometria de absoro no UV/vis 2.4.2. Cromatografia lquida de alta eficincia 2.5. Tratamento estatstico de dados 2.5.1. Desvio padro 2.5.2. Intervalo de confiana 2.5.3. Testes estatsticos 2.5.3.1. Teste de hipteses e significncia 2.5.3.2. Procedimento 2.5.4. Anlise de varincia 2.6. Validao de mtodos analticos 2.6.1. Especificidade e selectividade 2.6.2. Gama de trabalho 2.6.3. Linearidade 2.6.3.1. Preparao da curva de calibrao 2 2 6 6 7 9 11 11 12 13 14 16 17 17 19 19 20 22 22 23 25 26 29 31 31 31

ii

2.6.4. Limiares analticos 2.6.4.1. Limite de deciso 2.6.4.2. Limite de deteco 2.6.4.3. Limite de quantificao 2.6.5. Sensibilidade 2.6.6. Preciso 2.6.6.1. Repetibilidade 2.6.6.2. Preciso intermdia 2.6.6.3. Reprodutibilidade 2.6.7. Exactido 2.6.8. Robustez 2.6.9. Coerncia 2.6.10. Adequabilidade do sistema 2.6.11. Estabilidade das amostras 3. Seco experimental 3.1. Materiais e equipamento 3.1.1. Paracetamol 3.1.2. cido ctrico monohidratado 3.1.3. Citrato de sdio 3.1.4. Sacarose 3.1.5. Metilparabeno e Propilparabeno 3.1.6. Aroma de laranja 3.1.7. Tartrazina 3.1.8. Goma xantana 3.1.9. gua purificada 3.1.10. Medicamento de referncia 3.1.11. Reagentes 3.1.12. Fase mvel HPLC 3.1.12.1. Soluo aquosa de cido acttico 3.1.13. Soluo padro para o doseamento do

34 36 36 37 38 38 39 40 41 41 44 45 45 45 48 48 48 48 49 49 50 51 51 52 52 53 53 53 63

iii

paracetamol, metilparabeno e propilparabeno 3.1.13.1. Soluo padro me de paracetamol 3.1.13.2. Soluo padro me de metilparabeno 3.1.13.3. Soluo padro me de propilparabeno 3.1.13.4. Soluo padro a 100% 3.1.14. Soluo para ensaio de solubilidade 3.1.14.1. Soluo padro me de paracetamol 3.1.15. Equipamento 3.2. Mtodos 3.2.1. Quantificao espectrofotomtrica do paracetamol 3.2.2. Solubilidade do paracetamol 3.2.3. Doseamento por HPLC da substncia activa e conservantes 3.2.3.1. Condies de trabalho 3.2.3.2. Tratamento da amostra 3.2.4. Caracteristicas da suspenso de paracetamol 3.2.4.1. Descrio 3.2.4.2. Viscosidade 3.2.4.3. Densidade 3.2.4.4. pH 4. Resultados e Discusso 4.1. Quantificao espectrofotomtrica 4.2. Solubilidade 4.3. Medicamento de referncia 4.4. Suspenso contendo paracetamol 4.5. Validao do mtodo analtico 4.5.1 Especificidade 4.5.2. Linearidade e Gama de trabalho 4.5.3. Sensibilidade 4.5.4. Limiares analticos

54 54 54 54 54 55 55 56 56 56 57

57 58 58 60 61 61 61 62 64 64 66 67 67 68 68 70 76 76
iv

4.5.5. Preciso 4.5.5.1. Repetibilidade 4.5.5.2. Preciso intermdia 4.5.6. Exactido 4.5.7. Estabilidade das solues analticas 4.5.7.1. Estabilidade da soluo padro 4.5.7.2. Estabilidade da soluo amostra 5. Concluses 6. Bibliografia Anexos A.1. Cromatogramas correspondentes ao ensaio de especificidade.

77 77 78 85 89 89 94 101 105 108

108

Abreviaturas
ANOVA Anlise de varincia AINES Anti-inflamatrios no esteroides Abs Absorvncia CV Coeficiente de variao HR Humidade Relativa HPLC - Cromatografia Lquida de Alta Resoluo (do ingls High Performance Liquid Chromatography) ICH - Conferncia Internacional de Harmonizao (do ingls International Conference on Harmonisation) ISO - Organizao Internacional para a Padronizao (do ingls International Organization for Standardization) IUPAC - Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (do ingls International Union of Pure and Applied Chemistry) LQ Limite de quantificao LD Limite de deciso MRC Materiais de Referncia Certificados Mw Massa molar Ndf nmero de graus de liberdade OLS - Ordinary Least Squares P - Pureza RSD Desvio padro relativo R2 Coeficiente de determinao do ajuste linear TV Valor experimental USP - Farmacopeia dos Estados Unidos da Amrica (do ingls United States Pharmacopoeia) UV/VIS - Ultravioleta/Visvel WLS Weighted Least Square
vi

Xd Limite de deciso XLD Limite de deteco XLQ Limite de quantificao

vii

Resumo
O paracetamol o medicamento mais consumido e vendido em Portugal e no resto do mundo, para o tratamento da dor e da febre e facilmente adquirido nas farmcias. Actualmente, encontra-se no mercado vrias formas farmacuticas contendo paracetamol com eficcia clnica comprovada, como comprimidos, xaropes e

supositrios. O produto de referncia utilizado, que serviu de base este projecto foi o xarope Ben-U-ron , paracetamol a 40mg/ml, que se encontra comercializado em todo o mundo. Deste modo, com o presente trabalho pretendeu-se numa primeira fase caracterizar o produto de referncia de uma forma geral, e em particular determinar e estabelecer a formulao qualitativa e as especificaes tcnicas do produto acabado. A segunda fase do trabalho consistiu no desenvolvimento da formulao farmacutica contendo paracetamol, tendo como base a formulao qualitativa do produto referncia e especificaes do produto acabado e

posteriormente a validao do mtodo de anlise do produto acabado. Na validao foram avaliados os parmetros: especificidade, gama de trabalho, sensibilidade, limites analticos, preciso, exactido e estabilidade das amostras.

viii

Abstract
Paracetamol is one of the most popular and widely used drugs for treatment of pain and fever in Portugal and in world and is easily acquired in pharmacies. Currently, the market is more dosage forms containing acetaminophen with proven clinical efficacy, such as tablets, syrups and suppositories. The reference product used in this project ,was the syrup Ben-U-ron , paracetamol 40mg/ml, which is marketed worldwide. Thus, initially with this work the characterization of the reference product in a global way was attempted and in particular to determine and establish the design quality and technical specifications of the finished product. The second phase of work was the development of pharmaceutical formulation containing paracetamol, based on the formulation of the reference product quality and specifications of the finished product and further validation of the method of analysis of finished product. In the validation parameters were evaluated: specificity, working range, sensitivity, analytical limits, precision, accuracy and stability of the samples.

ix

Agradecimentos
Agradeo ao Professor Doutor Jorge L.G.F.S. Costa Pereira pela oportunidade de realizar este trabalho, por todos os

conhecimentos e orientao cientfica, pela sua disponibilidade, pela opinio e reviso crtica. Ao Mestre Ricardo Filipe dos Reis Campante, meu orientador externo, pela integrao no seu grupo de trabalho, simpatia, pacincia, compreenso, disponibilidade e por tudo que me ensinou. A todos os colegas de trabalho dos Laboratorios Basi gostaria de agradecer o apoio, a ajuda laboratorial, a compreenso, o companheirismo e a boa disposio que demonstraram,

proporcionando um bom ambiente de trabalho. Agradeo a todos os meus amigos por todo o seu apoio, carinho, pacincia durante estes anos, com perodos bons e outros menos bons e ainda aos meus colegas de curso que estiveram por perto na minha vida acadmica. Obrigada a toda a minha famlia, em especial minha me e ao meu irmo, pela pacincia, carinho, disponibilidade e apoio. Por ltimo o meu muito obrigada minha sobrinha por todas as brincadeiras, carinho e sorrisos e ao meu pai, o meu anjo da guarda.

Prefcio
Este trabalho encontra-se desenvolvido sob a forma de cinco captulos. No primeiro captulo procurou-se transmitir e resumir, sob a forma de uma perspectiva global o tema do trabalho e o objectivo do mesmo. No segundo captulo pretendeu-se abordar os fundamentos tericos essenciais para a execuo do mesmo enquanto no terceiro captulo apresenta-se a seco experimental onde se descreve os mtodos e materiais necessrios. No quarto captulo apresenta-se os resultados obtidos no decorrer do trabalho, bem como o seu tratamento estatstico e discusso dos mesmos. No ltimo captulo apresenta-se as concluses finais do trabalho realizado. Por uma questo de simplicidade prescindiu-se da utilizao da vrgula, como separador decimal dos nmeros reais, tendo recorrido, para este efeito, ao ponto decimal. Esta substituio permitiu transportar, de uma forma expedita, toda a informao numrica, computacional e grfica para o texto. Para facilitar a transferncia e permitir manter a coerncia dessa informao, optouse por representar os nmeros reais sob a forma exponencial com a notao utilizada nos programas de clculo onde, por exemplo, 3.201E-08 representa o valor 3.201 x 10-8 escrito correctamente no formato cientfico. Sempre que possvel e adequado, os valores estimados esto representados com a sua incerteza associada, respectivo erro padro, indicada entre parntesis, seguida das respectivas unidades, de forma a conferir maior significado estatstico aos resultados obtidos.

xi

1. Introduo _____________________

Captulo 1

Introduo

1. Introduo
O uso de analgsicos naturais, para alvio das dores remonta aos primrdios da histria (cerca de 3.000 a.C.) onde se recorria ao uso de plantas. Posteriormente, o rpido avano dos conhecimentos fitoqumicos levaram descoberta e ao desenvolvimento dos analgsicos. Um exemplo clssico foi a sntese do cido saliclico, em 1860, e dos compostos do grupo da pirazolona, representado pela antipirina, em 1883. A fenacetina foi sintetizada em 1886 e finalmente em 1890,
[1]

tem-se o desenvolvimento do paracetamol (acetaminofeno) .

Figura 1.1 Estrutura qumica da pirazolona.

Actualmente o paracetamol um dos frmacos mais utilizado a nvel global para o alvio das dores crnicas e um dos melhores analgsicos disponveis no mercado. Encontra-se disponvel em diversas formas farmacuticas com eficcia clnica aprovada, como o caso de comprimidos, supositrios e xaropes. Desta forma, o objectivo deste trabalho, foi numa primeira fase caracterizar o produto de referncia (Ben-u-ron, paracetamol a 40mg/ml, xarope) de uma forma geral e numa segunda fase foi o desenvolvimento de uma formulao contendo paracetamol tendo como base a formulao qualitativa do medicamento de referncia e especificaes do produto acabado e validao do seu mtodo de
2

Captulo 1

Introduo

anlise. O projecto foi desenvolvido nas instalaes da BasiLaboratrios de indstria farmacutica em Coimbra.

1.1. Laboratrios BASI

Os Laboratrios BASI, S.A. (seguidamente designado por Basi) encontram-se sediados em Coimbra na Rua do Padro n 98 e actualmente so um dos mais antigos Laboratrios da Indstria Farmacutica Portuguesa. Desde a sua fundao, em 1956, consolidaram a sua presena no mercado nacional, e ao longo das ltimas dcadas em pases de lngua oficial Portuguesa. reconhecida como uma empresa de referncia no seu sector que conta com uma histria de mais de 50 anos, erigida sobre uma enorme diversidade de acontecimentos, experincia e aprendizagens. Em 2007 e com a aquisio de 98% do capital da companhia pelo novo accionista, promovida uma profunda reestruturao organizativa e a requalificao de toda a unidade fabril, sendo tambm definida uma nova orientao estratgica de acordo com as Boas Prticas de Fabrico. A misso dos laboratrios Basi fornecer s pessoas solues teraputicas ajustadas s suas necessidades, ao melhor preo possvel e com a garantia de excelncia de dcadas de actividade. Para tal, tm implementado um sistema de gesto de qualidade conforme as normas UNI EN ISO 9001 que permite uma contnua melhoria de processos, garantia de bons servios e resposta s exigncias da populao. Este sistema de gesto de qualidade diariamente acompanhado pelo Responsvel de Gesto da Qualidade (GQ) do Departamento de Garantia da Qualidade.
3

Captulo 1

Introduo

O portflio dos laboratrios Basi conta com produtos ticos, medicamentos no sujeitos a receita mdica, dermocosmticos e suplementos alimentares dedicando-se produo de medicamentos slidos, semi-slidos e lquidos no estreis, nomeadamente, supositrios, alimentares. Os laboratrios BASI mantm actualmente uma relao de parceria estratgica com as empresas e FHC Farmacutica, Phagecon xaropes, pomadas, cremes, gis e suplemento

Overpharma

(Produtos

Mdicos

Farmacuticos),

(Consultoria e Servios Farmacuticos) e ainda com a Organizao PharmaPortugal.

2. Fundamentos tericos ______________________

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.Fundamentos tericos
2.1. Formas farmacuticas lquidas
Segundo o Decreto-Lei n. 176/2006, de 30 de Agosto, o estatuto de medicamento, forma farmacutica o estado final que as substncias activas ou excipientes apresentam depois de submetidas s operaes farmacuticas necessrias, a fim de facilitar a sua administrao e obter o maior efeito teraputico desejado [2]. A classificao das formas farmacuticas pode ser realizada utilizando vrios critrios, como a sua aco teraputica, o tipo de administrao, estado fsico, mtodo de fabrico e o modo de libertao dos constituintes. As suspenses so sistemas heterogneos em que a fase externa ou contnua (fase dispersante) lquida ou semi-slida e a fase interna ou dispersa constituda por partculas slidas insolveis no meio utilizado. Com o repouso e a aco da gravidade as partculas sedimentam, o que implica a agitao da embalagem antes do uso. As suspenses podem ser usadas para uso oral, aplicao tpica na pele, aplicao nas mucosas e administrao parenteral mas no podem ser usadas na via sangunea, pelo perigo de formao de mbolos. O uso de suspenses justifica-se devido insolubilidade dos frmacos nos veculos habitualmente usados, o mau sabor que os compostos podem apresentar em soluo ou em p e para prolongar a aco do princpio activo.

Captulo 2

Fundamentos tericos

Uma suspenso representa um sistema termodinamicamente instvel. As partculas dispersas na grande superfcie e energia livre tendem a agrupar-se para que a rea inicial seja reduzida, como tambm o seu nvel energtico. Assim numa suspenso lquida vai haver tendncia para que as partculas slidas se unam umas s outras, o que poder gerar agregados mais firmes que sedimentam e que no so susceptveis de serem novamente suspensos. Do ponto de vista farmacutico interessa obter suspenses que no depositem rapidamente, que possam reconstituir facilmente com agitao, que o produto apresente aspecto homogneo durante o maior perodo de tempo possvel e que durante o seu armazenamento no se verifique aparecimento de cristais.

2.2. Paracetamol
O paracetamol ou acetaminofeno apresenta-se como o frmaco mais verstil e mais usado no tratamento da febre (antipirtico) e da dor (analgsico) em diversos pacientes incluindo crianas, mulheres grvidas e idosos.
[3]

um

frmaco

com

propriedades analgsicas e antipirticas, mas sem propriedades antiinflamatrias clinicamente provadas . Quando administrado nas doses recomendadas apresenta um excelente perfil de segurana [4,5]. A origem das palavras acetaminofeno e paracetamol deriva da nomenclatura usada em qumica orgnica N-acetil-para-aminofenol e para-acetilaminofenol. A IUPAC recomenda, desde 1993, o nome sistemtico N-(4-hidroxifenil)acetamida. Nos tempos primrdios da histria e durante o perodo medieval utilizavam-se analgsicos naturais para o alvio das dores, recorrendo para tal ao uso de plantas na sua preparao. Os

Captulo 2

Fundamentos tericos

antipirticos naturais conhecidos eram os compostos presentes na casca do salgueiro-branco e outros compostos contidos na casca da quina. A cortia da quina era utilizada para a obteno de quinino, composto que apresenta actividade antimalria e antipirtica. Em 1880 a quina comeou a escassear, sendo necessrio procurar alternativas, e assim dois compostos antipirticos foram

desenvolvidos, em 1886 a acetanilida e em 1887 a fenacetina, ambas com a vantagem de apresentarem propriedades analgsicas e antipirticas ao contrrio dos produtos naturais que at a eram usados. Nesta altura j o paracetamol tinha sido sintetizado (1873) por Harmon Northrop Morse, atravs da reduo do p-nitrofenol com o estanho em cido actico glacial, embora no tenha sido utilizado para fins medicinais durante dcadas. Em 1893, este composto foi encontrado na urina dos indivduos que tinham tomado fenacetina que depois de isolado foi descrito como um composto branco, cristalino e de sabor amargo. Em 1899 foi identificado como sendo um metabolito da acetanilida, mas estas descobertas foram ignoradas durante algum tempo. O Instituto para o Estudo de Drogas Analgsicas e Sedativas, em 1946, atribuiu um subsdio ao Departamento de Sade de Nova Iorque, para o estudo de problemas associados ao uso de analgsicos e Bernarde Brodie e Julius Axelrod foram nomeados para investigar a origem pela qual compostos diferentes da aspirina estavam associados ao desenvolvimento de metahemoglobinmia (converso excessiva da hemoglobina em metahemoglobina, que incapaz de transportar oxignio). Em 1948, ambos os investigadores relacionaram o uso da acetanilida e fenacetina com a metahemoglobinmia e deduziram que o seu efeito analgsico era devido ao seu metabolito maioritrio, o paracetamol. Assim propuseram o seu uso como analgsico, uma vez que no apresentava os efeitos txicos da acetanilida [6].

