Protocolo Sta Catarina

Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Curso de Agronomia
DESENVOLVIMENTO DE UM PROTOCOLO PARA MICROPROPAGAO DE VETIVER (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).
Couglan Hilter Sampaio Cardoso
Florianpolis/SC, Junho de 2011
Desenvolvimento de um protocolo para micropropagao de Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).
Relatrio de Concluso de Curso apresentado ao Curso de Graduao em Agronomia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), como requisito parcial para obteno do grau de Engenheiro Agrnomo.
Nome do Aluno: Couglan Hilter Sampaio Cardoso Orientador: Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra Supervisor: Dr. Douglas Andr Steinmacher
Florianpolis/SC, Junho de 2011
Assinaturas da Comisso Examinadora aprovando o Relatrio de Concluso de Curso
Desenvolvimento de um protocolo para micropropagao de Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).

elaborado por
Couglan Hilter Sampaio Cardoso
como requisito parcial para obteno do grau de Engenheiro Agrnomo
BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________________ Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra (FIT/CCA/UFSC)
_________________________________________________ Dr. Douglas Andr Steinmacher (FIT/CCA/UFSC) _________________________________________________ Engenheiro Agrnomo Yohan Fritsche (FIT/CCA/UFSC)
Florianpolis, 28 de Junho de 2011
AGRADECIMENTOS:
Agradeo primeiramente a Deus; Aos meus pais, Ademir Joo Cardoso e Rosngela Rocha Sampaio Cardoso, e minha irm Danna, pelo carinho e incentivo de uma vida; s amizades que cultivei durantes os seis anos da faculdade e que sempre levarei em pensamento; Ao pessoal do LFDGV, em especial Clarissa Capestrano, ao Ramon Felipe Scherer e Yohan Fritsche pelos conhecimentos repassados; Ao professor Miguel Pedro Guerra e Douglas Steinmacher pelo apoio e confiana demonstrada; Ao Carlos Tadeu Freitas da Silva Jr. por me apresentar ao Capim Milagroso; UFSC pela infra-estrutura.
RESUMO: O Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty) uma planta de origem Asitica, especificamente do Sul da ndia e sua utilizao se limitava produo de leo essencial at meados da dcada de 1980. Por apresentar caractersticas morfolgicas, fisiologias e ecolgicas particulares da espcie, conhecido como Capim Milagroso na sia. Servindo-se das caractersticas do Vetiver, o Banco Mundial, em 1986, desenvolveu o Sistema Vetiver (SV) como uma maneira sustentvel para o controle de eroso e recuperao de reas degradadas. Por no apresentar estoles ou sementes frteis o Vetiver no considerado uma planta invasora e sua propagao realizada utilizando partes maduras de touceiras da planta-me, tais como mudas de razes nuas, coroa e colmos. Uma alternativa para a produo massal de mudas de Vetiver a cultura de tecidos. Neste contexto, o incentivo do uso do SV para preservao/recuperao de reas degradadas deve ser estimulado aqui no Brasil e protocolos especficos devem ser desenvolvidos para aperfeioar a propagao in vitro de Vetiver para produo de mudas para o controle de eroso e recuperao de reas degradadas. O desenvolvimento de um protocolo para micropropagao de Vetiver foi conduzido no Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal do CCA/UFSC durante o perodo de 11/03/2010 at 28/06/2011. Este protocolo procurou estabelecer uma maneira eficaz para o estabelecimento de culturas asspticas, multiplicao de brotos, pr-aclimatizao in vitro e aclimatizao. Os experimentos realizados foram: a) estabelecimento de culturas asspticas; b) multiplicao de brotos e incremento de massa fresca; c) multiplicao de brotos sob diferentes densidades de meio de cultura (slido e lquido) e de agentes geleificantes (gar e fita-gel); d) efeito do GA3 e ANA em aglomerados visando alongamento de colmos e desenvolvimento de folhas; e) influncia de diferentes substratos na aclimatizao do Vetiver. Os resultados demonstraram que: a) o experimento de desinfestao de gemas basais de colmo no apresentou resultados estatsticos concretos e deve ser levado em desconsiderao, porm foi possvel estabelecer uma cultura assptica; b) o meio de cultura suplementado com ANA (2 M) + BAP (8 M) obteve melhor resultado para desenvolvimento de brotos e o meio contendo ANA (2 M) + BAP (2 M) apresentou maior incremento de massa fresca; c) o maior desenvolvimento de brotos ocorreu em meio de cultura lquido; d) o meio de cultura no suplementado com ANA favorecia o desenvolvimento de colmos por aglomerado e de folhas por colmo, todos os tratamentos suplementados com GA3 no diferiam quanto desenvolvimento de colmos e nem do nmero de folhas por colmo; e) os diferentes substratos (composto orgnico, casca de arroz carbonizado e espuma fenlica) no apresentaram diferenas estatsticas quanto ao crescimento da folha e da raiz. Realizando os estgios pr-determinados acima foi possvel obter mudas de Vetiver.
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... I LISTA DE TABELAS ......................................................................................................................... II LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS .......................................................................................... III 1 2 3 4 INTRODUO: ....................................................................................................................... 1 OBJETIVOS: ........................................................................................................................... 2 JUSTIFICATIVAS: .................................................................................................................... 3 REVISO BIBLIOGRFICA: ...................................................................................................... 5 4.1 - Caractersticas gerais da planta: ......................................................................................... 5 4.2 - Sistema Vetiver: ................................................................................................................ 7
4.2.1 - Conservao do solo e de sua umidade: ............................................................................................. 8 4.2.2 - Preveno e tratamentos de reas contaminadas: ........................................................................... 10 4.2.3 - Vantagens e desvantagens do Sistema Vetiver: ................................................................................ 12
4.3 - Outras utilidades: ............................................................................................................ 13 4.4 Propagao do Vetiver: ................................................................................................... 15 4.5 - Biotecnologia: ................................................................................................................. 16
4.5.1 - Cultura de Tecidos: ............................................................................................................................ 17 4.5.5.1 - Laboratrio de Cultura de Tecidos de plantas: .......................................................................... 18 4.5.5.2 - Metodologia geral da Micropropagao: ................................................................................... 19 4.5.5.3 - Meio de cultura: ......................................................................................................................... 21 4.5.5.3 - Reguladores de crescimento: ..................................................................................................... 22
MATERIAL E MTODOS: ....................................................................................................... 24 5.1 - Obteno de culturas asspticas: ..................................................................................... 24 5.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca: .............. 25 5.3 - Efeitos de diferentes densidades de meio de cultura e de agentes geleificantes na multiplicao de brotos:.......................................................................................................... 26 5.4 - Efeito do GA3 e ANA no desenvolvimento de plntulas: .................................................... 27 5.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver: ............................................................................. 28
RESULTADOS E DISCUSSO: ................................................................................................. 29 6.1 - Obteno de culturas asspticas: ..................................................................................... 29 6.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca: .............. 31 6.3 - Efeitos de diferentes densidades de meio de cultura e de agentes geleificantes na multiplicao de brotos:.......................................................................................................... 33 6.4 - Efeitos do GA3 e ANA no desenvolvimento de plntulas ................................................... 36 6.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver .............................................................................. 38
7 8
CONCLUSES:...................................................................................................................... 39 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS: ........................................................................................... 40
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: a) planta de Vetiver cultivada em vaso, observar o sistema radicular da planta ao lado com aproximadamente 6 meses de idade; b) gemas desenvolvidas por micropropagadas de Vetiver em meio de cultura suplementado com 2 M ANA / 4 M BAP (30 dias); c) Relao do crescimento de razes de Chrysopogon zizanioides (L) Roberty e C. nemoralis (foto c; adaptado TRUONG, et al. 2006). ..................................... 6 Figura 2: Gemas basais do colmo de Chrysopogon zizanioides a) gemas basais de diferentes tamanhos, observar os primrdios foliares; b) gemas basal induzida em meio de cultura MS suplementado com 2 M de ANA e 4 M BAP. .............................. 30 Figura 3: Desenvolvimento de Chrysopogon zizanioides em meios de cultura contendo diferentes concentraes de reguladores de crescimento (ANA e BAP). a) plantas desenvolvidas em meio suplementado com ANA (2 M) + BAP (8 M); b) detalhe do aglomerado de gemas, com aproximadamente 15 brotos, desenvolvido em meio de cultura suplementado ANA (2 M) + BAP (8 M) e ANA (2 M) + BAP (4 M); c) intenso desenvolvimento radicular em meio de cultura isento de reguladores de crescimento; d) detalhe da proeminncia na base do colmo quando o meio era suplementado com ANA (8 M) + BAP (2 M). ................................................................. 32 Figura 4: Desenvolvimento de clusters em meios de cultura em diferentes densidades e agentes geleificantes de Chrysopogon zizanioides. a e b) desenvolvimento foliar em meio de cultura com gar; c e d) desenvolvimento de clusters em meio de cultura lquido. ................................................................................................................................ 35 Figura 5: Desenvolvimento de clusters de Chrysopogon zizanioides em meio de cultura MS suplementado com GA3 e ANA. a) observar a quantidade de razes e vigor das folhas, meio sem reguladores de crescimento; b) aglomerados com sinais de fitotoxidez; c) aglomerado com crescimento homogneo em meio suplementado com 10 M de GA3; d) expanso foliar em meio suplementado com 15 M de GA3. ............. 37
II
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Taxa de contaminao e sobrevivncia das gemas axilares de Chrysopogon zizanioides quando desinfestadas em diferentes tempos de imerso (5, 10, 15 min) em hipoclorito de sdio........................................................................................................... 30 Tabela 2: Incremento de massa fresca e desenvolvimento de brotos de Crhysopogon zizanioides submetidos a tratamentos com reguladores (ANA e BAP) de crescimento em diferentes concentraes............................................................................................ 31 Tabela 3: Nmero de brotos de Chrysopogon zizanioides desenvolvidos em diferentes consistncias de meio de cultura e agentes geleificantes. ............................................ 33 Tabela 4: Influncia do meio de cultura MS suplementado com GA3 e ANA no desenvolvimento de colmos por cluster e de folhas por colmo em aglomerados de gemas de Chrysopogon zizanioides. ............................................................................... 36 Tabela 5: Crescimento de folha e raiz de Chrysopogon zizanioides cultivados em diferentes substratos. ....................................................................................................... 38
III
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
Siglas C M 2,4-D 6-BA AIA AIB ANA BAP CVs GA3 HCl LFDGV NaOH pH PVC SNK SV Grau(s) celsius Micromolar cido 2,4 diclorofenoxiactico 6-Benzylaminopurine cido indolactico cido indolbutrico cido naftalenactico Benziladenina Coeficientes de variao
Significado
cido Giberlico cidoclordrico Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal Hidrxido de sdio Potencial hidrogeninico Policloreto de vinila Teste de separao de mdias Student-Newman-Keuls Sistema Vetiver
INTRODUO:
O Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty) uma planta de origem Asitica,
especificamente do Sul da ndia. At meados da dcada de 1980 sua utilizao praticamente limitava-se produo do leo essencial. Conhecido na sia como Capim Milagroso, o Vetiver apresenta caractersticas morfolgicas, fisiologias e ecolgicas intrnsecas da espcie. A planta resiste s mais diversas condies edafoclimticas, sobrevive em condies de secas prolongadas, incndios, inundaes e temperaturas extremas (-15C a +55C). Quando submetido ao intenso trfego/presso de pastoreio, soterramento por sedimentos ou poda severa rapidamente se recompe emitindo novos perfilhos. Tolera solos sdicos, salinos, alcalinos, uma ampla faixa de pH (3.3 a 12.5), altos nveis de saturao de Al, Mn e diversos metais pesados. Por no apresentar sementes frteis ou estoles o Vetiver no considerado uma planta invasora. Servindo-se das caractersticas do Vetiver, em 1986 o Banco Mundial promoveu, baseado na Tecnologia do Capim Verde, o Sistema Vetiver (SV) como uma maneira sustentvel para o controle de eroso e recuperao de reas degradadas. A aplicao dessa Tcnica na Bioengenharia consiste no cultivo em fileiras do Vetiver, formando cordes vegetativos que atuam como barreiras vivas que recobrem o solo, diminuindo a ao direta do impacto da gota da chuva sob sua superfcie e reduzindo a velocidade superficial da gua. A conservao da umidade do solo e o resgate de nutrientes ao longo do perfil melhoram o micro-clima e proporciona condies favorveis para o estabelecimento de outras plantas semeadas ou voluntrias no local. Alm do mais as caractersticas morfolgicas e fisiolgicas nicas da espcie tornam o Vetiver uma excelente planta a ser empregada na proteo ambiental, em especial na preveno e tratamento do solo e da gua contaminada, podendo ser utilizado em tratamentos de guas residuais e fitoremediao de solos contaminados. As grandes vantagens do SV so: o baixo custo de implantao e longevidade da vidatil da obra quando comparado com mtodos da engenharia convencional; uma vez estabelecido, virtualmente livre de manuteno. O custo de implantao desse Sistema , em mdia, 30% do valor das solues de engenharia tradicionais. Experimentos demonstram que o uso do SV, combinado com outras tcnicas de conservao do solo, tem se revelado muito eficaz e de baixo custo na Bioengenharia. No entanto, convm sublinhar que as chaves mais importantes para o sucesso do projeto so: aplicao de tcnicas corretas no plantio, um bom material a ser cultivado e a elaborao de um projeto especfico para cada rea.
