JOS SANDRO PEREIRA DA SILVA

Estudo das caractersticas fsico-qumicas e biolgicas pela

adeso de osteoblastos em superfcies de titnio
modificadas pela nitretao em plasma

Tese apresentada Faculdade de Medicina

da Universidade de So Paulo para
obteno do ttulo de Doutor em Cincias
rea de concentrao: Ortopedia e
Traumatologia
Orientador: Prof. Dr. Alberto Tesconi Croci

So Paulo
2008

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Silva, Jose Sandro Pereira da
Estudo das caractersticas fsico-qumicas e biolgicas pela adeso de osteoblastos em
superfcies de titnio modificadas pela nitretao em plasma / Jose Sandro Pereira da
Silva. -- So Paulo, 2008.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo.

Departamento de Ortopedia e Traumatologia.
rea de concentrao: Ortopedia e Traumatologia
Orientador: Alberto Tesconi Croci.
Descritores: 1.Titnio 2.Osteoblastos 3.Aderncia celular
4.Propriedades de superfcie

USP/FM/SBD-362/08

DEDICATRIA

Dedico este trabalho aos meus pais, Sebastio e Irene, que sempre me
apoiaram com amor e dedicao, sem os quais no seria possvel nenhuma
realizao.

minha amada esposa Hallissa e nossa filha Jlia, pelo estmulo e

compreenso nos momentos em que me ausentei do convvio familiar e s
quais a minha dedicao jamais ser suficiente.

AGRADECIMENTOS

Agradeo sinceramente ao meu orientador, Prof. Dr. Alberto Tesconi

Croci, da Faculdade de Medicina da USP, por reservar parte de seu precioso
tempo para me ensinar os princpios da metodologia cientfica elucidando
minhas dvidas durante todo o trabalho e, acima de tudo, ter me permitido
liberdade em conduzir o experimento com instrues oportunas.
Ao Prof. Dr. Clodomiro Alves Junior, coordenador do Laboratrio de
Processamento a Plasma- LabPlasma/UFRN, pelas orientaes valiosas,
cesso de seu disputado laboratrio e por estimular seus alunos no
fascinante campo do estudo da cincia e engenharia de materiais.
Profa. Dra. Marcia Martins Marques do departamento de dentstica
da FOUSP, pela introduo no fascinante campo dos estudos com cultura
celular.
Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Galvo Barbosa do departamento de
Morfologia da UFRN, pela orientao e conduo nos ensaios de cultura de
clulas.
Ao Prof. Dr. Sandro Campos Amico da UFRGS pelo auxlio na
caracterizao das amostras, dispensando seu valioso tempo com
orientaes e sugestes relevantes ao trabalho.
Profa. Dra. Helen Jamal Khoury, do IPEN- UFPE, pela colaborao
na irradiao das amostras.
Aos Profs. Knio Costa Lima e ngelo Roncalli do departamento de
Odontologia da UFRN pelas orientaes na anlise estatstica dos
resultados e por, principalmente, estimularem ao entendimento dos mtodos
de anlise dos resultados do trabalho cientfico.

SUMRIO

Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas e smbolos
Resumo
Summary
1. INTRODUO......................................................................................
2. REVISO DA LITERATURA.................................................................
2.1 Interao do titnio com o meio biolgico...........................................
2.2 Propriedades de superfcie e caracterizao......................................
2.3 O processo de nitretao plasma .......................................................
2.4 Nitretao do titnio.............................................................................
2.5 Resposta celular a superfcies de titnio modificadas.........................
3. OBJETIVOS...........................................................................................
4. MATERIAL E MTODOS......................................................................
4.1 Preparo das amostras.........................................................................
4.2 Protocolo de nitretao.......................................................................
4.3 Caracterizao das amostras..............................................................
4.3.1 Fases superficiais.............................................................................
4.3.2 Textura superficial............................................................................
4.3.3 Rugosidade.......................................................................................
4.3.4 Molhabilidade....................................................................................
4.4 Ensaios de adeso e proliferao celular............................................
4.4.1 Curva de crescimento e viabilidade celular......................................
4.5 Caracterizao da morfologia celular por MEV...................................
4.6 Anlise estatstica................................................................................
5. RESULTADOS......................................................................................
5.1 Composio de camada......................................................................
5.2 Textura superficial...............................................................................
5.3 Rugosidade.........................................................................................
5.4 Molhabilidade .....................................................................................
5.5 Adeso e proliferao celular..............................................................
5.6 Curva de crescimento celular..............................................................
5.7 Morfologia celular................................................................................
6. DISCUSSO.........................................................................................
7. CONCLUSES.....................................................................................
8. REFERNCIAS
BIBLIOGRFICAS................................................................

1
7
7
13
23
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69
72
72
74
91
92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Desenho esquemtico de uma amostra na nitretao em

ctodo oco..................................................................................
Figura 2- Reator de plasma.......................................................................
Figura 3- Configurao de nitretao em gaiola catdica.........................
Figura 4- Configurao de nitretao em modo planar.............................
Figura 5- Desenho do experimento com cultura de clulas de acordo
com os grupos............................................................................
Figura 6- Difratograma por rX das amostras em diferentes condies de
tratamento 2..............................................................................
Figura 7- Textura de superfcie das diferentes condies de tratamento
por microscopia eletrnica de varredura...................................
Figura 8- Topografia tridimensional dos diferentes tipos de tratamento
por microscopia de fora atmica (MFA)...................................
Figura 9- Valores de rugosidade media (Ra) obtidos por microscopia de
fora atmica..............................................................................
Figura 10- Valores de rugosidade media (Ra) obtidos por profilmetro
mecnico..................................................................................
Figura 11- ngulo de contato nas diferentes superfcies do titnio...........
Figura 12- ngulo de contato nas diferentes superfcies de titnio...........
Figura 13- Adeso de osteoblastos MC3T3 em 24 horas nos diferentes
grupos.......................................................................................
Figura 14- Proliferao de osteoblastos MC3T3 em 72 horas nos
diferentes grupos......................................................................
Figura 15- Adeso e proliferao de osteoblastos MC3T3 nas diferentes
superfcies de titnio em 24,48 e 72 horas (a,b e c
respectivamente) visualizadas por MEV...................................
Figura 16- Proliferao celular nos diferentes grupos identificados por
MEV..........................................................................................
Figura 17- Morfologia dos osteoblastos em 24h nas diferentes
superfcies................................................................................

27
54
54
54
58
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67
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71
71

71
72
73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Graus de pureza do titnio........................................................

Tabela 2- Parmetros de tratamento com plasma de nitrognio...............
Tabela 3- Valores de rugosidade obtidos por microscopia de fora
atmica (MFA)...........................................................................
Tabela 4- Valores de rugosidade obtidos por profilmetro mecnico.......
Tabela 5- Nmero de amostras, medianas, quartil 25, mdia dos postos
e significncia estatstica para valores de rugosidade (Ra)
referentes aos diferentes tratamentos do titnio obtidos por
microscopia de fora atmica....................................................
Tabela 6- Nmero de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos
postos e significncia estatstica para valores de rugosidade
(Ra) referentes aos diferentes tratamentos do titnio obtidos
por profilmetro mecnico.........................................................
Tabela 7- Nmero de amostras, medianas, quartil 25, mdia dos postos
e significncia estatstica para os valores dos ngulos de
contato referentes aos diferentes tratamentos do titnio...........
Tabela 8- Nmero de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos
postos e significncia estatstica para valores de adeso
celular em 24 horas referentes aos diferentes tratamentos do
titnio.........................................................................................
Tabela 9- Nmero de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos
postos e significncia estatstica para valores de proliferao
celular em 72 horas referentes aos diferentes tratamentos do
titnio.........................................................................................

2
55
65
65

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67

69

70

70

LISTA DE SMBOLOS E ABREVIATURAS

ASTM
A
bar
DC
EDX
H2
K
Kgf/mm
MFA
MEV
mm2
N2
Pa
SLA
Ticp
TiN
Torr
V
W/cm2

L
S
LV
SL
CVD
PVD
XDR
PIRAC
Ra

American Society for Testing and Materials

ampre
unidade de presso em dinas/cm2 ( 1mbar=103 barias= 100Pa)
Corrente contnua
Energia dispersiva de Rx
Hidrognio
Constante dieltrica
Kilograma fora por milmetro
Microscopia de fora atmica
Microscopia eletrnica de varredura
milmetro quadrado
Nitrognio
pascal
Jato de areia com granulao grande + cido (HCl/H2SO4)
Titnio comercialmente puro
Nitreto de titnio
unidade de presso em mmHg
volt
Watts por centmetro quadrado.
ngulo de contato
Tenso superficial lquido/ar
Tenso superficial slido/ar
Tenso superficial lquido/vapor
Tenso superficial slido/lquido
Deposio qumica por plasma
Deposio fsica por plasma
Difratometria de Rx
Powder immersion reaction assisted coating
Desvio mdio aritmtico da rugosidade

RESUMO

SILVA, J. S. P. Estudo das caractersticas fsico-qumicas e biolgicas pela

adeso de osteoblastos em superfcies de titnio modificadas pela nitretao
em plasma [tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So
Paulo; 2008.

INTRODUO: Superfcies de titnio modificadas por diferentes mtodos

foram estudadas com base nos parmetros fsicos e qumicos de
caracterizao superficial e sua influncia no comportamento de clulas prosteoblsticas (MC3T3) in vitro. MTODOS: Discos de titnio
comercialmente puro grau II foram submetidos a trs mtodos de
modificao de superfcie (polimento, nitretados em plasma em configurao
planar e gaiola catdica). As diferentes superfcies foram caracterizadas
para observar o efeito do processamento na estrutura da camada superficial,
na rugosidade e molhabilidade. Ensaios de adeso e proliferao celular
usando linhagens de clulas pr-osteoblsticas MC3T3 foram realizados
para avaliar o efeito das novas superfcies no comportamento celular in vitro.
RESULTADOS: Os resultados demonstraram que a nitretao em plasma
na configurao de gaiola catdica produz superfcies mais rugosas (p<0,02)
e com menores ngulos de contato com a gua. CONCLUSES: A adeso
celular maior nas superfcies mais rugosas do que nas superfcies polidas
(p<0,05) e reagem de modo diferente a composio qumica do substrato e
topografia da superfcie.

Descritores: 1.Titnio 2.Osteoblastos 3.Aderncia celular 4.Propriedades

de superfcie

xii

SUMMARY

SILVA, J. S. P. Study of physical-chemical and osteoblast adhesion

characteristics of titanium surfaces modified by plasma nitriding [thesis]. So
Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo, 2008.

PURPOSE: The aim of this study was to evaluated the physico-chemical

properties of different titanium surfaces modified by means of low
temperature plasma nitridind on rat osteoblast cell adhesion and proliferation.
METHODS: Pure Titanium discs grade II was submitted to three different
surface preparations (polishing, glow discharge plasma nitriding in planar and
cathodic cage configurations). Surface parameters as roughness, wettability
and chemichal composition was determined to compare influency of gas
mixture on the modified surface material properties. Cellular morphology was
observed by scanning electron microscopy. To evaluate the effect of the
surface on cellular response, osteoblast cells (MC3T3) adhesion and
proliferation was quantified and data analised by Kruskal-Wallis and
Friedman statistical tests. RESULTS: plasma nitriding discs shows rougher
surfaces( p<0,02) in cathodic cage configuration and lower contact angle
values. MC3T3 cells attached on rough surfaces produced by cathodic cage
configuration was statistically significant p<0,05 compared to polished discs.
CONCLUSIONS: Glow discharge plasma nitriding improve titanium surface
roughness and wettability. MC3T3 cell adhesion behavior is related to
substrate chemical composition and topography.

Descriptors: 1.Titanium
Characterization

2.Osteoblasts

3.Cellular adhesion

4.Surface

1 INTRODUO

O estudo de materiais com aplicao biomdica tem se tornado um

ramo abrangente do conhecimento cientfico, muito provavelmente porque
existem problemas clnicos que necessitam de implantes para sua soluo.
Branemark et al. (1969) observaram em seu estudo clssico sobre
revascularizao do tecido sseo em reas de fratura que o titnio
apresentava alta resistncia remoo em condies experimentais e
lanaram as bases cientficas do que atualmente conhecido como
osseointegrao. O desenvolvimento dessas pesquisas resultou na criao
de dispositivos metlicos para utilizao em pacientes desdentados totais
com a finalidade de substituio de elementos dentrios perdidos e da
reabilitao com prtese implanto-suportada (Branemark et al., 1985)
Estima-se que grande quantidade de dispositivos mdicos com
aplicao clnica seja utilizada anualmente em todo o mundo em reas como
ortopedia e odontologia, tais como prteses metlicas para reconstruo
articular e implantes dentrios fabricados em titnio.
Os sistemas de implantes odontolgicos fabricados atualmente so
confeccionados em titnio comercialmente puro (Ticp) ou uma de suas ligas
de interesse da odontologia (como Ti-Al e Ti-V). Dessas ligas, a mais comum
contm 6% de alumnio e 4% de vandio e conhecida como Ti 6Al4V. Elas
so leves, fortes e altamente resistentes fadiga e corroso, embora sejam
mais duras que o osso. Seu mdulo de elasticidade 114x10 3 MPa e mais

prximo do mdulo de elasticidade do osso de 16.5 x 10 3 MPa que qualquer

outro material utilizado na fabricao de implantes endsseos, com exceo
do Ticp

cujo mdulo de elasticidade de 103.4 x 10 3 Mpa.

Esta

propriedade permite uma maior distribuio das foras na interface ossoimplante (Parr, 1985).
A produo comercial do titnio rigidamente controlada pela
sociedade americana para anlise e padronizao de materiais (ASTM), que
estabelece normas especficas para os graus de contaminao do titnio e
para suas ligas de Ti6Al4V, utilizadas na fabricao de implante de uso
cirrgico (ASTM, 1976). As diferentes concentraes dos elementos
nitrognio, carbono, hidrognio, ferro, oxignio e titnio, assim como suas
propriedades mecnicas, distinguem os diferentes graus de pureza do titnio
(tabela 1).

Tabela 1 Graus de pureza do titnio

Liga
Ti grau I
Ti grau II
Ti grau III
Ti grau IV
Ti Al6V4

N
0,03
0,03
0,05
0,05
0,05

C
0,10
0,10
0,10
0,10
0,08

H
0,015
0,015
0,015
0,015
0,012

Elemento (% de impureza)
Fe
O
Al
V
0,02
0,18
0,03
0,25
0,03
0,35
0,05
0,40
0,25
0,13 5,5-6,5 3,5-4,5

Ti
restante
restante
restante
restante
restante

Um dos problemas mais freqentes a interao de material metlico

com tecidos orgnicos, traduzida pela sua biocompatibilidade que envolve
aspectos fsicos, qumicos, biolgicos, metalrgicos e cirrgicos. Em relao
s proteses metlicas, um problema clnico importante refere-se integrao
desses materiais com o tecido sseo. Fatores como estabilidade primria,

velocidade de osseointegrao, resistncia mecnica e biocompatibilidade

so requisitos fundamentais desses biomateriais.
Biocompatibilidade definida como uma coleo de fenmenos
associados s interaes entre os biomateriais e o ambiente fisiolgico que
permita a coexistncia de ambos. Esse fenmeno observado na interface
entre o material e o sistema biolgico onde est sendo implantado, pelo
comportamento dos constituintes moleculares do meio e sua interao com
os componentes moleculares da superfcie. De tal modo, as propriedades de
superfcie, qumica e fsica, so determinantes da biocompatibilidade de um
material (Ratner, 1990). Essas propriedades, em geral, governam a resposta
biolgica a um material implantado em tecidos vivos. A forma, textura de
superfcie e composio qumica da camada superficial interferem no
desempenho do implante (Mcmillan et al., 2000).
Nesse aspecto, o desenvolvimento de superfcies um ponto crtico
para o biomaterial, de modo que a natureza da superfcie de um implante
influencia sua interao com os fluidos do corpo e em particular com as
protenas, desencadeando uma cascata de reaes que culmina com o
estabelecimento de uma interface implante/tecido (Brunette, 1988). O
entendimento

das

caractersticas

das

superfcies

dos

materiais

particularmente importante para compreenso de sua biocompatibilitidade,

principalmente quando se pretende desenvolver um implante para uso
clnico uma vez que as diferentes propriedades de superfcie desempenham
um papel importante na reao do corpo humano ao material artificial.