Captulo 2 Na dcada de 50, devido ao

Fundamentos tericos
trabalho destes dois

investigadores, houve a introduo de paracetamol no mercado. Em 1955 pelos laboratrios McNeil sob o nome registado Tylenol (elixir das crianas), em 1956 no Reino Unido, comprimidos de 500 mg de paracetamol com o nome Panadol , produzido pela Frederick Stearns & Co. e em Junho de 1958 iniciou-se a comercializao de xarope, uma nova forma de apresentao, Elixir Panadol , destinado s crianas. Em 1963, o paracetamol foi adicionado Farmacopeia Britnica e a partir desta data, o seu uso vulgarizou-se [6]. Actualmente o paracetamol um dos analgsicos mais utilizados por ser seguro e no interagir com a maioria dos medicamentos. farmacuticas Encontra-se como disponvel em diferentes gotas, formas xaropes,

cpsulas,

comprimidos,

supositrios e injectveis. Em Portugal encontra-se disponvel com o nome comercial Ben-U-Ron, Panadol e Supofen entre outros e segundo o Infarmed (Autoridade Nacional do Medicamento) o paracetamol, o medicamento no sujeito a receita mdica mais vendido em Portugal.

2.2.1.Caractersticas fsico-qumicas
O paracetamol quimicamente designado por N-(4hidroxifenil)acetamida ou 4-Hidroxiacetanilida, tem como frmula molecular C8H9NO2 e massa molar correspondente 151.2 g/mol, a sua estrutura encontra-se representada na Figura 2.1[7] .

Figura 2.1 - Estrutura qumica do paracetamol (N-(4-Hidroxifenil)acetamida). 9

Captulo 2

Fundamentos tericos

O paracetamol apresenta-se como um p cristalino branco, com um ligeiro sabor amargo e inodoro e ponto de fuso entre 169170.50C sendo quimicamente estvel a 2000C
[8]

. O paracetamol

solvel em 1:70 partes de gua (temperatura ambiente) e em 1:20 partes de gua em ebulio. No entanto, encontra-se igualmente descrito na bibliografia que a solubilidade aquosa do paracetamol de 14.7mg/ml (20C), 14.3 mg/ml (25C) e 23.7 mg/ml (37C)
[9,10]

solvel em etanol, metanol, soluo de hidrxido de sdio 1N, dimetilformamida, dicloroetano, acetato de etilo e acetona. ligeiramente solvel em diclorometano e ter e praticamente insolvel em pentano e benzeno [7,11]. A molcula de paracetamol caracteriza-se por apresentar um pKa de 9.51 a 25C e um coeficiente de partilha Log P (octanol/gua) de 0.5 [11]. Foram isoladas e caracterizadas 3 formas metastveis de paracetamol. O acetaminofeno ortorrmbico (forma II), adequado para compresso directa e pode ser ligeiramente mais solvel, contudo tem sido cristalizado apenas em pequenas quantidades. A nica forma comercialmente (forma I), disponvel por o acetaminofeno ser a forma

monoclnico

caracterizado

termodinamicamente mais estvel [4,5,10,12]. Numa soluo aquosa saturada o pH do paracetamol encontrase entre 5.5 e 6.5. A soluo aquosa saturada estvel, durante vinte anos, embora a sua estabilidade v diminuindo em condies cidas ou alcalinas, uma vez que o paracetamol vai sendo lentamente transformado em cido actico e p-aminofenol
[6]

. Sob condies de

alta temperatura e pH, o paracetamol sofre hidrlise originado o 4aminofenol e cido actico como produtos de degradao [3]. No que respeita estabilidade o acetaminofeno deve ser armazenado em recipientes fechados de forma hermtica, para que
10

Captulo 2

Fundamentos tericos

desta forma se encontre protegido da luz, calor e humidade. No estado puro, estvel a temperaturas inferiores a 45C [7]. A determinao do paracetamol em produtos farmacuticos, quer isolado ou em combinaes, de grande importncia sendo, para tal, propostos diversos mtodos analticos para a sua quantificao, como, espectroscopia de fluorescncia, colorimetria, absoro Ultravioleta-Visivel (UV-Vis), voltametria, sistemas de injeco em fluxo com deteco colorimtrica, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, anlise electroqumica, espectrometria de massa, cromatografia gasosa, electroforese capilar, cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) entre outros
[3,13]

Contudo a Farmocopeia Americana (USP) sugere para anlise do paracetamol em p, o mtodo de espectrofotometria de absoro UV/vis e para todas as outras preparaes HPLC. A Farmacopeia Britnica apresenta vrios procedimentos analticos para o

doseamento do paracetamol quer em p ou noutras formas farmacuticas como a titulao com sulfato
[14]

de

crio,

espectrofotometria de absoro UV/vis e HPLC

2.2.2. Propriedades farmacolgicas

Dentro das propriedades farmacolgicas mais relevantes ao nvel da indstria farmacutica enquadram-se a farmacocintica e as respectivas indicaes farmacuticas, que resultam do estudo do desempenho in vitro e/ou in vivo da respectiva formulao. 2.2.2.1. Indicaes teraputicas O paracetamol o medicamento anti-inflamatrio no

esterode (AINES) mais usado para no tratamento da dor e no alvio da febre em todo o mundo, ocupando desta forma, uma posio nica dentro dos medicamentos analgsicos [3]. Ele indicado no tratamento
11

Captulo 2

Fundamentos tericos

sintomtico de situaes clnicas que requerem um analgsico e/ou antipirtico, infecciosas, como, sndromes gripais, da ou outras vacinao, hipertermias cefaleias,

reaces

hipergnicas

enxaquecas, dores de dentes, ouvidos, menstruais, traumticas, musculares e articulares e como analgsico antes e aps intervenes cirrgicas. A maior vantagem do paracetamol no apresentar efeitos secundrios graves, sendo muito bem tolerado quando administrado nas doses teraputicas recomendadas. Embora o paracetamol seja usado clinicamente mais de um sculo, o seu modo de aco tem sido um mistrio. Como o paracetamol apresenta efeito analgsico e antipirtico e no apresenta actividade anti-inflamatria, durante muito tempo se pensou que a sua aco analgsica fosse atribuda inibio da sntese da prostaglandina (composto relacionado com os processos febris e da dor) no sistema nervoso central receptores canabinides CB1 [14].
[15]

mas recentemente foi descoberto

que o seu efeito analgsico devido activao indirecta dos

2.2.2.2. Farmacocintica
Para que um medicamento actue necessrio que atinja concentraes eficazes no seu local de aco, que, geralmente longe do ponto de aplicao do frmaco, ou seja, o frmaco tem de ser absorvido e distribudo pelo sangue dos tecidos onde vai actuar. Entretanto, vai sendo metabolizado e eliminado. absoro, distribuio, metabolizao e eliminao dos frmacos denomina-se farmacocintica. Para que um frmaco tenha efeito teraputico, deve possuir caractersticas farmacocinticas adequadas. Aps administrao oral, a absoro do paracetamol rpida e completa. Esta essencialmente realizada atravs do tracto gastrointestinal, atingindo, aps 10 a 60 minutos, concentraes plasmticas mximas, dependendo das suas formulaes. O
12

Captulo 2

Fundamentos tericos

metabolismo do paracetamol ocorre essencialmente por trs vias: conjugao com cido glucurnico, conjugao com o io sulfonato ou via citocromo P450 (complexo enzimtico localizado maioritariamente a nvel heptico, responsvel pela metabolizao de muitos medicamentos). As duas primeiras vias so responsveis por cerca de 90% do metabolismo e a terceira via por cerca de 5%. Os metabolitos farmacologicamente inactivados so excretados via renal sendo apenas excretados 4% inalterados. Pequenas quantidades de metabolitos txicos so produzidas o p-aminofenol (via N-hidroxilao) e N-acetil-p-benzoquinomina [16]. Os efeitos hepatotxicos1 do paracetamol so causados por um metabolito alquilado menor, a imina N-acetil-p-benzoquinona (NAPQI) que resulta da aco das duas isoenzimas do citocromo P450 no fgado e no rim
[17]

. A quantidade de imina N-acetil-p-

benzoquinona produzida depois de uma dose normal de paracetamol vai ser completamente eliminada pelos rins aps conjugao com a glutationa. Quando ocorre sobredosagem as vias de glucuronidao e sulfunao ficam saturadas, podendo originar danos hepticos [5]. A semi-vida de eliminao2 do paracetamol varia entre uma a trs horas. Geralmente dentro de vinte e quatro horas a sua excreo completa. A semi-vida do paracetamol prolongada quando existe insuficincia heptica ou renal, em caso de sobredosagem e em recm-nascidos. O efeito mximo e a durao de aco mdia deste composto esto em parte relacionados com a concentrao plasmtica [18].

2.2.2.3. Dosagem e administrao

O paracetamol deve ser administrado tendo em conta o peso corporal e idade do doente e a situao clnica para que pretendido.
1 2

Substncias que so txicas para o fgado. Tempo necessrio para eliminar metade da concentrao da substncia activa.

13

Captulo 2

Fundamentos tericos

A dose nica recomendada 10-15 mg de paracetamol por kg de peso corporal e a dose diria total 50mg/kg de peso corporal. A administrao pode ser repetida em intervalos de quatro a oito horas, ou seja, trs a quatro doses nicas dirias. Por exemplo, num adulto a dose mxima diria recomendada 4000mg de paracetamol e numa criana at 12 anos 2000mg. Em indivduos com insuficincia heptica ou renal ou com a doena de Gilbert a dose de paracetamol deve ser reduzida ou administrada em intervalos mais alargados [19].

Os comprimidos podem ser tomados inteiros ou desfeitos na gua e deve-se ter em conta que a sua administrao aps as refeies pode retardar o seu efeito. Os xaropes so medicamentos prontos a usar e podem ser tomados com as refeies, a administrao de alimentos no demonstrou ter qualquer influncia sobre o efeito do medicamento [19].

2.3. Solubilidade
A determinao da solubilidade de um novo frmaco em meio aquoso de extrema importncia, pois o slido deve dissolver-se nos fluidos aquosos do tracto gastrointestinal para que possa ocorrer absoro deste. importante conhecer a solubilidade dos frmacos em toda a gama de pHs fisiolgicos, normalmente limitada entre pH 1 e 8 j que a velocidade de dissoluo dos frmacos a nvel do tracto gastrointestinal pode tambm influenciar a velocidade e extenso da absoro [20]. Dado que a velocidade de dissoluo de um frmaco depende da sua solubilidade no meio em causa, esta influencia a absoro,
14

Captulo 2

Fundamentos tericos

principalmente quando o soluto pouco solvel. Contudo, este pressuposto no pode ser aplicado de modo indiscriminado, uma vez que se deve considerar tambm a dose de frmaco a administrar e a sua estabilidade ao nvel do fluido gastrointestinal. Deste modo, em alguns casos, se a solubilidade de um frmaco for inferior concentrao necessria para a dose recomendada, deve recorrer-se a tcnicas para melhorar a sua solubilidade [20]. A determinao da solubilidade de um frmaco pode ser realizada atravs de diversos mtodos consoante se quer um resultado quantitativo ou semi-quantitativo, ou consoante a quantidade de frmaco disponvel para o ensaio. Uma determinao semi-quantitativa da solubilidade pode ser efectuada adicionando pequenas pores de soluto a um volume fixo de solvente, seguido de forte agitao e examinao visual de partculas no dissolvidas. Quando uma parte fica por dissolver, a quantidade de soluto adicionada at quele ponto serve como um indicador da solubilidade. Outra tcnica consiste em colocar um excesso de soluto num solvente, sob agitao, sendo retiradas e filtradas amostras a intervalos de tempo regulares. A concentrao vai ser determinada por mtodo apropriado. A amostragem continua at se obter dois valores consecutivos semelhantes tidos como o valor da solubilidade. No entanto, quando j existe na literatura informao acerca da solubilidade do frmaco que se pretende estudar, pode recorrer-se a tcnicas menos laboriosas. Uma delas consiste em colocar excesso de frmaco (de acordo com a informao bibliogrfica) em volume fixo de solvente. A metodologia utilizada consiste habitualmente em agitao durante sete dias (normalmente vinte e quatro horas so
[21]

, que sero, ento,

15

Captulo 2

Fundamentos tericos

suficientes para atingir o valor de solubilidade), seguida de repouso por doze horas3. Normalmente, considera-se que se um composto apresenta solubilidade aquosa superior a 1% (massa/volume) provavelmente no vai apresentar problemas de absoro relacionados com a dissoluo [21]. A determinao da solubilidade ento um ensaio importante que pode ajudar a nvel da formulao e na determinao das condies de armazenamento do frmaco.

2.4. Mtodos instrumentais de anlise

Os mtodos analticos tem uma vasta aplicao e importncia na nossa sociedade, pois especificidade, diagnosticar com e eles possvel processos, verificar a garantir a

controlar

qualidade de bens produzidos ao nvel industrial e na prestao de servios, diagnosticar e rastrear anomalias, identificar causas e responder a diversos fenmenos. Um mtodo analtico um conjunto de procedimentos que envolvem tcnicas laboratoriais, criteriosamente desenvolvidos,

planeados e sistematizados, visando quantificar com rigor um determinado analito numa determinada matriz a um certo nvel de concentrao. Para cumprir tal objectivo, o mtodo tem que apresentar certos requisitos como ser fivel, acessvel e adequado ao analito na matriz ao nvel de concentrao pretendida. No presente trabalho destacam-se dois mtodos, a

espectrofotometria de absoro no ultravioleta e visvel (que usado no estudo de solubilidade do paracetamol) e cromatografia lquida de
3 A solubilidade determinada aps filtrao das solues seguida de diluio conveniente e quantificao por mtodo mais apropriado.

16

Captulo 2

Fundamentos tericos

alta eficincia (HPLC usado no doseamento do princpio activo e conservantes da formulao em estudo).

2.4.1. Espectrofotometria de absoro no ultravioleta e visvel

A espectrofotometria no ultravioleta e visvel um dos mtodos analticos mais usados em determinaes analticas em diversas reas. aplicada para determinaes de compostos orgnicos e inorgnicos, como, por exemplo, no doseamento e identificao do princpio activo em frmacos. A absoro na regio visvel e ultravioleta depende do nmero e do arranjo dos electres nas molculas ou dos ies absorventes. Como consequncia, o pico de absoro pode ser correlacionado com o tipo de ligao que existe na espcie que est a ser estudada. O aspecto mais importante no clculo quntico a

determinao da quantidade da luz absorvida pela amostra, que est baseada na medida de transmitncia (T) ou absorvncia (A). Esta medida descrita pela lei de Beer- Lambert (equao 2.1), que d a relao entre a intensidade da luz monocromtica incidente na soluo (I0) e a intensidade da luz monocromtica transmitida (I).

A = cb = log

10

I0 I

(2.1)

Sendo c a concentrao do analito (moles por litro, M), b o percurso ptico (expresso em centmetros, cm) e o valor da absortividade molar do analito (expresso em M-1cm-1).

2.4.2. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

A separao de substncias pode ser realizada por diversos mtodos que se baseiam nas suas diferentes propriedades fsicoqumicas. um mtodo fsico-qumico de resoluo de componentes
17

Captulo 2

Fundamentos tericos

de misturas que depende da diferena entre o comportamento dos analitos entre a fase mvel e a fase estacionria. A interaco dos componentes da mistura com as duas fases influenciada por diferentes foras intermoleculares, incluindo inica, bipolar, apolar, e efeitos de afinidade e solubilidade especficos. A cromatografia um poderoso mtodo de separao com aplicao em todos os ramos da cincia que abrange um diversificado e importante conjunto de mtodos que possibilitam a separao de componentes muito semelhantes de misturas complexas que com outros mtodos seria impossvel. Foi inventada e denominada pelo botnico russo Mikhail Twett no incio do sculo XX. Nas separaes cromatogrficas, a amostra transportada por uma fase mvel, que pode ser um gs, um lquido ou um fluido super crtico. Esta obrigada a passar atravs de uma fase estacionria imiscvel fixa, colocada na coluna ou superfcie slida. Na escolha das duas fases, o objectivo que as mesmas permitam que os componentes da amostra se distribuam em ambas com diferentes graus, garantindo, deste modo, a separao das substncias. A separao ocorre em forma de bandas ou zonas discretas que podem ser analisadas qualitativamente e/ou quantitativamente. Um equipamento de HPLC constitudo por um sistema de bomba, um injector, uma coluna cromatogrfica (eventualmente termostatada), um detector e um sistema de obteno de dados (um integrador ou um registador). A fase mvel que sai de um ou vrios reservatrios, circula atravs da coluna, em geral, a fluxo constante, chegando em seguida ao detector. Quando um detector que responde concentrao do soluto for colocado no fim da coluna e o seu sinal for representado num grfico em funo do tempo (ou do volume de fase mvel adicionada), obtm-se uma srie de sinais. Este grfico designa-se cromatograma e fornece informaes teis para anlise qualitativa e quantitativa. As
18

Captulo 2

Fundamentos tericos

posies dos sinais no eixo do tempo podem identificar os componentes da amostra. As reas sob os sinais do uma medida quantitativa de cada componente da amostra (por comparao da altura ou da rea do pico obtido com o analito com a de um ou mais padres)4. A cromatografia lquida de alta eficincia bastante aplicada, na indstria, nomeadamente na farmacutica, e em investigao devido sua sensibilidade (desde 10-6 ppm), fcil adaptao para determinaes quantitativas acuradas, adequabilidade separao de espcies no-volteis ou termicamente frgeis e, principalmente, sua ampla aplicabilidade a uma vasta gama de substncias.

2.5. Tratamento estatstico de dados

A estatstica uma ferramenta fundamental na anlise qualitativa e quantitativa de um analito numa certa matriz. As medidas so inerentemente variadas
[25]

, isto , os dados analticos obtidos

apresentam variaes em torno de um valor central, regra geral, mais frequente. No entanto, a distribuio normal dos dados pode ser assumida na grande maioria dos resultados de anlise fsico-qumica.

2.5.1. Desvio padro

O desvio padro um importante parmetro para descrever a largura da distribuio normal, isto , o grau de disperso dos dados. Este parmetro corresponde distncia horizontal entre o vrtice e o

Idealmente, um cromatograma apresenta-se como uma sequncia de picos gaussianos sobre

uma linha da base.

19

Captulo 2

Fundamentos tericos

ponto da inflexo da curva Gaussiana. O desvio padro (x) traduz-se pela equao 2.2.

N i

( xi x ) 2 N

(2.2)

onde x um estimador da disperso da distribuio, N o nmero de observaes, xi valor obtido e x valor mdio obtido.