Alm do uso do Vetiver na conservao do solo/gua, outros usos/utilidades potenciais podem ser considerados. H mais de trs mil anos a utilizao do Vetiver se restringia, em grande parte da sia, extrao do leo essencial de suas razes, mas suas folhas podem ser utilizadas na alimentao de animais, produo de etanol, complemento para fabricao do papel, construo civil, paisagismo, artesanatos, entre outros. Como a reproduo do Vetiver exclusivamente vegetativa a produo de mudas realizada principalmente em viveiros mantidos a campo, necessitando de um amplo espao para o cultivo de plantas matrizes. A forma mais comum de se propagar mudas de Vetiver a propagao das partes maduras de touceiras da planta-me, tais como mudas de razes nuas, coroa e colmos. Uma alternativa para a produo massal de mudas de Vetiver para recuperao de reas degradadas a cultura de tecidos. Este trabalho procurou estabelecer mtodos para elaborao de um protocolo para propagao in vitro de Vetiver, visando produo massal de mudas para recuperao de reas degradadas.
OBJETIVOS:
O objetivo geral do presente estudo foi desenvolver um protocolo de propagao in
vitro de Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty) visando produo massal de mudas para recuperao de reas degradadas. Os objetivos especficos do trabalho so: Avaliar a eficincia do hipoclorito de sdio na desinfestao de gemas basais do colmo submetidos a diferentes tempos de imerso para o estabelecimento de culturas asspticas. Comparar o efeito de diferentes concentraes combinadas dos reguladores de crescimento ANA e BAP na multiplicao de brotos e no incremento de peso de explantes de Vetiver. Determinar o efeito do meio de cultura lquido e slido (gar e fita-gel) na multiplicao de brotos. Avaliar a influncia dos reguladores de crescimento GA3 e ANA no desenvolvimento de colmos em aglomerados e o nmero de folhas por colmo.
Determinar o melhor substrato a ser utilizado no processo de aclimatizao, avaliando a taxa de sobrevivncia, crescimento da raiz e desenvolvimento de folhas das plntulas.
JUSTIFICATIVAS:
A ao do escoamento superficial da gua e do vento em solo descoberto provoca uma
grande perda anual de solos cultivveis, tornando terrenos com alto potencial em reas improdutivas e menos sustentveis. Alm da eroso, catstrofes naturais desestabilizam solos causando desabamentos e deslizamentos de terra que podem acarretar em perdas valiosas na infra-estrutura de uma propriedade. Em 1986 o Banco Mundial desenvolveu o Sistema Vetiver como uma maneira sustentvel para o controle de eroso e recuperao de reas degradadas. Esse Sistema, utilizado na Bioengenharia, baseado na Tecnologia do Capim Verde. Esta tcnica consiste no cultivo em fileiras do Vetiver, estes cordes vegetativos atuam como barreiras vivas que recobrem o solo, diminuem o impacto das gotas de chuva, reduzem a velocidade superficial da gua e atuam na conteno de sedimentos, formando progressivamente um terrao natural. Em terras instveis ou erodveis o SV primeiro reduz a eroso para depois estabilizar o solo, conservando sua umidade e resgatando nutrientes ao longo do perfil; melhorando o microclima do local para que outras plantas semeadas ou voluntrias possam estabelecer-se mais tarde. Alm dessas caractersticas de proteo fsica do solo a planta possui caractersticas morfolgicas e fisiolgicas nicas especializadas na proteo ambiental, em especial na preveno e tratamento do solo e gua contaminada, podendo ser utilizadas em tratamentos de guas residuais e fitoremediao de solos contaminados. Por no apresentar sementes frteis ou estoles o Vetiver no se torna invasivo no meio ambiente, podendo ser utilizado em diversos stios ecolgicos. Sua rusticidade torna a planta capaz de sobreviver numa ampla gama de ambientes. Truong et al. (2006) afirmam que o Vetiver capaz de sobreviver em condies de secas prolongadas, incndios, inundaes, temperaturas extremas (-15C a +55C) e quando submetido ao intenso trfego/presso de pastoreio, soterramento por sedimentos ou poda severa rapidamente se recompe emitindo novos perfilhos. Tolera solos sdicos, salinos, alcalinos, uma ampla faixa de pH (3.3 a 12.5), altos nveis de saturao de Al, Mn e metais pesados tais como: As, Cd, Cr, Ni, Pb, Hg, Se e Zn. Quando no for mais interessante manter a planta, a pulverizao de glifosato (Roundup) ou o corte da planta abaixo da coroa pode elimin-la do local.
A qualidade do material de plantio fundamental para o sucesso do SV. A produo desse material requer viveiros capazes de produzir grandes quantidades de mudas de alta qualidade e de baixo custo. Como a reproduo do Vetiver exclusivamente vegetativa a produo de mudas realizada principalmente em viveiros mantidos a campo, o que necessita um amplo espao para o cultivo de plantas matrizes. Uma alternativa para a produo massal de mudas de Vetiver a cultura de tecidos. Pode-se afirmar que a capacidade do controle do ambiente, a grande quantidade de material produzido em espao reduzido, o controle da produo de mudas geneticamente idnticas e livres de contaminantes, so vantagens da cultura de tecidos. Porm, o maior obstculo na propagao in vitro do Vetiver o custo do investimento inicial e da manuteno de um laboratrio; a necessidade de mo-de-obra especializada, elaborao de protocolos especficos para cada variedade e a probabilidade de ocorrncia de mutaes genticas tambm so entraves na cultura de tecidos. Truong et al. (2006) recomendam o cultivo de mudas de razes nuas em sacos de polietileno (polybags) quando o local de plantio apresentar condies adversas e hostis. Esta prtica facilita o estabelecimento e crescimento ps-plantio das mudas pois tornam as plantas mais resistentes a variao de temperatura e umidade, minimizando o manejo da manuteno. Por outro lado, a produo, o longo perodo de preparao das mudas e o transporte de grandes volumes das polybags encarecem essa tcnica. Truong, et al. (2006) apresentam um mtodo alternativo, baseado na polybags, para o cultivo do Vetiver. Neste mtodo as plantas so cultivadas bem perto uma da outra em uma longa esteira especial, formando um cordo uniforme, o que aumenta a sobrevivncia da planta e facilita o transporte e o plantio em reas restritas. Pereira (2006) afirma que o uso do Vetiver para controle da eroso, estabilizao de encostas e conservao da gua/solo no Brasil ainda muito restrito, em razo da deficincia de produo de mudas e da pouca informao a respeito das tcnicas utilizadas no SV. O mesmo autor ainda afirma que o aumento de conhecimento sobre as funes da planta e da confirmao do sucesso de experimentos realizados nos estados Brasileiros, est abrindo portas para que esta tecnologia seja difundida largamente no Brasil. Alm do controle da eroso, estabilizao de encostas e conservao da gua/solo, outras funes podem ser atribudas ao Vetiver: de suas razes se extrai o leo essencial utilizado na medicina natural e na fixao de perfumes; suas folhas so utilizadas na alimentao de animais, artesanatos, produo de bicombustvel e suas cinzas tm alto potencial na substituio do cimento; sua bela inflorescncia lils apreciada no paisagismo; entre outros. Devido a essas caractersticas deve-se estimular o uso do Vetiver na gerao de
renda em comunidades de pases em desenvolvimento. O mesmo deve ocorrer com uso do SV em reas em que ocorreram desastres ecolgicos, encorajando a participao dos integrantes da comunidade nas etapas do projeto. O SV de fcil utilizao, baixo custo e, se aplicado corretamente, funciona! Na maioria dos casos, a falha no uso da Tecnologia do Capim Verde devido compreenso inadequada ou aplicaes incorretas da Tcnica, e no ao Sistema em si. No entanto, convm sublinhar que as chaves mais importantes para o sucesso do projeto so: aplicao de tcnicas corretas no plantio, um bom material a ser cultivado e a elaborao de um projeto especfico para cada rea. A divulgao e o estabelecimento do SV podem surtir grande efeito no Estado, visando a preveno/recuperao de desastres como o que ocorreu no Vale do Itaja em 2008. Atualmente essa tecnologia de domnio pblico e a informao sobre ela gratuita. Por todos os motivos acima mencionados deve-se estimular o desenvolvimento de protocolos especficos para micropropagao do Vetiver.
REVISO BIBLIOGRFICA:
4.1 - Caractersticas gerais da planta:
O Vetiver (Vetiveria zizanioides (L.) Nash), recentemente reclassificado como Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty, uma planta perene, cespitosa, ereta com 1,50-2,00 m de altura pertencente famlia Poaceae. Ela ainda conhecida como capim-vetiver, capimverde, capim-de-cheiro, grama-das-ndias, falso-patchuli e raiz-de-cheiro, de acordo Correia apud Barros (2008). Possui numerosas razes, de cor parda escura, fortes, longas e aromticas. Suas folhas so estreitas e longas, fortes, eretas, mas com a extremidade dobrada, no aromtica, mais escura que o colmo, com margens speras e cortantes, com lgula curta e escariosa (CASTRO e RAMOS apud BIASI e DESCHAMPS, 2009). O Vetiver possui quatro espcies do gnero Chrysopogon distintas de origem Sul Asitica. No Norte do subcontinente Indiano encontra-se a espcie C. lawsonii, silvestre, normalmente diplide de sementes frteis e sistema radicular escasso. No Sul da ndia existem diversos acessos da espcie C. zizanioides, planta domesticada, poliplide de sementes infrteis e de extenso sistema radicular. A espcie C. nemoralis distribu-se amplamente nas terras bem drenadas da Tailndia, Laos e Vietnam estendendo a Camboja e Mianmar. A espcie C. nigritana nativa do Continente Africano tem seu uso restrito ao continente (TRUONG et al., 2006).
Figura 1: a) planta de Vetiver cultivada em vaso, observar o sistema radicular da planta ao lado com aproximadamente 6 meses de idade; b) gemas desenvolvidas por micropropagadas de Vetiver em meio de cultura suplementado com 2 M ANA / 4 M BAP (30 dias); c) Relao do crescimento de razes de Chrysopogon zizanioides (L) Roberty e C. nemoralis (foto c; adaptado TRUONG, et al. 2006).
At meados da dcada de 1980 a utilizao do Vetiver praticamente limitava-se a produo do leo essencial. No decorrer desta dcada os centros de investigaes na ndia realizaram os primeiros projetos de conservao do solo/gua utilizando a Tecnologia do Capim Verde (TCV) na Malsia e Tailndia. A TCV baseada no cultivo em curva de nvel do capim Vetiver, formando um cordo vegetativo que reduz intensamente o escoamento
superficial da gua e promove a agregao do solo devido ao intenso desenvolvimento horizontal do seu radicular (GRIMSHAW, 2006). Muitos estudos realizados com C. zizanioides com C. nemoralis comprovaram maior eficincia na conservao do solo da primeira em relao segunda (Figura 1-c). O Vetiver conhecido como Capim Milagroso na sia por apresentar caractersticas morfolgicas, fisiologias e ecolgicas exclusivas, que o tornam uma planta excelente para conservao do solo e da gua. O Vetiver no considerado uma planta invasora, pois no apresenta sementes frteis ou estoles, sendo pouco invasiva em qualquer stio ecolgico. Sua perpetuao em outras reas depende do plantio manual/mecnico de mudas (PEREIRA, 2006). Muitos estudos demonstram que o Vetiver possui uma ampla faixa de adaptao s mais diversas condies edafoclimticas. A planta sobrevive em condies de secas prolongadas, incndios, inundaes, temperaturas extremas (-15C a +55C) e quando submetido ao intenso trfego/presso de pastoreio, soterramento por sedimentos ou poda severa rapidamente se recompem emitindo novos perfilhos. Tolera solos sdicos, salinos, alcalinos, uma ampla faixa de pH (3.3 a 12.5), altos nveis de saturao de Al, Mn e metais pesados tais como: As, Cd, Cr, Ni, Pb, Hg, Se e Zn (TRUONG et al., 2006). Servindo-se das caractersticas acima expostas do Vetiver, o Banco Mundial desenvolveu em 1986 o Sistema Vetiver (SV) como um sistema vegetativo de conservao de gua e solo de baixo custo. Atualmente mais de 100 pases dos trpicos, semi-trpicos e regies temperadas utilizam o SV em estabilizao de terrenos (ferrovias e rodovias), reabilitao de minas, tratamento de guas residuais e melhoria da qualidade da gua (GRIMSHAW, 2006).
4.2 - Sistema Vetiver:
Assim como a gua, o solo tem uma grande importncia para a humanidade, porm o uso irracional destes limita suas utilizaes. Como estes recursos fornecem indiretamente grande parte do que necessitamos, especialmente o alimento, a conservao dos mesmos deve ser encorajada. Diante disso, deve ser realizado um planejamento tcnico, acompanhado e fiscalizado pelos rgos governamentais de todos os pases, visando o manejo adequado e sustentvel destes meios. O Banco Mundial desenvolveu em 1986 o Sistema Vetiver (SV) como um sistema vegetativo de conservao de gua e solo de baixo custo. Este Sistema baseado na aplicao
da Tecnologia do Capim Verde (TCV), ou seja, o cultivo em curva de nvel do Capim Milagroso (GRIMSHAW, 2006). Segundo Truong et al. (2006) a aplicao dessa Tcnica na Bioengenharia consiste no cultivo em fileiras do Vetiver, formando cordes vegetativos que atuam como barreiras vivas que recobrem o solo, diminuindo a ao do impacto da gota da chuva, reduzindo a velocidade superficial da gua, conservando sua umidade, resgatando nutrientes ao longo do perfil e melhorando o micro-clima; estimulando o estabelecimento de outras plantas semeadas ou voluntrias no local. Alm do mais as caractersticas morfolgicas e fisiolgicas nicas da espcie tornam o Vetiver uma excelente planta a ser empregada na proteo ambiental, em especial na preveno e tratamento do solo e da gua contaminada, podendo ser utilizadas em tratamentos de guas residuais e fitoremediao de solos contaminados. O SV foi implantado com sucesso em muitos pases do mundo, incluindo Austrlia, Brasil, China, Etipia, ndia, Itlia, Malsia, Nepal, Filipinas, frica do Sul, Sri Lanka, Tailndia, Venezuela e Vietn (TRUONG et al., 2006).