Dos materiais metlicos que apresentam aplicao clnica em seres

humanos, o titnio provavelmente o mais utilizado por apresentar
excelente biocompatibilidade, atribuda formao de um filme de xido
quimicamente estvel (TiO2) formado na sua superfcie em contato com o ar,
que previne a corroso do metal, alm de interagir eletricamente com
molculas de protenas dos tecidos biolgicos atravs de sua camada
externa hidroflica. Na superfcie do titnio formam-se filmes finos de xidos
estveis, tais como: Ti02, Ti0, Ti203, sendo que o mais comum o Ti02.
Todos eles apresentam constantes dieltricas (K) altas (50 a 120),
propriedade essa que pode retardar o movimento celular sobre superfcies
desde um meio aquoso e causar menor desnaturao das protenas, que
estaria relacionada com a ntima relao observada entre titnio e tecido
sseo (Branemark et al., 1985).
No Ticp existem vrios xidos, sendo que mais prximo do metal
verifica-se uma predominncia de Ti0 e adjacente ao tecido o Ti0 2. A
camada de Ti02, formada espontaneamente durante o processo de
torneamento dos implantes, semicondutora ou no condutora e previne a
troca de eltrons e qualquer reao redox na superfcie. Dessa forma, os
produtos de corroso nos tecidos no esto em forma de on, mas como
xidos estveis. Em meios fisiolgicos a camada de xido altamente
protetora prevenindo o contato entre o meio e o metal base, o que significa
que no existe o contato direto entre o metal e seus tecidos hospedeiros,
mas certamente entre o tecido e a superfcie do xido formado (Kasemo,
1998). Essas caractersticas tornam vantajosa a aplicao do titnio como

material para a confeco de implantes metlicos em medicina e

odontologia.
A literatura especializada relata um grande crescimento de tcnicas
de tratamento de superfcies que so ambientalmente limpas. Dentre elas
est a nitretao inica, que consiste na deposio de nitretos em
superfcies metlicas quando inseridas em plasma de nitrognio. Alm do
fator ambiental, vrias so as vantagens desta tcnica sobre as
convencionais, tais como baixa temperatura de tratamento, melhor controle
da espessura da camada, tempo de tratamento inferior, uniformidade na
espessura da camada, nitretao de partes da pea, maior economia (Alves
Jr, 1995).
As alteraes superficiais causadas pela formao de nitretos de
titnio, atravs do uso de tcnicas como nitretao em plasma tm levado ao
desenvolvimento recente e progressivo de pesquisas que investigam suas
propriedades biolgicas. O nitreto de titnio considerado pela Food and
Drugs Administration como um material biologicamente inerte e adequado ao
uso em implantes de titnio e suas ligas (Sovak, 2000).
A nitretao de implantes de titnio cilndricos com o mesmo padro
de modelagem de uso corrente no mercado pode gerar superfcies com a
formao de nitretos de titnio de topografia homognea e com alta
molhabilidade em condies experimentais bem controladas, sugerindo um
potencial favorvel para aplicao em ambientes biolgicos (Guerra-Neto,
2006).
Vrios mtodos de tratamento de superfcie tm sido aplicados ao

titnio, particularmente com a finalidade de alterao topogrfica, todos com

o objetivo primordial de fazer com que essas alteraes estruturais possam
exercer algum grau de controle no modo como o corpo interage com a
superfcie do biomaterial, como por exemplo, melhorando a integrao de
uma prtese de quadril ou de um implante dentrio com o tecido sseo.
Tratamentos de superfcie, como o jateamento com plasma de titnio,
jateamento com partculas de slica, subtrao por ataque cido,
implantao inica e revestimento com fosfato de clcio esto disponveis
comercialmente com eficcia clnica comprovada (>95% acima de cinco
anos). O papel preciso da composio qumica da superfcie e da topografia
nos eventos iniciais da osseointegrao em implantes dentais ainda no
esto claramente compreendidos ( Le Guhennec et al., 2007).
Baseado nessas consideraes iniciais, o objetivo deste estudo
avaliar as caractersticas fsico-qumicas e biolgicas pela adeso de

osteoblastos em superfcies de titnio modificadas pela nitretao em

plasma.
As normas de apresentao das citaes bibliogrficas e estrutura
geral deste trabalho obedecem aos padres descritos por Cunha (1991)
publicado pelo Servio de Biblioteca e Documentao da Faculdade de
Medicina da Universidade de So Paulo.
As abreviaturas dos ttulos dos peridicos seguiram as normas
vigentes no List of Journals Indexed in the Index Medicus, publicado pela
National Library of Medicine.

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 INTERAO DO TITNIO COM MEIO BIOLGICO

A interao do titnio com o meio biolgico ocorre na interface do

material por meio de ligaes qumicas com os fluidos teciduais

que

desencadeiam a seqncia de eventos moleculares e celulares que podem

resultar no processo de osseointegrao. Biomolculas podem unir-se
superfcie do titnio num meio biolgico por foras Van der Walls, ligaes
covalentes, inicas e ligaes de hidrognio. Para as ligaes do tipo
Foras de Van der Walls, a constante dieltrica do xido da superfcie e a
polaridade das molculas ou grupo de radicais que se unem s superfcies
so importantes parmetros fsicos que determinam a fora da unio. A alta
constante dieltrica dos xidos de titnio pode ser um fator crucial que
distingue o titnio de outros metais para implantes (Parsegian, 1983).
O segundo tipo de ligao deve-se s camadas carregadas da
superfcie e superposio de molculas adsorvidas. Esse tipo de unio se
estabelece atravs de fortes ligaes covalentes e inicas, ou seja, entre
dipolos eltricos permanentes, freqentes tanto em biomolculas como em
superfcies de xido polar, e se caracteriza por sua curta extenso e suas
dimenses atmicas freqentemente com um alto grau de direcionalidade.
Particularmente, ligaes fortes podem se estabelecer em locais de defeitos

especficos das superfcies, tais como vazios ou espaos aninicos ou

catinicos, tomos com impurezas e nas reas de unio entre os gros
(Jansen, 1991).
Um terceiro tipo de ligao importante na interao biomolecular est
representado pelas ligaes de hidrognio. O ambiente biolgico aquoso,
e pode participar das ligaes de hidrognio alm de modificar, em alguns
momentos, as ligaes inicas de forma que os ons sero hidratados, isto ,
rodeados de uma camada de gua (Kasemo, Lausmaa, 1988). Deste modo,
a superfcie de xido de titnio oferece uma grande extenso para os
diferentes tipos de unies, quais sejam as foras de unio e as unies de
tipo qumico. Considerando o largo espectro de biomolculas expostas
superfcie, provvel que algumas dessas ligaes sejam estabelecidas:
algumas representando unies irreversveis e outras caracterizadas por um
contnuo intercmbio de molculas num equilbrio dinmico (Kasemo,
Lausmaa, 1988).
Embora a camada de xido seja, termodinamicamente, muito estvel,
reaes com o fluido ou meio biolgico podem ocorrer. Espcies contendo
titnio so liberadas nos tecidos adjacentes e, ao mesmo tempo, espcies
contendo oxignio nos fluidos biolgicos so adsorvidas, levando ao
aumento na espessura da camada de xido. Existe a possibilidade de
dissoluo da camada protetora de xido, o processo qumico, denominado
corroso, que representa um problema srio para alguns materiais de
implante, parece ser um processo muito lento com o titnio, provavelmente
devido alta estabilidade de seus xidos.

Outros processos qumicos ocorrem na superfcie do xido como a

adsoro e a dessoro de molculas. A fora da ligao entre a
biomolcula e a superfcie determina se haver ou no dessoro ou
substituio das biomolculas. A hidratao do xido outro processo que
provavelmente

ocorre

que

pode

ser

muito

importante

para

estabelecimento de um ambiente qumico apropriado para as biomolculas

(Parsegian, 1983).
A superfcie do implante parece exercer influncia no ambiente
biolgico e nos processos biolgicos na interface que determinaro o
sucesso ou falha da implantao. importante que o implante no tenha um
efeito de desnaturao das protenas na superfcie. Se a desnaturao
ocorrer, depender do tipo e resistncia da unio entre a protena em
questo e a superfcie. Se as unies internas que determinam a
conformao da protena so influenciadas de forma muito forte, ocorrer a
desnaturao. Se, pelo contrrio, forem levemente afetadas, as protenas
permanecero na sua conformao original. Uma forma de prevenir a
desnaturao das protenas atravs de uma adsoro seletiva de
biomolculas pelas superfcies que formam uma camada de separao entre
as superfcies do implante e as protenas (Kasemo, Lausmaa,1988).
A superfcie hidratada se desenvolve nas primeiras fraes de
segundo aps o contato e composta por vrias macromolculas
adsorvveis bem como clulas potencialmente adesivas. Algumas dessas
biomolculas se uniro atravs das ligaes descritas acima, e muitas outras
eventualmente sero substitudas por molculas mais eficientes. A superfcie

10

do material transformada, imediatamente, pela adsoro instantnea de

filmes predominantemente proticos. Esses filmes condicionadores devero
formar-se em uma espessura em torno de 1m, antes de uma colonizao
bem sucedida de clulas de qualquer tipo (Kasemo, Lausmaa,1988).
Existem diferentes escalas nos eventos que ocorrem na interface
implante-tecido. O nvel macroscpico visvel a olho nu e o nvel molecular
onde o implante de titnio coberto por uma superfcie de xido de
aproximadamente 2 a 5nm de espessura (Kasemo, 1998). Molculas
proticas unem-se superfcie de xido e a natureza da interao entre a
superfcie mais externa de tomos do implante e as protenas (e/ou outras
biomolculas) crucial para a resposta do sistema biolgico ao implante.
Ambas, a microarquitetura (microgeometria, rugosidade) da superfcie e sua
composio qumica so importantes no estabelecimento dessa interao
pelos seguintes aspectos:
1- Uma

superfcie

lisa

uma

superfcie

curva

ou

rugosa

respectivamente causam diferentes reas de contato com biomolculas e

clulas. As diferentes reas de contato produzem diferentes tipos de unies
de unidades biolgicas que podem influenciar sua conformao e funo.
2- Variaes na composio qumica das superfcies produzem
diferentes tipos de unio s biomolculas as quais podem, ento, afetar suas
propriedades. A composio da superfcie qumica determina amplamente a
estabilidade qumica e reatividade do material do implante.
Um fator essencial, nesse contexto, como a superfcie do material
interage com a gua. Se a superfcie se ligar fortemente com a gua, ou

11

seja, se for uma superfcie hidroflica, a protena com sua cpsula de gua
considerar a superfcie como similar gua. Essa protena interagir com o
material indiretamente, atravs da intermediao de uma camada de gua, e
permanecer em seu estado conformacional normal. Se, ao contrrio, a
superfcie repelir ou tiver uma ligao frgil com a gua, ou seja, se a
superfcie for hidrofbica, a protena estar mais prxima a formar ligaes
diretamente com os tomos da superfcie, os quais podero causar ento
mudanas na forma ou sua desnaturao. Essa mais uma combinao da
micro-arquitetura e de composio qumica da superfcie que, espera-se,
determine completamente a interao mtua entre o implante e o sistema
biolgico. Outros fatores so tambm importantes, como posicionamento do
implante, procedimento cirrgico, condies cicatriciais (Kasemo, 1988).
A interao molecular entre a superfcie do implante e o tecido de
suma importncia. As clulas interagem com a camada de biomolculas e
gua que esto ligadas superfcie, e a natureza e propriedades das
biomolculas esto determinadas primariamente pela superfcie. A natureza
da camada de biomolculas na superfcie determinar como as clulas
respondem a ela. Conseqentemente, h uma interao clula/superfcie
mediada pela interveno das camadas de biomolculas mais gua
(Kasemo, 1998).
No perodo inicial aps a implantao haver essencialmente gua,
ons dissolvidos e biomolculas livres na regio mais prxima da superfcie.
A composio do biolquido mudar continuamente, conforme o processo
inflamatrio de cicatrizao progrida, o que provavelmente causa mudanas

12

na composio da camada de biomolculas adsorvidas na superfcie do

implante durante os primeiros minutos e posteriormente ao longo dos dias
que sucedem a implantao. As clulas, ao se aproximaram da superfcie e,
dependendo da natureza das camadas adsorvidas, respondem de forma
especfica, podendo ainda modific-la. Com o tempo, os tipos de clulas
mais prximas s superfcies e suas atividades podero mudar, dependendo
do tipo de interao inicial, assim o resultado final poder ser a formao de
uma cpsula fibrosa ou a osseointegrao (Kasemo, 1998). As propriedades
iniciais da superfcie do implante determinam, de forma decisiva, a natureza
e as propriedades da camada de gua e biomolculas que eventualmente
so adsorvidas nela, o que influenciar o comportamento das clulas,
quando alcanarem a superfcie.
Os eventos cicatriciais que ocorrem na interface entre tecido sseo e
implante seguem certa seqncia de eventos importantes (Cooper, 2000).
No incio, o corte do tecido sseo preenchido por sangue que se organiza
em cogulo. Para que esse cogulo ocorra adequadamente so importantes
os aspectos de energia superficial na distribuio do sangue na superfcie do
metal, e formao de xido, pela influncia que esta camada externa pode
exercer na conformao destas estruturas. A micro-rugosidade tem o papel
de conduzir a migrao de clulas sobre a superfcie do material
biocompatvel. Segundo o processo de cicatrizao, o cogulo sanguneo
transformado

pelas

clulas

fagocitrias,

como

os

leuccitos

polimorfonucleares, clulas linfides e macrfagos. A atividade fagocitria

atinge o nvel mximo durante o tempo entre o primeiro e o terceiro dia aps

13

a cirurgia. Durante este perodo ocorre a formao do pr-calo, contendo

fibroblastos, tecidos fibrosos e fagcitos. O pr-calo se transforma em tecido
conjuntivo denso, e clulas mesenquimais se diferenciam em osteoblastos e
fibroblastos. O tecido conjuntivo chamado de calo, incluindo osteoblastos
que aparecem na superfcie do implante. Fibras osteognicas, formadas por
osteoblastos, tm potencial de calcificao. O tecido conjuntivo denso forma
ento um calo fibrocartilaginoso, que ocorre normalmente entre o implante e
o osso. O osso neoformado penetra e a nova matriz ssea chamada de
calo sseo. O novo osso amadurece, aumentando em densidade e dureza.
Nessa fase, a prtese pode ser apoiada nos implantes e, sob estmulo,
ocorre a remodelao ssea.

O osso haversiano calcifica, tornando-se

denso e homogneo Os esforos oclusais estimulam o osso circundante a

se remodelar, e os implantes osseointegrados podem resistir s funes
mastigatrias (Cooper, 2000).

2.2 PROPRIEDADES DE SUPERFCIE E CARACTERIZAO

As propriedades de superfcie do titnio que afetam a resposta celular

tm sido descritas em termos de composio qumica, energia de superfcie,
molhabilidade e topografia superficial. Essas propriedades dependem do
elemento qumico e suas ligaes, do tipo do material e ainda so afetadas

14

pelo tipo de processamento ao qual o material submetido (Kipaldi, Lemons,

1994).
Define-se superfcie como a interrupo do arranjo atmico
cristalogrfico ordenado que pode existir em diferentes estruturas. Esta
interrupo ocasiona uma alterao no comportamento eletrnico do
conjunto atmico do material, modificando as propriedades fsico-qumicas
no local (Kipaldi, Lemons, 1994).
O processo original de fabricao de implantes de titnio para
implantao nos maxilares produz a superfcie usinada com valores de
rugosidade (Ra) entre 0,5 e 1,0m. Tem sido utilizado com sucesso no
decorrer das ultimas dcadas, embora estudos tenham demonstrado que a
modificao da topografia tende a aumentar a rea de contato osso-implante
e a resistncia da unio na interface (Wennerberg, 1999).
Superfcies com valores de rugosidade mdia (Ra) 1m

so

consideradas lisas e aquelas acima de 1m, rugosas. O modo como a

superfcie produzida pode gerar topografias orientadas ou aleatrias. Por
exemplo, em superfcies usinadas em tornos mecnicos, a direo e o fio da
ferramenta de corte originam sulcos peridicos de orientao paralela. Esta
caracterstica da topografia parece ter a capacidade de influenciar a
orientao e a locomoo de tipos especficos de clulas e de diretamente
afetar a forma e funo celular (Sykaras, 2000). Entretanto, a rugosidade
mdia no o nico parmetro de avaliao da rugosidade de uma
superfcie.