Quando a dimenso da amostra pequena (N <30) o desvio padro apresenta tendencialmente valores por defeito, como tal deve ser efectuada uma correco atendendo ao nmero de graus de liberdade da amostra. Esta correco feita atravs da estimativa do desvio padro (sx), determinado pela equao 2.3.

sx =

N i

( xi x ) 2 N 1

(2.3)

Na indstria farmacutica as sries de dados geralmente disponveis, so pequenas e variam pouco extensamente dentro da escala terica possvel da populao inteira e quanto menor for o nmero de dados, mais elevada a variabilidade do desvio padro calculado. Quanto mais dados so usados para calcular o desvio padro, mais a distribuio se torna mais estreita e simtrica. Geralmente, a variabilidade analtica exposta como um desvio padro relativo (RSD) ou Coeficiente de variao (CV, %), isto , o desvio padro dividido pela mdia respectiva. Esta normalizao permite uma comparao directa das precises.

2.5.2. Intervalo de confiana

Na ausncia de erro sistemtico e assumindo que as estimativas efectuadas so no-tendenciosas, espera-se que os valores obtidos no mtodo de anlise se encontrem prximos do valor
20

Captulo 2

Fundamentos tericos

correcto contudo, este nunca poder ser um valor exacto devido contribuio do erro aleatrio. As estimativas podem ser: a) Pontuais - expressa atravs de um nico valor numrico; b) Por intervalos - estimativa dada por um conjunto de dois valores limites no qual o parmetro estimado tem grande probabilidade de estar localizado.

Contudo, devido essencialmente a erros de quantificao como tambm falta de homogeneidade /representatividade da amostra no faz sentido exprimir a estimativa atravs de uma valor pontual mas sim atravs de um intervalo de confiana que abranja, com certo grau de confiana, o verdadeiro valor esperado. Na ausncia de erro sistemtico, a amostragem de uma determinada populao normal (x~N[,2]) conduz estimativa

x ~ N [x, s2]
Para exprimir os resultados teramos de indicar a gama de valores que cobre o grosso da distribuio por exemplo os percentis P0.025 e P0.975 (percentis entre 0.025 e 0.975) permitem definir o intervalo de confiana central dos valores da distribuio ao nvel de 95%. Caso a disperso seja expressa pelo desvio padro (s), o resultado tambm pode ser expresso em termos de uma estimativa central e o respectivo intervalo de confiana onde se localizam os valores de populao inicial dado por:

E [ x ] ~ x zc sx
Onde o multiplicador zc exprime um factor de cobertura da distribuio identificada e que permite associar uma certa probabilidade de encontrar o valor central da populao original () dentro desse intervalo de cobertura.
21

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.5.3. Testes estatsticos

Os testes estatsticos so baseados nos conceitos estatsticos referidos anteriormente. O procedimento geral para execut-los descrito em seguida.

2.5.3.1. Teste de hipteses e de significncia

Devido ao pequeno nmero de dados normalmente usados em anlise farmacutica, intervalos de confiana largos podem

obscurecer diferenas inaceitveis. Por outro lado, devido a pequenas anomalias que ocorrem por vezes, nas sries analticas, as diferenas so identificadas como significantes, o que no apresenta qualquer relevncia prtica. A componente aleatria intrinsecamente envolvida implica sempre a possibilidade de se cometer um erro de juzo. Atendendo forma como estes se desviam em relao ao valor tomado como correcto, os erros estatsticos podem ser classificados em erros por excesso e erros por defeito. Os erros por excesso correspondem a uma falsa rejeio erro do tipo I ( ) a hiptese nula estava correcta e foi abusivamente rejeitada por ter sido considerada falsa. Os erros por defeito referem-se a uma falsa aceitao erro do tipo II () a hiptese nula estava errada e foi abusivamente aceite como verdadeira.

O nvel de significncia de teste, designada por , (frequentemente expresso sob a forma percentual 100%.)

corresponde probabilidade mxima com que se pretende proceder rejeio abusiva (erro tipo I). A probabilidade de aceitao de hiptese correcta designa se de nvel de confiana e corresponde probabilidade de (1-) (em termos percentuais 100 (1-)%).
22

Captulo 2

Fundamentos tericos

Na formulao de hipteses estatsticas, a hiptese nula (H0) vai no sentido de no haver diferena significativa, isto , de pertencer ao grosso da distribuio tambm designado de (1 ); a hiptese alternativa (H1) encontra-se direccionada para a diferena significativa (), o complemento da hiptese nula.

2.5.3.2. Procedimento
Os testes estatsticos constituem uma ferramenta para, com critrios estatsticos, auxiliar na tomada de decises na interpretao de resultados. Cada teste estatstico depende do nvel de confiana para o qual as concluses so desejadas assim como do nmero de graus de liberdade para essas circunstncias. Os testes estatsticos devem ser efectuados com base num procedimento lgico que passa pelos seguintes passos: 1. Formulao do problema: Deve-se realizar uma anlise do evento de forma a racionalizar a questo e poder testar. 2. Escolha do teste: O teste escolhido de acordo com o objectivo pretendido, ou seja, com base na distribuio estatstica que melhor se adequa5. 3. Nvel de significncia: Nvel com o qual se pretende obter concluses. Deve ser estabelecido previamente previso do erro mximo admissvel para se tirar concluses erradas por rejeio abusiva (). Regra geral o nvel de significncia refere-se a = 0.05 podendo tambm ser reduzido para = 0.01 para serem tiradas concluses mais definitivas. 4. Hipteses de trabalho: As hipteses devem ser

complementares e de forma a abranger o universo do

5 As distribuies estatsticas mais comuns para efectuar testes estatsticos so a normal, t student, F-Fisher e qui-quadrado.

23

Captulo 2

Fundamentos tericos
evento. A hiptese nula (H0) deve ser formulada no sentido de no haver diferena (est tudo correcto, dentro do IC da estimativa, (1- )). A hiptese alternativa (H1) incide sobre a diferena significativa (no est conforme, fora do IC da estimativa ()).

5. Simetria do teste: Esta depende do modo como as hipteses foram formuladas. Se o que se pretende um teste de desigualdade (superior a ou inferior a), apenas se est interessado em considerar um extremo da distribuio como referencia e por isso o teste estatstico tem uma simetria unilateral. Pelo contrrio, se o que se pretende um teste de igualdade, ou seja, comparar a parte central da distribuio com determinada estimativa, agora o teste estatstico apresenta uma simetria bilateral. 6. Clculo do teste: Calcula-se com base na expresso da distribuio estatstica correspondente. 7. Comparao com valores crticos (Xcrit): Os valores crticos esto tabelados de acordo com o nvel de significncia e com o nmero de graus de liberdade. Estes valores permitem definir as regies de aceitao e de rejeio das hipteses formuladas. 8. Concluso: No caso do valor experimental ultrapassar os limites tabelados (regio de rejeio) diz-se que, ao nvel de confiana 100 (1-) % h diferena significativa e a hiptese nula deve ser rejeitada em detrimento da hiptese alternativa; caso contrrio, no existe evidncia estatstica para rejeitar a hiptese nula. Os testes estatsticos podem ser efectuados a diferentes nveis de significncia. As normas ISO recomendam testes de significncia aos nveis de 5% (=0.05, probabilidade de efectuar 1 insucesso em

24

Captulo 2

Fundamentos tericos
cada 20 decises) e 1% (=0.01, probabilidade de taxa de insucesso de 1/100).

2.5.4. Anlise de varincia

A anlise de varincia (ANOVA)6 uma ferramenta que permite distinguir dentro da variabilidade total de diversos conjuntos de valores experimentais as contribuies puramente aleatrias e a contribuio sistemtica entre amostras. Ou seja, permite verificar se as amostras exercem um efeito significativo fazendo com que estes se sobreponham componente aleatria contribuindo para diferenas significativas entre si. Se o factor em estudo (factor A) no influi de modo significativo, ambas as disperses so estimativas da varincia da componente aleatria. J se o factor influi de modo significativo, a disperso devida ao factor A (sA) torna-se maior que a componente puramente aleatria (s0). A comparao das disperses conseguida atravs do teste F (equao 2.4)
2 sA F = 2 F 0 . 05 ( n 1 , n ( m 1 )) s0

(2.4)

onde n e m representam o nmero de nveis de factor e o nmero de rplicas em cada nvel, respectivamente. Caso o valor do teste calculado no exceda o respectivo valor crtico previsto para o nvel de confiana de 95%, a hiptese nula pode ser assumida como verdadeira. Se este valor ultrapassar o valor crtico ao nvel de confiana de 95% mas no exceder o valor crtico para o nvel de confiana de 99% a hiptese nula dbia. Caso o valor exceda o respectivo valor crtico previsto para o nvel de confiana de 99% a hiptese nula rejeitada e a hiptese um aceite.
6

A sigla ANOVA provm do ingls, Analysis Of Variance.

25

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.5. Validao de mtodos analticos

Actualmente, pretende-se que todos os caminhos levem busca da qualidade total, tornando-se desta forma, indispensvel conhecer perfeitamente cada fase de um processo produtivo. Neste caso, a validao de um mtodo analtico uma ferramenta adequada que verifica a garantia de qualidade operacional e o desempenho analtico. Atravs deste processo pode-se demonstrar que o mtodo analtico em causa adequado para a anlise de um determinado analito numa certa matriz a um determinado nvel de concentrao, levando a resultados fiveis, com boa exactido e preciso, pois o objectivo da validao demonstrar que o mtodo adequado para o fim pretendido [22]. Na indstria farmacutica, a fiabilidade dos resultados analticos so cruciais para garantir a qualidade, a segurana e a eficcia dos frmacos. Por este motivo, exigncias reguladoras foram publicadas por muitos anos. A Conferncia Internacional sobre a Harmonizao (ICH) de exigncias tcnicas para o registo dos frmacos para o uso humano foi iniciado em 1990, como um frum para um dilogo construtivo entre autoridades reguladoras e indstria, a fim de harmonizar as exigncias da submisso para frmacos novos entre a Europa, os Estados Unidos da Amrica e Japo. Um dos primeiros tpicos dentro da seco da qualidade foi a validao analtica e a ICH foi muito til nos termos da harmonizao e nas definies [22] assim como na determinao das exigncias bsicas [23]. A validao embora possa ser uma actividade algo complexa e exigente, necessria, pois as consequncias de um mtodo no validado traduzem-se num desperdcio de tempo, dinheiro e recursos,

26

Captulo 2

Fundamentos tericos

pois os resultados obtidos no apresentam fiabilidade. A validao um processo moroso mas vital na garantia de qualidade analtica de um processo analtico desenvolvido. No deve ser considerada como uma actividade singular, mas deve ser sempre compreendida no que diz respeito ao ciclo de vida do procedimento analtico. Iniciando-se com o desenvolvimento ou a optimizao do mtodo, o desempenho do procedimento analtico deve ser combinado com exigncias num processo interactivo. Segundo a norma NP EN ISO/IEC 17025 o laboratrio deve validar mtodos no normalizados, mtodos criados ou desenvolvidos pelo prprio laboratrio, mtodos normalizados utilizados fora do seu mbito de aplicao e extenses ou modificaes de mtodos normalizados [24]. Para satisfazer as necessidades de uma dada aplicao ou campo de aplicao, a validao deve ser to exaustiva quanto necessrio. O laboratrio deve registar os resultados obtidos, o procedimento utilizado para a validao e uma declarao quanto adequao do mtodo para o uso pretendido. As normas

internacionais, nacionais e sistemas da qualidade destacam a importncia da validao de mtodos analticos e a documentao do trabalho de validao, para a obteno de resultados confiveis e adequados ao uso pretendido [25]. Antes de se iniciar o processo de validao de um determinado mtodo analtico deve-se ponderar sobre o mbito de aplicao pretendido e quais os critrios de validao que necessrio demonstrar. Algumas das questes mais relevantes deste processo passam por reflectir sobre o analito que se pretende determinar, os nveis de concentrao esperados, o tipo de matriz envolvida e se se

27

Captulo 2

Fundamentos tericos

pretende no final uma informao apenas qualitativa7 ou quantitativa, correspondendo estimativa do seu teor. Devido a variedade de ensaios analticos vamos ter diferentes mtodos que necessitam de diferentes programas de validao. A tabela 2.1 descreve os parmetros a determinar, consoante o mbito de anlise a realizar [26].
Tabela 2.1 -Exigncias de validao dos mtodos analticos de acordo com a ICH.
Mtodos Analticos Parmetros de desempenho Exactido Repetibilidade Preciso intermdia Especificidade
(2)

Doseamento

Pesquisa de impurezas Quantitativo Limites (1)

Caractersticas de desempenho + + + +
(4) (4) (4) (4)

Identificao

+ + + + (1)

+ + + + -

+ -

+ +

Limite de deteco Limite de quantificao Linearidade Gama de trabalho Coerncia Robustez

+ + + +

+ + + + + -

+
(3)

+ +
(4)

(-) Caracterstica normalmente no avaliada; (+) Caracterstica normalmente avaliada; (1) Nos casos em que a reprodutibilidade foi avaliada, no necessrio determinar a preciso intermdia; (2) A ausncia de especificidade de um mtodo analtico pode ser compensada por outro mtodo analtico de suporte; (3) Pode ser necessrio em alguns casos. (4) Pode no ser necessria em alguns casos.

A validao de um mtodo analtico garante e confere confiana ao processo de quantificao do analito numa determinada matriz a um certo nvel de concentrao. De acordo com a USP os parmetros analticos usados para a validao de um mtodo analtico so:
7

(presente / ausente, correcto / incorrecto,...)

28

Captulo 2 1. Especificidade e selectividade 2. Gama de trabalho 3. Linearidade

Fundamentos tericos

4. Limiares analticos (limite de deciso, limite de deteco e limite de quantificao) 5. Sensibilidade 6. Preciso 7. Exactido 8. Robustez 9. Coerncia

Quando ocorrem alteraes no procedimento analtico, as mudanas podem conduzir necessidade de revalidao do procedimento analtico. Esta revalidao deve ser desenvolvida para garantir que o procedimento analtico mantm as suas caractersticas e para demonstrar que continua a assegurar a identidade, qualidade, potncia da substncia activa e do frmaco, e a biodisponibilidade. O grau da revalidao vai depender da natureza da mudana, por exemplo, quando um procedimento analtico regulador diferente substitudo, o novo procedimento deve ser validado [27].

2.6.1. Especificidade e selectividade

A selectividade e a especificidade so parmetros que confirmam a confiana das medies na presena de interferncias. Ambos esto relacionados com a capacidade de quantificar correctamente um determinado analito na presena de outras substncias da matriz da amostra. Podem ser medidos como um tipo de erro sistemtico devido presena de interferentes, substncias susceptveis de originar desvios no valor instrumental referente ao analito, e assim provocar consequentemente desvios sistemticos. Estes interferentes podem ser impurezas ou produtos de degradao.
29

Captulo 2

Fundamentos tericos

Em HPLC estes parmetros so avaliados geralmente atravs da capacidade de resoluo cromatogrfica, da eficincia da separao e do factor de assimetria. A especificidade corresponde capacidade de um mtodo analtico determinar inequivocamente um analito na presena de outros componentes esperados na matriz, no caso de uma forma farmacutica pode ser impurezas, produtos de desagregao e excipientes. Diz-se que um mtodo especfico quando permite discriminar o analito relativamente a outras substncias

eventualmente presentes na matriz amostra a analisar, ou seja, quando se tem garantia que a grandeza medida provm apenas do analito. O termo selectividade corresponde capacidade de o mtodo analtico responder preferencialmente a um determinado analito, ou seja, identificar e distinguir um analito numa mistura complexa sem interferncia dos outros componentes.

2.6.2. Gama de trabalho

A gama de trabalho de um mtodo analtico corresponde ao intervalo entre a concentrao mais baixa e a concentrao mais elevada determinadas experimentalmente com preciso, exactido e linearidade. Normalmente, pretende-se que na gama de

concentraes o sinal instrumental fornea uma resposta linear como tambm homogeneidade da varincia na varivel dependente. Estas concentraes so evidenciadas estatisticamente atravs da

calibrao analtica do mtodo. Segundo a ICH, a especificao para o doseamento dum produto farmacutico acabado, geralmente faz-se na gama analtica referente a 80 a 120% da concentrao teste [28].

30

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.6.3. Linearidade
A linearidade de um mtodo analtico revela a habilidade do mtodo produzir resultados directamente proporcionais

concentrao do analito numa dada faixa de aplicao. Ou seja, verificar se existe uma relao linear entre os valores medidos e as concentraes dos padres de calibrao. Em termos grficos a linearidade do mtodo pode ser comprovada atravs do coeficiente de determinao (R2) da equao da recta de calibrao obtida, que reflecte o grau de relao ou ligao entre as variveis X (concentrao) e Y (resposta), e considera-se o resultado conforme se o valor de R2 for superior a 0,999
[29]

. Estatisticamente a linearidade verificada, usando o teste

de Mandel.

2.6.3.1.Preparao da curva de calibrao

Para garantir a rastreabilidade do processo utilizam-se, inicialmente, padres de concentrao conhecida de forma a testar a resposta do equipamento que far a quantificao. Com a calibrao pretende-se obter uma relao entre o padro submetido e o correspondente sinal instrumental. A curva de calibrao correcta deve apresentar os seguintes aspectos: i. o limite inferior estimado com base na menor concentrao capaz de originar um sinal estatisticamente distinto do branco. Aps a determinao do limite de quantificao (XLQ) deve-se sempre verificar se o menor padro (X1) excede esse valor (X1XLQ); ii. os padres devem abranger a gama de concentraes das amostras. O ideal que as amostras se situem prximo do centride da curva de calibrao;

31

Captulo 2 iii.

Fundamentos tericos
a varincia dos valores medidos deve ser constante uma vez que a introduo de pesos estatsticos implica um custo adicional no esforo da quantificao;

iv.

a gama de trabalho do mtodo analtico definida como amplitude de concentraes usadas para a definio de curva de calibrao (X1 e XN).

A calibrao um processo crtico uma vez que dela depende a qualidade das estimativas da quantificao das amostras em termos de preciso e exactido. Uma vez excludo o problema do erro sistemtico cuja estatstica no consegue tratar, tem que se ter em conta trs passos fundamentais para obter uma curva de calibrao correcta que ir condicionar a qualidade dos resultados estimados. Os trs passos fundamentais so: representatividade dos valores na curva de calibrao (homogeneidade da varincia), escolha do modelo e deteco de eventuais valores discrepantes.