4.2.1 - Conservao do solo e de sua umidade:
Segundo Grimshaw (2006), para que uma planta possa ser utilizada na Bioengenharia e no ser invasiva deve apresentar as seguintes caractersticas: suas sementes devem ser estreis e a planta no deve apresentar estoles, de modo no se tornar invasora; seja resistente ao fogo, pisoteio e pastoreio. Deve ainda ser uma planta perene e permanente, formar perfilhos densos que permitam minimizar o efeito erosivo das guas de enxurradas e possuir caractersticas das plantas xerfilas e hidrfilas. O sistema radicular deve ser vertical e profundo e capaz de se desenvolver em solos no favorveis, independentemente do nvel de nutrientes, pH, sodicidade, salinidade e minerais txicos. Quando soterrada, a planta deve ter capacidade de rebrotar ao mesmo nvel do sedimento, no competir com a cultura que est protegendo, ser resistente a pragas e doenas, crescer em uma ampla variedade de climas, suportar temperaturas extremas (-15 C a mais de 55 C), longas estiagens (>6 meses) at precipitaes entre 300 mm - 6.000 mm. Quando no mais necessria deve ser de fcil remoo e a implantao e manuteno do projeto dever ser de fcil execuo e de baixo custo econmico. Todas essas caractersticas podem ser encontradas no Capim Milagroso. O objetivo da prtica de conservao do solo controlar ou reduzir a eroso do solo causada pela gua e pelo vento. No caso da eroso hdrica, as partculas do solo so primeiramente fragmentadas pelo impacto da gota da chuva e ento carregadas pelo volume
excessivo e/ou alta velocidade do escoamento superficial da gua e a eroso elica o resultado da alta velocidade do vento ao nvel do solo na superfcie nua (PEREIRA, 2006). O controle da eroso hdrica visa proteger a superfcie do solo do impacto das gotas de chuva, reduzir a velocidade de escoamento superficial atravs da cobertura vegetal e proporcionar a infiltrao da gua no perfil do solo. A cobertura vegetal tambm protege o solo nu das aes da eroso elica (PEREIRA, 2006). Os espessos e firmes colmos do Vetiver formam uma densa cobertura que reduz a velocidade de escoamento superficial da gua, armazenando os sedimentos e permitindo a infiltrao da gua no perfil do solo. Os sedimentos que se espalham por trs da barreira gradualmente se acumulam para formar um terrao de longa durao com a proteo de Vetiver. Uma boa cobertura de plantas reduzir o fluxo da gua em 70% e sedimentos em at 90% (TRUONG, et al., 2006). Seu forte sistema de razes incomparvel com qualquer outra planta utilizada para o controle de eroso e estabilizao de encostas. A fora e vigor de suas razes permitem sua penetrao em solos compactados, consolidando e estabilizando a estrutura do mesmo (PEREIRA, 2006). Truong, et al. (2006) afirmam que suas razes possuem uma fora de trao mdia testada de cerca de 75 Mega Pascal, que equivalente a 1/6 do reforo de ao leve, e um incremento de resistncia ao cisalhamento de 39% em uma profundidade de 0,5 m. O profundo sistema de razes do Vetiver cresce rapidamente e, dependendo das condies, pode atingir at dois metros no primeiro ano. Esta caracterstica torna a planta tolerante a pocas de estiagem e eficaz na recuperao de nutrientes solveis nas mais profundas camadas do perfil do solo; estes nutrientes so reciclados quando a planta utilizada na cobertura do solo ou no composto de suas folhas (PEREIRA, 2006). Alm da eroso do solo, o Sistema Vetiver pode prevenir ou reabilitar reas onde ocorreram desastres naturais, atuando na conteno e estabilizao de encostas. Muitos estudos j foram realizados na recuperao de reas degradas por deslizamentos de terra em estradas e ferrovias, margens de rios, represas, cursos dgua, dunas, proteo de rvores frutferas ou de madeira, diques, rupturas em barragens e pontes. Aplicando tcnicas e metodologias corretas pode-se reduzir ou eliminar a incidncia de deslizamentos, protegendo a infra-estrutura do terreno (TRUONG, et al., 2006). De modo geral a cobertura do terreno com Capim Vetiver estabelecida atravs da plantao de mudas com trs brotos, espaadas cerca de 10-15 cm de distncia e intervalo entre linhas de contorno variando de 1-2 m dependendo do clima, declividade do terreno e do tipo do solo. A poca do plantio um fator importante para o cultivo do Vetiver, deve ser preferencialmente realizada na poca das chuvas ou com irrigao suplementar. Apesar de
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exigir pouca manuteno, o controle das ervas daninhas at o estabelecimento das plantas necessrio, pois o crescimento do Vetiver favorecido pela incidncia solar sobre a planta; existem relatos de Sistemas que foram suprimidos devido ao intenso desenvolvimento de plantas concorrentes. O uso do herbicida a base da molcula de glifosato de amnio deve ser evitado, pois o Vetiver muito sensvel a este composto. O replantio de mudas se faz necessrio quando, eventualmente, algumas plantas do cordo vegetativo morrem, assegurando a eficincia do Sistema. Em terras instveis ou erodveis, Vetiver primeiro reduz a eroso, estabiliza o solo, em seguida, por causa do resgate de nutrientes e conservao da umidade, melhora o microambiente possibilitando o estabelecimento de plantas semeadas ou voluntrias (TRUONG, et al., 2006). Muitos trabalhos foram realizados na recuperao de encostas erodidas, Truong, et al. (2006) cita os exemplos na Austrlia, China, Madagascar, Vietnam e Tailndia. A apesar de ser pouco difundido no Brasil o SV j foi implantado em Pomerode/SC, nas margens do Rio So Francisco/SE (GONALVES, et al., 2007) e em Petrpolis/ RJ (HENRIQUE, 2010). Truong, et al. (2006) cita como uma das vantagens do SV seu baixo custo de implantao quando usado com obras de proteo civil, em mdia 30% dos custos dos tradicionais sistemas de engenharia. Para a estabilizao das encostas na China, por exemplo, as economias so da ordem dos 85-90%. Na Austrlia, a economia do SV sobre os mtodos de engenharia convencional varia entre 64%- 72%, dependendo do mtodo utilizado. Experimentos demonstram que o uso do SV, combinado com outras tcnicas de conservao do solo, tem-se revelado muito eficaz e de baixo custo na Bioengenharia. No entanto, convm sublinhar que as chaves mais importantes para o sucesso do projeto so: aplicao de tcnicas corretas no plantio, um bom material a ser cultivado e a elaborao de um projeto especfico para cada rea (ORIHUELA, 2007).
4.2.2 - Preveno e tratamentos de reas contaminadas:
O Sistema Vetiver alm de ser aplicado na estabilizao e conteno de encostas degradadas pode ser empregado na preveno e tratamento de solos/guas contaminadas por excesso de nutrientes, metais pesados e pesticidas (PEREIRA, 2006). A eficincia, simplicidade e o baixo custo tornam o SV um potencial agente na utilizao de plantas de Vetiver como filtro biolgico, suavizando os impactos de metais pesados bem como poluentes orgnicos e inorgnicos. Diversos pases utilizam esse Sistema no tratamento de efluentes industriais e domsticos, no controle de lixiviao em aterros
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sanitrios, na remoo de nutrientes em corpos hdricos eutrofizados, reabilitao de reas de minerao e fitoremediao de solos contaminados; mitigando o perigo da contaminao do lenol fretico (TRUONG, et al., 2006). A eficincia do Vetiver no tratamento da gua contaminada reside na sua capacidade de absorver rapidamente os nutrientes e metais pesados, e da tolerncia a nveis elevados destes elementos. Embora as concentraes destes elementos em plantas de Vetiver no sejam to elevadas como de plantas hiper-acumuladores, seu crescimento rpido e alto rendimento de biomassa permitem ao Vetiver remover um volume muito maior de nutrientes e metais pesados de terras contaminadas que a maioria dos hiper-acumuladores (TRUONG, et al., 2006). Experimentos realizados em estufas sob condies ideais quantificaram o consumo de gua do Vetiver, estima-se que para 1 kg de matria seca o uso de 6.86 l/dia. Uma vez que a biomassa de Vetiver de 12 semanas de idade de aproximadamente 30,7 t.ha-1, um hectare de Vetiver potencialmente usaria 279 l/ha/dia (TRUONG e SMEAL apud TRUONG et al., 2006). O Vetiver tem a capacidade de captao e reteno de metais pesados da seguinte forma: Zn> Cu> As> N> Pb> Hg, alm dos macronutrientes N e P (LIAO et al. apud TRUONG et al., 2006). Estudos realizados indicam que o Vetiver mostrou-se eficaz na reteno de herbicidas, como diuron, trifluralina, prometrina e fluometuro; e pesticidas, como endosulfan, sulfato de endosulfan e clorpirifos, paration, e profenofos (TRUONG, et al., 2006). Em Queensland/AU utilizaes prticas do SV no tratamento de guas residuais industriais em uma fbrica de processamento de alimentos e um matadouro bovino foram mencionadas (SMEAL et al. apud TRUONG et al., 2006). No Sul do Vietn, um ensaio de demonstrao foi elaborado em uma fbrica de processamento de frutos do mar, os nveis de nitrato foram reduzidos em 90% em 72 horas enquanto os nveis de fosfato reduzidos 82% em 72 horas (LUU et al. apud TRUONG et al, 2006). Os autores ainda citam o tratamento de efluentes de uma pequena fbrica de papel e uma pequena fbrica de fertilizantes de nitrognio no Norte do Vietn. Na China, os nutrientes e metais pesados das criaes de sunos so as principais fontes de poluio da gua, principalmente por N, P, Cu e Zn e a irrigao do Vetiver com esterco lquido mostrou-se muito eficiente para neutralizar esses compostos, alm de outros como As e Pb. Dadas as suas extraordinrias caractersticas o Vetiver tem sido usado com sucesso para a reabilitao de minas e fitoremediao de seus rejeitos, Truong et al. (2006) cita casos em minas de carvo, ouro, bauxita e bentonita na Austrlia, em minas de ouro, diamante e
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platina na frica do Sul, minas de Chumbo na Tailndia, minas de nquel e bauxita na Venezuela e minas de chumbo e bauxita na China. As folhas e razes que foram utilizados na descontaminao de guas residuais podem ser usadas na fabricao de cermicas e suas cinzas podem ser convertidas em cimento (ORIHUELA, 2007). Analisando as caractersticas acima descritas pode-se considerar o SV como uma alternativa vivel e possvel na reabilitao de reas degradas e tratamento de guas residuais.
4.2.3 - Vantagens e desvantagens do Sistema Vetiver:
Truong, et al. (2006) comentam as vantagens e desvantagens do Sistema Vetiver para recuperao de reas degradadas.
-VANTAGENS:
A grande vantagem do SV seu baixo custo de implantao e sua longevidade quando comparado com mtodos da engenharia convencional. Os custos de manuteno a longo prazo so baixos, necessrio um programa de manuteno planejada nos primeiros dois anos, no entanto, uma vez estabelecido, virtualmente livre de manuteno. Diferente das estruturas convencionais de engenharia, sua estrutura melhora com o amadurecimento da cobertura vegetal.
O SV um sistema natural, ambientalmente amigvel para o controle da eroso e estabilizao de encostas, uma alternativa ecolgica para medidas rgidas da engenharia convencional, tais como estruturas de concreto e pedra.
O Vetiver muito eficaz em solos pobres, altamente erodveis e dispersveis
-DESVANTAGENS:
O Vetiver intolerante ao sombreamento, em particular na fase de estabelecimento. O SV s eficaz quando as plantas estiverem bem estabelecidas. O perodo de estabelecimento inicial em clima quente cerca de 2-3 meses enquanto em climas frio prximo de 4-6 meses.
As plantas Vetiver s so plenamente eficazes quando cultivadas em alta densidade.
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difcil plantar e irrigar a vegetao em lugares muito altos ou em despenhadeiros nas encostas. Vetiver requer proteo contra o gado durante a sua fase de estabelecimento
Com base nestas consideraes, as vantagens do uso de SV como uma ferramenta de Bioengenharia superam as suas desvantagens.
4.3 - Outras utilidades:
Alm do uso do Vetiver na conservao do solo/gua, outros usos/utilidades potenciais podem ser considerados. Chomchalow e Nanakor (2003) diferenciam o uso e a utilidade do Vetiver; o uso definido quanto ao uso direto da planta, enquanto a utilizao refere-se ao uso das partes colhidas. As folhas do Vetiver podem ser utilizadas na alimentao de animais, dentre eles a carpa-capim, cavalos, ovelhas e gado (Truong et al., 2006). recomendada a utilizao das folhas mais jovens pois as folhas maduras tm alto teor de slica e apresentam baixo valor nutritivo. As folhas apresentam quantidades insignificantes de substncias txicas, podendo ser administradas ao gado no inverno, especialmente se combinado com forragem de alta protena (PANICHPOL et al. 1996 apud. CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). Alguns acessos so conhecidos por serem mais palatveis, sendo a cultivar Karnataka selecionada pelos agricultores ao longo de dcadas para essa finalidade. No Texas (EUA) sob condies de irrigao, a produo de matria seca prxima de 100 toneladas por hectare/ano, equivalente a 350 toneladas de folhas frescas. (GRIMSHAW, 2006). O composto produzido com folhas e colmos de Vetiver rico em nutrientes, de consistncia macia e de cor escura. Em pases tropicais com alta pluviosidade sua palha serve de cobertura vegetal mantendo as plantas daninhas sob controle e devido suas caractersticas repelentes contribui com a disperso de alguns insetos malficos (CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). Techapinyawat apud Chomchalow e Nanakor (2003) relata que certas substncias excretadas pela planta inibem o crescimento de outras plantas. O mesmo observou que extratos de caule e raiz apresentavam efeitos alelopticos negativos na germinao de sementes de soja, e ainda sugeriu a aplicao do extrato no controle de ervas daninhas evitando assim o uso de herbicidas qumicos. So relatados ainda efeitos fungicidas (GREENFIEL apud CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003) e acaricidas (KORPRADITKUL apud CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003)
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O Vetiver quando cultivado nas bordaduras das culturas do milho e arroz reduz o aparecimento de brocas do caule, sendo observada preferncia das mariposas em ovopositar nas folhas do Vetiver (TRUONG et al., 2006). Levy apud Chomchalow e Nanakor (2003) tambm observou a parcial inibio da broca da cana de acar quando o Vetiver plantado na bordadura da cultura. H mais de trs mil anos em grande parte da sia seu leo empregado na perfumaria e na medicina fitoterpica (PEREIRA, 2006). O leo possui efeitos sedativos e de fortalecimento do sistema nervoso atuando em doenas relacionadas ao estresse. Seu uso estimula o sistema circulatrio aumentando a produo de clulas vermelhas do sangue e , portanto, benfico para a anemia e cicatrizao de feridas. A frico com o leo tambm recomendada para dores musculares, entorses, rigidez, reumatismo e artrite