15

Molhabilidade a medida do ngulo de contato crtico formado pelo

espalhamento de uma gota de lquido em uma superfcie. Este dado pode
ser expresso em tenso superficial crtica (dinas/cm 2). O material com
tenso superficial crtica de 20 a 30 dinas/cm 2 exibe mnima adesividade
biolgica. A textura superficial em um implante tem o potencial de selecionar
certas populaes celulares e alterar suas funes, por exemplo, fibroblastos
se acumulam em superfcies lisas, enquanto os macrfagos preferem
superfcie rugosa, comportamento denominado de rugofilia. Desta forma,
seria esperado que clulas preferissem aderir umas s outras ou matriz
extracelular do que superfcie de um material com baixa energia superficial
(material com pobre adesividade), assim, essa situao resultaria em
formao de cpsula fibrosa (Brunette, 1999).
A topografia superficial pode afetar a orientao e a locomoo de
clulas epiteliais e fibroblastos. Um efeito do substrato mais estudado no
comportamento celular o direcionamento de contato, que se refere
tendncia das clulas serem guiadas em sua direo de locomoo pela
forma do substrato. Este modelo baseado no modo de locomoo celular
controlado pela contrao de feixes de microfilamentos inseridos no contato
focal (Kasemo, 1998)
A adeso definida como a fora que faz com que duas ou mais
substncias se unam quando colocadas em ntimo contato. Quando
molculas de substncias diferentes se mantm juntas, estas foras so
chamadas de adesivas; quando essas molculas so de uma mesma
substncia, as foras se denominam de coesivas. Para a adeso se

16

completar, dever ocorrer uma molhabilidade inicial que, em biomateriais,

usualmente associada com a molhabilidade de uma superfcie slida por
um lquido apropriado (Kasemo, 2000).
A tenso superficial no s garante o molhamento da camada de
lquido sobre o substrato como tambm assegura a adeso dessa camada e
sua durabilidade. Muitos estudos tm sido feitos sobre a relao das foras
de adeso e tenso superficial, uma vez que a adeso governada por
diferentes mecanismos, e, em diferentes casos, no se pode fazer
afirmaes definitivas. De qualquer modo, a fora de adeso depende da
tenso superficial de ambos os componentes e, conseqentemente, da
tenso interfacial. A fora de adeso aumentada ao mximo quando a
tenso superficial dos dois componentes tem magnitudes similares, o que
parece dever-se reduo da tenso interfacial (Kasemo, 2000).
Considerando o papel preponderante que as caractersticas de novas
superfcies de biomateriais tm no reparo do tecido, estas so descritas em
trs categorias: textura (ou rugosidade), carga (ou potencial eltrico) e
qumica, normalmente descritas em valores de energia de superfcie como
por exemplo: tenso superficial. Para cada novo mtodo de modificao de
superfcies metlicas com finalidade biomdica, deve-se proceder aos
estudos que descrevam as alteraes em termos de parmetros objetivos
(Kasemo, 2000).
Os mtodos de anlise da topografia de materiais metlicos
modificados, notadamente o titnio, consistem em transcrever a informao
da oscilao do perfil da superfcie em valores mdios que podem ser

17

interpretados em funo do objeto de estudo. Existem trs grandes grupos

de instrumentos que fornecem informaes quantitativa e qualitativa para
avaliao topogrfica da superfcie e esto divididos em profilmetros de
contato mecnico, ptico e microscpios de sondagem por varredura
(Wennerberg, Albrektsson, 2000).
Os profilmetros ou rugosmetros mecnicos so os dispositivos de
mensurao mais utilizados e so compostos por uma agulha de diamante
apoiada num cantilver que varre a superfcie da amostra na direo
horizontal. A oscilao do cantilver registra no eixo vertical o perfil da
superfcie em modo digital ou analgico originando grficos para anlise. A
caracterstica da agulha de diamante acaba por influenciar a medida
dependendo do raio (2 a 10 m) e do ngulo da ponta (60 a 90).
Na pesquisa com implantes de titnio, os rugosmetros de contato so
utilizados para avaliar implantes cilndricos e amostras planas e tambm
para medir a rugosidade de implantes ortopdicos removidos do leito
cirrgico. O desenho do implante pode determinar que tipo de instrumento
o mais adequado e onde a medida pode ser feita. Discos e cilindros so bem
avaliados por rugosmetros de contato, enquanto apenas algumas partes de
implantes na forma de parafusos pode ser avaliadas por este mtodo
(Wennerberg, Albrektsson, 2000).
Os instrumentos pticos so interessantes pelo fato de no danificar a
superfcie de materiais moles e vulnerveis, alm de ser um mtodo mais
rpido e de fornecer melhor resoluo do que os rugosmetros de contato
mecnico. Dentre as possibilidades destacam-se a microscopia de varredura

18

confocal a Laser (MCL) e a microscopia de fora atmica (MFA). A

microscopia de fora atmica utiliza uma ponta de dimenses que varia de 6
a 60 nanmetros(nm) a presso e velocidades constantes. Tem como
limitao a rea de mensurao reduzida no sentido vertical mximo de 6
m, que pode ser muito pequeno para determinadas superfcies de
implantes (Vanzillotta et al., 2004)
Alm do equipamento, os parmetros de avaliao da superfcie
devem ser considerados, como a calibrao do aparelho e as caractersticas
de superfcie, definidas como forma, ondulao e rugosidade. Naturalmente,
a rugosidade o parmetro filtrado dos erros de forma e ondulao. Esse
filtro estabelecido pelo equipamento por meio do cut-off que o
espaamento da extenso da medida total da superfcie. Geralmente
estabelece-se um cut-off de 2,5 vezes o espaamento de pico a pico e um
quinto da extenso total da medida.
Em uma reviso sobre os efeitos da topografia da superfcie, a
diferena que mais chama ateno entre implantes dentais comercialmente
disponveis a topografia superficial. Macroscopicamente, h implantes em
forma de parafuso, cilndricos, cnicos e lminas. Microscopicamente alguns
implantes tm superfcie lisa, enquanto outras so usinadas, texturizadas ou
porosas. Uma razo para estas diferentes propriedades superficiais, por
exemplo, a poro que atravessa o epitlio gengival freqentemente lisa
na tentativa de produzir um colar epitelial que resista a invaso bacteriana,
enquanto que o corpo do implante deve ser poroso para promover

19

crescimento de tecido sseo e, ento, produzir estabilizao (Sykaras et al.,

2000)
Uma grandeza importante na avaliao da molhabilidade entre duas
superfcies o ngulo de contato. Ele definido como o ngulo formado
entre a superfcie slida e a tangente superfcie do lquido no ponto de
contato dos dois. O ngulo de contato pode variar de 0 a 180 graus. A
condio de equilbrio de energia interfacial na rea de contato pode-se
expressar em termos de energia interfacial da interface slido/lquido (sl),
interface lquido/vapor (lv), interface slido/vapor (sv) e o ngulo de contato
(), pela equao de Young:
sl = lv + sv cos

(1)

onde pode-se considerar o como a energia superficial ou tenso superficial

que referida em dyna/cm, erg/cm 2 ou N/m e termodinamicamente
representa a energia necessria criada numa unidade de rea na interface
ou superfcie onde no existia previamente (Ratner, 1990).
Os trs tipos de molhabilidade podem ser interpretados agora, de
acordo com os seguintes valores do ngulo de contato:
No-molhabilidade:

> 90;

Molhabilidade:

< 90;

Como visto, o valor de = 90 ento o limite entre a situao de

molhabilidade e no-molhabilidade.
Desde que a molhabilidade seja dependente da superfcie do material,
todos os procedimentos que possam alterar apreciavelmente o carter do

20

substrato afetaro, de forma significativa, as caractersticas de molhabilidade

desse substrato (Baier, 1986).
Os mtodos para determinao dos ngulos de contato so usados
de forma rotineira na caracterizao de biomateriais para descrever a
molhabilidade ou calcular/estimar a energia superficial. de interesse
experimental no estudo do ngulo de contato incluir contaminao e a
apropriada escolha de solventes.

Os lquidos utilizados comumente so

orgnicos e particularmente gua para biomateriais, e o ngulo de contato

pode ser medido com a superfcie slida exposta tanto a lquido ou a vapor
(Ratner, 1990).
A possibilidade de que a energia superficial de um slido possa
influenciar ou controlar as interaes de protenas e clulas com o material
tem exercido grande influncia na cincia dos biomateriais. A caracterizao
da energia de superfcies de implantes de titnio demonstra os efeitos do
tratamento da superfcie, tamanho dos grnulos e a rugosidade na tenso
superficial e molhabilidade do titnio puro. O plasma de descarga
luminescente por radiofreqncia confere uma superfcie com alta tenso
superficial quando comparado a amostras esterilizadas por calor, enquanto
amostras no submetidas a tratamento tem os menores valores de tenso. A
tenso em superfcies com grnulos de 23m no difere daquelas com
granulaes da ordem de 70m. J a rugosidade interfere diretamente nos
ngulos de contato do lquido com a superfcie. Todas as amostras avaliadas
esto dentro de uma faixa de 30 a 50 dinas/cm, sugerindo que os

21

biomateriais metlicos a base de titnio so favorveis osseointegrao

mesmo sem receber qualquer tipo de tratamento (Kilpadi e Lemons, 1994).
A molhabilidade tambm influenciada pela energia de superfcie do
material, sendo definida como a energia na superfcie de um slido, a qual
maior do que a energia no centro do material. Os tomos da camada externa
no esto ligados uns aos outros com a mesma energia, ao contrrio
daqueles nas camadas mais internas. Essa diferena se d em razo de as
ligaes estarem insaturadadas na superfcie gerando energia livre. O
ngulo de contato caracterstico da tenso superficial do lquido e da
energia de superfcie do slido ao qual est em contato (Kilpadi e Lemons,
1994).
O tipo de tratamento dado a superfcie do material pode afetar a
molhabilidade de modo positivo ou negativo. Placas de titnio puro e liga de
Ti6 Al4 V submetidas a diferentes tipos de alterao superficial foram
avaliadas quanto a molhabilidade da superfcie atravs da tcnica da gota
sssil com gua destilada e glicerol. O objetivo do estudo foi observar se o
tipo de tratamento afeta a molhabilidade. Ligas de titnio revestidas com
hidroxiapatita obtiveram o menor ngulo de contato() entre os diversos
tipos de superfcie (Mekayarajjanannoth, Winkler, 1999).
Uma importante contribuio ao entendimento da molhabilidade
superficial foi apresentado por Lim et al. (2001). Foram avaliados trs tipos
de materias usados para a produo de implantes dentais Ticp grau II, liga
Ti6 Al4 V e TiNi - polidas com lixas de carbeto de silcio e submetidas a treze
processos de modificao superficial, incluindo mtodos clssicos utilizados

22

em escala industrial e inovaes experimentais. Alm disso quatro meios

distintos foram escolhidos para a medio do ngulo de contato gua
destilada, NaCl a 1%, suspenso de neutrfilo e suspenso contendo
osteoblastos MG63. Duas placas de cada material foram expostas a trs
gotas de cada meio e avaliadas por dois observadores independentes,
totalizando 6 medies para cada meio. Para a rugosidade, duas placas de
cada material com cinco mensuraces cada foram utilizadas. A composio
qumica resultante de cada tipo de tratamento foi investigada por difrao de
raios x em uma amostra por grupo de tratamento.
A despeito dos quatro meios diferentes, houve poucas diferenas,
sem significncia estatstica, nos valores obtidos no ngulo de contato,
sugerindo que qualquer um deles pode ser utilizado para ensaios de
molhabilidade. No entanto, diferenas significativas foram encontradas em
relao aos diferentes tipos de materiais e rugosidade resultante dos
tratamentos de superfcie. Para o Ticp, quando > 45 a superfcie
apresentava um comportamento hidrofbico em relao aos meios, com o
aumento da rugosidade. Em contrapartida, quando < 45 a superfcie
apresentava comportamento hidroflico, com o aumento da rugosidade de
modo linear. Nas ligas de titnio apenas quando > 45 havia esse tipo de
relao, enquanto em alguns casos (TiNi) o parece ser independente da
rugosidade superficial. Os dois principais xidos de superficie formados
foram do tipo rutilico (TiO2 tetragonal) e anatase (Lim et al., 2001).
A mudana na configurao do plasma

gerado por catodo para

anodo foi capaz de reduzir o ngulo de contato da gua destilada em

23

superfcies de titnio, melhorando a molhabilidade e a adsoro de ons

fosfato e clcio. Os autores sugerem que o aumento na molhabilidade, neste
caso, depende do acmulo de eltrons na superfcie e no do efeito de
limpeza promovido por ons positivos e neutros gerados na configurao
catdica (Shibata, Miyazaki, 2002).
Polmeros submetidos a plasma de O2 por 3 minutos em corrente
contnua apresentaram reduo significativa no ngulo de contato da gua
em relao ao controle ( =54,2 versus =72,3), enfatizando o
comportamento hidroflico da superfcie, alm de provocar aumento na
rugosidade com alterao da estrutura normal do material (Chim et al.,
2003).
Diferentes mtodos de modificao de superfcie podem originar
topografias de aspectos distintos, com valores de rugosidade semelhantes e
valores de molhabilidade diferentes. O exato papel da composio qumica
de superfcie e da topografia nos eventos iniciais da osseointegrao em
implantes dentrios ainda no consistentemente compreendido e exige
inmeros estudos in vivo e in vitro.