A anlise da homogeneidade das varincias para o sinal medido realizada atravs do Teste Fisher (F) onde se compara as varincias nos extremos do intervalo de calibrao (equao 2.5).

s 12 2 F = 2 ( s 12 > s N ) sN

(2.5)

De igual modo as hipteses de trabalho a considerar so apenas duas: existe homogeneidade da varincia (H0) ou no existe homogeneidade da varincia (H1). Para a escolha do modelo deve usar-se diagnsticos simples mas com fundamento estatstico, sendo o teste de Mandel geralmente mais usado. O passo inicial deste teste corresponde a ajustar um polinmio de primeiro grau (P1), bem como um polinmio de segundo
32

Captulo 2

Fundamentos tericos

grau (P2) e calcular, para cada um deles, as respectivas somas de resduos quadrados. Pretende verificar-se se o aumento na varincia do ajuste causada pela eliminao de um parmetro equiparvel varincia aleatria [pure error], para realizar tal verificao recorre-se equao 2.6:

F =

2 fit 2 pe

( SS / )

(2.6)

2 pe

Se o valor de F calculado no exceder o valor de F tabelado (F0,01 (;pe), onde corresponde aos graus de liberdade que vai ser apenas um) a hiptese nula aceite, o que corresponde a dizer que ambos os polinmios (primeiro e segundo graus) ajustam os pontos experimentais de modo similar, concluindo-se que o polinmio de primeiro grau o mais adequado para curva de calibrao, j que apresenta maior nmero de graus de liberdade. Caso o valor de F obtido ultrapassa este valor crtico a hiptese nula no seria vlida (o polinmio de segundo grau conduzia a um melhor ajuste dos valores experimentais da curva de calibrao), deve-se reduzir a gama de trabalho para se obter uma funo de calibrao linear, pois o tratamento estatstico do polinmio de segundo grau bastante complexo (norma ISO 8466:2). Os eventuais outliers8 presentes nos dados obtidos podem ser detectados de diferentes formas. Uma delas trata-se da regresso robusta que pode ser bastante eficaz na deteco de outliers j que bastante insensvel a este tipo de valores. Outras alternativas passam por realizar o teste F (de modo semelhante ao teste de Mandel), e /ou um teste do tipo t-student.
8

Valores discrepantes que se afastam dos valores previstos pelo modelo.

33

Captulo 2

Fundamentos tericos

Os padres da curva de calibrao devem ser preparados com o mximo rigor analtico possvel para que, desta forma, a sua fonte de erro associada seja desprezvel quando comparada com o erro da varivel dependente. Os padres a utilizar devem obedecer a determinadas condies: i. ii. iii. possuir elevada pureza e ausncia de matriz; possuir homogeneidade na sua composio; ser representativo (propriedades fsico-qumicas similares aos analitos a utilizar); iv. v. apresentar elevada estabilidade; boas condies de armazenamento (padro no deve ser afectado pelo recipiente nem pelas condies de

armazenamento).

A ICH define um mnimo de cinco padres para estabelecer a gama de linearidade, como 80% a 120% do teor da substncia a quantificar [29].

2.6.4. Limiares analticos

Os limiares analticos especificam e definem os extremos inferior e superior da curva de calibrao. Assim os extremos inferiores correspondem a concentraes que permitem saber quais as capacidades de deteco do respectivo mtodo para esses nveis de concentrao, temos os limites de deciso, de deteco e de quantificao. Estes limiares analticos podem ser estimados por trs mtodos distintos: i. atravs de rplicas do branco (m010) (mtodo recomendado pela IUPAC e ISO); ii. com base nos parmetros da recta;
34

Captulo 2 iii. com base no desvio padro do ajuste.

Fundamentos tericos

Deve-se estimar os limiares analticos atravs das rplicas de branco de padro. No sendo possvel desta forma ou se algum destes limites conduzir a uma concentrao sem significado fsico deve optar-se por utilizar os parmetros da recta da calibrao. S em ltimo caso deve ser utilizado o desvio padro do ajuste para este objectivo. Os limiares so obtidos por transformao em concentrao do sinal respectivo (funo inversa da curva de calibrao: Xi =G (Yi)).

2.6.4.1 Limite de deciso

O limite de deciso (Xd) corresponde menor concentrao de analito que apresenta probabilidade de 5 % de que o respectivo sinal possa ser considerado como sendo o sinal do branco e 50 % de hipteses de se tratar de facto do analito (=0.05 e =0.50) e pode ser estimado a partir da equao 2.7.
u X d = G( y0 + t0 Y ) G( y0 + 1.65. ,05(m0 1) .
0

sy0 m0

(2.7)

Caso no seja possvel obter valores de branco, este limite pode ser estimado atravs dos parmetros da calibrao linear, atravs da equao 2.8.
u X d = G ( b0 + t 0 , 05 ( m 0 1 ) . ( b 0 )) G ( b 0 + 1 . 65 . ( b 0 ))

(2.8)

Pela equao 2.9 podemos determinar este limiar pelo desvio padro de ajuste:
u X d = G(t0 fit ) G(1.65 fit ) ,05( n p ) .

(2.9)

35

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.6.4.2.Limite de deteco
O limite de deteco (XLD) corresponde menor quantidade de analito que possvel detectar com uma certa confiana estatstica, mas no necessariamente quantificar. Esta concentrao til para especificar a presena/ausncia do analito da amostra. Em termos qualitativos, o conceito de limite de deteco corresponde concentrao mnima que possvel distinguir do branco. A quantificao deste valor de concentrao est sujeita a erros significativos: probabilidade de 5 % de ocorrem erros tipo I (falsa deteco, =0.05) e de 5 % de ocorrerem erros tipo II (falsa no deteco, =0.05). O limite de deteco pode ser calculado atravs de: Rplicas de brancos (m010), pela equao 2.10, onde se faz uma estimativa do valor mdio do sinal do branco ( y0 ) e respectivo desvio padro ( S y0 ):
u X LD = G( y0 + 2.t0 ,05(m0 1) .

sy0 m0

(2.10)

Pode tambm ser determinado a partir da equao 2.11 atravs da equao da curva de calibrao, recorrendo ao valor de intercepo da recta e respectiva incerteza:
u X LD = G (b0 + 2 .t 0 , 05 ( m0 1) . (b0 )) = G ( b0 + 3 .3 (b0 ))

(2.11)

Pela estimativa com base no desvio padro residual (fit) do ajuste da curva de calibrao atravs de mnimos quadrados e a sensibilidade, o limite de deteco determinado pela equao 2.12:

X LD = 3.3

(dYdX)

fit

(2.12)

36

Captulo 2

Fundamentos tericos

Por ltimo, o limite de deteco pode ser determinado atravs do quociente sinal/rudo da linha de base: concentrao que corresponde a um sinal proporcional a um determinado factor do quociente sinal/rudo. A determinao desta razo realizada por comparao dos sinais medidos da amostra com baixas concentraes conhecidas do analito com as do branco, estabelecendo-se assim a concentrao mnima onde o analito pode ser detectado. A razo sinal/rudo com valor 3:1 geralmente aceite para estimar o limite de deteco.

2.6.4.3.Limite de quantificao
O limite de quantificao (XLQ) corresponde menor concentrao de analito que possvel quantificar com preciso e exactido definidas e nas condies de operao especificadas. Este limiar analtico pode ser estimado com base em: Rplicas de brancos (m010) atravs de equao 2.13: concentrao de analito capaz de originar um sinal equivalente a,

X LQ = G( y0 +10S y0 )
Onde

(2.13)

y0 ,

a mdia do sinal medido para uma serie de brancos,

preparados de forma independente e S y0 o desvio padro associado a Y0. Atravs da equao da curva de calibrao: Estimativa com base no desvio padro residual (fit) do ajuste da curva de calibrao atravs de mnimos quadrados e a sensibilidade. A determinao do limite de quantificao por esta via obtida atravs da equao 2.14.

X LQ = 10

(dYdX)

fit

(2.14)

37

Captulo 2

Fundamentos tericos

E finalmente pelo quociente sinal/rudo da linha de base: concentrao que corresponde a um sinal proporcional a um determinado factor do quociente sinal/rudo. A razo sinal/rudo tpica segundo a ICH 10:1.

Deve se ter em conta possveis oscilaes isoladas do sinal medido que podem corresponder a valores j significativos e que podem ser proveniente de contaminaes. Os limites de deteco e quantificao calculados devem ser sempre confirmados analisando um nmero apropriado de amostras que contenham o analito nas concentraes correspondentes e com a leitura de padres com as concentraes encontradas.

2.6.5.Sensibilidade
A sensibilidade definida como o menor incremento de concentrao (X) necessrio para originar uma variao detectvel no valor do sinal lido (Y) coincidindo esta com o declive da recta de calibrao quando se trata do modelo linear (polinmio de primeiro grau) como se pode ver pela equao 2.15.

E=

Y X

(2.15)

2.6.6. Preciso
A preciso do mtodo analtico expressa o grau de concordncia dos resultados entre ensaios independentes sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, em condies definidas. Pode ser determinada recorrendo a estimativas

paramtricas como:

1. Desvio padro dos resultados (s), determinado pela equao 2.16:

38

Captulo 2

Fundamentos tericos
n

s=

SS

(L
=
i =1

L )2

(2.16)

( n 1)

2. Coeficiente de variao (%CV), estimado pela equao 2.17:

% CV = 100

s L

(2.17)

Onde s o desvio padro das recuperaes e L a estimativa paramtrica central (mdia).

A ICH recomenda a determinao a trs nveis de preciso: repetibilidade, preciso intermdia e reprodutibilidade.

2.6.6.1. Repetibilidade
A repetibilidade corresponde preciso obtida para ensaios efectuados sobre a mesma amostra num curto intervalo de tempo e em condies to homogneas quanto possvel (mesmo laboratrio, mesmo analista, mesmo equipamento e mesmo tipo de reagentes). Segundo a norma ISO 5725:1 devem se realizar no mnimo dez ensaios sobre uma mesma amostra ou padro e repetir o procedimento para vrios nveis de concentrao dentro da zona de aplicao do mtodo. A repetibilidade dada pelo desvio padro sr associado mdia dos resultados assim obtidos. O limite de repetibilidade (r) o valor mximo permitido para a diferena absoluta entre dois ensaios obtidos em condies de repetibilidade, calculada para o nvel de confiana a 95 %, sendo obtido atravs da equao 2.18.
b r = 2 t 0 .05 ( m 1)

sr m

(2.18)

39

Captulo 2

Fundamentos tericos

O coeficiente de variao de repetibilidade (% CVr) d informao acerca da ordem de grandeza relativa esperada para a impreciso dos valores em condies de repetibilidade e determinado a partir da equao 2.19.

%CV r = 100

sr X

(2.19)

onde X corresponde ao valor mdio da gama analtica do mtodo ou, alternativamente, ao nvel de concentrao a que se refere a estimativa. O mtodo considera-se preciso em termos de

repetibilidade se o coeficiente de variao for inferior a 1.0%.

2.6.6.2. Preciso intermdia

A preciso intermdia corresponde preciso obtida nos ensaios sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio ou em laboratrios diferentes, mas definindo exactamente as condies que variam. Este tipo de estudo tem por objectivo avaliar a interferncia que a mudana de determinadas condies intra-laboratoriais podem ter no resultado final (anlises em dias diferentes, com diferentes operadores, etc). Esta medida de impreciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados do laboratrio. Segundo a norma ISO 5725:3, a preciso intermdia pode ser avaliada de trs formas distintas: atravs de cartas de controlo de amplitudes aplicadas a rplicas, a duplicados da amostra e a padres, quando se realizam n ensaios sobre t amostras ou padres ou quando se realizam n medies sobre uma mesma amostra, amostras

supostamente idnticas ou o mesmo padro. De acordo com esta norma o mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia se o coeficiente de variao for inferior a 2.0 %.

40

Captulo 2

Fundamentos tericos

2.6.6.3.Reprodutibilidade
Esta preciso obtida quando se efectuam vrios ensaios sobre a mesma amostra em diferentes laboratrios, com diferentes operadores, usando diferentes equipamentos e em perodos

diferentes, ou seja, realizando estudos interlaboratoriais. Esta uma medida de impreciso global do mtodo analtico pois obtida atravs de resultados publicados por diversos laboratrios independentes que realizam esse mesmo mtodo, em condies operacionais idnticas, efectuando anlises sobre o mesmo conjunto de amostras.

2.6.7. Exactido
A exactido de um procedimento analtico expressa a proximidade entre a mdia de uma srie de resultados de vrios ensaios e um valor aceite como verdadeiro de um padro de referncia. Indica, desta forma, a capacidade do mtodo analtico proporcionar resultados o mais prximo possvel do valor aceite como verdadeiro. A exactido de um mtodo, ou de um resultado, est condicionada pela existncia de erros sistemticos, erros que se manifestam sempre da mesma forma, para um dado conjunto de ensaios independentes. Os erros sistemticos obedecem a causas determinadas e levam ao aparecimento de resultados

significativamente afastados do seu valor verdadeiro. Este tipo de erros pode ser classificado em categorias: erros instrumentais (onde se encontram includas a m calibrao do material e as avarias parciais do equipamento), erros operativos onde so includos alguns erros dos analistas e erros de mtodo, associados a interferncias de ordem variada, existncia de reaces secundrias no processo analtico. Os erros sistemticos colocam em causa a veracidade do resultado experimental, provocando o seu afastamento relativamente
41

Captulo 2

Fundamentos tericos

ao valor verdadeiro presente na amostra analisada. Este tipo de erro pode ser minimizado pela utilizao de ensaios em branco e pela aplicao da mesma metodologia na preparao das solues padro de calibrao. Os testes estatsticos para diagnstico do desempenho de exactido do mtodo so geralmente realizados em relao a: I. Erro absoluto (): a varivel normalizada deve apresentar uma distribuio t-student evidenciada pela equao 2.20.

t exp =

[x ] sx

(2.20)

Onde x corresponde mdia dos dados obtidos, s x ao desvio padro associado media e ao valor correcto. O valor correcto deve ser um valor certificado do MRC ou valor de referncia de um ensaio. Este teste permite verificar a exactido por via interna, onde vamos ter as seguintes hipteses de trabalho: H0:

x H concordncia estatstica dos valores

H1: x H diferena significativa entre os valores. A hiptese nula deve ser aceite se o valor calculado no exceder o valor previsto para a distribuio bilateral t-student ao nvel de confiana a 99%. Caso contrrio, estima-se o valor previsto com 95% de confiana. Se ainda o valor de teste for superior ao valor previsto com 95% de confiana, rejeita-se a hiptese nula e aceita-se a hiptese 1. II. Erro relativo (%RE): quociente entre o erro absoluto () e o valor correcto (); O valor obtido atravs da equao 2.21 fornece indicao percentual do desvio obtido que serve como termo de avaliao e permite a comparao com outras situaes.
42

Captulo 2

Fundamentos tericos

% RE = 100

( xlab )

= 100

(2.21)

III.

Factor de desempenho (Z-score): Expressa-se em termos de varivel reduzida e estimado atravs da equao 2.22.

Z=

( xlab ) S

(2.22)

Onde S representa a incerteza associada ao material certificado (MRC) ou o desvio padro da mdia dos laboratrios no ensaio interlaboratorial. Segundo um protocolo com a AOAC, ISO e IUPAC se o factor de desempenho em mdulo for menor ou igual a um, temos um bom desempenho, se for menor ou igual a dois temos desempenho satisfatrio, caso se encontre entre dois e trs temos desempenho questionvel e por ltimo se for superior ou igual a trs temos mau desempenho do mtodo.

IV.

Erro normalizado (En): O erro normalizado estimado atravs da equao 2.23 onde Ulab corresponde incerteza associada ao laboratrio e UCRM incerteza associado ao valor de referncia. Quando o valor de erro normalizado em absoluto menor ou iguala a 2 o ensaio realizado satisfatrio.

En =

( xlab )
2 2 U lab + U CRM

(2.23)

43

Captulo 2 V.

Fundamentos tericos
Testes de recuperao: Os testes de recuperao permitem avaliar a exactido sem recorrer a materiais certificados, o que uma excelente vantagem econmica para o laboratrio, usando somente solues de padro e amostras. Este tipo de teste permite testar a resposta na presena da prpria matriz da amostra em causa, o que bastante vantajoso pois no comum haver materiais certificados com matrizes idnticas ou similares aquele que se est interessado. Caso se represente a concentrao recuperada em funo da concentrao adicionada obtm-se um grfico com variao linear que pode ser ajustado por um polinmio de primeiro grau conhecido por funo de recuperao (equao 2.24):

xrec = a f + b f xadd

(2.24)

Com esta funo podemos interpretar o tipo de erro sistemtico cometido no mtodo. Assim, a ordenada na origem (a) est relacionada com um erro sistemtico constante e o declive (b) est relacionado com um erro sistemtico proporcional.

2.6.8. Robustez
A robustez de um mtodo a capacidade do mtodo exibir estabilidade ao longo do tempo e no ser afectado por pequenas variaes nas condies de operao no laboratrio. Os factores normalmente estudados so a estabilidade das solues, o tempo de conservao da amostra, tempo de preparao e as condies experimentais do equipamento utilizado.

44

Captulo 2

Fundamentos tericos

A robustez pode ser determinada atravs de um teste ao mtodo em condies de preciso intermdia. Deve-se salientar que quanto maior for a robustez de um mtodo, maior ser a confiana desse relacionamento quanto sua preciso e maior insensibilidade (dependncia) de factores experimentais deliberadamente alterados, o que muito benfico pois o mtodo continua a conduzir a valores concordantes apesar das alteraes realizadas.

2.6.9. Coerncia
A coerncia de um mtodo analtico expressa a concordncia de valores obtidos quando so introduzidas variaes aleatrias nas condies experimentais do mtodo. De acordo com a USP este parmetro pode ser medido atravs da reprodutibilidade dos resultados obtidos sob a variao de diferentes condies (diferenas dentro do laboratrio, analistas, instrumentos, reagentes, perodos de trabalho).