(CHOMCHALOW, 2001). Na rea da perfumaria o leo utilizado como fixador de perfumes, pois serve de base para outras fragrncias que se aderem ao Vetiverol. (TRUONG et al., 2006) As folhagens de Vetiver so utilizadas em diversas reas da construo rural. Os Tailandeses, bem como outras populaes rurais na sia, h muitos anos vem utilizando seus colmos e folhas de Vetiver no telhado de sua residncia. As folhas de Vetiver so revestidas com cera e tem um perfume original que repele o ataque de insetos e fungos (CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). As folhas do C. nigritana so utilizadas na construo de cabanas no Continente Africano (JULIARD apud CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). Vrios estudos realizados comprovaram a eficcia do Vetiver na construo civil. Fibras de Vetiver so utilizadas na fabricao de blocos de argila, uma vez que diminuem as rachaduras e a possuem baixa condutividade trmica, promovendo economia de energia e melhorando o conforto em casas construdas com esses blocos (PEREIRA, 2006). Outros estudos mostraram que as cinzas do Vetiver tm caractersticas pozolnicas e podem ser utilizadas como argamassa em construes, substituindo o cimento em reas rurais de pases em desenvolvimento (NIMITYONGSKUL apud CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). Em situaes ideais de cultivo, o Vetiver representa um forte potencial de fonte de energia. Kuhirun e Punnapayak apud Chomchalow e Nanakor (2003), descreveram o
processo de produo de etanol a partir de folhas de Vetiver. Aps o pr tratamento alcalino as folhas de Vetiver foram adicionadas ao mosto (pH 5,0) a levedura (Trichoderma reesei) e posterior fermentao; aps 7 dias mantidos a 40 C a produo de etanol foi de 13% aps um ciclo de destilao.
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Por apresentar alto teor de hemicelulose e celulose (45,8%) o Vetiver pode ser usado como matria-prima na fabricao do papel e aproximadamente 35% de fibras de Vetiver podem ser adicionadas na composio do papel, com timos resultados para papis de impresso e escrita. Por apresentar diversos compostos qumicos as folhas de Vetiver so utilizadas como substrato no cultivo de cogumelos (CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). O Vetiver maduro possui uma inflorescncia lils muito bonita, podendo ser utilizada em reas abertas com finalidade paisagstica ou na confeco de arranjos florais (PEREIRA, 2006). Suas razes possuem aromas e so utilizadas para odorizar ambientes. Suas fibras so utilizadas no enchimento de colches e travesseiro e na produo de artesanatos como tapetes, cestas, persianas e vasos de barro (CHOMCHALOW e NANAKOR, 2003). 4.4 Propagao do Vetiver:
Como a maioria das aplicaes do Sistema Vetiver requer um grande nmero de plantas, necessrio existir viveiros de mudas capazes de produzir grandes quantidades de mudas de alta qualidade e baixo custo. Como o Vetiver possui sementes estreis, sua propagao exclusivamente vegetativa (TRUONG, 2006). A propagao vegetativa resulta em indivduos com a mesma constituio gentica da planta-me (HEICHHORN et al., 2006) e assim as condies ambientais so extremamente importantes para o desenvolvimento dos vegetais no viveiro. Para garantir sucesso no estabelecimento da produo devem ser levadas em considerao as tcnicas de cultivo e colheita, treinamento operacional do pessoal e condies edafoclimticas. A forma mais comum de se propagar mudas de Vetiver realizando o plantio das partes maduras de touceiras da planta-me, tais como mudas de razes nuas, coroa e colmos. (TRUONG, 2006). Le Van Be apud Truong (2006) desenvolveu um mtodo de quatro etapas para multiplicao de mudas de Vetiver: 1) A partir de uma planta-me retirar mudas contendo pelo menos dois ou trs brotos e uma parte da coroa (rizoma). As mudas separadas devem ser cortadas a 20 cm de comprimento e suas razes podadas. 2) Pulverizar as mudas com 10% de soluo de aguap. Esta soluo contm reguladores de crescimento (auxinas e giberelinas) que estimulam o enraizamento de novos brotos mais vigorosos. 3) Manter as mudas em condies mida e escura por 24 horas. 4) Mergulhar na lama de argila ou na lama de esterco (estrume) e plantar no viveiro. Os solos preferenciais para o cultivo so os franco-arenosos e areno-argilosos, pois facilitam o crescimento do sistema radicular da planta. Antes do plantio recomenda-se
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interpretar a anlise de solo e corrigir a acidez, elevar a taxa de saturao de bases para 60% e, se necessrio, aplicar 10 kg.ha-1 de N, 20-60 kg.ha-1 de P2O5, 20-40 kg.ha-1 de K2O. Aps um ms aplicar 30 kg.ha-1 de N (BIASI e DESCHAMPS, 2009). O clima ideal para o desenvolvimento do vegetal deve ser quente, chuvoso e ensolarado, Dudai et al. apud Biasi e Deschamps (2009) complementam que o nmero de perfilhos influenciado pelo aumento da temperatura do ar e no pelo comprimento do dia. O espaamento aconselhado para o cultivo, visando produo de mudas, de 1,00 m entre linhas e 1,00 m entre plantas, o que pode variar dependendo das condies de manejo e disponibilidade de mudas. Recomenda-se que, aps quatro meses do plantio, cortar a touceira a 30 cm do solo, antes do desenvolvimento das inflorescncias. Este trato mantm a uniformidade das novas plantas com as antigas e favorece o desenvolvimento de 30 novos brotos em mdia. Aplicando esses tratos culturais o nmero de brotos adquiridos em um ano aproximadamente de 600.000 brotos. Quando houver necessidade de obteno de novas mudas o ltimo corte da touceira deve ser feito com ajuda de uma p e faco para retirar a planta com partes da raiz (ORIHUELA, 2007). As mudas de razes nuas podem ser cultivadas em sacos de polietileno (polybags) para recuperao do solo, facilitando o plantio nessas reas que normalmente apresentam condies hostis. Segundo Pinto et al. (2010) as mudas de Vetiver produzidas em saquinhos de polietileno apresentaram taxa de sobrevivncia no campo superior quelas plantadas diretamente no campo (razes nuas), sendo que a taxa de sobrevivncia das mudas de Vetiver no influenciada pelo espaamento de plantio. O espaamento entre plantas e entre linhas depende das condies de relevo do local aonde ser cultivado. Outro mtodo relatado por Truong et al. (2006) para facilitar o cultivo do Vetiver no plantio em faixas uma forma modificada de polybags, neste as plantas so cultivadas bem perto uma da outra em uma longa esteira especial que facilitar o transporte e o plantio. A multiplicao de gemas in vitro uma tcnica utilizada na cultura de tecidos para multiplicao em larga escala e em condies controladas de crescimento (TRUONG et al., 2006). Vn y e Vn Ha (2007) afirmam que a partir de uma gema de Vetiver podem ser formados 42 bilhes de gemas em um ano pelo mtodo de imerso temporria.
4.5 - Biotecnologia:
A Biotecnologia compreende, em seu sentido mais amplo, a manipulao de microorganismos, plantas e animais, com o objetivo de obter os processos e produtos de
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interesse, empregando tcnicas modernas de biologia molecular e celular (GUERRA e NODARI, 2006). A Biotecnologia vem se desenvolvendo a milhares de anos. Quatro mil anos a.C. a fermentao para fabricao de pes e cervejas j era realizada no Egito, queijos e vinhos ja eram fabricados na China e at tcnicas de inseminao artificial em cavalos de raas superiores ja era efetuada em 1.322 d.C na Arbia (FELDBAUM, 2004). Apartir da dcada de 50, principalmente na de 80, a velocidade com que as descobertas e os avanos cientficos ocorreram contribuiram para que o termo Biotecnologia se desenvolve-se. Atualmente diversas setores utilizam tcnicas da Biotecnologia, podemos citar: agropecuria, txtil, ambiental, energtico, mdico-farmacutico, alimentcio, veterinrio, qumico, entre outros (NEI, et al., 2008). Uma tcnica da Biotecnologia, com grande potencial para a multiplicao de plantas, a cultura de tecidos.
4.5.1 - Cultura de Tecidos:
Andrade (2002) se refere a cultura de tecidos vegetais como uma ferramenta da biotecnologia com alto potencial para multiplicao de plantas. O mesmo autor ainda relata outras finalidades para a cultura de tecido tais como o intercambio e avaliao de germoplasma, produo de mudas livres de vrus, aumento da variabilidade gentica mediante a produo de variantes somaclonais, fase essencial para obteno de plantas transgnicas, no melhoramento vegetal, entre outros. A propagao vegetativa in vitro a aplicao mais prtica da cultura de tecidos e vem sendo utilizada para clonar massivamente plantas em escala comercial. Na tcnica de micropropagao explantes so isolados da planta matriz, desinfestados e cultivados em condies asspticas em um meio de cultura apropriado. Os principais explantes utilizados na micropropagao so os meristemas, pices caulinares, segmentos nodais, embries, entre outros (ANDRADE, 2002). A totipotencialidade, capacidade de cada celula possuir o potencial de regenerar-se em outra planta adulta (HEICHHORN et al., 2006), uma caracterstica intrnsica dos vegetais e permite o cultivo in vitro dos mesmos. Na micropropagao podemos observar duas rotas morfogenticas para o desenvolvimento dos explantes: a embriognese somtica e a organognese, nesta os orgos vegetais so induzidos enquanto naquela so formados embries a parir de clulas somticas. Estas duas vias podem passar por rotas morfogenticas
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distintas, a indireta e direta. Na primeira, tem-se a formao de rgos/embries diretamente, sem a passagem por fases intermedirias; enquanto que, na segunda, passa-se obrigatoriamente pela fase de calo (MANTELL et al. apud ANDRADE 2002). O calo uma massa de clulas com crescimento desordenado que pode apresentar certo grau de diferenciao (TORRES et al. apud ANDRADE 2002) Murashige apud Torres et al. (1998) apresenta o conceito de trs estgios de
desenvolvimento no processo de propagao in vitro. O Estgio I, a seleo de explantes, desinfestao e cultura em meio nutritivo sob condies asspticas em meio para multiplicao; Estgio II, multiplicao dos propgulos mediante sucessivas subculturas; Estgio III, transferncia para meio enraizante e transplantio das plantas obtidas para substrato ou solo; alguns autores citam o Estgio 0, sendo correspondente ao tratamento dado planta matriz, da qual ser retirado o explante.
4.5.5.1 - Laboratrio de Cultura de Tecidos de plantas:
Cid (2001) afirma que as atividades de cultura de tecidos devem ser realizadas em ambiente assptico e com temperatura e iluminao controladas, procurando proporcionar timas condies ambientais para melhor crescimento e desenvolvimento do material in vitro. Neste contexto, instalaes com caractersticas apropriadas, bem como equipamentos e normas de trabalho devem ser consideradas para manter um elevado nvel de assepsia. As atividades desenvolvidas dentro de um laboratrio de cultura de tecidos devem ser agrupadas da seguinte forma: limpeza e esterilizao, preparo de material e meios de cultura, manipulao assptica e incubao das culturas. As atividades anteriormente citadas devem ser realizadas em salas componentes do laboratrio tais como: sala de limpeza, de preparo, de transferncia do material vegetal, de cultura, almoxarifado e instalaes de apoio para adaptar e manter as mudas at sua comercializao como casas de vegetao, cmara de nebulizao e telado (TORRES, et al., 1998). Equipamentos indispensveis para o funcionamento do laboratrio so: autoclave, destilador, deionizador, forno de microondas, estufa de secagem, refrigerador domstico, freezer, balana de preciso, medidor de pH, agitador magntico, capela de fluxo laminar, frascos de cultura, frascos para reagentes e gua, bandeja, vidraria de laboratrio, local especfico para descarte do material, entre outros (TORRES, et al., 1998).
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4.5.5.2 - Metodologia geral da Micropropagao:
O sucesso de uma metodologia para micropropagao depende do controle de um grande nmero de variveis, inclusive da espcie da planta a ser propagada, a fonte de explantes e a condio do meio de cultura. A proposta da micropropagao produzir um grande nmero de plantas a um custo baixo. So utilizados protocolos especficos para obteno de bons resultados, geralmente seguindo estgios pr-determinados na realizao pra micropropagao (ANDRADE, 2002) Cid (2001) afirma que o incio da micropropagao ocorre com a seleo de explantes adequados e termina com a obteno de uma cultura livre de contaminantes visveis e adaptadas a condies in vitro para seguinte multiplicao. O estado fisiolgico da planta-matriz, de onde sero retirados os explantes, tem influncia direta no comportamento das culturas. Para obter explantes de boa qualidade devese assegurar o bom estado fisiolgico (nutricional e hdrico) e fitossanitrio do vegetal, o que influencia diretamente na contaminao durante o isolamento. A manuteno da planta matriz em casas de vegetao permite o controle e manipulao do fotoperodo, da intensidade luminosa e da temperatura, estimulando novas brotaes e evitando sua exposio s intempries encontradas em campo (TORRES, et al., 1998). Segundo Torres et al. (1998) antes da seleo de explantes, o material coletado deve ser lavado em gua corrente para lavagem superficial de fontes de contaminao. Em seguida, o material sofre uma primeira toalete, retirando o excesso de folhas e o caule das brotaes. Dependendo da finalidade do explante pode-se utilizar um estreomicroscpio para ser podado no tamanho desejado. Na seleo de explantes diversas regies da planta podem ser utilizadas para iniciar a micropropagao, considerando aspectos como o nvel de diferenciao dos tecidos e a finalidade da micropropagao. Teoricamente, devido totipotencialidade, toda clula vegetal teria condies virtuais de gerar outra planta, porm os tecidos meristemticos tm maior capacidade para expressar essa caracterstica, sendo os mais utilizados na micropropagao (TORRES, et al., 1998). O processo de desinfestao deve ser realizado em capela de fluxo laminar sob condies asspticas e os materiais devem ser previamente esterilizados, evitando o processo de contaminao. Vrias substncias com ao germicidas so utilizadas para realizar a desinfestao dos explantes, sendo comuns o etanol (70%) e compostos a base de cloro, como o hipoclorito de sdio. Gotas de detergente (Tween 20) so comumente adicionadas s solues de cloro, para aumentar a rea de contato especfica com os tecidos. As