2.3 O PROCESSO DE NITRETAO A PLASMA

O processo conhecido como nitretao inica (ion-nitriding), nitretao

em descarga luminosa (glow discharge nitriding) ou nitretao por plasma

24

(plasma nitriding) foi patenteado em 1931 por J.J Egan nos EUA e em 1932
por Berghaus na Alemanha, mas somente em 1960 teve incio o seu uso
comercial (Santos, 1987). No Brasil, a tcnica ainda no muito conhecida
tanto no meio empresarial como tambm entre metalurgistas e engenheiros
de materiais, ficando sua divulgao restrita aos resultados de pesquisas
desenvolvidas em universidades.
As Universidades pioneiras no Brasil, nesta rea, iniciaram suas
pesquisas entre 1985 e 1986. Enquanto a Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN) e a Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS) dedicaram-se mais pesquisa aplicada, como o aspecto
microestrutural e mecnico da camada formada, a Universidade Federal de
Santa Catarina preocupou-se mais com o aspecto terico, como o
diagnstico do plasma e a influncia das espcies sobre o mecanismo da
nitretao. Mais recentemente, em 1991, construiu-se e instalou-se na
Universidade Federal de So Carlos um equipamento para nitretao inica
com plasma pulsado.
O termo plasma se aplica a um gs contendo espcies neutras e
eletricamente carregadas como eltrons, ons positivos, ons negativos,
tomos e molculas. Na mdia, um plasma eletricamente neutro porque
qualquer desbalanceamento de carga resultar em campos eltricos que
tendem a mover as cargas de modo a restabelecer o equilbrio. Como
resultado disso, a densidade de eltrons mais a densidade de ons negativos
deve ser igual densidade de ons positivos. As cargas livres no plasma
podem mover-se em resposta a qualquer campo eltrico e neutraliz-lo. Se

25

uma carga qualquer inserida num plasma ou num campo imposto,

produzindo um potencial Vo, as cargas livres, compostas de eltrons na
grande maioria, se movero formando uma blindagem eltrica, denominada
blindagem de Debye (Alves Jr, 1995).
O plasma pode ser produzido em laboratrio atravs da aplicao de
uma diferena de potencial entre dois eletrodos. Quando uma diferena de
potencial

aplicada

entre

dois

eletrodos

contidos

num

sistema

hermeticamente fechado e a uma presso suficientemente baixa, eltrons e

ons so acelerados pelo campo eltrico, colidindo com outras partculas e
produzindo assim mais ons e eltrons atravs da seguinte combinao
(Alves Jr, 1985):

e G 0 G 2e
onde Go

(2)

o tomo ou molcula do gs no estado fundamental e G +

representa um on deste gs. Devido a essa produo de cargas, uma

corrente eltrica gerada e varia com a diferena de potencial entre
eletrodos. O catodo a regio mais importante no estudo da nitretao
inica porque nele que se desenvolve a maioria dos eventos responsveis
pelas caractersticas da camada nitretada. Dentre estes eventos, destaca-se
o Sputtering da superfcie, a dissipao de calor pelo bombardeio das
partculas, criao de defeitos na rede cristalina do catodo (pea), deposio
de nitretos, adsoro e a difuso de nitrognio (Alves Jr, 1995).
Um equipamento tpico de nitretao inica constitudo basicamente
de um sistema de vcuo, uma fonte de potncia e um reator. O esquema de
vcuo deve ser capaz de atingir em torno de 10 2 torr de presso e possuir

26

vlvulas para controlar a vazo dos gases introduzidos para o tratamento. A

fonte de potncia possui uma sada CC, com voltagem mxima de
aproximadamente 1500V, e uma corrente capaz de fornecer energia pea,
para que ela seja aquecida a uma temperatura entre 300 e 700 C (Alves Jr,
1995). No reator esto dois eletrodos onde o catodo tambm o porta
amostra. Ainda no reator devem existir sadas para medida da presso,
temperatura e outras variveis desejadas para o melhor controle do
processo. Devem ter ainda entradas para a atmosfera gasosa, bomba de
vcuo e outros acessrios que sejam necessrios para a nitretao da
amostra.
O processo consiste em expor superfcies metlicas a um plasma
nitretante, o qual gerado devido a uma diferena de potencial entre dois
eletrodos. Esses eletrodos esto contidos num reator hermeticamente
fechado, onde introduzida a atmosfera nitretante (tipicamente uma mistura
de N2-H2, a uma presso entre 1 e 10mbar. Os ons criados devido a essa
diferena de potencial, em torno de 600V bombardeiam a superfcie da pea
presa ao catodo, aquecendo-a at a temperatura de trabalho.
Para presses baixas, a descarga possui um brilho de cor rsea de
pequena intensidade que caracterstico do material do catodo (geralmente
ao) e do gs. medida que se aumenta mais a presso, este brilho vai
ficando mais intenso e mais localizado em torno do catodo, at que se atinge
uma condio de descarga propcia para a nitretao.
Nestas condies, o plasma j est revestindo completamente o
catodo e a pea a ser nitretada. Os ons deste plasma esto sendo

27

acelerados para a superfcie do catodo onde diversos efeitos ocorrem,

dentre eles o aquecimento da pea devido ao bombardeamento pelos ons.
A partir da, contado o tempo de durao do processo. Aps este tempo, a
fonte desligada e a pea deixada para resfriar naturalmente.
Uma extenso do processo de nitretao inica a nitretao em
ctodo oco. Este mtodo consiste em nitretar a pea numa atmosfera
altamente ionizada. A alta ionizao conseguida porque os eltrons no
plasma so obrigados a refletir sucessivamente entre duas superfcies
catdicas. A Figura 1 ilustra esta situao. Eltrons so repelidos pelo
ctodo central que pode ser a pea que se deseja nitretar em direo aos
ctodos externos. Ao se aproximarem destes so tambm repelidos
realizando, assim, um movimento de zig-zag que aumentar a taxa de
ionizao da regio em questo. Uma alta densidade de ons significar
maior

bombardeamento

na

superfcie,

ocasionando

alta

incidncia

energtica. Esta configurao de eletrodos utilizada quando se deseja

aumentar o dano superficial, ou seja, para uma mesma temperatura de
processo, produzem-se mais defeitos na superfcie que na nitretao inica
convencional ou planar (Alves Jr., 2001).

ctodos

Figura 1 Desenho esquemtico de uma amostra na nitretao em ctodo oco

28

Nos ltimos anos tem-se observado um grande crescimento de

tcnicas de tratamento de superfcies que so ambientalmente limpas.
Dentre elas est a nitretao inica, que consiste na deposio de nitretos
em superfcies metlicas quando inseridas em plasma de nitrognio. Alm
do fator ambiental, vrias so as vantagens desta tcnica sobre as
convencionais. As mais importantes so: baixa temperatura de tratamento,
melhor controle da espessura da camada, tempo de tratamento inferior,
uniformidade na espessura da camada, nitretao de partes da pea
(Ahmed, 1987; Alves Jr, 1995).
A tcnica de nitretao a plasma de metais um mtodo bem
estabelecido com inmeras aplicaes industriais devido a resultados
peculiares nas caractersticas fsicas e qumicas dos materiais, como o
aumento na dureza, resistncia ao desgaste e oxidao, alm de
comprovada biocompatibilidade (Figueroa, Alvarez, 2006).

2.4 NITRETAO DO TITNIO

Os nitretos de titnio caracterizam-se pela combinao de algumas

propriedades das cermicas: alto ponto de fuso (3160-3250C), alta dureza
(2500-3000 HV), estabilidade trmica e qumica, resistncia ao desgaste e
corroso, com algumas propriedades metlicas, tais como baixo coeficiente
de atrito e alta condutividade trmica e eltrica (Mezger, 1992; Fouilland,

29

1998). H vrios nitretos de titnio, sendo que a literatura refere com mais
freqncia o TiN e o Ti2N.
Suas propriedades so exploradas na produo de componentes
mecnicos, no aumento da vida til de ferramentas de corte e na tecnologia
da micro-eletrnica. Sua semelhana em colorao com o ouro amarelo
considerada uma qualidade importante j explorada em relojoaria e tendo
seu uso sugerido no recobrimento de superfcies metlicas de prteses
odontolgicas. O interesse da comunidade acadmica crescente em
relao a estes compostos. Nos ltimos anos, a odontologia, ortopedia e
cardiologia tm investigado suas propriedades de resistncia superficial e
biocompatibilidade (Aronson, 1997).
Pesquisas sobre tcnicas relatam que a nitretao em plasma e a
carbonitretao so as tcnicas de difuso com plasma mais usadas nas
indstrias para o tratamento superficial de peas mecnicas. Os nitretos e
carbetos de titnio so materiais duros que melhoram as propriedades
tribolgicas da superfcie, ou seja, aumentam a resistncia ao desgaste e
dureza superficial (Ylbas, 1996).
O interesse pela aplicao de tcnicas de modificao de superfcie,
especialmente a superfcie do titnio c.p. e da liga Ti-6Al-4V pela medicina
remonta dcada de 1980. A liga Ti-6Al-4V extensamente utilizada em
prtese de joelho e fmur desde a dcada de 1970. Ao longo dos anos 80
houve a constatao da falha em condies asspticas, de prteses de
joelho e fmur aps longo perodo de uso. A inspeo dos tecidos que
circundavam as prteses que falharam os mostrou com uma colorao

30

enegrecida. Este fenmeno foi creditado ao desgaste superficial do titnio e

do polietileno que compem a prtese. O atrito entre os componentes devido
ao uso desgastou a superfcie dos mesmos e danificou a camada protetora
superficial de xidos do titnio, fazendo com que partculas dos trs
componentes da liga e do polietileno se dispersassem nos tecidos. Embora
no tenha sido verificado nenhum efeito txico sistmico frente a estes
elementos enegrecidos, sua presena levou mobilizao de clulas
inflamatrias, especialmente macrfagos, que geraram a ostelise e perda
assptica dos implantes. Houve um consenso no sentido da necessidade de
um tratamento superficial que reduzisse a baixa resistncia ao atrito desta
liga, preservando suas qualidades (Sovak, 2000).
Foram avaliados os efeitos dos parmetros de nitretao relacionados
s condies do plasma. As concluses foram as seguintes: a concentrao
atmica de nitrognio diminui com o aumento da distncia relativa
superfcie, mas aumenta com a temperatura, j que o raio de difuso do
nitrognio aumenta quando a temperatura da superfcie e do substrato
aumentam. A nitretao em plasma diminui o coeficiente de frico, mas
este aumenta abruptamente quando se rompe a resistncia ao desgaste
superficial. A microdureza mostrou variao similar no processo de
nitretao, ou seja, ao aumentar a temperatura durante o processo h
aumento conseqente na microdureza. Os autores referem que aps um
pequeno tempo de nitretao a superfcie fica levemente amarelada;
aumentando-se o tempo esta se torna dourada e com longo tempo de
nitretao, como 30 horas, a superfcie da amostra torna-se escura. Nos

31

difratogramas os picos de nitrognio so mais evidentes em temperaturas

mais altas (Yilbas, 1996).
Em estudos referentes ao processo de CDV para a obteno
industrial de coberturas de TiN usado h mais de 20 anos, porm a alta
temperatura exigida no processo (1000C) no adequada s ligas
odontolgicas. J a obteno de TiN atravs de PVD exige o aquecimento
do substrato a temperaturas que variam entre 200 e 500C, tornando
possvel seu uso em Odontologia. A colorao da cobertura dependente
da quantidade de gs nitrognio presente durante o processo (Mezger,
1992).
O processo de nitretao pode sofrer o efeito da geometria das
amostras submetidas ao plasma. Cilindros de ao inoxidvel de 8mm de
dimetro e comprimento de 1 a 10mm de altura foram submetidos ao plasma
com atmosfera contendo N2 80% em presses de 100 e 500 Pa por trs
horas. Nessas condies houve formao de uma camada de nitretos com
espessura variada e dependente da altura da amostra. A espessura da
camada aumentou com a altura das amostras, embora tenha havido
decrscimo da camada nas amostras com 8 e 10mm de altura. Foi
observada a formao de um anel de eroso relatado como efeito da
distribuio da densidade de ons prximo s bordas das amostras.
possvel haver variaes na espessura da camada de nitretos de acordo
com a conformao da amostra (Alves Jr et al., 2001).
A formao da camada de nitretos tambm influenciada pelo tipo de
processamento (oxinitretao, carbonitretao). Amostras submetidas a

32

atmosferas de nitrognio, nitrognio e ar e nitrognio e metano em

temperaturas de 800C

em 3, 6 e 12 horas de tratamento tiveram em

comum a formao de camadas de nitreto TiN e Ti2N na ordem de 15m de

espessura, identificadas por difrao de Raios X (XRD). A adio de
oxignio diminui a dureza, embora mantenha boas propriedades anticorrosivas. De modo geral, a nitretao aumenta a dureza, resistncia
frico e corroso e o limite de fadiga de ligas de titnio (Sobiecki et al.,
2002).
Estudo sobre nitretao de ligas de titnio usando plasma
luminescente em corrente contnua comparando o efeito da mistura de
gases do plasma, temperatura e tempo de tratamento revela que
temperaturas da ordem de 900 C aumentam a dureza da superfcie. Ainda,
esse parmetro est aumentado quando se utiliza a mistura de NitrognioHidrognio. A formao de camada de TiN de aproximadamente 50m pode
ser identificada pela difrao de raios X, com conseqente reduo no
coeficiente de corroso (Lakshmi et al., 2002).
A nitretao a plasma de peas de ao e outros materiais est bem
estabelecida, embora haja a necessidade de controlar as condies
experimentais para se obter resultados reprodutveis, como as condies de
operao para cada tratamento, pois est claro que os parmetros
(voltagem, fluxo do gs, presso de tratamento, limpeza da cmara e
temperatura) podem variar, gerando resultados no uniformes relacionados
a forma das amostras, tamanho e posio dentro do reator de plasma
(Atade et al., 2003).

33

A tcnica de nitretao em plasma na configurao de catodo oco foi

introduzida recentemente para a modificao de implantes de titnio de uso
clnico e amostras experimentais, por meio de um dispositivo que gera
plasma altamente excitado e com densidade aumentada sob temperatura
controlada. Foi desenvolvido um reator alimentado por fonte de alta
voltagem em corrente contnua capaz de gerar influxo de eltrons a 1500V e
2A. (Alves Jr et al., 2006). Implantes cilndricos foram submetidos a um
plasma contendo a mistura de N2 20% e H2 80% em presses de 150 e 250
Pa, temperaturas de 400, 450 e 500C durante 1 e 2 horas. A caracterizao
de superfcie mostrou que esse tipo de plasma eficaz na formao de
camadas de nitretos, principalmente TiN e Ti2N e na alterao da topografia,
produzindo rugosidade mdia variando de 0,2 a 0,8m. Outro achado
significativo foi a melhora na molhabilidade superficial em todos os grupos
tratados, revelando que a nitretao em catodo oco capaz de produzir
superfcies hidroflicas em condies controladas.
Uma alternativa ao plasma em configurao de catodo oco a
utilizao da nitretao em gaiola catdica com o objetivo de homogeneizar
as caractersticas de camada e reduzir o efeito de borda em amostras de
geometria complexa. Neste processo, as amostras so envoltas por uma
gaiola na qual um potencial eltrico aplicado. A vantagem da tcnica a
eliminao do efeito de borda, uma vez que o plasma formado na gaiola e
no diretamente sobre as amostras, alm de reduzir a temperatura de
tratamento, pois o calor irradiado da gaiola supre a quantidade de calor
necessrio para o aquecimento pr-tratamento (Alves Jr et al., 2006)

34

Cilindros de ao inoxidvel foram lixados e polidos com alumina. Aps

limpeza com acetona em banho ultra-snico, as amostras foram nitretadas
por 3 e 5 horas em temperaturas de 500C e 360Pa, nas configuraes
planar e gaiola catdica. A avaliao macroscpica revelou amostras de
colorao homognea por toda a superfcie. Ambos os processos formaram
camadas que variaram de espessura de acordo com o tempo de tratamento
(18m/5h e 5,2m/3h). A espessura e morfologia da camada obtida no
variaram na mesma temperatura de tratamento, eliminando o efeito de borda
no grupo tratado na gaiola catdica em comparao aos inconvenientes da
tcnica anterior (Alves Jr et al., 2006).

2.5 RESPOSTA CELULAR A SUPERFCIES DE TITNIO MODIFICADAS

O titnio comercial puro (Ti cp) o material de escolha para produo

de dispositivos protticos devido sua aceitao biolgica no tecido sseo,
alta resistncia corroso, peso comparado ao ao e ao fato de poder ser
preparado em vrias formas.
Os sistemas biolgicos usados em testes de citotoxicidade in vitro
podem ser cultura de rgos, cultura de clulas ou organelas celulares. O
modo mais amplamente utilizado para avaliar a toxicidade de materiais como
o titnio a cultura de clulas. Dois tipos so utilizados: linhagens celulares
permanentes derivadas de bancos de clulas (ou comerciais) ou clulas

35

primrias derivadas de explantes e estabelecidas por cada laboratrio de

pesquisa. Em comparao com a experimentao animal e estudos clnicos
em humanos, estudos in vitro apresentam vantagens pela possibilidade de
controlar as condies experimentais, relativo baixo custo, rpida execuo
e iseno de questes ticas (Brunette,1988; Cooper et al., 1998; Brunette,
1999).
A principal limitao do mtodo a dificuldade em reproduzir as
condies do ambiente in vivo e a extrapolao dos resultados para o
paciente (Schmalz, 1994). Os testes de citotoxicidade medem o efeito finito
sobre as clulas durante as primeiras 24-72 horas aps a exposio das
clulas a um agente desconhecido. Entretanto, muitas reaes biolgicas in
vivo no so apenas citotxicas e propagam-se alm desse perodo (Hanks
et al., 1996).
Os estudos de biocompatibilidade de novas superfcies de titnio
focam na avaliao da resposta celular superfcie do material. Essa
resposta traduzida pelo processo de adeso, proliferao e diferenciao
das clulas, embora a multiplicidade de modelos experimentais torne difcil a
interpretao dos resultados.
O maior objetivo de um sistema de implantes tem sido produzir
superfcies que promovam respostas desejveis nas clulas e nos tecidos
que esto em contato com o implante. A fixao de clulas no implante
dental um acontecimento complexo porque envolve trs tipos distintos de
tecidos: epitlio, tecido conjuntivo e tecido sseo. A adeso de clulas na
presena de soro um processo multifatorial envolvendo adsorso de

36

molculas de adeso do soro com molculas do material, bem como o

contato celular, fixao e espalhamento. A adsorso de protenas ocorre
rapidamente, formando uma camada de 2 a 5 nm no primeiro minuto de
contato. O contato entre as clulas e o substrato provavelmente envolve a
extenso de processos celulares que contm receptores de membrana
especificamente direcionados para vrios fatores de adsoro.
A fixao e espalhamento celular esto associados com o
desenvolvimento de estruturas celulares especficas, identificveis na
microscopia ptica e eletrnica, (1) closes contacs podem ser considerados
um modo de fixao para locomoo celular atravs do movimento do
citoplasma marginal. (2) a habilidade das clulas em exercer uma fora
contrtil est associada com a adeso focal (estruturas grandes e
permanentes) e com o contato focal (estruturas pequenas e transitrias).
Algumas protenas como as integrinas, presentes na membrana celular e
especializadas em adeso da matriz extracelular tambm esto localizadas
no contato focal.