2.6.10. Adequabilidade do sistema

Os testes de adequabilidade do sistema so uma parte de vrios procedimentos analticos e pretendem garantir que o sistema implementado adequado para o tipo de anlise que se pretende realizar e pode ser mantido em funcionamento sem perda das caractersticas analticas. Estes testes so baseados no conceito de que o equipamento, operaes analticas e amostras a serem analisadas constituem um sistema integral que pode ser avaliado como tal [29].

2.611. Estabilidade das amostras

Para se obter resultados reprodutveis e confiveis durante o processo de validao a estabilidade das solues amostra e padres

45

Captulo 2

Fundamentos tericos

deve ser determinada. Muitas vezes essencial que as solues sejam estveis, para que desta forma, se ocorrer algum atraso durante o processo, isso no v influenciar os resultados obtidos. A estabilidade das amostras bem como dos padres deve ser testada durante um perodo de vinte e quatro horas no mnimo. O coeficiente de variao da razo das reas das amostras obtido deve ser inferior a 2.0 % [29].

46

3.Seco Experimental

_________________
47

Captulo 3

Seco Experimental

3.Seco experimental
3.1. Materiais e Equipamento
Nos materiais e equipamento so descritos e enumerados as matrias-primas utilizados na preparao da suspenso contendo paracetamol como tambm os reagentes para a anlise da formulao.

3.1.1. Paracetamol
A substncia activa, paracetamol, apresenta-se como um p cristalino branco ou quase branco, ligeiramente solvel em gua e facilmente solvel no lcool. ligeiramente solvel em gua fria, solvel em etanol, metanol, soluo de hidrxido de sdio 1N, dimetilformamida, dicloroetano, acetato de etilo e acetona. ligeiramente solvel em diclorometano e ter e praticamente insolvel em pentano e benzeno [7].

3.1.2. cido ctrico monohidratado

O cido ctrico monohidratado (C6H8O7.H2O, Mw = 210.14 g.mol-1 e P> 99.5 %) apresenta-se na forma p cristalino branco ou incolor, inodoro e apresenta um forte sabor amargo. Numa soluo aquosa a 1% (m/v) apresenta pH=2.2. Este composto apresenta densidade de 1.542 g.cm-3 e ponto de fuso de aproximadamente 100 C. solvel em lcool e gua e pouco solvel no ter. Na indstria
48

Captulo 3

Seco Experimental

farmacutica usado essencialmente para ajustar o pH das solues

[30]

Figura 3.1 - Estrutura qumica do cido ctrico monohidratado.

3.1.3. Citrato de sdio

O citrato de sdio (C6H5Na3O7, Mw = 258.07 g.mol-1). Apresenta-se na forma cristalina incolor ou na forma de p cristalino branco. inodoro e apresenta sabor salgado. solvel em gua e praticamente insolvel em etanol. amplamente usado em

formulaes farmacuticas, uma vez que actua como estabilizador, controlador de acidez, agente tamponizante e ainda tem funo anticoagulante [30].
NaO O O O

NaO OH

ONa

Figura 3.2 - Estrutura qumica do citrato de sdio.

3.1.4. Sacarose
A sacarose (C12H22O11 e Mw = 342.30 g.mol-1) formada pela unio de uma molcula de glicose e uma de frutose. obtida atravs da cana-de-acar ou da beterraba, no contendo substncias adicionadas. Apresenta-se na forma de cristais incolores ou como um p branco cristalino, que inodoro e de sabor doce. Na indstria

49

Captulo 3

Seco Experimental

farmacutica usada em formulaes orais, onde vai originar valor energtico, desempenhando funes de edulcorante e de

conservante, sendo tambm usado para aumentar a viscosidade da formulao [30].

Figura 3.3 - Estrutura qumica sacarose.

3.1.5. Metilparabeno e Propilparabeno

O metilparabeno (C8H8O3 e massa molar 152.15 g.mol-1) apresenta-se como p cristalino branco ou cristais incolores, inodoro e o seu ponto de fuso encontra-se entre 125C e 128C. O propilparabeno (C10H12O3 e massa molar correspondente 180.20 g.mol-1) apresenta-se como um p cristalino branco, inodoro e inspido. O ponto de fuso deste composto encontra-se compreendido entre 96 e 99C. Ambos os compostos so pouco solveis em gua, facilmente solveis em acetona, etanol e ter etlico. O metil e o propilparabeno so usados como conservantes em produtos cosmticos, alimentares e farmacuticos. Podem ser usados individualmente ou em conjunto com outro parabeno ou outro agente conservante. Os parabenos so eficazes numa ampla faixa de pH e apresentam uma ampla actividade antimicrobiana, embora sejam mais eficazes contra leveduras e bolores. A actividade antimicrobiana aumenta com o aumento da cadeia alqulica, mas em contrapartida diminui a solubilidade em meio aquoso; portanto, uma mistura de parabenos usada frequentemente para fornecer uma conservao mais eficaz. [30].

50

Captulo 3

Seco Experimental

A
Figura 3.4 - Estrutura qumica metilparabeno (A) e propilparabeno (B).

3.1.6. Aroma de laranja

O acetato ou etanoato de octila o composto que d nome ao aroma de laranja que se apresenta na forma de um lquido lmpido, de cor amarelo escuro e com forte odor caracterstico a laranja. miscvel com o lcool e praticamente insolvel na gua. Na indstria farmacutica usado como edulcorante e aromatizante.

3.1.7. Tartrazina
A tartrazina (C16H9N4Na3O9S2; Mw = 534.39 g.mol-1) um corante que se apresenta na forma de p de cor amaro-alaranjado, com fluorescncia laranja e solvel na gua. As solues aquosas apresentam cor amarela. Este composto apresenta um mximo de absorvncia a 425 nm.

Figura 3.5 - Estrutura qumica da tartrazina.

Os corantes so usados para dar uma aparncia distinta na forma farmacutica. A cor dum medicamento uma ferramenta til para ajudar a identificar o produto no seu processo de fabrico, na sua distribuio e tambm til para os pacientes, principalmente para

51

Captulo 3

Seco Experimental

aqueles que utilizam varia medicao. O uso de cores diferentes para diferentes dosagens de um mesmo frmaco pode tambm ajudar a eliminar erros [30].

3.1.8. Goma xantana

A goma xantana (C35H49O29) uma mistura polissacardica com elevado peso molecular obtida naturalmente pela fermentao da bactria Xanthomonas campestris, que sintetiza a goma para evitar sua desidratao.

Figura 3.6 - Estrutura qumica da tartrazina.

Apresenta-se na forma de um p fino branco e inodoro, sendo bastante usada na indstria farmacutica e alimentar como agente espessante, estabilizante e emulsionante. Esta mistura heterognea de polissacardeo supera os outros devido

principalmente s suas propriedades reolgicas, que permitem a formao de solues viscosas a baixas concentraes (0,05-1,0%), e sua estabilidade numa ampla faixa de pH e temperatura [30].

3.1.9. gua purificada

A gua purificada (H2O) apresenta-se como liquido lmpido, incolor, inodoro e inspido. amplamente utilizada como matriaprima servindo de diluente e veculo de transformao, elaborao e

52

Captulo 3

Seco Experimental

fabrico de produtos farmacuticos. A gua purificada obtida por osmose inversa (Millipore ELIX 10).

3.1.10. Medicamento de referncia

O medicamento de referncia Ben-U-ron usado neste trabalho apresenta-se na forma de xarope. um lquido viscoso de cor laranja, aspecto homogneo com odor e sabor a natas. Contm 40 mg de paracetamol por cada ml de xarope.

3.1.11. Reagentes
Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico (Merck e Sigma-Aldrich), nomeadamente: metanol grau gradiente para HPLC (CH3OH, Mw = 32.04 g.mol-1, densidade de 0.792 g.cm-3, pureza de 99.9%) cido actico glacial (CH3COOH, Mw = 60.05 g.mol-1, densidade 1.05 g.cm-3, pureza de 99.8 %), metanol, paracetamol padro secundrio, metilparabeno padro secundrio, propilparabeno padro secundrio. Todas as solues aquosas foram preparadas com gua purificada obtida por osmose inversa (Millipore ELIX 10).

3.1.12. Fase mvel (HPLC)

A fase mvel utilizada no doseamento do paracetamol, do metilparabeno e propilparabeno no produto acabado consiste numa mistura de 570 mL da soluo aquosa de cido actico e 450 mL de metanol grau gradiente para HPLC. A fase mvel obtida filtrada atravs de filtro membrana GHP de 47 mm de dimetro e 0.45 m de porosidade e desgaseificada sob vcuo.

3.1.12.1. Soluo aquosa de cido actico

Para um balo volumtrico de 1000 mL colocar aproximadamente 800 mL de gua para HPLC e adicionar 36.4 mL de
53

Captulo 3

Seco Experimental

cido actico glacial. Misturar bem e completar o volume com o mesmo solvente.

3.1.13.

Solues

padro

para

doseamento

do

paracetamol, metilparabeno e propilparabeno.

Neste subcaptulo encontra-se descrito o procedimento para a preparao das solues padro para o doseamento da substncia activa e dos conservantes na suspenso obtida.

3.1.13.1.Soluo padro me de Paracetamol

Pesar 50.0 mg de paracetamol padro para um balo volumtrico de 20 ml e dissolver em 15 mL de metanol R. Levar 5 minutos ao ultrassons, agitar durante mais 5 minutos e perfazer o volume com metanol R. (Cfinal= 2.5 mg/mL).

3.1.13.2. Soluo padro me de Metilparabeno

Pesar 25.0 mg de metilparabeno para um balo de 100 mL e dissolver em metanol R. Completar o volume com o mesmo solvente. (Cfinal = 0.25 mg/mL).

3.1.13.3. Soluo padro me de Propilparabeno

Pesar 2.5 mg de propilparabeno para um balo de 100 mL e dissolver em metanol R. Completar o volume com o mesmo solvente. (Cfinal = 0.025 mg/mL).

3.1.13.4. Soluo padro 100 %

Para um balo de 10 mL, retirar 2 mL da soluo padro me de paracetamol e 1 mL da soluo padro me de metil e propilparabeno. Diluir e perfazer o volume com fase mvel. (CParacetamol = 500g/mL; CMetilparabeno = 25g/mL; CPropilparabeno = 2,5g/mL). Filtrar a
54

Captulo 3

Seco Experimental

Soluo padro 100 % atravs de filtros seringa PP 0.45m, para um vial de HPLC de 2 mL.

3.1.14. Solues para o ensaio de solubilidade

Para o ensaio de solubilidade da substancia activa, paracetamol, foram usadas quatro solues diferentes, que abaixo se descrevem: HCl 0.1 M (meio gstrico simulado sem enzimas) Para um balo de 1000 mL retirar 50 mL de soluo de cido clordrico 2 M. Diluir e perfazer o volume com gua destilada. Tampo acetato (pH=4.5) Dissolve-se 63 g de acetato de sdio anidro R em gua destilada e junta-se 90 ml de cido actico R. ajusta-se o pH e perfazse o volume para 1000 mL com gua destilada (segundo Farmacopeia Britnica). Tampo fosfato (pH=5.8) Dissolve-se 1.19 g de fosfato dissodico di-hidratado R e 8.25 g de dihidrogenofosfato de potssio R em gua destilada e completa-se 1000 mL com o mesmo solvente (segundo Farmacopeia Britnica). Tampo fosfato (pH=6.8) (meio intestinal simulado sem enzimas) A 77.3 mL de soluo de fosfato dissodico R a 71.5 g/L adiciona-se 22.7 mL, de soluo de cido ctrico R a 21 g/L (segundo Farmacopeia Britnica).

3.1.14.1.Soluo padro me de Paracetamol

Pesar 5.0 mg de paracetamol padro para um balo volumtrico de 100 mL e dissolver em 90 mL no solvente em estudo. Completar o volume com o mesmo solvente (Cfinal= 50 g/mL).

55

Captulo 3

Seco Experimental

3.1.15. Equipamento
No desenvolvimento deste trabalho foram utilizados os seguintes equipamentos: HPLC LaChrom Elite (desgaseificador e forno integrados e autoinjector) com detector U.V./visvel; Agitador magntico. Balana analtica Mettler Toledo XS205DU Titulador automtico Metrohm 794 Basic Titrino Filtros seringa PP Acrodisc 0,45 m Papel de filtro Whattman n4 Viscosmetro Brookfield modelo DV II + PRO Densmetro Espectofotmetro UV/visvel Hitachi U2001

3.2. Mtodos
Nesta seco encontra-se a descrio dos mtodos utilizados no decorrer do trabalho para a quantificao do paracetamol para o estudo de solubilidade e o doseamento por HPLC do paracetamol e dos conservantes na suspenso em estudo.

3.2.1. paracetamol

Quantificao

Espectrofotomtrica

do

Pesar quantidades exactas de paracetamol (5.00 mg) e dissolver nos solventes utilizados no ensaio de solubilidade. A partir destas solues preparar, por diluio, vrios padres de

concentraes diversas. O doseamento efectuado por absoro espectroscpica no ultravioleta (UV) a 242.8 nm, por este
56

Captulo 3

Seco Experimental

corresponder a um mximo de absoro do analito nesta regio espectral, nos diferentes meios, conforme verificado por varrimento de espectro de 300 a 210 nm. Construir as curvas de calibrao de absorvncia versus concentrao para utilizar na quantificao do paracetamol no estudo de solubilidade. O mtodo foi validado para o parmetro linearidade, tendo sido determinado a partir do coeficiente de correlao (r2) de cada curva, que foi sempre superior a 0.999.

3.2.2. Solubilidade de paracetamol

Foi determinada a solubilidade de paracetamol em quatro solues diferentes (HCl; tampo acetato (pH=4.5), tampo fosfato (pH=5.8); tampo fosfato (pH=6.8)) a 37 C. Um excesso de paracetamol (1250 mg) suspenso em 50 mL de cada um dos meios em estudo ficando em agitao durante 72 h. As solues permanecem posteriormente 24 h em equilbrio antes de serem filtradas. Sofreu diluio apropriada e a quantidade de paracetamol foi determinada espectrofotometricamente, recorrendo a curvas de calibrao de absorvncia versus concentrao.

3.2.3. Doseamento por HPLC da substncia activa e conservantes

A metodologia utilizada para doseamento, em simultneo, do paracetamol, metilparabeno e propilparabeno foi desenvolvida e validada com base no descrito na monografia Acetaminophen e Acetaminophen Oral Solution (USP31, 2008).

57

Captulo 3

Seco Experimental

3.2.3.1. Condies de trabalho

As condies cromatogrficas de trabalho para o doseamento da substncia activa (paracetamol) e dos conservantes (metil e propilprabeno) em simultneo na suspenso foram: Pr-coluna: LiChroCart 4 4 Purospher STAR RP-8e, 5m; Coluna: LiChroCART 250 4.6 Purospher STAR RP-8 e (5m); Deteco: Ultravioleta a =280 nm; Fluxo: 1,0 ml/min; Temperatura do forno: 40C; Volume de injeco: 20l. Auto-injector: Temperatura ambiente Tempo de corrida: 28 minutos Fase mvel: metanol/ soluo aquosa de cido actico (45:57, v/v)

3.2.3.2. Tratamento da amostra

Agitar bem a suspenso e pesar para um balo de 20 mL o equivalente a 50 mg de paracetamol (cerca de 1.5 g de suspenso). Dissolver em metanol e levar aos ultrassons durante dez minutos e a agitar durante mais cinco minutos. Deixar arrefecer, perfazer volume com metanol. Filtrar com papel de filtro Whattman n4. Do filtrado retirar 2 mL para balo volumtrico de 10 mL e perfazer o volume com fase mvel. Filtrar a soluo atravs de filtro seringa PP acrodisc 0.45m. Injectar a amostra em triplicado e calcular o teor de cada uma das substncias na amostra.

identificao

do

paracetamol,

metilparabeno

propilparabeno na suspenso feita por comparao dos tempos de

58

Captulo 3

Seco Experimental

reteno obtidos com a soluo padro 100% e soluo amostra, respectivamente. A quantidade de paracetamol e parabenos na determinada a partir das seguintes frmulas: Paracetamol: A quantidade de paracetamol, na poro de suspenso tomada para ensaio, determinada atravs da equao 3.2:

(3.1)

(3.2)

Onde Aa o valor correspondente mdia de reas obtidas para a amostra, Mta massa terica de amostra (g), Mpp massa pesada do padro (mg), P pureza do padro, Ap mdia de reas obtida para o padro, Mp massa pesada de amostra (g), C concentrao de Paracetamol obtida (g/ml) e C0 = 500 g/ml. O teor de paracetamol na amostra deve estar compreendido entre 95.0 % e 105.0 % de C8H9NO2, respectivamente.

Metilparabeno:

A quantidade de metilparabeno na suspenso determinada pela equao 3.4. (3.3)

(3.4)

59

Captulo 3

Seco Experimental

Onde Aa o valor correspondente mdia de reas obtidas para a amostra, Mta massa terica de amostra (g), Mpp massa pesada do padro (mg), P pureza do padro, Ap mdia de reas obtida para o padro, Mp massa pesada de amostra (g), C concentrao de metilparabeno obtida (g/ml) e C0 a 25 g/mL. O teor de metilparabeno na amostra deve estar entre 90.0% e 110.0%.

Propilparabeno:

A quantidade de Propilparabeno, na poro de suspenso tomada para ensaio, determinada atravs da equao 3.6:

(3.5)

(3.6) Sendo que Aa corresponde mdia de reas obtidas para a amostra, Mta massa terica de amostra (g), Mpp massa pesada do padro (mg), P pureza do padro, Ap mdia de reas obtidas para o padro, Mp massa pesada de amostra (g), C concentrao de Propilparabeno obtida (g/ml) e C0 a 2,5 g/mL. O teor de propilparabeno na amostra deve estar entre 90,0% e 110,0% de 4-hidroxibenzoato de propilo.

3.2.4. Caracterizao da suspenso de paracetamol

Para alm do doseamento, por HPLC, do paracetamol e dos conservantes metilparabeno e propilparabeno existem outros ensaios

60

Captulo 3

Seco Experimental

igualmente importantes, e que permitem fazer uma caracterizao adequada da forma farmacutica desenvolvida.

3.2.4.1. Descrio
A suspenso deve apresentar-se como um lquido viscoso, cor amarela, aspecto homogneo e com odor e sabor caracterstico laranja.