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concentraes das solues desinfestantes e o tempo de imerso podem variar em funo da sensibilidade do tecido a ser desinfestado. Aps a desinfestao segue a lavagem com gua destilada e autoclavada e ento a inoculao em meio de cultura estril (TORRES, et al., 1998). Na etapa de desinfestao das gemas de Vetiver, Gmez et al. (2008), desinfestaram os explantes de Vetiver com lcool 70% por 15 minutos, Oxochem 0,6 % (cido peractico 6%; H2O2, inertes e gua desmineralizada c.s.p 94%), adicionando 3 gotas de detergente Tween por 15 minutos. Os autores relataram alta taxa de contaminao do material quando eram utilizadas gemas laterais do colmo, enquanto gemas basais apresentaram baixa taxa de contaminao. Aps a inoculao, as culturas devem ser mantidas em sala de crescimento com condies ambientais estveis. A sala de crescimento mantem o ambiente em condies na qual a maior parte das culturas cresce normalmente. A temperatura deve ser ajustada entre 2027C, o fotoperodo tende dias longos (16 horas de luz e 8 de escuro) e a intensidade luminosa varia entre 20 a 70 mmol.m-2.s-1 (TORRES, et al., 1998). Van Be, et al. (2008), afirmam que possvel manter plantas micropropagadas, nas fases de multiplicao e enraizamento in vitro, em condies naturais de temperatura luminosidade e obter uma reduo de gastos de aproximadamente 22%. Porm, o experimento foi conduzido no Sul do Vietn, regio tropical, local com alta incidncia solar e sem grandes variaes de temperatura. Eventualmente essa tcnica pode ser aplicada em algumas regies subtropicais, porm devem-se levar em conta diversos fatores, incluindo os fatores ambientais, para o sucesso da micropropagao conduzida em viveiros. A fase de multiplicao tem como objetivo principal produzir um grande e homogneo nmero de plantas no menor tempo possvel. Aps a fase de crescimento e multiplicao exponencial o explante inicia um processo de senescncia devido diversos tipos de estresse tais como a deficiencia nutricional, acmulo de gases, falta de gua, barreiras fsicas ao crescimento (tampas e paredes do frasco). A frequncia ideal de subcultura deve coincidir com a fase de crescimento ativo das partes areas, aliando o mximo vigor de crescimento com a mxima taxa de multiplicao, comumente em um intervalo de 4 semanas (TORRES, et al., 1998). Torres et al. (1998) ainda cita uma etapa de enraizamento in vitro e aponta que do ponto de vista econmico desnecessria dependendo da espcie. A etapa final envolve a transferncia da planta da condio in vitro para casa de vegetao (ex vitro), onde submetida a aclimatizao. Esta etapa crtica para o processo, pois a planta passa por uma srie de transformaes fisiolgicas e mudanas ambientais tais como: mudana para um
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ambiente no assptico com diversos microrganismos, aumento na taxa de transpirao, ausncia de suprimento externo de energia para condio autotrfica, necessidade de absoro de sais em ambiente com baixa disponibilidade dos mesmo; algumas plantas necessitando de preparaes especiais para o transplantio definitivo. No transplantio o estresse hidrico das plantas geralmente o maior entrave na micropropagao pois as plntulas nas condies in vitro no apresentam estmatos funcionais, tm pouca cutina e a conexo entre o sistema vascular do caule e das raizes adventcias ainda so precrios. Para manter uma alta umidade relativa na casa de vegetao normalmente utilizado o sistema de nebulizao automtico. As plntulas so normalmente transplantadas em bandejas de isopor com um substrato que tenha boa reteno de umidade e de pouca compactao. Os susbstratos comumente utilizados so a vermiculita, perlita, turfa, areia, casca de arroz carbonizada, espuma fenlica e preparados comerciais. O objetivo de todas essas etapas est no sucesso do desenvolvimento deste material em campo (TORRES et al., 1998).
4.5.5.3 - Meio de cultura:
Os meios nutritivos utilizados para a cultura de rgos, tecidos e clulas de plantas fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos, e podem controlar o padro de desenvolvimento in vitro. Desde o incio do desenvolvimento dos meios nutritivos procuram-se estabelecer meios definidos e de composio conhecida e controlada para o cultivo in vitro de determinada planta (CID, 2001). O elemento em maior abundncia no meio de cultura a gua, e como uma fonte potencial de impureza recomenda-se utilizar gua destilada e deionizada para preparao do meio. Sais inorgnicos tambm so adicionados ao meio, macronutrientes tais como o ferro, fsforo, potssio, clcio, magnsio, enxofre e algumas formas de nitrognio. Dentre os micronutrientes mais utilizados podemos citar o mangans, zinco boro, cobre, cloro, molibdnio, cobalto e iodo (TORRES et al., 1998). Como os materiais cultivados in vitro no encontram condies adequadas para realizar a fotossntese e portanto no conseguem sintetizar seu prprio acar, a adio de carbohidratos ao meio nutritivo essencial. A sacarose a forma de acar mais utilizada pois a maioria das espcies apresentam alta taxa de crescimento e desenvolvimento quando o complemento est no meio (CID, 2001).
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As vitaminas desempenham papel importante nas funes essenciais da planta. Misturas bsicas de vitaminas desenvolvidas pelos primeiros pesquisadores ainda so utilizadas at hoje, podemos citar as formulaes das vitaminas de MS e as vitaminas de Morel. As principais vitaminas utilizadas so a tiamina, cido nicotnico, piridoxina, pantotenato de Ca, mio-inositol e glicina (TORRES, et al., 1998). A composio e concentrao de hormnios no meio nutritivo so fatores determinantes no crescimento e no padro de desenvolvimento em grande parte dos sistemas de cultura de tecidos. As auxinas e citocininas so as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos, a interao e a disponibilidade dessas classes de reguladores regulam a formao de raz, parte area e calo nas culturas. Outros reguladores tambm so utilizados com menos frequncia podemos citar as giberelinas, cido abscsico, etileno, entre outros (CID, 2002). Os meios nutritivos podem ser de consistncia lquida ou slida dependendo da espcie a ser micropropagada e das condies de cultivo. Alm do preparo do meio de cultura lquido ser mais rpido, o contato direto com o meio faz aumentar a velocidade de difuso dos nutrientes, favocerendo a multiplicao e a uniformidade dos explantes, mas quando o tempo de imerso prolongado pode favorecer a vitrificao das gemas. Na preparao de meios slidos so utilizados agentes de geleificao, o principal agente utilizado o gar (polissacardeos extrados de algas marinhas) embora outros agentes tem sido utilizados tais como o amido e uma nova classe polmeros produzidos por certas bcterias, o fita-gel. necessrio gelifica o gar, para isto deve-se dissolv-lo em gua quente fervente e esperar esfriar (TORRES, et al. 1998). Aps a adio de todos os componentes de determinado meio nutritivo, ajusta-se o pH do meio para um valor ligeiramente cido (entre 5 e 6), neste processo utiliza-se HCl e NaOH para realizar o ajuste. O meio preparado acondicinado em frascos e aps so autoclavados a 121C por 15 a 20 minutos. Quando resfriado o meio ser utilizado propagao de certa espcie (TORRES, et al., 1998).
4.5.5.3 - Reguladores de crescimento:
A possibilidade de manipulao da totipotncia, em ltima anlise, depende do tipo e da concentrao relativa dos principais reguladores de crescimento, como indicado pelo j clssico trabalho de Skoog e Miller (1957). Estes autores observaram que a relao entre a
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auxina
citocinina
no
meio
de
cultura
era
responsvel
pela
resposta
organogentica/embriogentica em tecidos vegetais. Segundo Pino-Nunes (2009), a auxina e citocininas so essenciais ao desenvolvimento das plantas, controlando os processos de diviso, expanso e diferenciao celular. A utilizao de reguladores tem como funo suprir possveis deficincias dos teores endgenos de hormnios nos explantes. As auxinas e as citocininas so as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas em cultura de tecidos. O balano hormonal entre citocininas e as auxinas muito importante para o controle da morfognese na cultura de tecidos (TORRES et al., 1998). Heichhorn et al. (2006) expe outras classes de hormnios tais como as giberelinas, etileno, cido abscsico, entre outros. Nas plantas, as auxinas so sintetizadas em regies de crescimento ativo como meristema apical, gemas axilares e folhas jovens e depois translocados para diferentes rgos. Tem como funo promover crescimento do caule, folhas e razes, alm de ser responsvel pela dominncia apical. Tambm promovem desenvolvimento de razes adventceas no caule (EICHHORN et al., 2006). As auxinas mais utilizadas para estimular a multiplicao o ANA, seguido de AIB e AIA. Concentraes altas de auxinas podem estimular o enraizamento e a formao de calos em detrimento da multiplicao (TORRES et al., 1998). As citocininas promovem diviso, alongamento e diferenciao celular, retardam a senescncia das plantas, promovem a quebra de dominncia apical e induzem a proliferao de gemas axilares (EICHHORN, et al., 2006). A citocinina mais utilizada o BAP, seguido de cinetina e 6-BA. Sua aplicao na cultura de tecidos o desenvolvimento da parte area e a induo de gemas adventceas (TORRES et al., 1998). Eichhorn et al. (2006) relatam que a aplicao das giberelinas induzem efeitos notveis no alongamento de caule e folhas intactas tanto por estimular a diviso quanto o alongamento celular. Experimentos mostram que plantas ans tratadas com GA3 tornam-se indistinguveis das plantas normais. Essa classe de hormnios esto presentes em todas as partes da planta, mas sua maior concentrao ocorre em sementes imaturas. Os autores ainda apresentam a influncia na dormncia de sementes e o alongamento do escapo floral e florescimento.
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MATERIAL E MTODOS:
O presente trabalho foi realizado no Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e
Gentica Vegetal (LFDGV) da Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC.
5.1 - Obteno de culturas asspticas:
Seleo da planta matriz:
A planta Matriz de Vetiver utilizada no presente estudo foi coletada em uma propriedade rural na baixada do Maciamb no municpio de Palhoa, SC. A mesma foi transferida, com o solo que estava previamente plantada, para um vaso de 2,5 litros e em cmara fitotron com temperatura (22C) e fotoperodo de 16 horas luz controlados, permaneceu por 14 dias antes da extrao das gemas foliares.
Preparao dos explantes e desinfestao das gemas:
Para a preparao dos explantes a planta matriz foi primeiramente podada, lavada em gua e detergente comercial e enxaguada em gua corrente. Foram retiradas as gemas basais do colmo e com o auxlio de um estreomicroscpio foram obtidos explantes com aproximadamente 0,3, 0,6 e 1,0 cm de comprimento. Em cmara de fluxo laminar (CFL) os explantes foram imersos em lcool 70%, durante 30 segundos e lavados em gua destilada e autoclavada, submetidos a diferentes tempos de imerso em soluo comercial de hipoclorito de sdio (2,5%) adicionada de trs gotas de detergente Tween 20, recebendo posteriormente a trplice lavagem. Os explantes foram mantidos em gua destilada e autoclavada at o momento da inoculao. Aps a inoculao, as culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura (22C), fotoperodo de 16 horas de luz e luminosidade controladas. As culturas no contaminadas foram mantidas em sala de crescimento durante 60 dias para posterior repicagem do material.
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Materiais de laboratrio e meio de cultura:
O meio de cultura utilizado foi o MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951) e suplementado com 30g.L-1 de sacarose, 7g.L1
de gar, 2 M de ANA e 4 M BAP . O pH foi ajustado para 5,8 (+-0,2) utilizando HCl
(0,5N) e NaOH (0,5N), antes da autoclavagem (121C) a 1,5 atm por 15 minutos. O meio de cultura ento foi despejado em tubos de ensaio (2,4 x 15,0 cm) contendo 10 ml/tubo e aps, fechados com tampas plsticas e selados com filme PVC. Aps os 60 dias os brotos induzidos foram repicados visando multiplicao. Nesta etapa foram utilizados 10 frascos de 300 ml contendo 30 ml de meio de cultura de mesma composio e mantidos por 75 dias na sala de crescimento.
Delineamento experimental e anlise estatstica: Para a desinfestao dos explantes, as gemas foram submetidas a trs diferentes tempos de imerso (5, 10 e 15 min) em soluo comercial hipoclorito de sdio (2,5%) mais detergente Tween 20 para avaliar a taxa de desinfestao/sobrevivncia do material cultivado. Foram testados 3 tratamentos com 3 repeties, sendo a unidade experimental trs tubos de ensaio contendo uma gema em cada, totalizando 27 gemas avaliadas. A taxa de contaminao e sobrevivncia foi avaliada aps 20 dias em cultura, os dados obtidos foram submetidas ao teste 2 (p=0,05) e Tabela de Contingncia com o auxlio do software Statgraphics verso 7.0.
5.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca:
Explantes utilizados, metodologia da inoculao e meio de cultura:
Os explantes utilizados foram selecionados do experimento anterior. Os explantes tiveram suas razes e folhas senescentes removidas. Em balana eletrnica de preciso, foi avaliada a massa fresca inicial e final de cada cultura para obteno do incremento de massa fresca (IMF). Os explantes, para fins de homogeneidade, foram divididos em 3 categorias de massa (> 0.07 g, 0.04-0.07 g, <0.04 g) e cada repetio continha as 3 classes. Os explantes foram cultivados em frascos de vidro de 300 ml contendo 30 ml/ frasco de meio de cultura. O meio utilizado foi o MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com
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vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951), 30g.L-1 de sacarose e gelificado com 7g.L-1 de gar. Diferentes concentraes de ANA e BAP foram testadas para o incremento da matria fresca e nmero de brotos: testemunha, 2 M ANA / 2 M BAP, 2 M ANA / 4 M BAP, 2 M ANA / 8 M BAP, 4 M ANA / 2 M BAP, 8 M ANA / 2 M BAP 2 M. O pH foi ajustado para 5,8 (+-0,2) utilizando HCl (0,5N) e NaOH (0,5N). Aps autoclavados por 15 minutos a 121C os frascos foram fechados com tampas plsticas e selados com filme de PVC. As gemas resultantes foram repicadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951), 30g.L-1 de sacarose, 2 M de ANA, 8 M de BAP e gelificado com 7g.L-1 de gar. Os explantes foram divididos em 20 frascos e as culturas foram mantidas em sala de crescimento durante 50 dias. Esta multiplicao dos brotos visou produo de novos explantes para o prximo experimento.
Delineamento experimental e anlise estatstica:
O delineamento experimental utilizado foi em blocos completos casualizados sob esquema fatorial [fatores: concentrao de ANA (A) e concentrao de BAP (B)]. Foram testados 6 tratamentos com 4 repeties e a unidade experimental foi composta por 3 frascos com 1 explante em cada. Os dados de nmero de gemas e o IMF foram coletados e analisados 75 dias aps introduo das gemas e as mdias (transformadas em log (x+2)) foram submetidas anlise de varincia e teste de SNK a 5% de probabilidade com o auxlio do software Statgraphics verso 7.0.