Assim, o contato focal e adeso focal podem ser

considerados complexos de citoesqueleto da membrana especializada e

altamente adesivos: (3) outro tipo de contato a matriz extracelular, onde
fibras desta parecem conectar a membrana do plasma com o substrato; (4)
um

quarto

tipo

de

estrutura

mediando

fixao

celular

hemidesmossomas (Kasemo,1998).
As clulas no se unem diretamente superfcie do material, mas
atravs de molculas de adeso como glicoprotenas extracelulares que so
adsorvidas na superfcie. Talvez a molcula de adeso mais estudada seja a

37

fibronectina, mas tambm tm sido identificadas outras como a lamina,

epibolina, epinectina e vitronectina. As clulas tm diferentes integrinas que
podem se unir especificamente a diferentes molculas de adeso (Kasemo,
1998).
As propriedades do material que afetam a resposta celular incluem
rigidez, molhabilidade e topografia superficial. Molhabilidade a medida do
ngulo de contato crtico formado pelo espalhamento de uma gota de lquido
em uma superfcie. Este dado pode ser expresso em tenso superficial
crtica (dinas/cm2). O material com tenso superficial crtica de 20 a 30
dinas/cm2 exibe mnima adesividade biolgica. A textura superficial em um
implante tem o potencial de selecionar certas populaes celulares e alterar
suas funes, por exemplo, fibroblastos se acumulam em superfcies lisas,
enquanto os macrfagos preferem superfcie rugosa, comportamento
denominado de rugofilia. Para descrever o movimento celular direcional que
ocorre como resultado de gradientes de adesividade no substrato usa-se o
termo haptotaxis. Ento, a migrao mediada por constituintes de adeso
celular da matriz extracelular ocorre por movimento haptottico, em funo
do comportamento celular na interface tecido-implante (Brunette, 1988). A
insero de um implante produz um possvel gradiente de adesividade que
pode variar entre os diferentes tipos de clulas ou da matriz extracelular.
Desta forma seria esperado que clulas preferissem aderir umas s outras
ou matriz extracelular do que superfcie de um material com baixa
energia superficial (material com pobre adesividade), assim, esta situao
resultaria em formao de cpsula fibrosa (Brunette, 1988).

38

Outro evento importante a deposio de um filme condicionador

glicoproteico que, por sua vez, depende de dois fatores: da textura, com sua
propriedade de embricamento celular e da energia de superfcie, com sua
propriedade de adsoro molecular (Brunette,1988).
A adsoro protica ocorre rapidamente, com a formao de uma
camada de 2 a 5 nm, no primeiro minuto aps o contato com sangue. Como
regra geral, as clulas no se aderem diretamente s superfcies dos
materiais e sim camada glicoproteica extracelular que est adsorvida na
superfcie do implante. Dentre as vrias macromolculas capazes de
promover aderncia celular, as mais estudadas so: fibronectina, laminina,
epibolina, epinectina, osteopontina, molculas colgenas e vitronectina
(Baier, 1986).
O uso do plasma como meio de modificao de superfcies de titnio
estudado h algum tempo. A aplicao de plasma de argnio com o
objetivo de esterilizao do titnio revelou um aumento significativo da
molhabilidade. O ngulo de contato foi reduzido em todos os grupos ( <
20) comparado ao grupo no tratado ( =62) e ao plstico (= 61,5).
Embora tenha sido identificada a presena de contaminantes inorgnicos,
houve aumento da adeso de osteoblastos nas superfcies expostas ao
plasma por 1minuto ( Swart et al., 1992).
Amostras de materiais utilizados em prteses ortopdicas (Ti e cromocobalto) foram submetidas cultura de osteoblastos humanos para avaliar
se o substrato poderia influenciar na adeso celular. As amostras foram
submetidas a tratamentos de superfcie idnticos, polidas com lixa de

39

carbeto de silcio de granulao 600. Os resultados indicaram que a

superfcie de titnio favoreceu a adeso e diferenciao celular (Sinha et al.,
1994).
Discos de titnio submetidos a lixamento e passivados com cido
ntrico a 40% apresentaram fraca adeso de osteoblastos obtidos de
mandbula de fetos bovinos. As clulas formaram multicamadas de matriz
em mineralizao separadas da interface do titnio. reas de mineralizao
foram observadas a partir da segunda semana de modo homogneo sobre a
superfcie do disco (Yliheikki,1995).
O efeito de diferentes tipos de tratamento sobre discos de titnio
comercialmente puro (Ti cp) grau II, revelou que a adeso, proliferao e
diferenciao de clulas derivadas de osteossarcoma humano (MG63) foram
afetadas pelo grau de rugosidade do material, assim como a morfologia
celular. Em superfcies com valores de mdia de altura do perfil (Zm) entre
5.02 e 10.31 m os osteoblastos formaram uma monocamada homognea
de clulas achatadas dispersas em matriz extracelular depositada. medida
que o valor de Zm aumentava, as clulas, embora distribudas de maneira
uniforme, no formavam monocamadas, com algumas apresentando
filopdios que denotam o contato com a superfcie por adeso focal (Martin
et al.,1995).
Ainda, no estudo descrito por Martin et al., (1995), o nmero de
clulas aderidas superfcie em 24 horas foi maior em superfcies menos
rugosas, semelhantes ao controle poo de plstico da placa de cultura.
Aps 48 horas, apenas superfcies TPS (titanium plasma spray) com valores

40

de 18 m, continham significativamente menos clulas do que a superfcie

plstica. Entretanto, aps uma segunda tripsinizao, as superfcies mais
rugosas liberaram maior quantidade de clulas, sugerindo uma correlao
direta entre a rugosidade e o nmero de clulas presas na estrutura
tridimensional do disco.
Hipteses foram estabelecidas para avaliar se o aumento na
rugosidade de superfcie causa aumento na deposio de clcio, fsforo e
na produo de protena por osteoblastos obtidos de explantes primrios de
tbia de rato. A adsoro de compostos inorgnicos ocorre durante a imerso
em solues fisiolgicas independente do tipo de superfcie. Clcio e fsforo
so depositados em maior quantidade aps a primeira semana, indicando o
incio da mineralizao da matriz extracelular. Os osteoblastos sobre
superfcies lisas assumiam a forma arredondada, ao passo que em
superfcies rugosas aparecem alongados e seguindo a direo dos sulcos
causados pelo lixamento. Conclui-se que a textura da superfcie pode
influenciar a morfologia celular (Ong et al., 1996).
Osteoblastos MG63 foram utilizados para avaliar o efeito da
rugosidade e da composio qumica do titnio comercial puro (Ticp) e da
liga

TiAl6V4

usando

discos

polidos

jateados

com

grnulos

de

alumina(Al2O3). A rugosidade exerceu efeito estimulatrio na proliferao e

diferenciao celular, notadamente no Ti puro. A adeso foi mais
pronunciada no plstico em comparao s superfcies de titnio. O estudo
comprovou que a composio qumica desempenha papel fundamental, uma

41

vez que a atividade da fosfatase alcalina foi maior em superfcies de titnio

puro do que na liga (Lincks et al., 1998).
Estudos in vitro indicam que a rugosidade superficial um parmetro
importante que influencia a resposta biolgica inicial de clulas em
superfcies de titnio modificada. Discos de titnio grau II foram submetidos
a lixamento com granulaes variando de 220 a 4000 para avaliar a adeso
e diferenciao celular de clulas de medula ssea de ratos. Microscopia
eletrnica de varredura foi utilizada para determinar o efeito da rugosidade
na

morfologia

celular

enquanto

composio

qumica

da

matriz

mineralizada e da estrutura cristalogrfica foram avaliadas pela difrao de

raios X. De modo geral, as clulas aderiram s trs diferentes superfcies e
elaboraram matriz extracelular por volta do 15 dia de cultura, sem nenhuma
evidncia de que a rugosidade aumentou a deposio de protenas da matriz
extracelular. Dois padres morfolgicos foram encontrados nas superfcies:
esfrico e achatado. Clulas esfricas e exibindo mitose foram observadas
na primeira semana de cultivo (Castellani et al., 1999).
O mtodo de esterilizao um fator importante nos estudos de
biocompatibilidade, uma vez que a temperatura parece alterar as
caractersticas de superfcie do material.
Um estudo foi conduzido com o objetivo de investigar o efeito do calor
de tratamento de superfcies de titnio na adsoro de protenas e na
resposta de osteoblastos in vitro. Discos de titnio grau II foram tratados com
lixas 600 e passivados em cido ntrico a 40% em temperatura ambiente por
30 minutos. Metade das amostras foi exposta a temperaturas de 750 C por

42

90 minutos. Todas as amostras foram ento esterilizadas em luz ultra-violeta

por 24 horas. Para determinar a estrutura cristalogrfica das amostras, foi
aplicada a difrao por raios X em 20 a 70 em 2 a velocidade de 0,1 por
minuto. Cinco amostras por grupo foram selecionadas para medio do
ngulo de contato com gua destilada (Bess et al., 1999).
Altas temperaturas so capazes de alterar a estrutura cristalina da
camada superficial do titnio com a converso da camada amorfa de xido
para o TiO2 rutlico ao ser exposto a 750 C. Isto tem efeito na molhabilidade,
pois o ngulo de contato menor do que em amostras no expostas ao
calor (=32 versus =47,7) e no comportamento celular, uma vez que a
produo de protena e a atividade de fosfatase alcalina so maiores nessas
superfcies (Bess et al., 1999).
Ligas de titnio utilizadas para a fabricao de material ortopdico
foram submetidas a diferentes tratamentos de superfcie para avaliar
quantitativamente a adeso de osteoblastos humanos nessas superfcies e
as protenas expressas em funo da rugosidade da superfcie. A adeso e
proliferao celulares so menores em superfcies menos organizadas
enquanto a matriz extracelular melhor organizada e orientada em
superfcies lisas. H poucas diferenas na deposio de fibronectina,
osteopontina e colgeno tipo I entre as diferentes superfcies. A proliferao
diminui com o aumento da rugosidade mdia (Ra), enquanto foi maior em
superfcies com valores de Ra entre 0,16 e 0,30m (Anselme et al., 2000).
Ainda, a resposta de osteoblastos de medula ssea humana a ligas
de titnio TiAl6V4 com trs valores distintos de Ra (0,32, 0,49 e 0,87 m),

43

mostra que adeso e proliferao so sensveis a Ra e aumentam a medida

que a rugosidade aumenta. As superfcies dos discos de titnio foram
obtidas por lixas de carbeto de silcio de modo unidirecional resultando em
sulcos com orientao paralelos no sentido longitudinal. As clulas formaram
pontes atravs de ondulaes e se espalharam na superfcie sem diferenas
aparentes na morfologia celular. Como o tamanho do osteoblasto maior do
que a distncia entre dois sulcos adjacentes, os resultados sugerem que
clulas osteognicas podem reconhecer alteraes de rugosidade da ordem
de 0,6 m. Os osteoblastos expressaram fosfatase alcalina de modo
semelhante nas trs superfcies (Deligianni et al., 2001).
Considera-se que a adsoro de protenas sricas seja um dos
primeiros eventos a ocorrer na superfcie de um material em contato com
tecidos vivos. A natureza dessas protenas dependente das propriedades
de superfcie. A albumina e fibronectina adsorvidas de soro bovino
respondem de modo diferente a variaes de Ra, com a albumina sendo
adsorvida preferencialmente em superfcies lisas e exercendo um efeito
inibitrio

na

adeso

celular,

enquanto

fibronectina

adsorvida

preferencialmente em superfcies rugosas, favorecendo a adeso (Deligianni

et al., 2001).
Naturalmente tenta-se estabelecer a rugosidade ideal que favorea a
adeso, proliferao e diferenciao celular. Discos de titnio jateados com
partculas de TiO2 de 90, 180 e 300m apresentam superfcies com distintos
valores de Ra. A adeso de osteoblastos mandibulares humanos guarda
relao com o aumento na rugosidade, embora o jateamento com partculas

44

de 300m no corresponda a aumento adicional na adeso e nem na

morfologia celular com aparncia achatada e espalhada em todos os tipos
de superfcie (Mustafa et al., 2001).
Implantes comerciais com diferentes tratamentos de superfcie (liso,
jateado com TiO2, TPS e revestido com hidroxiapatita) foram expostos a
explantes primrios de calvria de ratos para determinar o efeito da
superfcie na adeso e morfologia celular. As clulas foram categorizadas
em 4 estgios, sendo o estgio 1 caracterizado por clulas ovais com
poucos filopdios, que progridem com extenses citoplasmticas focais ou
lamelopdios (estgio 2), espalhamento circunferencial (estgio 3) e
espalhamento com formato achatado poligonal (estgio 4). Observa-se que
um nmero similar de clulas aderem as diferentes superfcies, exceo
de implantes revestidos com hidroxiapatita, com poucas clulas aderidas. A
superfcie de plasma spray de titnio (TPS) favorece o espalhamento celular,
enquanto nas outras superfcies isto ocorre de modo mais lento. Ainda, a
forma da clula reflete a textura do substrato (Lumbikanonda, Simmons,
2001).
A topografia da superfcie pode alterar o modo como o citoesqueleto
da clula se organiza e se direciona em substratos de titnio com
rugosidades diferentes. Fibroblastos gengivais de quinta a stima passagem
foram semeados sobre os discos por 48 horas. As clulas aderidas guiadas
por contato dependem do valor mdio da altura pico-vale (Ra). Mesmo em
superfcies polidas, onde as clulas no tm nenhuma estrutura para poder
se alinhar, 11% das clulas est por definio, alinhada em qualquer

45

direo. A adeso de clulas MC3T3 mais forte pela formao de contatos

focais (fibras de stress de actina) em discos com sulcos do que nas
superfcies no texturizadas e polidas (Eisenbarth et al., 2002).
Osteoblastos obtidos de calvria de rato respondem de modo distinto
a superfcies de titnio com composio qumica modificada. A presena de
hidroxiapatita revestindo ligas de titnio impede o crescimento e a viabilidade
celular de clulas Osteo-1. Entretanto, este revestimento aumenta a
formao de matriz extracelular. As clulas apresentam morfologia achatada
e poligonal com processos citoplasmticos partindo do corpo celular
independente do substrato onde foram semeadas (Lavos-Valereto et al.,
2002).
Ainda acerca da rugosidade do titnio, observa-se que a rugosidade
deve ser considerada no apenas em termos de amplitude, mas tambm em
termos de organizao. H melhor adeso e proliferao de osteoblastos
obtidos de crista ilaca humana em superfcies com microrugosidade, baixa
repetibilidade e valores maiores de Ra