3.2.4.2. Viscosidade
A viscosidade da forma farmacutica obtida atravs de um viscosmetro Brookfield modelo DV-II + PRO (figura 3.7), utilizando agulha n3 a velocidade de 60 RPM. Nestas condies, para este tipo de preparaes farmacuticas esperam-se valores de viscosidade situados entre 500.0 e 1500.0 cP9.

Figura 3.7 - Viscosmetro Brookfield modelo DV-II + PRO.

3.2.4.3. Densidade
A densidade da suspenso determinada a 20C utilizando um densmetro/picnmetro. Os valores da densidade esperados para a formulao obtida situam-se entre 1.100 1.250.

cP: Centipoise

61

Captulo 3

Seco Experimental

3.2.4.4. pH
O pH da suspenso determinado por potenciometria, sob agitao suave a 20C. Nestas condies, para este tipo de soluo esperam-se valores de pH compreendidos entre 4.5 a 6.5.

62

4.Resultados e Discusso ______________________

63

Captulo 4

Resultados e Discusso

4. Resultados e Discusso
4.1. Quantificao Espectrofotomtrica
Foram construdas quatro curvas de calibrao de paracetamol dissolvido nos diferentes meios (HCl, tampo acetato (pH=4.5), tampo fosfato (pH=5.8), tampo fosfato (pH=6.8)). A absorvncia foi determinada a 242.8 nm, em virtude de este comprimento de onda () corresponder ao mximo de absoro do paracetamol, para os diferentes meios, conforme pode ser verificado atravs dos respectivos espectros, ver figura 4.1.

Figura 4.1 - Espectro de absorvncia das solues em funo do comprimento de onda (nm).

Na figura 4.1 encontra-se tambm representada uma linha vertical (azul claro) que se situa no espectro na zona mximo de absorvncia correspondente ao paracetamol. Na tabela 4.1.

encontram-se sistematizados os valores de absorvncia registados para cada uma das solues a este comprimento de onda (242.8 nm).
64

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.1 - Pico mximo obtido no espectro do paracetamol de 300 a 210 nm.
Pico Solues (nm) HCl 0.1M (pH=1.2) Tampo acetato (pH=4.5) Tampo fosfato (pH=5.8) Tampo fosfato (pH=6.8) 242.8 242.8 242.8 242.8 Abs 0.168 0.325 0.173 0.176

Cada curva de calibrao foi determinada com cinco padres de paracetamol (concentraes entre 1.00 a 6.00 g/ml preparados a partir de soluo me a 50 g/ml). As equaes das rectas obtidas bem como o valor do coeficiente de correlao (r2) de cada uma das curvas encontram-se descriminados na tabela 4.2. Como evidenciado pelos valores de r2, todas as curvas de calibrao apresentam boa linearidade entre absorvncia e concentrao, podemos assim admitir a correcta quantificao do paracetamol sempre que os valores a determinar se encontrem dentro dos limites de concentrao utilizadas.
Tabela 4.2- Estimativas obtidas nas curvas de calibrao do paracetamol nos diferentes meios: indicao dos parmetros do modelo e do respectivo coeficiente de determinao (n=5).
Solues HCl 0.1M (pH=1.2) Tampo acetato (pH=4.5) Tampo fosfato (pH=5.8) Tampo fosfato (pH=6.8) a0 -0.00310(0.0024) -0.0385 (0.0044) 0.01011 (0.0019) -0.00471(0.0025) a1 0.06592(0.00056) 0.06598(0.0010) 0.06489(0.00044) 0.06342(0.00059) R
2

0.99978 0.99928 0.99986 0.99974

65

Captulo 4

Resultados e Discusso

4.2. Solubilidade
A solubilidade foi determinada a diferentes valores de pH, nomeadamente, 1.2, 4.5, 5.8 e 6.8. Os valores de solubilidade encontrados para o paracetamol encontram-se descritos na tabela 4.3.
Tabela 4.3- Valores de solubilidade do paracetamol.
Solues HCl 0.1M (pH=1.2) Tampo acetato (pH=4.5) Tampo fosfato (pH=5.8) Tampo fosfato (pH=6.8) Solubilidade (mg/mL) 12.98 (0.14) 25.99 (0.21) 12.55 (0.11) 14.25 (0.09) Solub./ Sol. Max (%) 49.8 100 48.3 54.8

Da tabela 4.3 verifica-se que a solubilidade do paracetamol cerca do dobro em tampo acetato (pH=4.5) do que em relao s restantes condies testadas. Verifica-se ainda que numa amplitude grande de pH entre 1.2 e 6.8 (mais de cinco ordens de grandeza em termos de actividade do proto em soluo) a solubilidade deste frmaco quase no varia, recorrendo a tampes constitudos com compostos inorgnicos. Tal facto faz-nos pensar que a cadeia pequena carbonada do cido actico pode ter um peso determinante a promover a solubilidade deste frmaco. Para validar esta hiptese terse-ia de testar um tampo inorgnico com pH = 4.5 e por exemplo uma tampo orgnico com pH = 6.8.

66

Captulo 4

Resultados e Discusso

4.3. Medicamento de referncia

O medicamento de referncia encontra-se disponvel em frascos de vidro, com 85 ml (100 g) de xarope. Apresenta-se na forma de um lquido viscoso de cor laranja, aspecto homogneo e com odor e sabor a natas. De forma a caracterizar o produto de referncia, verificou-se o pH, viscosidade, densidade, identificao e doseamento do princpio activo (paracetamol) e dos conservantes (metilparabeno e propilparabeno). Os resultados obtidos encontram-se na tabela 4.4.
Tabela 4.4- Caracterizao do Ben-U-ron .
Ben-U-ron pH Viscosidade (cP) Densidade (g.dm ) Identificao de conservantes Doseamento de metilparabeno Doseamento de propilparabeno Identificao paracetamol Doseamento paracetamol
-3

5.43 893.81 1.199 Positivo 97.6% 98.4% Positivo 104.5%

4.4. Suspenso contendo paracetamol

Tendo como base a formulao qualitativa do produto de referncia e as especificaes do produto acabado obteve-se uma suspenso contendo paracetamol a 40 mg/ml. A soluo final obtida apresenta-se como um lquido viscoso de cor amarela, aspecto

67

Captulo 4

Resultados e Discusso

homogneo com odor e sabor a laranja. Na tabela 4.5. encontra-se resumido os resultados dos ensaios realizados.
Tabela 4.5- Suspenso contendo paracetamol 40mg/ml.
Ensaios pH Viscosidade (cP) Densidade (g/dm ) Identificao de conservantes Doseamento de metilparabeno Doseamento de propilparabeno Identificao paracetamol Doseamento paracetamol
2

Xm 5.375 (0.063) 724 (27) 1.187 (0.0017) Positivo 103.3 (1.3) 103.1 (3.1) Positivo 101.63 (0.88)

CV % 1.2 3.7 0.1 1.2 3.0 0.9

4.5. Validao do mtodo analtico

Para caracterizar de forma adequada o medicamento em estudo tornou-se fundamental implementar uma metodologia analtica precisa, exacta e robusta, que permitisse o doseamento da substncia activa e dos conservantes. Para assegurar a fiabilidade dos resultados analticos obtidos tornou-se necessrio validar o mtodo analtico o que foi feito de acordo com as exigncias da ICH. O mtodo de doseamento utilizado foi descrito no captulo Materiais e Mtodos, sendo realizado por cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC).

4.5.1.Especificidade
A especificidade foi avaliada atravs da injeco de solues do branco de fase mvel, do branco da amostra, soluo padro de referncia (paracetamol, metil e propilparabeno) dissolvido em fase mvel, amostra de suspenso e soluo de referncia Be-u-ron
68

Captulo 4

Resultados e Discusso

dissolvida em fase mvel. Os cromatogramas obtidos encontram-se na figura 4.2. No anexo A.1 encontram-se os cromatogramas em maior dimenso, para melhor visualizao.

69

Captulo 4

Resultados e Discusso

Figura 4.2- Cromatogramas correspondentes ao ensaio de especificidade no mtodo de doseamento do paracetamol e de metil e propilparabeno: A Branco de fase mvel; B Branco da amostra; C Soluo padro de Paracetamol, Metil e Propilparabeno (CParaceamol: 500g/ml, CMetilparabeno:25g/ml, CPropilparabeno:2,5g/ml); D - Amostra de suspenso 40mg/ml (CParacetamol: 500 g/ml, CMetilparabeno: 25 g/ml, CPropilparabeno: 2,5 g/ml); E Amostra de soluo de referncia Ben u ron 40 mg/ml.

Pela observao dos cromatogramas verifica-se que a ordem de eluio dos componentes : paracetamol, metilparabeno e propilparabeno. Aps a anlise dos cromatogramas pode-se concluir que no existem interferncias dos excipientes e do solvente/fase mvel com a substncia activa (paracetamol) e conservantes (metilparabeno e propilparabeno) a dosear, havendo uma perfeita separao dos picos correspondentes a cada um dos compostos em anlise, pelo que se pode afirmar que o mtodo apresenta especificidade.

4.5.2. Linearidade e Gama de trabalho

A linearidade do mtodo foi avaliada atravs da construo de uma curva de calibrao para as trs substncias a dosear. Deste modo preparam-se sete padres abrangendo o intervalo de concentrao entre 10 % e 120 % para paracetamol, metilparabeno e propilparabeno. Na tabela 4.6 podemos observar as reas mdias obtidas para cada padro e as respectivas incertezas associadas.

70

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.6- reas da curva de calibrao do doseamento do paracetamol (PA), metilparabeno (Metil) e propilparabeno (Propil).
[PA] ppm 50 250 400 450 500 550 600 rea mdia 6 (1x10 ) 2.693(0.013) 13.513 (0.010) 21.142 (0.018) 23.951 (0.005) 26.454 (0.013) 28.782 (0.018) 31.589 (0.020) [Metil] ppm 2.5 12.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 rea mdia 6 (1x10 ) 0.292 (0.0020) 1.609 (0.0024) 2.588 (0.0032) 2.938 (0.0058) 3.260(0.00016) 3.544 (0.0038) 3.930 (0.0036) [Propil] ppm 0.25 1.25 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 rea mdia 6 (1x10 ) 3.019 (0.11) 16.759(0.062) 27.392 (0.13) 30.809 (0.17) 34.751 (0.43) 37.440(0.030) 41.262 (0.22)

Para um melhor ajuste para cada curva de calibrao realizaram-se testes estatsticos adequados referentes s trs fases crticas da calibrao: 1- Representatividade dos valores na curva de calibrao (homogeneidade da varincia); 2- Escolha do modelo; 3- Deteco de outliers.

A homogeneidade das varincias para o sinal medido verificada atravs do Teste Fisher (F) com intervalo de confiana de 99% (Fb0.01=Fu0.005). Neste caso assume-se como hiptese inicial (H0) que as varincias obtidas so estatisticamente equivalentes e como hiptese alternativa a sua diferena. Os valores calculados atravs do teste F bem como os respectivos valores prova (PH0), encontram-se na tabela 4.9.

71

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.9- Resultados da homogeneidade da varincia para as trs substncias.

Valor de teste F Paracetamol Metilparabeno Propilparabeno 2,64 3,35 3,75 P(H0) 0.6 0.5 0.4

Uma vez que nenhum dos valores do teste F obtido ultrapassa o valor crtico a 99% de confiana (14.94), a hiptese nula vlida, ou seja, as varincias so estatisticamente semelhantes para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno. O elevado valor de prova obtido para cada composto (0.6, 0.5 e 0.4) auxilia na confirmao de que h homogeneidade da varincia.

Como

as

varincias

so

estatisticamente

semelhantes,

transportam-se todos os valores para a segunda fase da calibrao, a escolha do modelo atravs do teste Mandel. Os valores de teste obtidos como os respectivos valores prova dos compostos a dosear na suspenso encontram-se na tabela 4.10.
Tabela 4.10- Resultados do teste de Mandel para a escolha do modelo. Valor de teste F Paracetamol Metilparabeno Propilparabeno 3.73 0.0003 0.02 P (H0) 0.1 0.99 0.9

Uma vez que o valor de teste F obtido para os componentes a dosear no ultrapassou o F crtico a 99% de confiana (21.2), a hiptese nula aceite, ou seja, os polinmios P1 e P2 apresentam

72

Captulo 4

Resultados e Discusso

ajustes idnticos, o modelo escolhido P1 para cada curva de calibrao. O valor de prova ajuda a confirmar a opo escolhida. O ltimo passo para a construo da curva de calibrao foi a verificao da existncia de outliers, onde numa primeira fase foram verificados por regresso robusta, atravs da anlise de resduos, que podemos observar na figura 4.3. A

Figura 4.3- Representao grfica dos resduos (em valor absoluto) em funo do ndice do padro utilizado. Para a verificao de outliers da curva de calibrao do paracetamol (A), metilparabeno (B) e propilparabeno (C). Eventuais outliers, para testar a sua rejeio, encontram-se assinalados com marca a vermelho.

73

Captulo 4

Resultados e Discusso

No caso da curva do paracetamol, os possveis valores discrepantes correspondem ao padro 1, 2, 4 e 6 sendo o primeiro padro aquele cujo valor experimental mais se afasta da respectiva estimativa robusta. Na curva do metilparabeno o possvel outlier o padro 6 e por ltimo, na curva do propilparabeno, os possveis valores discrepantes so os resduos correspondentes ao padro 5 e 6. O diagnstico destes valores foi efectuado atravs do teste Mandel (tabela 4.11).
Tabela 4.11- Resultados do teste de Mandel para verificar a existncia de outliers.
Valor de teste F Paracetamol Metilparabeno 0.01 25.32 9.57 Propilparabeno 9.54 F crtico 21.2 21.2 34.1 21.2

Pela anlise dos valores obtidos no teste estatstico realizado, verificamos que apenas o padro 6 na curva de calibrao do metilparabeno corresponde a um outlier, pois o valor obtido atravs do teste Mandel superior ao valor crtico a 99 % de confiana, sendo desta forma, rejeitado na construo da respectiva curva de calibrao. Aps eliminao deste outlier foi verificado se existia outro valor discrepante, mas tal no se verificou, pois o valor do teste F no excedeu o valor de F crtico a 99 %.

Aps verificar da homogeneidade da varincia, escolha do modelo e deteco de ouliers foi construda a respectiva curva de calibrao para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, onde se estabeleceram curvas de calibrao apresentadas na tabela 4.12.

74

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.12- Equaes da curva de calibrao e respectivos coeficientes de correlao.

A0 Paracetamol Metilparabeno Propilparabeno 2.36 (1.6) E+05 -4.28 (0.80) E+04 -4.95 (2.44) E+03 A1 5.23 (0.03) E+04 1.32 (0.0039) E+05 1.39 (0.011) E+05 R
2

0.99975 0.99997 0.99968

Figura 4.4- Representao grfica das respectivas curvas de calibrao do paracetmol e parabenos. A- Paracetamol; B- Metilparabeno e CPropilparabeno.

75

Captulo 4

Resultados e Discusso

A gama de trabalho linear fica estabelecida com uma faixa de concentraes 50 a 600 ppm, 2.5 a 30 ppm e 0.25 a 3 ppm para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, respectivamente.

4.5.3. Sensibilidade
A sensibilidade do mtodo corresponde primeira derivada da curva de calibrao, neste caso, como temos uma curva de calibrao modelo P1 (polinmio de primeiro grau) vai corresponder ao valor de a1. Assim, para a curva do paracetamol o valor 5.23 (0.03) E+04 ppm-1, para o metilparabeno 1.32 (0.0039) E+05 ppm-1 e para o propilparabeno corresponde a 1.39 (0.011) E+05 ppm-1.

4.5.4. Limiares analticos

Os limites de deciso (Xd), limites de deteco (XLD) e limites de quantificao (XLQ) foram estimados a partir dos parmetros das rectas de calibrao dos trs compostos, paracetamol, metilparabeno e propilparabeno. Os resultados obtidos para os limites encontram-se na tabela 4.13.
Tabela 4.13- Valores dos limiares analticos para a substncia activa e conservantes.
Limiares analticos (ppm) Xd Paracetamol Metilparabeno Propilparabeno 6.3 0.13 0.035 XLD 12.5 0.26 0.059 XLQ 37.6 0.78 0.21

Os limites de quantificao para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno encontram-se abaixo da concentrao do primeiro padro (50 ppm, 2.5 ppm e 0.25 ppm, respectivamente) o que est em

76

Captulo 4

Resultados e Discusso

conformidade com os requisitos no estabelecimento deste mesmo limite.

4.5.5. Preciso
A preciso do mtodo de anlise para o doseamento do paracetamol, metilparabeno e propilparabeno foi verificada em termos de repetibilidade e preciso intermdia.