5.3 - Efeitos de diferentes densidades de meio de cultura e de agentes geleificantes na multiplicao de brotos:
Os aglomerados de gemas (clusters) utilizados foram selecionados a partir do subcultivo anterior. Cada cluster continha aproximadamente 15 brotos. O meio de cultura utilizado foi o MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951), 30g.L-1 de sacarose, 2 M de ANA e 8 M
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de BAP. Foi avaliada a multiplicao de gemas em meio de cultura lquido e slido gelei ficado com gar 7g.L-1 e Phytagel 2g.L-1. O pH foi ajustado para 5,8 (+-0,2) utilizando HCl (0,5N) e NaOH (0,5N). Os frascos contendo 30 ml de meio de cultura foram autoclavados por 15 minutos a 121C, fechados com tampas plsticas e selados com filme de PVC. No tratamento com meio lquido foram utilizados 20 ml de meio de cultura para que os explantes no ficassem totalmente submersos. Aps a inoculao os explantes foram transferidos e mantidos por 40 dias em sala de crescimento com temperatura (25C) e fotoperodo de 16 horas de luz.
O experimento foi constitudo de 3 tratamentos com 4 repeties, sendo a unidade experimental quatro frascos contendo 1 aglomerado com aproximadamente 15 brotos. As avaliaes foram realizadas aps 45 dias em cultura e as mdias (transformadas em log (x+2)) foram submetidas anlise de varincia e teste de Duncan a 5% de probabilidade com o auxlio do software Statgraphics verso 7.0.
5.4 - Efeito do GA3 e ANA no desenvolvimento de plntulas:
Os clusters utilizados foram selecionados em funo do melhor resultado do experimento anterior e continham aproximadamente 15 brotos. Foi utilizado o meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com vitaminas de Morel (Morel & Wetmore, 1951) e 30g.L-1 de sacarose. Diferentes concentraes de ANA (0 e 2 M) e GA3 (0, 5, 10 e 15 M) foram testadas compondo os seguintes tratamentos: testemunha, 2 M ANA / 0 M AG3, 2 M ANA / 5 M AG3, 2 M ANA / 10 M AG3, 2 M ANA / 15 M AG3, 0 M ANA / 5 M AG3, 0 M ANA / 10 M AG3, 0 M ANA / 15 M AG3. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 (+-0,2) utilizando HCl (0,5N) e NaOH (0,5N).
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Os frascos, adicionados de 30 ml de meio de cultura, foram autoclavados por 15 minutos a 121C, fechados com tampas plsticas e selados com filme de PVC. Aps a inoculao as culturas foram mantidas por 30 dias em sala de crescimento com temperatura (25C), fotoperodo de 16 horas de luz e intensidade luminosa controlada.
Foi utilizado o delineamento experimental em blocos completos casualizados em esquema fatorial (fatores: diferentes concentraes de GA3 (A) e concentrao de ANA (B). Foram testados 8 tratamentos com 3 repeties e a unidade experimental era composta 3 de frascos com 3 clusters cada. A observao do nmero de plantas acima de 4cm e o nmero de folhas por planta dos aglomerados foi realizada aps 30 dias da introduo das plantas e as mdias [transformadas em log (x+2)] foram submetidas anlise de varincia e teste de Duncan a 5% de probabilidade com o auxlio do software Statgraphics verso 7.0.
5.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver:
Origem das plntulas:
As plntulas utilizadas na aclimatizao foram selecionadas do experimento de multiplicao. Para retirar o excesso de meio de cultura das razes as plntulas foram lavadas em gua corrente, separadas e as razes e folhas senescentes foram removidas. Para fins de homogeneidade cada repetio dos tratamentos possua as trs classes de tamanho: classe I- < 6 cm; classe II- entre 7-10 cm, classe III- >10 cm.
Substratos, metodologia do plantio e aclimatizao:
Para avaliar o desenvolvimento das plantas no processo de aclimatizao foram testados trs tipos de substratos: casca de arroz carbonizada, composto orgnico e espuma fenlica. Foram utilizadas bandejas de isopor (72 unidades) para a aclimatizao das plantas.
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Aps o plantio, as bandejas foram mantidas em casa de vegetao com irrigao por sistema de asperso.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos completos casualizados tendo como fator diferentes substratos. A unidade experimental constitui-se de quatro plantas divididas na bandeja. Foram utilizadas 3 repeties, totalizando 12 plntulas por tratamento e 108 no experimento. Avaliou-se o tamanho da maior raiz, sobrevivncia das plantas e o comprimento da folha mais alta aps 30 dias da realizao do experimento. As mdias (transformadas em log (x+2)) foram submetidas anlise de varincia e ao teste de SNK a 5% de probabilidade com o auxlio do software Statgraphics verso 7.0.
RESULTADOS E DISCUSSO:
6.1 - Obteno de culturas asspticas:
Visando a produo massal do Vetiver, gemas retiradas da base do colmo foram submetidas aos diferentes tratamentos em hipoclorito de sdio para desinfestao dos explantes. O local da planta da onde retirado o explante tem efeito na contaminao do mesmo. Na etapa de desinfestao das gemas, Gmez et al. (2008), relataram uma alta taxa de contaminao do material quando os explantes eram retirados das gemas laterais do colmo, enquanto gemas basais apresentaram baixa taxa de contaminao. Foi possvel observar que o tamanho dos explantes tambm influenciou na contaminao do material propagado, gemas que apresentavam 1 cm sobreviveram a todos os tratamentos porm, todas contaminaram; gemas com 0.3 cm eventualmente contaminaram mas diversas amostras no resistiram ao hipoclorito de sdio. Enjalric (1988) em seu trabalho com Hevea brasiliensis, observou que gemas de 0,1 mm obtiveram 26% de contaminao, enquanto gemas com 3 mm obtiveram 79% de contaminao. Para fins de homogeneidade os tamanhos das gemas utilizadas foram de 0,3; 0,6 a 1 cm de comprimento. No presente trabalho foi observado que a maioria das gemas com 0,3 cm no resistiram ao tratamento em hipoclorito. Ao contrrio, gemas com 1 cm resistiram ao tratamento, porm a desinfestao no foi eficiente. Gemas com 0,6 cm (Figura 2) resistiram aos diferentes tratamentos e
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apresentaram baixa contaminao quando submersas em 5 e 15 minutos em hipoclorito de sdio.
Figura 2: Gemas basais do colmo de Chrysopogon zizanioides a) gemas basais de diferentes tamanhos, observar os primrdios foliares; b) gemas basal induzida em meio de cultura MS suplementado com 2 M de ANA e 4 M BAP.
No foi possvel obter informaes precisas sobre este ensaio, pois os dados analisados no apresentavam confiabilidade quando submetidos ao teste 2 (p=0,05) e anlise Contingncia submetidos, provavelmente pelo baixo nmero de amostras. Analisando a Tabela 1, pode-se observar que a baixa taxa de sobrevivncia dos explantes est relacionada com a taxa de contaminao e pela ao do hipoclorito de sdio. Para fins de preciso deve ser considerada a realizao de um experimento de desinfestao de gemas do colmo. A quantidade de gemas obtida foi o suficiente para a introduo de uma cultura assptica do Vetiver.
Tabela 1: Taxa de contaminao e sobrevivncia das gemas axilares de Chrysopogon zizanioides quando desinfestadas em diferentes tempos de imerso (5, 10, 15 min) em hipoclorito de sdio.
Tratamentos (min) 5 10 15
Taxa de contaminao (%) 77 77 45
Taxa de sobrevivncia (%) 11 0 11
*A taxa de contaminao corresponde proporo do material contaminado e a taxa de sobrevivncia corresponde aos explantes sobreviventes ao tratamento em soluo comercial de hipoclorito de sdio (2,5%).
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6.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca:
Em relao varivel nmero de brotos, observa-se pela Tabela 2, que os meios de cultura suplementados com 4 e 8 M de BAP apresentaram, pela anlise da separao de mdias, diferenas estatsticas sobre os outros tratamentos. Analisando os explantes gerados foi observada a formao de clusters que continham aproximadamente 15 brotos de Vetiver (Figura 3-b).
Tabela 2: Incremento de massa fresca e desenvolvimento de brotos de Crhysopogon zizanioides submetidos a tratamentos com reguladores (ANA e BAP) de crescimento em diferentes concentraes.
Tratamentos Testemunha ANA (2 M) + BAP (2 M) ANA (2 M) + BAP (4 M) ANA (2 M) + BAP (8 M) ANA (4 M) + BAP (2 M) ANA (8 M) + BAP (2 M) CV (%)
Nmero de brotos 2.125 c 17.850 b 55.583 a 78.333 a 16.330 b 18.753 b 9.45
Incremento de massa fresca (g) 0.650 c 3.345 a 2.275 b 2.543 ba 2.983 ba 2.165 b 7.07
*Para fins de anlise estatstica os dados foram transformados em log (x+2). Mdias acompanhadas de letras distintas indicam diferena significativa pelo teste de SNK a 5% de probabilidade. Os valores da tabela referem-se s porcentagens originais no transformadas.
Van Be et al. (2008), observaram em um intervalo de 6 semanas um bom crescimento e desenvolvimento de gemas de Vetiver em meio de cultura suplementado com (2-4 mg/L) de BAP. Estes autores tambm notaram a formao de clusters em meio de cultura suplementado com BAP, porm, afirmam que apesar de apresentarem numerosos e pequenos brotos, os mesmos no so eficientes para a etapa de aclimatizao. Os autores tambm observaram que a adio de 1 mg ANA no meio MS (Murashige & Skoog, 1962), desenvolvia um nmero maior de raizes por touceira (mdia de 19 razes / touceira) em comparao ao meio isento de ANA (7,6 razes / touceira). Vn y e Vn Ha (2007) em seu experimento de multiplicao do Vetiver em sistema de imerso temporrio relatam que a adio de 2 ppm de BAP mostraram os melhores resultados no crescimento e desenvolvimento de gemas. Santos et al.
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(2007) afirmam que em 6 semanas a maior regenerao de plantas de Vetiver ocorreu utilizando de 3,45 mg.L-1 de BAP e 0,06 mg.L-1 de ANA. Gmez e Pez (2005) declaram que o meio de cultura suplementado com 10 mol BAP e 0,1 mol de AIB, em um intervalo de 6 semanas, uma boa taxa de multiplicao desta espcie. Lu et al (2004) mostraram que o meio MS suplementado com a combinao de 0,5 mg.L-1 BAP e 2,0 mg.L-1 de 2,4-D foi melhor para a induo de calos de Vetiver, o meio ideal para induzir a diferenciao de brotaes foi o meio MS com 3,5 mg.L-1 BAP 3,5 mg e 0,2 mg.L-1 de AIA e as mudas foram enraizadas com sucesso em meio MS com 3,0 mg.L-1 de BAP 3,0 e 0,5 mg.L-1 de AIA. De acordo com a Tabela 2, o tratamento ANA (2 M) + BAP (2 M) apresentou maior incremento de massa fresca, seguido por ANA (4 M) + BAP (2 M) e ANA (2 M) + BAP (8 M). Os dois primeiros tratamentos apresentavam uma grande quantidade de razes que continham uma proeminncia na base do colmo (Figura 3-d), enquanto o ltimo apresentou maior nmero de brotos, assim possvel concluir que o ganho de biomassa no esteve relacionado com o nmero de brotos produzidos.
Figura 3: Desenvolvimento de Chrysopogon zizanioides em meios de cultura contendo diferentes concentraes de reguladores de crescimento (ANA e BAP). a)
33 plantas desenvolvidas em meio suplementado com ANA (2 M) + BAP (8 M); b) detalhe do aglomerado de gemas, com aproximadamente 15 brotos, desenvolvido em meio de cultura suplementado ANA (2 M) + BAP (8 M) e ANA (2 M) + BAP (4 M); c) intenso desenvolvimento radicular em meio de cultura isento de reguladores de crescimento; d) detalhe da proeminncia na base do colmo quando o meio era suplementado com ANA (8 M) + BAP (2 M).
6.3 - Efeitos de diferentes densidades de meio de cultura e de agentes geleificantes na multiplicao de brotos:
A utilizao de meios de cultura de consistncia lquida e com o agente geleificante Phytagel proporcionaram um aumento significativo na taxa de multiplicao, especialmente quando o material vegetal foi cultivado no meio lquido (Tabela 3). Levin et al. (1997) afirmam que em meio lquido ocorre um aumento de contato dos explantes com os nutrientes dissolvidos em gua, acelerando a difuso destes para a planta.
Tabela 3: Nmero de brotos de Chrysopogon zizanioides desenvolvidos em diferentes consistncias de meio de cultura e agentes geleificantes.
Tratamentos Meio de cultura com gar Meio de cultura com Phytagel Meio de cultura lquido CV (%)
Nmero de brotos 30.437 b 56.688 a 63.500 a 9.6
*Para fins de anlise estatstica os dados foram transformados em log (x+2). Mdias acompanhadas de letras distintas indicam diferena significativa pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Os valores da tabela referem-se s porcentagens originais no transformadas.
Porm, em sua pesquisa com diferentes variedades de capim elefante ( Pennisetum purpureum Schum) Karasawa et al. (2000) observaram que o nmero de brotos era maior em meio de cultura slido que em lquido. Karasawa et al. (2000) apud George (1993) afirmam que a superioridade do meio slido sobre o meio lquido pode ter ocorrido em resposta a perda de gua da clula para o meio lquido devido ao potencial osmtico negativo do meio lquido, em relao ao meio slido; ou por estresse hdrico, pois a cultura em ambiente natural no suporta o excesso de umidade dos solos mal drenados (KARASAWA, et al. 2000 apud
34
JACQUES, 1997), o que no acontece com o Vetiver que natural de regies alagadas do Sul ndia (TRUONG, et al. 2006). Foi observada uma tendncia ao desenvolvimento das folhas em clusters cultivados em meio slido (gar) enquanto nos outros tratamentos ocorreu um maior desenvolvimento de outros aglomerados (Figura 4- a e b). O meio de cultura lquido apresentou alta taxa de multiplicao dos clusters o meio suplementado com Phytagel apresentou uma boa taxa de multiplicao de aglomerados, mas tambm ocorreu o desenvolvimento de suas folhas (Figura 4 c e d). O tamanho dos fololos dos clusters desenvolvidos em meio lquido eram menores em relao aos aglomerados do meio com Phytagel, porm o nmero de brotos por aglomerado desenvolvidos no meio lquido eram superiores. Como o custo dos agentes geleificantes caro, o meio lquido torna-se a melhor alternativa para a multiplicao de brotos.
35
Figura 4: Desenvolvimento de clusters em meios de cultura em diferentes densidades e agentes geleificantes de Chrysopogon zizanioides. a e b) desenvolvimento foliar em meio de cultura com gar; c e d) desenvolvimento de clusters em meio de cultura lquido.
36
6.4 - Efeitos do GA3 e ANA no desenvolvimento de plntulas A induo das gemas presentes nos clusters e o nmero de folhas por colmo foi favorecida pela ausncia de auxina no meio de cultura. As diferentes concentraes de GA3 no diferiram estatisticamente para ambas variveis (Tabela 4).
Tabela 4: Influncia do meio de cultura MS suplementado com GA3 e ANA no desenvolvimento de colmos por cluster e de folhas por colmo em aglomerados de gemas de Chrysopogon zizanioides.
Tratamentos 0 M GA3 5 M GA3 10 M GA3 15 M GA3 Mdias CV (%)
Nmero de colmos 0 M ANA 2 M ANA 10. 45 3.67 13.22 8.33 9.78 9.33 10.78 6.00 11.06 a 23,00 6.83 b
Mdias 7.06 a 10.78 a 9.56 a 8.39 a 17,90
Nmero de folhas por colmo 0 M ANA 2 M ANA 3.38 1.75 1.97 2.18 1.56 1.93 1.90 1.28 2.20 a 9,37 1.79 b
Mdias 2.57 a 2.08 a 1.75 a