Rz. Nos sulcos de maior

periodicidade, as clulas adotam forma poligonal, enquanto em superfcies

mais caticas as clulas adotam um padro fusiforme (Anselme et al., 2002).
A despeito do longo uso de metais como implantes ortopdicos, ainda
h problemas com esses materiais no ambiente biolgico. Osteoblastos
humanos semeados em Ticp, ligas, ao inoxidvel e liga de cromo-cobalto
com superfcies semelhantes quelas de uso clnico revelam que as clulas
aderem, proliferam e formam ndulos mineralizados em todos os substratos.
Nas superfcies lisas as clulas exibem forma achatada e apenas pequenas

46

diferenas so observadas nas superfcies com composies qumicas

distintas. Entretanto, nas ligas de titnio rugosas, a diferenciao ocorre em
menor tempo, sugerindo um efeito positivo da rugosidade na diferenciao
celular (Schimidt et al., 2002).
Discos de titnio (TiAl6 V4) com cinco tipos de topografia submetidos a
testes in vitro com clulas pr-osteoblsticas derivadas de calvria de rato
MC3T3 revelam que h variaes na expresso de protenas de adeso
analisadas por imunofluorescncia, onde a actina expressa no
citoesqueleto, vinculina nas reas de adeso focal e fibronectina e colgeno
tipo I na matriz extracelular. Existe uma correlao significativa entre a
rugosidade superficial e o crescimento celular, sendo que a proliferao e o
espalhamento dos osteoblastos pela amostra maior em superfcies mais
lisas. Nos discos tratados com jateamento de areia (Ra= 0,62 / Rt= 8,76) as
clulas

apresentam

formato

esfrico,

com

poucos

prolongamentos

citoplasmticos, enquanto nas superfcies polidas (Ra= 0,16 / Rt= 1,46)

tornam-se achatadas com prolongamentos e finas extenses do citoplasma
em mltiplas direes (Linez-Bataillon et al., 2002).
A adeso celular e diferenciao so induzidas por protenas sricas
como a fibronectina, que adsorvem a superfcie do titnio. Placas polidas
com alumina e submetidas ao plasma de argnio por 1 minuto em descarga
luminescente (glow discharge plasma) a baixa presso foram submetidas a
culturas de clulas pr-osteoblsticas MC3T3 em meios com e sem soro. A
adsoro de fibronectina foi medida nos dois meios. O estudo revelou que a
adeso celular positivamente influenciada pelo soro, comprovando o papel

47

das protenas na adeso celular e que esta foi significativamente aumentada

no grupo tratado em plasma. O efeito foi atribudo limpeza da superfcie e
ao aumento da molhabilidade promovido pelo plasma (Shibata et al., 2002).
A adeso e proliferao celular em superfcies de titnio um evento
maior no processo de osseointegrao de prteses metlicas intra-sseas.
Um estudo investiga os parmetros de rugosidade, energia livre de
superfcie e hidrofobicidade de substratos de titnio e sua relao com o
comportamento de fibroblastos humanos em cultura. A molhabilidade da
superfcie investigada pela tcnica da gota sssil revela que superfcies com
alta polaridade e energia superficial tm um efeito positivo na adeso e
proliferao em amostras de Ticp e Liga de nquel-titnio (TiNi). Valores de
rugosidade referentes s distncias pico-vale (Rz) de todas as amostras tm
correlao com a proliferao celular e quanto maior a rugosidade, menor a
proliferao (Ponsonnet et al., 2003).
Osteoblastos obtidos de explantes primrios de calvria de ratos e
expostos a discos de titnio puro e liga, polidos com alumina de partculas
variando de 25 a 250m e esterilizados em autoclave no apresentam
diferenas na adeso celular em duas horas de avaliao. Os diferentes
tratamentos geram superfcies com valores de Ra diferentes, embora no
sejam observadas diferenas significativas na adeso, proliferao e
protenas totais. A atividade de fosfatase alcalina e formao de ndulos
mineralizados, caractersticos da diferenciao celular, so afetados pela
natureza qumica do substrato, mas no pela rugosidade, sendo maior no
Ticp (Rosa, Beloti, 2003).

48

Em outro experimento, a adeso de osteoblastos foi avaliada

considerando o tempo de avaliao em 4 e 24horas aps serem semeadas
em discos de titnio com diferentes rugosidades. A adeso no afetada
pela rugosidade em nenhum dos tempos de avaliao, mas maior em 24
horas (Xavier et al., 2003).
A topografia de superfcie pode afetar a funo e estrutura celular dos
osteoblastos. Superfcies com valores de Ra=6.07m bombardeadas com
partculas de corundum (xido de alumnio) apresentam bordas agudas que
inibem a formao de estruturas fibrilares de tensina, afetando a
organizao do citoesqueleto de clulas MG63. Como conseqncia,
observa-se a reduo na mineralizao, atribudo ao tipo de superfcie (Nebe
et al., 2004).
A variao na faixa de rugosidade e sua influncia na adeso celular
mostra que existe um predileo por superfcies com valores intermedirios
e Ra. Discos de titnio polidos com partculas de alumina de diferentes
tamanhos geram superfcies com rugosidades que variam de 0,05 a 1,20m
com grande influncia na adeso de clulas U-2OS aps duas horas de
incubao. Amostras com Ra = 0,15 m tem a melhor adeso e
espalhamento quando comparadas com superfces mais lisas (Ra=0,05) ou
mais rugosas (Ra= 0,3 e 1,20 m) (Huang et al., 2004).
A diferenciao de osteoclastos em placas de titnio tratadas com e
sem plasma revela que aumento da energia livre de superfcie, produzida
pelo plasma de argnio em descarga luminescente afeta a diferenciao de
osteoclastos sobre placas de titnio. A adsoro de protenas do soro

49

maior nas placas tratadas no plasma sugerindo que as protenas da matriz

extracelular esto diretamente relacionadas ao processo de diferenciao
celular e esta beneficiada por este processo de modificao de superfcie
(Kawai et al., 2004).
A adsoro de componentes inorgnicos no meio de cultura favorece
a ligaco e adsorco de protenas da matriz extracelular sobre superfcies
metlicas. Observa-se que h aumento significativo na adsoro de sdio
nas superfcies de titnio tratadas em plasma andico de argnio e isso
induz a maior adsoro de fibronectina sobre o material (Yamamoto et al.,
2005).
Os efeitos da composio qumica do material, composio qumica
da camada superficial e a topografia so largamente estudados em culturas
de clulas osteoblsticas. Quando comparadas amostras experimentais de
Ticp, liga de titnio e ao inoxidvel submetidas a seis diferentes processos
de modificao de superfcie obtendo duas amplitudes de R a, demonstra-se
que nem a composio do material nem a topografia exercem efeito
significativo na resposta de osteoblastos humanos. Entretanto, ao se revestir
as amostras com uma fina camada de ouro-paldio, modificando a
composio qumica da superfcie, observa-se um decrscimo na adeso
celular na maioria dos substratos, exceto no grupo tratado por jateamento e
ataque com cido sulfrico e neste caso demonstrado que o tipo de
processamento pode, de algum modo, influenciar a adeso celular pela
morfologia e composio qumica da superfcie (Anselme, Bigerelle, 2006).

50

O titnio possui estruturas policristalinas com diferentes orientaes

que so identificadas por difrao de raios X. As propriedades fsicas desse
material dependem da distribuio e orientao dos cristais. Clulas prosteoblsticas MC3T3 expostas a amostras de Ti AL6 V4

com duas

orientaes cristalogrficas sugerem que a adeso e a proliferao celular

sofrem efeito da orientao tridimensional dos cristais e que o tipo de
processamento determinante dessa modificao (Faghihi et al. 2006).
Observa-se que superfcies de titnio ionizadas em plasma em
resduos de gases no vcuo por 60 minutos induzem a maior confluncia e
adeso de osteblastos, quando comparadas a amostras no ionizadas. Os
osteoblastos aderidos apresentaram morfologia mais achatada do que no
grupo controle.

A energia dos ons depende da voltagem da descarga

eltrica e o tempo de exposio no plasma influencia na resposta celular

(Abidzina et al., 2007).

51

3 OBJETIVOS

O presente trabalho tem por objetivo avaliar as caractersticas fsicas

e qumicas de superfices de titnio modificadas por nitretao a plasma e o
efeito na adeso e proliferao de clulas pr-osteoblsticas in vitro.
O protocolo de pesquisa foi submetido apreciao e aprovado pela
Comisso de Avaliao de Projetos de Pesquisa- CAPPesq (n 620/05) e
pela Comisso de tica do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de So Paulo.

52

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 PREPARO DAS AMOSTRAS

Setenta e oito discos de titnio grau II ASTM F86, nas dimenses de

15mm de dimetro por 1,5mm de espessura foram lixados gradualmente
com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400, 600, 1000, 1200 e 2000 em
gua corrente. Foram depois polidas (politriz AROTEC, modelo APL-2 e
srie 212560, BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, slica coloidal
(SiO2) com partculas de 0,1m (ATM-GMBH, Alemanha) e gua oxigenada
(H2O2) 20V at um acabamento final de 0,04m.
As amostras polidas foram limpas em banho de

ultra-som com

acetona por 10 minutos, com objetivo de remover contaminantes que

pudessem interferir no processo de nitretao inica. As amostras foram
secadas em temperatura ambiente e acondicionadas em placas de cultura
at a nitretao.

4.2 PROTOCOLO DE NITRETAO

53

Aps o polimento, as amostras foram colocadas em uma cmara de

ao inoxidvel (reator), com 400 mm de dimetro e 400 mm de comprimento,
hermeticamente fechada, para receber o tratamento de superfcie (Fig.2).
Foram utilizadas duas configuraes no reator de plasma, nitretao em
gaiola catdica e planar (Figs. 3 e 4, respectivamente).
A gaiola foi produzida a partir de titnio puro grau II, em dimenses de
76mm de dimetro por 25mm de altura, com uma cobertura removvel. A
espessura da parede de 0,8mm, com furos de 7,6mm de dimetro e
distncia entre os centros dos furos adjacentes de 9,2mm. Nesta
configurao um isolante foi posicionado sobre o porta-amostra para garantir
a mesma distncia do topo e da lateral da gaiola.
Internamente, a cmara possui um eletrodo em forma de disco, sobre
o qual colocada a amostra (Fig. 2). Inicialmente foi feito um vcuo no
reator at uma presso de 10-1 mbar e ento se introduzia hidrognio com
um fluxo de 12sccm, como gs de arraste de impurezas, at uma presso de
1,6 mbar por 20 minutos. Aps essa etapa, introduziu-se o N2 a 3sccm at
conseguir uma atmosfera de trabalho estvel em torno de 680V, 0,5
miliampre (mA), temperatura de 450C e presso de nitretao de 2,5mbar.
Nessas condies as amostras foram nitretadas por 60minutos. O protocolo
de nitretao foi utilizado de acordo com o preconizado por Alves Jr (2001,
2006).

54

Figura 2 - Reator de plasma

Figura 3 - Configurao de nitretao em gaiola catdica

Figura 4 - Configurao de nitretao em modo planar

As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo a um

fluxo de gases de 15sccm (tabela 2).

55

Tabela 2 Parmetros de tratamento com plasma de nitrognio

Grupo
experimental

Configurao
do reator

Atmosfera
do plasma

Presso
do
plasma
-

Temperatura
do plasma

Tempo
tratamento
-

Fluxo
do gs
total
-

I (polidas)

II

Planar

N20%H80%

1h

2,5mbar

450C/17.5mA

15sccm

III

Gaiola

N20%H805

1h

2,5mbar

450C/17.5mA

15sccm

catdica

Depois de terminado o tratamento de superfcie, as amostras foram

seqencialmente submetidas a ensaio de caracterizao superficial, como
descrito a seguir.

4.3 CARACTERIZAO DAS AMOSTRAS

4.3.1 Fases superficiais

Para anlise das fases superficiais foi utilizado um difratmetro de

raios X Shimadzu modelo XRD-6000. Duas amostras foram analisadas com
ngulos de varredura entre 30 e 800, passos de 0,0020 e tempo de 3 s por
passo numa velocidade de 10/min.

4.3.2 Textura superficial

56

Uma amostra de cada grupo foi submetida microscopia eletrnica

de varredura (MEV) para anlise das caractersticas de textura superficial
(JEOL JSN 6060, 10-20 KeV) em ampliaes de 40, 100 e 200 vezes.

4.3.3 Rugosidade

Para anlise da rugosidade foi mensurado o parmetro Ra em seis

amostras de cada grupo, utilizando um rugosmetro modelo SURTRONIC 3,
(Taylor-Hobson Inc, USA) com cut-off igual a 0.25. As medidas foram
tomadas em trs direes diferentes, em ngulos de aproximadamente 1200
com disperso nestas trs direes inferior a 10%.
Trs amostras de cada grupo foram submetidas a anlise da
topografia em um microscpio de fora atmica modelo Shimadzu (SPM
9500J3) em ampliaes de 50x50 micra e 37,5x37,5 micra. As medidas de
rugosidade foram feitas considerando-se quatro direes diferentes da
amostra, variando-se os ngulos de medida em 45 em uma mesma
imagem. Os valores de rugosidade representam a mdia das quatro
medidas.

57

4.3.4 Molhabilidade

Aps o tratamento a plasma, cinco amostras de cada grupo

experimental foram submetidas ao ensaio de molhabilidade. A tcnica
utilizada foi a determinao do ngulo de contato esttico, ou tcnica da gota
sssil, para cada uma das amostras, mensurada por dois observadores. As
amostras foram colocadas em uma superfcie plana e utilizando uma
micropipeta digital de volume ajustvel com uma soluo fisiolgica,
posicionada de forma perpendicular e muito prxima superfcie foi
depositado 0,25ml da soluo sobre a superfcie da amostra.
De forma a padronizar o teste e por serem gotas muito pequenas, foi
feito acompanhamento da mudana do ngulo por 01 seg., 30 seg. e 60 seg.

4.4 ENSAIOS DE ADESO E PROLIFERAO CELULAR

Aps a exposio ao plasma, 45 amostras foram acondicionadas em

placas de cultura de 24 poos de 2cm 2 de rea e esterilizadas por radiao
gama. A dose total de radiao por amostra foi de 25 kGy, liberada a uma
dose mdia de 8,993 kGy/h (2h 46minutos a uma distncia de 50mm), em
irradiador GAMMACELL 220 Excel (MDS Nordion, Ca).

58

Para os experimentos de adeso, foram plaqueadas 1x10 4 clulas

/cm2 por poo, da linhagem MC3T3 aps a oitava passagem, sobre todos as
placas, totalizando 36 discos divididos em trs grupos experimentais: Grupo
I (Titnio polido); Grupo II (20%N2:80%H2 - 1h em modo planar); Grupo III
(20%N2:80%H2 1h em gaiola catdica). Trs amostras de cada grupo
foram aleatoriamente selecionadas para anlise da morfologia celular.
Quatro poos de cada placa foram utilizados como controle. As clulas
foram semeadas em triplicatas em todos os grupos.
A proliferao celular foi analisada atravs das contagens do nmero
de clulas aderidas s amostras, nos diferentes tempos experimentais (1, 2
e 3 dias) de todos os grupos, em triplicatas. Estes dados foram utilizados
para a obteno das curvas de crescimento celular dos diferentes grupos
experimentais.

Controle Polido

Planar

Gaiola
Catdica

Adeso e
proliferao

ME

V
Figura 5 Desenho do experimento com cultura de clulas de acordo com os
grupos

59

4.4.1 Curva de crescimento e viabilidade celular

Trinta e seis poos foram contados por 24, 48 e 72 horas aps o

plaqueamento. O nmero de clulas viveis colhido de cada Flask foi obtido
pela contagem de clulas viveis atravs do uso de hemocitmetro e o
mtodo da excluso de clulas coradas pelo azul de trypan (FRESHNEY,
2000). O nmero total de clulas originrias do frasco foi obtido atravs da
seguinte equao matemtica: Nmero total de clulas contadas x diluio x
104/ Nmero de quadrados do hemocitmetro usados para contagem.
Finalmente, o percentual de viabilidade da populao celular foi obtido
dividindo-se o nmero total de clulas viveis pelo nmero total de clulas e
o resultado, multiplicado por 100.