4.5.5.1. Repetibilidade
A repetibilidade avaliada atravs da anlise do coeficiente de variao de um conjunto de rplicas consecutivas da mesma amostra. O mtodo considera-se preciso em termos de repetibilidade se o coeficiente de variao for inferior a 1.0 %. Neste caso fizeram-se dez injeces consecutivas de uma soluo amostra da suspenso e da soluo padro no mesmo dia, no mesmo equipamento e pelo mesmo analista e procedeu-se anlise do coeficiente de variao das reas obtidas tanto para a amostra da suspenso como para a soluo padro, os resultados obtidos encontram-se presentes na tabela 4.14.
Tabela 4.14- Coeficientes de variao da substncia activa e conservantes da amostra.
Amostra Concentrao (ppm) Paracetamol Metilparabeno Propilparabeno 756.64 (1.18) 37.08 (0.14) 3.15 (0.019) 0.2 0.4 0.6 CV % Padro Concentrao (ppm) 511.19 (0.65) 25.16 (0.15) 2.54 (0.013) 0.1 0.6 0.5 CV %

Pela anlise dos coeficientes de variao pode-se considerar o mtodo validado em termos de repetibilidade para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, uma vez que os valores obtidos so inferiores a 1.0 %.
77

Captulo 4

Resultados e Discusso

4.5.5.2. Preciso intermdia

Para estudar a preciso intermdia do mtodo foram realizadas anlises de amostras de padro e de xarope preparadas a 80%, 100% e 120% em dias diferentes, tendo sido avaliado o coeficiente de variao decorrente da injeco de trs gamas de concentrao diferentes de paracetamol, metilparabeno e

propilparabeno ao longo dos trs dias. O mtodo considera-se preciso em termos de preciso intermdia se o coeficiente de variao obtido for inferior a 2.0%. O factor efeito dia tambm foi estudado com o auxlio da ferramenta ANOVA. Na tabela 4.16 encontram-se os valores de concentrao obtidos para o paracetamol, na soluo amostra e na soluo padro, para o estudo de preciso intermdia.
Tabela 4.16- Preciso intermdia do mtodo para o paracetamol.
[Soluo amostra] (ppm) 80% 411.85 1 Dia 411.46 411.39 411.27 2 Dia 411.45 412.08 411.52 3 Dia 411.96 411.12 100% 576.52 577.97 576.33 575.21 576.33 575.26 577.77 576.86 576.99 120% 673.92 675.03 673.43 672.00 671.62 673.09 675.51 675.64 676.48 [Soluo Padro] (ppm) 80% 411.73 411.86 412.12 396.35 397.25 397.15 399.52 400.03 399.37 100% 511.50 510.64 510.24 501.37 500.67 500.26 501.21 500.95 501.43 120% 608.31 607.28 607.78 597.93 598.98 601.01 599.21 599.05 599.79

78

Captulo 4

Resultados e Discusso

Na soluo amostra para a gama de 80% o valor do teste (0.02) muito inferior em relao ao valor crtico unilateral da distribuio de Fisher ao nvel de confiana de 95 % (5.14) indicando que o factor dia no apresenta efeito relevante. O respectivo valor de prova (0.98) muito superior a 0.05 confirmando que, para esta amostra, nestas condies de anlise interdiria, a variabilidade obtida exclusivamente devida ao efeito da repetibilidade (0.37 ppm). Ao nvel de concentrao de 411.57 ppm verifica-se que estas anlises so extremamente precisas j que a repetibilidade assume um coeficiente de variao de apenas 0.1 %. Ao nvel de concentrao de 576.58 ppm (gama a 100 %) na soluo amostra obtm-se um valor de teste de 4.62 que inferior ao respectivo valor crtico previsto para a distribuio unilateral de Fisher (0.05) (5.14) indicando que o efeito dia tambm no se faz sentir neste caso. Esta deciso estatstica reforada pelo respectivo valor de prova (0.06) que superior ao limite 0.05. Assim, a repetibilidade assume agora o valor 0.70 ppm sendo o ensaio muito preciso (CV% = 0.1 %). J quando o teor da ordem de 674.08 ppm (na gama de 120 %) o valor de teste elevado (19.51) excedendo o valor crtico ao nvel de confiana de 95% e 99% (5.14 e 10.92, respectivamente). O valor de prova demasiado baixo (0.002) de forma que a hiptese alternativa tem de ser considerada revelando que existe efeito interdirio. Tendo a repetibilidade a contribuio de 0.71 ppm, a preciso intermdia assume o valor 1.8 ppm. Este ensaio muito preciso (CV% = 0.1 %) e apresenta o efeito interdirio que corresponde a uma incerteza da ordem de 0.3 %. Na soluo padro ao nvel de concentrao de 402.82 ppm, o valor de teste excessivo (1412.68) e o respectivo valor de prova nulo (0.000) indicando inequivocamente que o efeito dirio contribui significativamente nesta determinao. Enquanto que a repetibilidade
79

Captulo 4

Resultados e Discusso

assume um valor baixo (0.37 ppm) indicando uma boa preciso em condies de repetibilidade (CV% = 0.1 %). Contudo a variabilidade introduzida aqui pelo efeito dia assume a grandeza de 8.0 ppm (CV% = 2.0 %). Na soluo padro ao nvel de concentrao de 100 %, 504.25 ppm, o valor de teste excessivo (366.54) e o respectivo valor de prova nulo (0.000) concluindo que o efeito dirio contribui de forma significativa. Enquanto que a repetibilidade assume um valor de 0.57 ppm, indicando uma boa preciso em termos de repetibilidade (CV% = 0.1 %). Embora a variabilidade introduzida pelo efeito dia assuma a grandeza de 5.7 ppm (CV % = 1.1 %). Ao nvel de concentrao de 602.15 ppm (gama de 120%) observa-se de novo o efeito dirio na impreciso desta determinao. O valor do teste elevado (75.27) ultrapassando largamente os valores crticos respectivos e tambm nesta gama de concentrao o valor de prova nulo (0.000) reafirmando o efeito em causa. A repetibilidade permanece reduzida (0.98 ppm) indicando que o ensaio muito preciso em termos de repetibilidade (CV% = 0.2 %). O efeito dirio sobre a disperso estima-se ser da ordem de 4.9 ppm (CV% = 0.8 %).

Na tabela 4.17 encontram-se discriminados os valores de concentrao obtidos para o metilparabeno, na soluo amostra e na soluo padro, para validao de preciso intermdia deste composto na suspenso.

80

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.17- Preciso intermdia do mtodo para o metilparabeno.

[Soluo amostra] (ppm) 80% 20.92 1 Dia 20.88 20.91 20.91 2 Dia 20.68 20.95 20.91 3 Dia 20.95 20.91 100% 27.82 27.89 27.89 27.82 27.94 27.85 27.99 27.96 27.97 120% 33.46 33.57 33.52 33.36 33.43 33.46 33.66 33.66 33.72 [Soluo Padro] (ppm) 80% 20.08 20.06 20.07 20.01 20.01 20.15 19.89 19.93 19.88 100% 24.76 25.15 25.16 25.30 25.24 25.22 24.98 24.98 24.98 120% 29.98 29.91 29.94 30.45 30.45 30.56 30.02 30.07 30.06

Na soluo amostra, para o metilparabeno, na gama de 20.89 ppm o valor do teste (0.59) inferior ao valor crtico unilateral da distribuio de Fisher ao nvel de confiana de 95 % (5.14) indicando que o factor dia no apresenta efeito relevante. O respectivo valor de prova (0.58) muito superior a 0.05 confirmando que, para esta amostra, nestas condies de anlise interdiria, a variabilidade obtida exclusivamente devida ao efeito da repetibilidade (0.09 ppm). Ao nvel de concentrao de 20.89 ppm verifica-se que estas anlises so extremamente precisas j que a repetibilidade assume um coeficiente de variao de apenas 0.4 %. J quando o teor de metilparabeno da ordem de 20.97 ppm (na gama de 100 %) o valor de teste (6.44) superior ao valor crtico ao nvel de confiana de 95% embora no ultrapasse a 99% (5.14 e 10.92, respectivamente). Desta forma, pode-se afirmar a 99% de confiana que no existe efeito interdirio. Tendo a repetibilidade a
81

Captulo 4

Resultados e Discusso

contribuio de 0.04 ppm e o respectivo coeficiente de variao 0.15 %. Na gama de 120 %, ao nvel de concentrao de 33.54 ppm observa-se o efeito dirio na impreciso desta determinao. O valor do teste elevado (24.97) ultrapassando os valores crticos respectivos e o valor de prova praticamente nulo (0.001) reafirmando o efeito em causa. A repetibilidade permanece reduzida (0.047 ppm) indicando que o ensaio muito preciso em termos de repetibilidade (CV% = 0.1 %). O efeito dirio sobre a disperso estimase ser da ordem de 0.13 ppm (CV% = 0.4 %). No estudo do metilparabeno na soluo padro ao nvel de concentrao de 20.01 ppm (80 %) observa-se efeito dirio, uma vez que o valor teste (12.94) superior aos valores crticos a 95 e 99 % de confiana e o valor de prova 0.007, reafirmando o efeito dia. A repetibilidade apresenta contribuio de 0.05 ppm e o respectivo coeficiente de variao de 0.2 %, indicando que o ensaio preciso em termos de repetibilidade. Ao nvel de concentrao de 25.09 ppm na soluo padro obtm-se um valor de teste de 3.64 que inferior ao respectivo valor crtico previsto para a distribuio unilateral de Fisher (0.05) (5.14) indicando que o efeito dia no se faz sentir neste gama de concentrao. Esta deciso estatstica reforada pelo respectivo valor de prova (0.09) que superior ao limite 0.05. Assim, a repetibilidade assume agora o valor 0.13 ppm sendo o ensaio preciso (CV% = 0.5 %). Na soluo padro ao nvel de concentrao de 120 %, 30.16 ppm, o valor de teste excessivo (125.92) e o respectivo valor de prova nulo (0.000) concluindo que o efeito dirio contribui de forma significativa. Enquanto que a repetibilidade assume um valor de 0.04 ppm, indicando uma boa preciso em termos de repetibilidade (CV% =

82

Captulo 4

Resultados e Discusso

0.1 %). Embora a variabilidade introduzida pelo efeito dia assuma a grandeza de 0.3 ppm (CV% = 1.0 %).

Na tabela 4.18 encontram-se os valores de concentrao obtidos para o propilparabeno nas trs gamas de concentrao em estudo, na soluo amostra e na soluo padro, para validao de preciso intermdia deste composto na suspenso.
Tabela 4.18- Preciso intermdia do mtodo para o propilparabeno.
[Soluo amostra] (ppm) 80% 1.77 1 Dia 1.80 1.76 1.77 2 Dia 1.75 1.76 1.77 3 Dia 1.75 1.77 100% 2.38 2.36 2.36 2.34 2.37 2.36 2.36 2.36 2.36 120% 2.84 2.85 2.84 2.83 2.83 2.84 2.83 2.79 2.84 [Soluo Padro] (ppm) 80% 2.03 2.02 2.03 2.02 2.00 2.01 2.01 1.99 2.01 100% 2.53 2.53 2.52 2.61 2.59 2.57 2.52 2.50 2.57 120% 3.11 3.04 3.05 3.10 3.06 3.08 2.98 3.00 3.02

Na soluo amostra para a gama de 1.77 ppm de propilparabeno o valor do teste (1.04) inferior em relao ao valor crtico unilateral da distribuio de Fisher ao nvel de confiana de 95% (5.14) indicando que o factor dia no apresenta efeito relevante. O respectivo valor de prova (0.41) muito superior a 0.05 confirmando que, para esta amostra, nestas condies de anlise interdiria, a variabilidade obtida exclusivamente devida ao efeito da
83

Captulo 4

Resultados e Discusso

repetibilidade (0.013 ppm). Na gama de 80 %, para este conservante, verifica-se que estas anlises so precisas j que a repetibilidade assume um coeficiente de variao de 0.7 %. Para a gama de 2.36 ppm o valor do teste (0.46) muito inferior em relao ao valor crtico unilateral da distribuio de Fisher ao nvel de confiana de 95 % (5.14) indicando que o factor dia tambm no apresenta efeito relevante, nesta gama de concentrao. O respectivo valor de prova (0.65) muito superior a 0.05 confirmando que nestas condies de anlise interdiria, a variabilidade obtida exclusivamente devida ao efeito da repetibilidade (0.011 ppm). O coeficiente de variao 0.5 %, o que leva a concluir que as anlises so precisas nesta gama de concentrao para o propilparabeno na soluo amostra. Na soluo amostra para a gama de 1.83 ppm de propilparabeno o valor do teste (1.89) inferior em relao ao valor crtico unilateral da distribuio de Fisher ao nvel de confiana de 95% (5.14) indicando que o factor dia no apresenta efeito relevante. O respectivo valor de prova (0.23) muito superior a 0.05 confirmando que, para esta amostra e nestas condies de anlise interdiria, a variabilidade obtida exclusivamente devida ao efeito da

repetibilidade (0.016 ppm). O respectivo coeficiente de variao de 0.6%, indica que o ensaio preciso em termos de repetibilidade. Na soluo padro quando o propilparabeno se encontra na gama 2.01 ppm (na gama de 80 %) o valor de teste (7.46) superior ao valor crtico ao nvel de confiana de 95 % embora no ultrapasse a 99 % de confiana (5.14 e 10.92, respectivamente). A 99 % de confiana pode-se afirmar que no existe efeito interdirio. Tendo a repetibilidade a contribuio de 0.008 ppm e o respectivo coeficiente de variao 0.4 %, considera-se o ensaio preciso. Quando o teor de propilparabeno na ordem de 2.55 ppm (na gama de 100 %) o valor de teste (7.87) volta a ser superior ao valor
84

Captulo 4

Resultados e Discusso

crtico ao nvel de confiana de 95 % embora no ultrapasse a 99 %. A 99 % de confiana pode-se afirmar que no existe efeito interdirio relevante. A variabilidade obtida tambm se deve ao efeito repetibilidade que apresenta contribuio de 0.02 ppm e respectivo coeficiente de variao de 0.8 %. Quando o propilparabeno se encontra na gama de 3.05 ppm (na gama de 120 %), na soluo padro o valor de teste (7.83) superior ao valor crtico ao nvel de confiana de 95 % embora no ultrapasse a 99 % de confiana. Assim, a 99 % de confiana pode-se afirmar que no existe efeito interdirio. A repetibilidade apresenta contribuio de 0.03 ppm e o respectivo coeficiente de variao 0.9 %.

4.5.6. Exactido
Para avaliar a exactido do mtodo de doseamento do paracetamol e conservantes na amostra procedeu-se preparao de amostras de placebo, fortificadas com padro, de modo a obter solues com concentraes de paracetamol, metilparabeno e propilparabeno a 80, 100 e 120 % (tabela 4.19) e posteriormente compararam-se os valores obtidos com um padro de referncia, na mesma gama de concentraes. A exactido do mtodo de anlise foi avaliada pelo erro absoluto atravs do teste t-student e erro relativo e posteriormente procedeu-se determinao da percentagem de recuperao, como terceiro parmetro de desempenho do mtodo.

85

Captulo 4

Resultados e Discusso

Tabela 4.19- Resultados obtidos no estudo de exactido dos mtodos de quantificao dos doseamentos de paracetamol, metilparabeno e propilparabeno aos nveis de concentrao de 80, 100 e 120%. Doseamento (%) [Amostra]/ ppm [Padro]/ ppm Paracetamol 406.75 80 407.72 593.46 100 590.34 735.51 120 736.00 Metilparabeno 20.77 80 20.74 29.00 100 28.98 36.20 120 36.18 Propilparabeno 1.74 80 1.75 2.45 100 2.44 3.06 120 3.07 3.06 2.50 3.10 1.74 2.52 1.74 36.21 28.24 36.29 20.06 28.23 20.08 745.95 612.69 746.28 413.09 612.03 413.86

Do estudo da exactido, tabela 4.19, obteve-se para o paracetamol, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 407.3 (0.68), 591.9 (2.2) e 735.75 (0.35) ppm que correspondem ao coeficiente de variao de 0.2, 0.4 e 0.05 %, respectivamente. Tendo como valores de referncia 413.48 (0.55), 612.36 (0.46) e 746.11 (0.23) ppm, para cada gama de
86

Captulo 4

Resultados e Discusso

concentraes, a exactido avaliada atravs do teste t-student conduz ao valor de teste 7.23, 10.55 e 24.85 que inferior ao valor previsto pela distribuio t-student bilateral ao nvel de confiana de 99 % (12.71) excepto para a gama de concentrao de 120 % e desta forma verificou-se ao nvel de confiana 95 % (63.66) e conclui-se que inferior. Os valores obtidos como estimativas de erro relativo foram de 1.5, 3.3 e 1.4 % que se encontram dentro da gama pretendida (inferior a 5.0 %) e as percentagens de recuperao obtidas (98.5, 103.5 e 101.4 %) que se encontram dentro o intervalo pretendido (95.0 e 105.0 %). Pela anlise dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos de exactido para o paracetamol.

No estudo de exactido para o metilparabeno, tabela 4.19, obteve-se para cada gama de concentraes 80, 100 e 120% estimativas mdias de 20.76 (0.016), 28.99 (0.015) e 36.19 (0.013) ppm que correspondem ao coeficiente de variao de 0.08, 0.05 e 0.03%, respectivamente. Tendo como valores de referncia 20.07 (0.086), 28.23 (0.011) e 36.25 (0.054) ppm, para cada gama de concentraes, a exactido avaliada atravs do teste t-student conduz ao valor de teste 130.20, 40.25 e 2.15 que superior ao valor previsto pela distribuio t-student bilateral ao nvel de confiana de 99% (12.71) excepto para a gama de concentrao de120%. Desta forma verificou-se ao nvel de confiana 95% (63.66) e verificamos que apenas a gama de concentrao de 100% inferior. O valor de prova (= 0.005, 0.02 e 0.28) leva a afirmar que na gama de concentrao de 80% o ensaio apresenta erro sistemtico. O valor obtido como estimativa de erro relativo foi de 3.5, 2.7 e 0.9 % que se encontra dentro do pretendido (inferior a 5.0%) e a percentagem de recuperao obtida foi 103.4, 102.7 e 100.2% que se encontram compreendidas entre o intervalo permitido (95.0 e 105.0%). Assim,
87

Captulo 4

Resultados e Discusso

podemos concluir que o mtodo se encontra validado ao nvel de exactido para o metilparabeno.

Do estudo da exactido, tabela 4.19, obteve-se para o propilparabeno, para cada gama de concentraes ensaiadas, as estimativas mdias 1.74 (0.083), 2.45 (0.0058) e 3.07 (0.0012) ppm que correspondem ao coeficiente de variao de 0.5, 0.2 e 0.04 %, respectivamente. Tendo como valores de referncia 1.74 (0.0036), 2.51 (0.014) e 3.08 (0.023) ppm, para cada gama de concentraes, a exactido avaliada atravs do teste t-student conduz ao valor de teste 1.05, 18.27 e 0.81 que inferior ao valor previsto pela distribuio tstudent bilateral ao nvel de confiana de 99% (12.71) excepto para a gama de concentrao de 100 % e desta forma verificou-se ao nvel de confiana 95% (63.66) e verificamos que inferior. O valor obtido como estimativa de erro relativo foi de 0.21, 2.7 e 0.45 % que se encontra dentro do pretendido (inferior a 5.0%) e a percentagem de recuperao obtida foi 100.2, 97.3 e 99.6% que est dentro do intervalo permitido (95.0 e 105.0%). Pela anlise dos valores obtidos podemos afirmar que o mtodo se considera validado em termos de exactido para o propilparabeno.