1.59 a
8,10
*Para fins de anlise estatstica os dados foram transformados em log (x+2). Mdias acompanhadas de letras distintas indicam diferena significativa pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Os valores da tabela referem-se s porcentagens originais no transformadas.
Foi observada a presena de raiz em todos os aglomerados que possuam pelo menos uma folha acima de 4 cm; tanto para meios com auxina quanto para os sem este fitoregulador. Porm, os tratamentos que no eram suplementados com reguladores de crescimento apresentavam uma grande quantidade de razes e folhas robustas (Figura 5-a), aparentando ser mais vigorosos. Muitos aglomerados presentes em meio de cultura com giberelina apresentavam sinais de toxidez (Figura 5-b), com o aumento da concentrao ocorria tambm o aumento de sinais de toxicidade. Segundo Heichhorn, et al. (2006) as giberelinas induzem o alongamento foliar, esse efeito foi notado nos aglomerados submetidos a esse regulador de crescimento. As folhas desenvolvidas nos diferentes tratamentos com giberelinas apresentaram alongamento foliar, porm suas folhas apresentavam crescimento desuniforme, eram delgadas e longas, menos verdes que folhas desenvolvidas em meio de cultura com ausncia do regulador.
37
Aglomerados desenvolvidos em meio de cultura suplementado com 15 M de GA3 (com ou sem ANA) apresentavam tendncia expanso foliar, chegando a 25 cm de comprimento da folha dominante (Figura 5-d). Alguns clusters desenvolvidos em meio suplementado com 10 M de GA3 apresentaram um crescimento mais homogneo (Figura 5-c), porm muitos estavam com sinais de toxidez e suas folhas aparentemente frgeis talvez no resistissem etapa de aclimatizao. A ausncia de fitoreguladores (ANA e GA3) no meio de cultura foi melhor para crescimento de folhas por planta. Para nmero de plantas desenvolvidas a ausncia de ANA foi melhor e para GA3 no houve diferenas. Por aparentar menos vigor, podemos inferir que o uso de reguladores de crescimento pode ser desfavorvel para o desenvolvimento de plantas que sero aclimatizadas, deve ser realizados experimentos com plantas desenvolvidas em meio de cultura com GA3 para verificar a taxa de sobrevivncia dessas plantas em comparao as plantas cultivadas em meio de cultura sem reguladores.
Figura 5: Desenvolvimento de clusters de Chrysopogon zizanioides em meio de cultura MS suplementado com GA3 e ANA. a) observar a quantidade de razes e vigor das folhas, meio sem reguladores de crescimento; b) aglomerados com sinais de fitotoxidez; c) aglomerado com crescimento homogneo em meio
38 suplementado com 10 M de GA3; d) expanso foliar em meio suplementado com 15 M de GA3.
6.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver
Analisando a Tabela 5 podemos concluir que no houve diferena estatstica para crescimento da folha e raiz entre os diferentes substratos utilizados.
Tabela 5: Crescimento de folha e raiz de Chrysopogon zizanioides cultivados em diferentes substratos.
Substrato
Composto orgnico Arroz carbonizado Espuma fenlica CV (%)
Crescimento folha (cm) 2.60 a 2.29 a 1.42
Crescimento raz (cm) 5.29 a 4.53 a 4.14 a 19,65
21,15
*Para fins de anlise estatstica os dados foram transformados em log (x+2). Mdias acompanhadas de letras distintas indicam diferena significativa pelo teste de SNK a 5% de probabilidade. Os valores da tabela referem-se s porcentagens originais no transformadas.
Truong, et al. (2006) afirmam que o desenvolvimento do Vetiver favorecido pelo aumento da incidncia solar e em temperaturas mdias de 25C. Segundo dados do CIRAM, a temperatura mdia durante o perodo do experimento foi de 21,5C em Florianpolis o que possivelmente atrasou o desenvolvimento do Vetiver. A baixa incidncia solar dentro da cmara de vegetao tambm pode ter contribudo para o reduzido desenvolvimento. Apesar de no estar em condies timas, nenhuma muda de Vetiver plantada em bandejas de isopor morreu, e ainda apresentaram um crescimento razovel de razes e folhas. Van Be, et al. (2008) relatam em seu trabalho com micropropagao do Vetiver, uma alta taxa de sobrevivncia (>95%) na etapa de aclimatizao, aps 10 semanas, de clusters com 3 brotaes acima de 5 cm. Em seu trabalho com diferentes gentipos de capim elefante (Pennisetum purpureum Schum) Sobrinho et al. (2005), tambm relatam uma alta taxa de sobrevivncia de plantas aclimatizadas em estufas. Em seu estudo concluram que o tempo de multiplicao in vitro (15 e 90 dias) interferia na sobrevivncia das plantas enquanto o tipo de substrato no interferia na mesma. Tambm no foram observadas diferenas estatsticas no comprimento da planta.
39
Pinto, et al. (2010) testaram o cultivo campo de diferentes tipos de mudas de Vetiver procurando obter informaes sobre a taxa de sobrevivncia. Os mesmos autores afirmam que o plantio de mudas em razes nuas desmembradas na hora apresentou taxa de sobrevivncia inferior (86,85%) s mudas previamente preparadas em saquinhos de polietileno mantidos por 90 dias em viveiro (95,76% e 97,94%).
CONCLUSES:
No foi possvel analisar estatisticamente a eficincia do tempo de imerso em hipoclorito de sdio na desinfestao de segmentos nodais de Vetiver devido ao baixo nmero de gemas disponveis, mas foi possvel realizar o estabelecimento de culturas asspticas. Os meios de cultura suplementados com ANA (2 M) + BAP (4 M) e ANA (2 M) + BAP (8 M) apresentaram diferenas estatsticas entre os outros tratamentos quanto ao nmero de brotos multiplicados, especialmente para o primeiro. Os meios de cultura contendo ANA (2 M) + BAP (2 M), (4 M) + BAP (2 M) e ANA (2 M) + BAP (2 M) apresentaram maior incremento de peso durante o experimento em relao aos outros tratamentos, principalmente o primeiro citado. Foi observado que no existe relao entre o incremento de peso e o aumento do nmero de brotos produzidos. O meio de cultura lquido e o meio de cultura slido contendo o geleificante Phytagel apresentaram melhores resultados para desenvolvimento de brotos se comparado com o meio de cultura com gar, especialmente o meio lquido. A ausncia de ANA no meio de cultura influenciou positivamente a induo de colmos em clusters e o desenvolvimento das folhas de cada planta. As diferentes concentraes de GA3 no diferiram estatisticamente para ambas variveis No houve diferenas significativas para crescimento de folha e raiz entre os substratos (composto orgnico, casca de arroz carbonizado, espuma fenlica). Todas as plantas sobreviveram ao processo de aclimatizao.
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Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Curso de Agronomia