4.5

CARACTERIZAO

DA

MORFOLOGIA

CELULAR

POR

MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA

Uma amostra de cada grupo experimental foi fixada em soluo de

glutaraldedo a 2,5% em tampo fosfato de sdio 0,1 M por 2 horas
temperatura ambiente. A ps-fixao se deu atravs de soluo de tetrxido
de smio a 1% no mesmo tampo. Em seguida, as amostras foram
desidratadas em etanol em srie crescente, imersas em hexametildisilazane

60

(HMDS) por 30 minutos e secas no ar dentro da capela. Para anlise por

microscopia eletrnica utilizou-se um microscpio JEOL 6100. As amostras
foram revestidas com ouro por sputtering, cuja espessura final estimada foi
de 10nm. Todas as amostras foram fotografadas no microscpio eletrnico
de varredura com distncia focal de 20mm e aumento de 40 e 500X. Foram
obtidas eletromicrografias com o objetivo de abranger as mesmas reas de
todos eles.

4.6 ANLISE ESTATSTICA

Os dados foram submetidos anlise no paramtrica. A existncia

de diferenas significativas entre cada tipo de tratamento de superfcie foi
identificada mediante anlise da mdia dos postos e saparatrizes. Cada
dado das contagens celulares corresponde mdia sem (desvio padro da
mdia) de 4 amostras por grupo. As diferenas entre os grupos foram
comparadas pelo mtodo Kruskal-Wallis para dados no relacionados entre
si e pelo teste de Friedman para dados do mesmo grupo. O nvel de
significncia foi de 5% (p0,05), com 95% de confiana.

61

5 RESULTADOS

5.1 COMPOSIO DE CAMADA

A composio da camada superficial avaliada pela difrao de raios X

revelou a presena de xido de titnio em todas as superfcies e a formao
de nitreto de titnio nas amostras submetidas ao plasma, embora no tenha
sido possvel caracterizar fases Ti2N de acordo com a figura 6.

Figura 6 - Difratograma de rX das amostras em diferentes condies de tratamento em 2

62

5.2 TEXTURA SUPERFICIAL

Uma amostra de cada grupo foi analisada por microscopia eletrnica

de varredura (MEV) com a finalidade de observar a textura da superfcie
aps o tratamento. Os trs grupos apresentaram texturas de superfcie
distintas, embora o tratamento por gaiola catdica tenha criado microgranulaes uniformemente distribudas pelo disco. (Fig. 7)

Figura a. gaiola catdica

Figura b. planar

Figura c. polida
Figura 7 - Textura de superfcie das diferentes condies de tratamento por microscopia
eletrnica de varredura

63

A topografia analisada por microscopia de fora atmica (fig.8) mostra

claramente a distino entre as superfcies resultantes dos trs mtodos de
tratamento. O titnio polido apresenta superfcie plana com evidncias de
direcionamento de sulcos e cristas decorrentes do lixamento e polimento (fig.
8-c). A amostra submetida ao plasma de nitrognio em configurao de
gaiola catdica mostra picos e vales com pouco espaamento distribudos
homogeneamente por toda a superfcie (fig. 8-a). Observa-se que a mdia
da distncia vertical mxima entre os picos mais altos e os vales mais
baixos, expressos pelo parmetro Ry , so mais destacados nessa condio
de tratamento, o que denota uma superfcie com perfil agudo. A
configurao planar produz igualmente uma superfcie rugosa, no entanto,
os picos e vales se distanciam menos em relao ao perfil mdio da
superfcie (fig 8-b).

Figura a. gaiola catdica

Figura b. planar

64

Figura c. polida

Figura 8 Topografia tridimensional dos diferentes tipos de tratamento por microscopia de

fora atmica (MFA)

5.3 RUGOSIDADE

As medidas de rugosidade foram obtidas por dois mtodos distintos;

profilmetro de contato e microscopia de fora atmica. As medidas de
rugosidade por microscopia de fora atmica foram feitas considerando-se
quatro direes diferentes da amostra, variando-se os ngulos de medida
em 45 em uma mesma amostra. Os valores de rugosidade representam a
mdia das quatro medidas. Esses dados esto expressos na tabela abaixo
(Tabela 3).

65

Tabela 3 - Valores de rugosidade obtidos por microscopia de fora atmica (MFA)

Parmetros de rugosidade em nanmetros

tratamento

amostra

Ra

Ry

Rz

Rms

Rp

Rv

Polido

6.6

216.2

85.6

8.3

183.9

32.3

Polido

8.5

321.3

106.0

10.7

298.3

23.0

Polido

2.4

216.0

77.3

3.8

153.7

62.0

Planar

10.4

261.9

108.3

15.1

157.6

104.3

Planar

11.1

110.9

51.7

1.9

54.2

57.0

Planar

13.0

293.7

120.7

16.7

227.7

66.0

Gaiola

24.6

385.1

141.4

30.7

277.0

108.0

Gaiola

22.6

414.2

189.0

30.0

316.2

96.0

Gaiola

25.2

711.2

307.5

34.4

593.8

117.3

As medidas de rugosidade por profilmetro mecnico foram feitas

considerando-se trs direes diferentes da amostra, variando-se os ngulos
de medida em 45 em uma mesma amostra. Os valores de rugosidade
representam a mdia das medidas. Esses dados esto expressos na tabela
abaixo (Tabela 4).

Tabela 4 - Valores de rugosidade obtidos por profilmetro mecnico

Parmetros de rugosidade em micrometros

Tratamento

amostra

Ra

Rq

Rz

Rms

Rp

Rv

Polido

0.04

0.05

0.24

0.05

0.14

0.11

Polido

0.04

0.05

0.22

0.05

0.11

0.11

Polido

0.04

0.05

0.26

0.06

0.12

0.14

Polido

0.04

0.05

0.25

0.06

0.12

0.12

Polido

0.04

0.05

0.24

0.06

0.11

0.12

Polido

0.04

0.05

0.25

0.06

0.14

0.11

Planar

0.30

0.37

1.48

0.37

0.67

0.81

Planar

0.04

0.06

0.24

0.06

0.11

0.12

66

Planar

0.06

0.08

0.36

0.08

0.16

0.20

Planar

0.06

0.08

0.37

0.08

0.21

0.15

Planar

0.07

0.09

0.40

0.09

0.20

0.20

Planar

0.07

0.09

0.41

0.09

0.18

0.23

Gaiol

0.04

0.05

0.23

0.05

0.12

0.11

Gaiol

0.11

0.13

0.62

0.13

0.30

0.32

Gaiol

0.09

0.11

0.39

0.11

0.20

0.18

Gaiol

0.07

0.09

0.39

0.09

0.19

0.19

Gaiol

0.13

0.15

0.66

0.15

0.30

0.30

Gaiol

0.08

0.10

0.46

0.10

0.23

0.23

As amostras tratadas na gaiola catdica apresentam valores de

rugosidade significativamente diferentes dos outros grupos, sugerindo um
efeito positivo dessa configurao em alterar a textura do titnio, dado
evidenciado no perfil obtido pela microscopia de fora atmica.

Tabela 5 - n de amostras, medianas, quartil 25, mdia dos postos e significncia

estatstica para valores de rugosidade (Ra) referentes aos diferentes tratamentos do titnio
obtidos por microscopia de fora atmica

Polidoa
Planarb
Gaiolac

Mediana

Q25

3
3
3

6,6
11,1
24,6

2,4
10,4
22,6

Mdia dos
postos
2
5
8

P
0,027
-

Letras iguais revelam no existir diferena significativa

Nvel de significncia de 5% (p0,05).

Os parmetros de rugosidade tambm foram mensurados por

profilmetro mecnico. As medidas foram tomadas em seis amostras de
cada grupo experimental sob trs direes diferentes, em ngulos de
aproximadamente 1200 com disperso nestas trs direes inferior a 10%.
(Tabela 6).

67

Tabela 6 - n de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos postos e significncia

estatstica para valores de rugosidade (Ra) referentes aos diferentes tratamentos do titnio
obtidos por profilmetro mecnico

Polidoa
Planarb
Gaiolab

Mediana

Q25- Q75

6
6
6

0,04
0,06
0,08

0,04- 0,04
0,05- 0,12
0,06- 0,11

Mdia dos
postos
4,5
10,92
13,8

P
0,01
-

Letras iguais revelam no existir diferena significativa

Nvel de significncia de 5% (p0,05).

Os valores de rugosidade obtidos foram significativamente diferentes

entre as amostras polidas e as amostras expostas ao plasma. No houve
diferena significativa entre as duas configuraes de nitretao.
Ambos os mtodos de avaliao de rugosidade foram capazes de
identificar diferenas de rugosidade de superfcie entre os grupos

30,00

0,30

25,00

0,25

20,00

0,20

Ra

Ra

experimentais (figs. 9 e 10).

15,00

10,00

0,15

0,10

5,00

0,05

0,00

0,00
Polido

Planar

Gaiola

Grupos de tratamento

Figura 9 - Valores de rugosidade media (Ra)

obtidos por microscopia de fora atmica

Polido

Planar

Gaiola

Grupos de tratamento

Figura 10 - Valores de rugosidade media

(Ra) obtidos por profilmetro mecnico.

68

5.4 MOLHABILIDADE

A molhabilidade foi obtida de trs amostras de cada grupo

experimental pela determinao do ngulo de contato esttico para cada
uma das amostras e mensurada por dois observadores (fig 11).

polido 0s

polido 30s

polido 60s

planar 0s

planar 30s

planar 60s

gaiola 0s

gaiola 30s

gaiola 60s

Figura 11 - ngulo de contato nas diferentes superfcies do titnio

Os dados demonstram que a superfcie com maiores valores de

rugosidade (Ra =24nm) apresenta menores ngulos de contato do lquido
com o titnio, caracterizando um comportamento hidroflico e polar dessa
nova superfcie obtida em configurao de gaiola catdica.

69

Tabela 7 - n de amostras, medianas, quartil 25, mdia dos postos e significncia

estatstica para os valores dos ngulos de contato referentes aos diferentes tratamentos do
titnio

Polidoa
Planarb
Gaiolac

Mediana

Q25

3
3
3

15,29
49,20
11,70

14,52
48,70
9,85

Mdia dos
postos
5
8
2

P
0,027
-

Letras iguais revelam no existir diferena significativa

Nvel de significncia de 5% (p0,05).

50,00

Molhabilidade

40,00

30,00

20,00

10,00

Polido

Planar

Gaiola

Grupos

Figura 12 - ngulo de contato nas diferentes superfcies de titnio

5.5 ADESO E PROLIFERAO CELULAR

As clulas MC3T3 reagiram de modo particular tanto topografia

quanto a composio qumica das superfcies expostas. A adeso celular foi
mais pronunciada no controle. O plstico representa tanto uma superfcie
mais lisa, como quimicamente diferente do titnio, alm de ser o ambiente
padro para o cultivo celular. H diferena significativa para os valores de
adeso celular em 24 horas para as superfcies de titnio (tabela 8).

70

Tabela 8 - n de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos postos e significncia

estatstica para valores de adeso celular em 24 horas referentes aos diferentes
tratamentos do titnio

Mediana

Q25- Q75

Plsticoa

18,2x104

Polidob
Planarc
Gaiolac

3
3
3

4x104
5,6x104
6,8x104

11,8x104
21,9x104
2,8x104 - .
5,2x104 - .
5,6x104 - .

Mdia dos
postos
11,5

P
0,013

2,0
5,5
7,5

Letras iguais revelam no existir diferena significativa

Nvel de significncia de 5% (p0,05).

A proliferao celular apresentou um comportamento semelhante em

relao ao controle, embora no tenha havido diferenas estatsticas
significativas entre as superfcies polida e nitretada, nestas, independente da
configurao de tratamento (tabela 9).

Tabela 9 - n de amostras, medianas, quartil 25 e 75, mdia dos postos e significncia

estatstica para valores de proliferao celular em 72horas referentes aos diferentes
tratamentos do titnio

Mediana

Plsticoa

67,2x104

Polidob
Planarb
Gaiolab

3
3
3

18,8x104
21,6x104
15,6x104

Q25- Q75
49,2x104
89,7x104
12,0x104 - .
21,2x104 - .
12,8x104 - .

Mdia dos
postos

11,5

0,036

4,3
6,6
4,0

Letras iguais revelam no existir diferena significativa

Nvel de significncia de 5% (p0,05).

Entre as diferentes superfcies do titnio a adeso foi mais

pronunciada na superfcie obtida por meio da configurao de plasma em
gaiola catdica, indicando que a microarquitetura favorece a acomodao
celular (Figuras 13-15).

71

1000000,00

200000,00

Nmero de clulas

Nmero de clulas

800000,00

150000,00

100000,00

600000,00

400000,00

200000,00
50000,00

0,00
plstico

polido

planar

gaiola

plstico

Grupos de tratamento

polido

planar

gaiola

Grupos de tratamento

Figura 13 - Adeso de osteoblatos MC3T3 em

24 horas nos diferentes grupos

Figura 14 - Proliferao de osteoblastos

MC3T3 em 72horas nos diferentes grupos

Polida(a)

Polida(b)

Polida(c)

Planar(a)

Planar(b)

Planar(c)

Gaiola catdica (a)

Gaiola catdica (b)

Gaiola catdica(c )

Figura 15 Adeso e proliferao de osteoblastos MC3T3 nas diferentes superfcies de

titnio em 24,48 e 72horas(a,b e c respectivamente) visualizadas por MEV

72

5.6 CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR

O crescimento celular aumentou de modo linear no grupo controle nos

perodos de avaliao. As clulas proliferaram de modo expressivo em 48
horas, com discreta diferena dentro do grupo planar de 24 para 48 horas
(figura 16). Os resultados indicam que a adeso sofre mais impacto das
caractersticas superficiais do titnio, pois medida que as clulas tendem a
confluncia, as camadas sobrepostas j tem pouco contato com a topografia
original.

Figura 16 - Proliferao celular nos diferentes grupos identificados por MEV

5.7 MORFOLOGIA CELULAR

A morfologia dos osteoblastos variou de acordo com o padro da

superfcie do titnio. Nas amostras polidas com baixos valores de Ra, a

73

clula adquiriu a forma achatada com regies de contato entre as clulas e

aparentemente no seguindo um padro de orientao paralelo s linhas de
orientao causadas pelo lixamento
observam-se

projees

dendrticas,

(fig. 17a). Nas superfcies rugosas,

distribudas

aleatoriamente

pela

superfcie. Verifica-se discretos filopdios, representando pontos de adeso

focal em resposta a rugosidade superficial e as clulas apresentando maior
proximidade umas com as outras (figs. 17b e 17c)

a.Polida

b.Planar

c.Gaiola catdica

Figura 17 - Morfologia dos osteoblastos em 24h nas diferentes superfcies

74

6 DISCUSSO

Desde a introduo de materiais metlicos como substitutos de

articulaes em humanos, busca-se incessantemente o aprimoramento
destes

de

modo

obter

articulaes

artificiais

biocompatveis

funcionalmente estveis. A larga aplicao do titnio como biomaterial devese em grande parte a sua excelente adaptao ao tecido orgnico,
notadamente ao tecido sseo.
H dcadas os implantes de titnio com superfcies lisas tm sido
utilizados com finalidades diversas em odontologia e medicina, tais como
materiais de osteossntese, implantes dentrios, prteses ortopdicas e
stents vasculares. Com a evoluo do tratamento clnico e apoiado em
estudos experimentais houve uma transio para o desenvolvimento de
implantes com rea de superfcie aumentada ou mesmo modificada
quimicamente.
Essas superfcies so responsveis por assegurar uma melhor
estabilidade ssea inicial propiciando uma osseointegrao mais rpida e a
aplicao precoce de carga mecnica

sobre esses implantes, alm de

assegurar estabilidade em longo prazo, que o objetivo primordial de

qualquer material para uso prottico.
Diversos mtodos de tratamento de superfcie tm sido desenvolvidos
desde a introduo do conceito da osseointegrao na dcada de 60. Dentre
as modalidades encontram-se processos com aplicao na confeco de

75

implantes em escala industrial para criar superfcies texturizadas atravs de

revestimento por PVD e CVD, jateamento com partculas abrasivas, ataque
com substncias cidas, tratamento termoqumico, laser, implantao inica
e o uso de plasma em configuraes variadas (Aronson et al. 1997; Sykaras,
2000;

Cheung,

2002;

Ikeda

et

al.