88

Captulo 4

Resultados e Discusso

4.5.7.Estabilidade das solues analticas

A soluo padro a 100% e a amostra da suspenso foram mantidas temperatura ambiente do laboratrio (22C - 24C / 40% HR 60% HR) e no auto-injector do HPLC durante 24 horas. Este ensaio permite determinar o perodo de tempo no qual as amostras podem ser mantidas em bancada, no laboratrio, e no auto-injector do HPLC sem sofrerem degradao significativa. A estabilidade das solues foi verificada estatisticamente pela anlise ANOVA de um factor (onde se verifica a influencia do factor tempo) e pelo coeficiente de variao (CV, %).

4.5.7.1.Estabilidade da soluo padro

Na bancada A soluo padro 100% foi mantida temperatura ambiente do laboratrio (22 C - 24 C / 40% HR 60% HR), durante um dia. As amostras so injectadas, em duplicado, em diferentes intervalos de tempo, e as concentraes obtidas para a soluo padro encontramse na tabela 4.20.
Tabela 4.20- Estabilidade das solues padro na bancada.
Tempo (horas) 0 [Paracetamol] (ppm) 491.65 496.32 497.12 497.35 497.75 497.87 497.75 497.87 [Metilparabeno] (ppm) 23.97 24.21 24.29 24.37 24.37 24.32 24.37 24.32 [Propilparabeno] (ppm) 2.40 2.43 2.44 2.45 2.46 2.45 2.46 2.45

12

24

89

Captulo 4

Resultados e Discusso

No estudo de estabilidade da soluo padro durante um dia obteve-se para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno as estimativas de concentrao 496.71 (2.1), 24.28 (0.14) e 2.44 (0.019) ppm, respectivamente. Estas estimativas correspondem ao coeficiente de variao de 0.3, 0.4 e 0.4 %. Pela anlise ANOVA de um factor pode-se verificar que durante um dia a soluo padro a 100 % pode permanecer na bancada do laboratrio, sem sofrer degradao significativa pois o valor de teste obtido (2.47, 3.53 e 5.89) inferior ao valor previsto ao nvel de confiana de 99 % (6.59), ou seja, o factor tempo no influi na estabilidade da soluo padro durante um dia e quando esta se encontra na bancada. Como os coeficientes de variao so inferiores a 2.0 % quer para a substncia activa quer tambm para os conservantes, auxilia na confirmao da no influncia do factor dia.

Foi representado graficamente (figura 4.5) a estabilidade das concentraes (em ppm) do paracetamol, metilparabeno e

propilparabeno em funo do tempo.

90

Captulo 4

Resultados e Discusso
A

Figura 4.5- Estabilidade da soluo padro na bancada. A- Paracetamol, BMetilparabeno e C- Propilparabeno.

Atravs de figura 4.5 pode-se verificar que a mdia das concentraes obtidas durante um dia que a soluo permaneceu na bancada no varia significativamente para o paracetamol,

metilparabeno e propilparabeno.

91

Captulo 4 No auto-injector

Resultados e Discusso

A soluo padro 100 % foi mantida em viales no autoinjector, temperatura ambiente, durante um dia sendo injectada, em duplicado, em diferentes intervalos de tempo (tabela 4.21). Este ensaio permite determinar o perodo de tempo no qual a amostra pode ser mantida no auto-injector do HPLC, sem sofrer degradao significativa.
Tabela 4.21- Estabilidade da soluo padro no auto-injector.
Tempo (horas) 0 [Paracetamol] (ppm) 468.83 469.03 469.23 469.19 469.44 469.70 469.24 468.79 [Metilparabeno] (ppm) 21.34 21.33 21.37 21.34 21.29 21.32 21.36 21.33 [Propilparabeno] (ppm) 1.79 1.80 1.82 1.80 1.78 1.80 1.76 1.78

12

24

Durante o tempo de estudo da estabilidade da soluo padro quando esta se encontra no auto-injector obteve-se as estimativas de concentrao mdia 469.18 (0.30), 21.33 (0.024) e 1.79 (0.018) ppm para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno,

respectivamente, que correspondem ao coeficiente de variao 0.04, 0.09 e 1.1 %. Pela anlise ANOVA de um factor pode-se verificar que durante um dia a soluo padro pode ser mantida no auto-injector do HPLC, sem sofrer degradao significativa pois o valor de teste obtido para os trs compostos em estudo (4.07, 2.60 e 1.09) inferior ao valor previsto com 99 % de confiana (6.59) e o coeficiente de variao inferior a 2.0% para os trs compostos.

92

Captulo 4

Resultados e Discusso

A estabilidade da soluo padro foi verificada visualmente (figura 4.6) atravs dos valores de concentrao obtidos em funo do factor horas. A

Figura 4.6- Estabilidade da soluo padro no auto-injector. A- Paracetamol, B- Metilparabeno e C- Propilparabeno.

Pela anlise da figura 4.6 pode-se verificar que a mdia das concentraes obtidas para o paracetamol, metilparabeno e
93

Captulo 4

Resultados e Discusso

propilparabeno durante este estudo no sofreu alterao significativa, o que confirmar mais uma vez a estabilidade da soluo padro no auto-injector.

4.5.7.2. Estabilidade da soluo amostra

Na bancada A soluo amostra foi mantida temperatura ambiente do laboratrio (22 C - 24 C / 40% HR 60% HR), durante um dia. Os resultados obtidos encontram-se na tabela 4.22.
Tabela 4.22- Estabilidade da soluo amostra na bancada.
Tempo (horas) 0 [Paracetamol] (ppm) 566.05 567.94 572.89 566.07 569.95 570.39 569.15 568.06 [Metilparabeno] (ppm) 26.52 26.50 26.86 26.56 26.70 26.73 26.55 26.52 [Propilparabeno] (ppm) 2.24 2.22 2.23 2.20 2.21 2.16 2.29 2.27

12

24

As

estimativas

mdias

obtidas

para

paracetamol,

metilparabeno e propilparabeno durante o estudo da estabilidade da amostra foram 568.81 (2.30), 26.62 (0.13) e 2.23 (0.04) ppm, respectivamente, que correspondem ao coeficiente de variao 0.4, 0.4 e 1.1 %. Como os coeficientes de variao so inferiores a 2.0% quer para a substncia activa quer tambm para os conservantes, pode-se dizer que a amostra estvel durante um dia. Pela anlise ANOVA de um factor confirmou-se que durante o perodo de um dia a soluo amostra da suspenso pode permanecer na bancada do laboratrio, sem sofrer degradao significativa, pois o valor de teste

94

Captulo 4

Resultados e Discusso

obtido para os trs compostos (0.58, 2.20 e 4.88) menor que o valor previsto com 99% de confiana (6.59), ou seja, o factor horas na influncia na concentrao da substncia activa quer tambm para os conservantes. Na figura 4.7 pode-se visualizar a estabilidade da concentrao da amostra em funo do factor tempo. A

Figura 4.7- Estabilidade da soluo amostra na bancada do laboratrio. AParacetamol, B- Metilparabeno e C- Propilparabeno. 95

Captulo 4

Resultados e Discusso

Atravs da anlise da figura 4.7, verificou-se que durante vinte e quatro horas as concentraes mdias da amostra no variaram significativamente para o paracetamol, metilparabeno e

propilparabeno e assim confirmar o que o factor tempo no influencia as concentraes dos compostos durante o perodo de um dia. No auto-injector A soluo amostra da suspenso foi mantida em viales no auto-injector, temperatura ambiente, durante um dia sendo injectada, em duplicado, em intervalos de tempo diferentes (tabela 4.23).
Tabela 4.23- Estabilidade da soluo amostra no auto-injector.
Tempo (horas) 0 [Paracetamol] (ppm) 482.08 481.44 483.45 484.02 483.20 483.85 482.90 483.09 [Metilparabeno] (ppm) 22.59 22.59 22.76 22.72 22.68 22.69 22.71 22.80 [Propilparabeno] (ppm) 1.94 1.90 1.91 1.89 1.91 1.89 1.95 1.91

12

24

Durante a verificao da estabilidade da amostra no autoinjector obteve-se as estimativas de concentraes 483.00 (0.87), 22.69 (0.08) e 1.91 (0.02) ppm para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, respectivamente, que correspondem a um coeficiente de variao de 0.1, 0.2 e 1.1 %. Como os coeficientes de variao so inferiores a 2.0 %, podemos dizer que h estabilidade das concentraes durante um dia. Para a verificar a influncia do factor tempo na concentrao da amostra realizou-se a anlise ANOVA de
96

Captulo 4

Resultados e Discusso

um factor a 99% de confiana e verificou-se que o factor tempo influi para o paracetamol e metilparabeno uma vez que o valor de teste obtido (10.63 e 10.20, respectivamente) superior ao valor previsto com este grau de confiana (6.59) mas o que no se observou para o propilparabeno (o valor teste (1.09) menor que o valor previsto). Assim para o paracetamol e metilparabeno testou-se a influncia do factor a 95 % e verificou-se que durante um dia, o factor tempo no influi (o valor de teste inferior ao valor previsto com 95 % de confiana, 16.69). Desta forma, pode-se afirmar que a soluo amostra da suspenso pode permanecer na bancada do laboratrio durante este perodo de tempo, sem sofrer degradao significativa.

Na figura 4.8, encontra-se representada as concentraes mdias dos trs compostos em estudo em funo do tempo.

97

Captulo 4

Resultados e Discusso
A

Figura 4.8- Estabilidade da soluo amostra no auto-injector do HPLC. Concentrao do Paracetamol (A), Metilparabeno (B) e Propilparabeno (C) em ppm em funo do tempo em horas.

Atravs da anlise da figura 4.8, verificou-se que durante vinte e quatro horas as concentraes mdias da amostra no variaram

98

Captulo 4 significativamente para o

Resultados e Discusso
paracetamol, metilparabeno e

propilparabeno e assim confirma-se o que o factor tempo no influencia as concentraes dos compostos durante o perodo de um dia quando esta se encontra no auto-injector do HPLC.

99

5.Concluses ______________________

100

Captulo 5

Concluses

5. Concluses
O trabalho desenvolvido visava essencialmente dois objectivos o desenvolvimento de uma formulao farmacutica contendo paracetamol e a validao do respectivo mtodo de anlise. Para esse efeito preparou-se uma suspenso de cor amarela contendo 40 mg de paracetamol por mL. Atravs do estudo de solubilidade do paracetamol, verificou-se que este parmetro depende do solvente e do pH do meio, e que com o tampo acetato a pH 4.5 apresenta maior solubilidade. Para a avaliao dos parmetros de validao do mtodo de anlise do doseamento simultneo de paracetamol, metilparabeno e propilparabeno na formulao farmacutica em HPLC comeou por se verificar a especificidade/selectividade do mtodo e atravs dos cromatogramas comprovou-se que no existem interferentes no doseamento do princpio activo e dos conservantes. Pelo parmetro de linearidade estabeleceu-se para cada composto a respectiva curva de calibrao linear com equao de polinmio de primeiro grau. A gama de trabalho construiu-se a partir de sete padres (excepto para o metilparabeno, foram seis) e definiu-se de 50 a 600 ppm, 2.5 a 30 ppm e 0.25 a 3 ppm, para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, respectivamente. A partir das curvas de calibrao estabeleceu-se os limiares analticos para os trs compostos a dosear, onde se obteve como limites de quantificao 37.56 ppm, 0.778 ppm e 0.212 ppm, para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, respectivamente. A sensibilidade do mtodo de anlise determinou-se pelo declive da curva de calibrao onde se obteve para o paracetamol
101

Captulo 5

Concluses

5.23 (0.03) E+04 ppm-1, para o metilparabeno 1.32 (0.0039) E+05 ppm-1 e para o propilparabeno 1.39 (0.011) E+05 ppm-1. A preciso do mtodo verificou-se pela repetibilidade e preciso intermdia. Em termos de repetibilidade, os coeficientes de variao obtidos para o paracetamol, metilparabeno e propilparabeno na soluo padro e na soluo amostra foram inferiores a 1.0 %, logo o mtodo encontra-se validado em termos de repetibilidade. Quanto preciso intermdia avaliou-se a soluo padro e amostra em trs gamas de concentraes diferentes (80 %, 100 % e 120 %) e em trs dias diferentes. Em todos os casos os coeficientes de variao obtidos foram inferiores a 2.0 %, logo o mtodo considera-se validado em termos de preciso intermdia, nestas gamas de concentrao. Contudo pela anlise ANOVA, verificou-se que existe efeito dia para a soluo amostra a 120 % e na soluo padro em todas as gamas de concentrao estudadas, no caso do paracetamol. No caso do metilparabeno tambm se verificou efeito interdirio na soluo amostra a 120 % e nas solues padro a 80 % e 120 %. Nas concentraes de propilparabeno na soluo amostra e padro no existe efeito interdirio. Como os parmetros indicadores da preciso do mtodo se encontram validados, o mtodo encontra-se tambm validado no parmetro preciso. A exactido do mtodo avaliou-se pelo erro absoluto atravs do teste t-student a 95 % de confiana e erro relativo e posteriormente procedeu-se determinao da percentagem de recuperao, como terceiro parmetro de desempenho do mtodo, e em ambos os casos verificou-se que o mtodo exacto, ou seja, no apresenta erro sistemtico significativo. Foi ainda verificada a estabilidade da soluo padro e da soluo amostra durante vinte e quatro horas na bancada e no autoinjector do HPLC, no doseamento simultneo do paracetamol, metilparabeno e propilparabeno. Pelo estudo de anlise ANOVA
102

Captulo 5

Concluses

verificou-se que o factor tempo no influi na estabilidade das solues e os coeficientes de variao obtidos foram inferiores a 2.0 %, pelo que se pode confirmar a estabilidade das solues neste perodo de tempo. A metodologia testada para doseamento, em simultneo, do paracetamol, metilparabeno e propilparabeno, considera-se validada, uma vez que satisfaz as especificaes determinadas para cada parmetro de validao testado.

103

6.Bibliografia ______________________

104

Captulo 6

Bibliografia

6. Bibliografia
[1] H. Hass, The American Journal of Medicine,75, 1983, 1-3. [2] Estatuto do Medicamento, Decreto-Lei n. 176/2006, de 30 de Agosto. [3] R. Rao, A. Narasaraju, Analytical Sciences, 22,2006, 287-292. [4] Paracetamol, in AHFS Drug Information. January 2007, American Society of Health-System Pharmacists: Maryland, Bethesda. [5] Paracetamol, in Martindale: The complete Drug Reference, 2008, Sean C. Sweetman [6] History of paracetamol. Disponvel em

http://www.pharmweb.net/pwmirror/pwy/paracetamol/pharmwebpic5.ht ml (acedido em 01/06/2010). [7] Acetaminophen, United States Pharmacopeia 32. [8] L. E Zhnyakina, M. L. Tkachenko, A. S. Kosmynin, Y. V. Moshchenskii, Pharmaceutical Chemistry Journal, 2001,35, 32 33. [9] Dissolution Test for Solid Dosage Forms, in European

Pharmacopoeia Sixth Edition. [10] L. Kalantzi, C.Reppas, J. Dressman, G.Amidon, H. Junginger, K. Midha, V. Shah, S.Stavchansky, D.Barends, Journal of Pharmaceutical Sciences , 95 (1), 2006,4-14. [11] Paracetamol, in Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, A. Moffat, M. Osselton, B. Widdop, L. Galichet. [12] Paracetamol, in The Merck Index 2001, Pharmaceutical Press. [13] M.A. Olivac, R. A. Olsinaa, A. N. Masi, Talanta, 66, 2005, 229 235.

105

Captulo 6

Bibliografia

[14] T. Belal, T. Awad, C.R. Clark, Journal of Chromatographic Science, 47,2009,849-854. [15] E. Kumpulainen, H. Kokki, T. Halonen, M. Heikkinen, J. Savolainen, M. Laisaimi, American Academy of Pediatrics, 2007, 119, 766-771 [16] D. Bartlett, Journal of Emergency Nursing, 30 (3), 2004, 281-283. [17] S. M. Riordana, R. Williams, Addiction Biology, 7 (2), 2002, 191 206. [18] C. Van der Marel, B.Anderson, R. Van Lingen, N. Holford, M. Pluim, F. Jansman, J. Van den Anker, D.Tibboel, European Journal of Clinical Pharmacology, 60(4),2004 297. [19] ndice teraputico, 2009, Tupam Editores, Tcnica & Magia Lda. [20] J. Swarbrick, J. Boylan, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 1995 [21] D. Wadke, A. Serajuddin, H. Jacobson, Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets., Marcel Dekker,1989. [22] J. Ermer, J. Miller, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, Wiley VCH, Wheinheim, 2005. [23] Validation of Analytical Methods:Definitions and Terminology, Q2A, ICH Harmonized Guideline,1995 [24] Validation of Analytical Procedures: Methodology, Q2B, ICH Harmonized Guideline, Techinical Coordenationn R.Bass, London E14 4HB, UK ,1996 [25] Norma Portuguesa: Requisitos gerais de competncia para laboratrios de ensaio e calibrao NP EN ISSO/IEC 17025:2005 [26] Working Party on Control of Medicines and Inspections, European Commission, Brussels, 2000 [27] Guidance for Industry Analytical Procedures and Methods Validation, 2000 [28] Validation of analytical procedures: methodology, ICH,

Harmonised Tripartite Guideline, 1996

106

Captulo 6

Bibliografia

[29] G.A.Shabir, Journal of Chromatography A, 987,2003, 57-66. [30] R. Rowe, P. Sheskey, M. Quinn, Pharmaceutical Excipients, 6. edio, Hardcover, 2009.

107

Anexos

Anexos
A.1. Cromatogramas correspondentes ao ensaio de especificidade
A

108

Anexos

109

Anexos

Figura A.1 - Cromatogramas correspondentes ao ensaio de especificidade no mtodo de doseamento do paracetamol e de metil e propilparabeno: A Branco de fase mvel; B Branco da amostra; C Soluo padro de Paracetamol, Metil e Propilparabeno (CParaceamol: 500g/ml, CMetilparabeno:25g/ml, CPropilparabeno:2,5g/ml); D - Amostra de suspenso 40mg/ml (CParacetamol: 500 g/ml, CMetilparabeno: 25 g/ml, CPropilparabeno: 2,5 g/ml); E Amostra de soluo de referncia Ben u ron 40 mg/ml.

110