DESENVOLVIMENTO DE UM PROTOCOLO PARA MICROPROPAGAO DE VETIVER (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).

Couglan Hilter Sampaio Cardoso

Florianpolis/SC, Junho de 2011

Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Curso de Agronomia

Desenvolvimento de um protocolo para micropropagao de Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).

Florianpolis/SC, Junho de 2011

Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Cincias Agrrias Curso de Agronomia

Assinaturas da Comisso Examinadora aprovando o Relatrio de Concluso de Curso

Desenvolvimento de um protocolo para micropropagao de Vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty).

Couglan Hilter Sampaio Cardoso

como requisito parcial para obteno do grau de Engenheiro Agrnomo

_________________________________________________ Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra (FIT/CCA/UFSC)

Florianpolis, 28 de Junho de 2011

CONCLUSES:...................................................................................................................... 39 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS: ........................................................................................... 40

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

4.1 - Caractersticas gerais da planta:

4.2 - Sistema Vetiver:

4.2.1 - Conservao do solo e de sua umidade:

4.2.2 - Preveno e tratamentos de reas contaminadas:

4.2.3 - Vantagens e desvantagens do Sistema Vetiver:

O Vetiver muito eficaz em solos pobres, altamente erodveis e dispersveis

As plantas Vetiver s so plenamente eficazes quando cultivadas em alta densidade.

4.3 - Outras utilidades:

4.5.1 - Cultura de Tecidos:

4.5.5.1 - Laboratrio de Cultura de Tecidos de plantas:

4.5.5.2 - Metodologia geral da Micropropagao:

4.5.5.3 - Meio de cultura:

4.5.5.3 - Reguladores de crescimento:

Gentica Vegetal (LFDGV) da Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC.

5.1 - Obteno de culturas asspticas:

Seleo da planta matriz:

Preparao dos explantes e desinfestao das gemas:

Materiais de laboratrio e meio de cultura:

5.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca:

Explantes utilizados, metodologia da inoculao e meio de cultura:

Delineamento experimental e anlise estatstica:

Explantes utilizados, metodologia da inoculao e meio de cultura:

Delineamento experimental e anlise estatstica:

5.4 - Efeito do GA3 e ANA no desenvolvimento de plntulas:

Explantes utilizados, metodologia da inoculao e meio de cultura:

Delineamento experimental e anlise estatstica:

5.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver:

Origem das plntulas:

Substratos, metodologia do plantio e aclimatizao:

Delineamento experimental e anlise estatstica:

6.1 - Obteno de culturas asspticas:

apresentaram baixa contaminao quando submersas em 5 e 15 minutos em hipoclorito de sdio.

Taxa de contaminao (%) 77 77 45

Taxa de sobrevivncia (%) 11 0 11

6.2 - Efeitos do ANA e BAP na multiplicao de brotos e incremento de massa fresca:

Nmero de brotos 2.125 c 17.850 b 55.583 a 78.333 a 16.330 b 18.753 b 9.45

Nmero de brotos 30.437 b 56.688 a 63.500 a 9.6

Tratamentos 0 M GA3 5 M GA3 10 M GA3 15 M GA3 Mdias CV (%)

Mdias 7.06 a 10.78 a 9.56 a 8.39 a 17,90

Mdias 2.57 a 2.08 a 1.75 a

38 suplementado com 10 M de GA3; d) expanso foliar em meio suplementado com 15 M de GA3.

6.5 - Aclimatizao de plntulas de Vetiver

Crescimento folha (cm) 2.60 a 2.29 a 1.42

Crescimento raz (cm) 5.29 a 4.53 a 4.14 a 19,65

FELDBAUM, C.. Biotecnologia As oportunidades que surgem Apartir da vida. Radar

Tissue culture and rapid propagation of Vetiveria zizanioides. Jornal da Universidade

www.posgrap.ufs.br/down/Livro_Resumos_17EIC_3EPG.pd Acesso: 05/06/2011.

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