2002;

Kasemo,

2002;

Mndl;

Rauschenbach, 2002; Mndl et al., 2002; Le Guhennec et al., 2007). Cada

mtodo apresenta particularidades no modo como altera o material, seja por
adio ou subtrao de componentes da superfcie ou de camadas mais
profundas do material.
Vrios estudos concentram-se em examinar o efeito de mtodos
especficos de tratamento de superfcie na composio e estrutura da
camada de xido para os materiais a base de titnio. O resultado dos
diferentes tratamentos origina superfcies com alteraes topogrficas de
diferentes dimenses espaciais representadas, em sua maioria, pela
rugosidade superficial, mas tambm na composio qumica e na energia
livre da superfcie de modo que essas alteraes podem ser caracterizadas
por parmetros fsicos e qumicos (Kilpadi, Lemons, 1994; Czarnowska et
al.,1999; Mekayarajjananonth, 1999; Placko et al., 2000; Wennerberg,
Albrektson, 2000; Lim et al., 2001; Amaral et al. 2002; Lakshmi et al., 2002;
Rupp et al., 2004; Kholes et al., 2004; Vanzillota et al., 2004; CzyrskaFilemonowicz et al., 2005; Nowakowski 2006).
Avaliou-se neste trabalho o efeito da modificao de superfcies de
titnio puro grau II pela nitretao em plasma por descarga luminescente. A
tcnica consiste em expor o titnio em uma atmosfera gasosa contendo uma

76

mistura de N2 e H2 com fluxo de 15sccm na proporo 20-80%

respectivamente, a baixa presso, ionizados por corrente contnua da ordem
de 600V, mantendo-se a temperatura de tratamento controlada de 450 C,
durante 60 minutos. Este mtodo de tratamento foi introduzido na
modificao de materiais para implantes dentais e consiste na deposio de
nitretos em superfcies metlicas quando inseridas em plasma de nitrognio.
Apresenta caractersticas peculiares como ser ambientalmente limpa,
permite o tratamento a baixa temperatura, melhor controle da espessura da
camada, tempo de tratamento curto, uniformidade na espessura da camada,
nitretao de partes da pea, e economica em relao a tcnicas mais
convencionais (Ahmed, 1987; Alves Jr, 1995; Alves Jr, 2001).
No presente trabalho, a nitretao das amostras foi realizada na
configurao planar, onde os discos eram apoiados no porta-amostra e na
configurao em gaiola catdica, onde as amostras foram circundadas por
uma gaiola de titnio com o objetivo de potencializar o efeito do plasma.
As amostras submetidas s diferentes condies do plasma
comportam-se de modo a produzir camadas superficiais com distintas
caractersticas analisadas ao difratmetro de Raio X. Nas amostras
nitretadas, os picos referentes a fase -titnio possuem intensidade inferior
aos das amostras no nitretadas. Uma vez que o substrato das duas
amostras semelhante, a explicao para essa diminuio est na absoro
dessa radiao pela fase superficial formada devido ao tratamento. Tambm
se observa que, de um modo geral, h um deslocamento para a esquerda
desses picos quando comparados queles das amostras no tratadas.

77

Sabe-se que pela lei de Bragg a posio angular inversamente

proporcional distncia interplanar. Deste modo, houve aumento na
distncia interplanar na fase provocada provavelmente pela insero dos
tomos de nitrognio na rede do titnio, formando uma soluo slida
contnua.
Outro aspecto a ser considerado foi o ngulo de varredura utilizado.
Duas amostras foram analisadas com ngulos de varredura entre 30 e 800.
Provavelmente o ngulo de varredura utilizado tenha identificado o rearranjo
na estrutura cristalogrfica do titnio ocasionado pelo processamento a
plasma. ngulos rasantes podem identificar melhor as fases que se formam
na camada superficial e no na estrutura interna da amostra. A utilizao de
ngulos de varredura da ordem de 4 podem detectar com mais preciso a
fase TiN, Ti2N em amostras nitretadas a plasma (Lakshmi et al. 2002). O
exame por MEV destaca a formao de compostos de precipitados na
superfcie das amostras nitretadas no identificados pela difrao de raios X.
O tempo de exposio do titnio na atmosfera do plasma parece
influenciar a formao de compostos de nitreto de titnio na superfcie do
material, tendo em vista o aparecimento de fases de TiN nas amostras
nitretadas no tempo de 2 horas e a ausncia deste composto em tempos
mais curtos de exposio. A formao de TiN em atmosferas no tempo de 2
horas mostra maior incorporao de N2 numa concentrao menor do gs.
Essa diferena pode ser atribuda maior concentrao de H 2 na atmosfera,
o que induz maior passivao da superfcie e permite maior incorporao do

78

nitrognio no titnio, haja vista que o composto TiN reflete uma fase mais
rica em nitrognio (Guerra Neto, 2001).
A alterao na concentrao do gs tambm induz alteraes nas
camadas superficiais do titnio tempo dependente. Amostras nitretadas com
80% de nitrognio em 1 hora de exposio ao plasma revelaram a menor
interao entre o titnio superficial e o nitrognio do plasma. Amostras
submetidas atmosfera do plasma contendo N2 a 80% e uma hora de
exposio no foram capazes de formar compostos de nitreto de titnio,
provavelmente devido a pouca passivao da superfcie, em conseqncia
da baixa concentrao de H2 no plasma associado ao menor tempo de
tratamento superficial (Alves Jr., 2006).
Os resultados sugerem que as condies utilizadas na investigao
representam o nvel ideal de concentrao de H2 em funo do tempo, com
a finalidade de obteno de nitretos em superfcies de titnio num curto
espao de tempo, ou pelo menos, no menor tempo possvel com a utilizao
desta tcnica. Embora ambos os parmetros influenciem na formao de
uma superfcie quimicamente modificada, os compostos de TiN, mais ricos
em nitrognio, dependem mais do tempo de exposio do que da
concentrao de H2 (Guerra Neto, 2001).
Ligas de titnio polidas com alumina submetidas a nitretao a
plasma apresentam fases de TiN dependentes da mistura do gs e do tempo
de exposio. A dureza da camada maior quando tratada em temperatura
de 900 C por quatro horas contendo mistura de nitrognio e hidrognio,
alm de apresentar aumento na resistncia a corroso (Lakshmi et al.,

79

2002). Este fato atesta favoravelmente ao uso da nitretao a plasma, pois a

reduo da corroso um requisito fundamental para a biocompatibilidade
do titnio.
A caracterizao de superfcie revelou alteraes topogrficas
significativas provocadas pela nitretao a plasma em ambas as
configuraes. Os trs grupos apresentaram texturas de superfcie distintas,
embora o tratamento por gaiola catdica tenha criado micro-granulaes
uniformemente distribudas pelo disco. Enquanto as amostras tratadas no
plasma de nitrognio evidenciam a formao de superfcie texturizada com
variaes de amplitude em toda a superfcie do material, o titnio polido no,
tendo como conseqncia, valores distintos nos parmetros de rugosidade
em escala nanomtrica, conforme achados na microscopia por fora
atmica.
Discos de titnio lixados com carbeto de silicone, eletropolidos e
jateados com partculas de fosfato de clcio revelam morfologia distinta
quando analisados por MEV e MFA. Apenas fases de titnio so
identificadas, o que indica que a topografia foi alterada em conseqncia do
tipo de tratamento, sem modificar a composio qumica independente da
composio do substrato. Um fato relevante que os valores da rugosidade
dependem da escala de avaliao. Quando analisadas em escalas acima de
100m, tanto as amostras jateadas quanto as eletropolidas so idnticas.
Em escalas menores, abaixo de 1m, as amostras eletropolidas e polidas
aparecem idnticas. Portanto, os valores quantitativos da rugosidade
dependem significativamente do nvel de resoluo da medida (Placko et al.,

80

2000). De modo similar, a mensurao de valores de Ra por profilmetro de

contato, microscopia de fora atmica e interfermetro realizadas em discos
preparados com mtodos tpicos da confeco de implantes dentais,
revelam que o tratamento de superfcie e o tipo de instrumento influenciam
fortemente os valores de Ra (Kholes et al., 2004).
A topografia analisada por MFA mostra claramente a distino entre
as superfcies resultantes dos trs mtodos de tratamento. O titnio polido
apresenta superfcie plana com evidncias de direcionamento de sulcos e
cristas decorrentes do lixamento e polimento. A amostra submetida ao
plasma de nitrognio em configurao de gaiola catdica mostra picos e
vales com pouco espaamento distribudos homogeneamente por toda a
superfcie. Observa-se que a mdia da distncia vertical mxima entre os
picos mais altos e os vales mais baixos, expressos pelo parmetro R y , so
mais destacados nessa condio de tratamento, o que denota uma
superfcie com perfil agudo. A configurao planar produz igualmente uma
superfcie rugosa, no entanto os picos e vales distanciam-se menos em
relao ao perfil mdio da superfcie.
As amostras tratadas na gaiola catdica apresentam valores de
rugosidade significativamente diferentes dos outros grupos, sugerindo um
efeito positivo dessa configurao em alterar a textura do titnio, dado
evidenciado no perfil obtido pela microscopia de fora atmica. Neste caso
em particular, apenas amostras de titnio puro grau II foram utilizadas e,
portanto, no foi possvel determinar o efeito da nitretao em diferentes
composies do titnio.

81

A anlise da rugosidade foi obtida primeiramente pelo profilmetro de

contato. Esse mtodo, apesar de utilizado largamente em estudos de
caracterizao de superfcies, apresenta limitaes quanto ao nvel de
resoluo da escala (m). Ainda assim, os valores de rugosidade obtidos
foram significativamente diferentes entre as amostras polidas e as amostras
expostas ao plasma. No houve diferena significativa entre as duas
configuraes de nitretao. Estes dados so coerentes com os valores
obtidos pela MFA, o que valida, de certo modo, a mensurao da rugosidade
superficial de amostras de titnio com dispositivos tradicionais, levando em
considerao que a variabilidade nos mtodos de caracterizao da
rugosidade pode obscurecer as correlaes funcionais entre a topografia de
superfcie e os eventos iniciais da osseointegrao.
Os protocolos para quantificar os valores de rugosidade so variados
assim como os mtodos de mensurao. importante que se estabelea um
padro nos estudos de caracterizao levando em considerao esses
detalhes, assim como o nmero de medidas mnimas necessrias para obter
inferncia estatsticas. Embora no haja consenso na literatura consultada,
h predileo por no mnimo trs medidas em cada amostra e trs amostras
de cada tipo diferente de topografia (Sykaras et al., 2000; Bagno et al., 2004,
Kholes et al., 2004).
A molhabilidade foi obtida de cinco amostras de cada grupo
experimental pela determinao do ngulo de contato esttico ou tcnica da
gota sssil para cada uma das amostras e mensurada por dois
observadores. Os dados demonstram que a superfcie com maiores valores

82

de rugosidade (Ra =24nm) apresenta menores ngulos de contato do lquido

com o titnio, caracterizando um comportamento

hidroflico e polar dessa

nova superfcie obtida em configurao de gaiola catdica. Este fato pode

ser relacionado a uma superfcie rugosa com um padro de perfil regular,
reduzindo a possibilidade de que contaminantes possam ficar retidos em
microdeformaes ao longo da superfcie.
Durante a fase de tratamento o reator foi alimentado com o fluxo de
H2 durante aproximadamente 30 minutos e at que a temperatura atingisse
450 C mantendo a baixa presso. A adio de Hidrognio (H2) ao plasma
tem por objetivo a passivao e ativao da superfcie pela remoo da
camada de xido e limpeza de impurezas que podem estar presentes na
superfcie da amostra e interferir no processo de nitretao.
A reduo da molhabilidade tambm atribuda ao acmulo de
eltrons quando se utiliza o plasma de argnio em configurao andica e
no ao efeito apenas da limpeza promovido por ons positivos e nutrons
gerados pela configurao catdica (Shibata, 2002). Nestas condies,
osteoclastos apresentam maior diferenciao e as protenas presentes no
meio de cultura, relacionadas ao fenmeno de adeso celular, so mais
adsorvidas do que no titnio polido (Kaway et al., 2004). Considerando que a
adsoro de protenas sricas na superfcie do material um evento
primrio na osseointegrao, a adeso celular mediada pela fibronectina e
outras protenas aumentada em superfcies tratadas a plasma.
Muito embora as condies estabelecidas no presente trabalho
difiram do plasma de argnio, possvel que a reduo do componente

83

hidrofbico seja uma combinao de fatores que alterem a polaridade e a

energia de superfcie.
Em geral, as superfcies hidroflicas representam melhores condies
para a adeso celular do que superfcies hidrofbicas. Os estudos de
caracterizao de superfcie atribuem a molhabilidade um papel relevante no
modo como osteoblastos aderem e proliferam no titnio (Lampin et al., 1997;
Ponsonnet et al. 2003)
Apesar da dificuldade em atribuir a este dado isolado o efeito na
molhabilidade, observa-se uma relao prxima entre a rugosidade e a
molhabilidade do titnio, que dependente do tipo de tratamento utilizado na
obteno de novas superfcies. No presente trabalho as superfcies tratadas
em gaiola apresentaram reduo no ngulo de contato ao lquido utilizado,
confirmando uma superfcie com melhor molhabilidade, a qual refletiu
melhor adeso celular. A nitretao a plasma mostrou-se uma tcnica eficaz
na modificao de superfcie do titnio tanto no aumento da rugosidade
quanto no aumento da molhabilidade.
Alguns parmetros devem ser observados quando se avalia a
molhabilidade superficial de um biomaterial. Fatores como a composio
qumica do material, estrutura cristalogrfica, lquidos usados nas medies
e tipo de tratamento, todos influenciam no resultado obtido.
Os modelos in vitro so propostos com o intuito de melhor
compreender os fenmenos iniciais do processo de osseointegrao e de
como as clulas interagem com superfcies modificadas pelos mais variados
mtodos. A adeso funcional e estrutural entre o tecido sseo e a superfcie

84

de implantes ortopdicos submetidos carga sugere ser fator de sucesso in

vivo (Sinha et al., 1994).
A superfcie modificada deve conservar as propriedades intrnsecas
do material e ser biocompatvel, pois o objetivo final de qualquer alterao
superficial exercer algum grau de controle sobre os processos que o
organismo ou biomolculas respondem ao material, que podem variar de
uma reao de citotoxicidade at a induo de osseointegrao entre o
material e o osso do organismo receptor (Brunete, 1988; Kasemo et
al.,1998).
sabido que a adeso celular na superfcie do titnio um fator
primordial para a osseointegrao de prteses metlicas e implantes
dentais. Tm sido dada muita nfase ao papel da rugosidade superficial do
titnio como o principal responsvel pela adeso de osteoblastos e a
conseqente formao de tecido mineralizado na interface com o implante
(Martin et al., 1995; Ong, 1996; Castellani, 1999; Lavos-Valereto et al., 2002;
Schimidt et al., 2002; Nebe et al., 2004; Huang et al., 2004) embora
trabalhos

demonstrem

que

superfcies

com

diferentes

rugosidades

respondam de maneira semelhante no que diz respeito a adeso e

proliferao celular (Mustafa et al., 2001; Rosa, Beloti, 2003; Xavier et al.,
2003; Anselme, Bigerele 2006)
A rugosidade mdia de uma superfcie (Ra) isoladamente no um
parmetro definitivo para se avaliar o comportamento de uma clula
textura do material. Diferentes mtodos de tratamento podem produzir
valores de Ra semelhantes e no refletir o impacto do mtodo no

85

desempenho clnico. A anlise de parmetros hbridos da topografia merece

ser mais bem investigada na caracterizao e eventual correlao com a
molhabilidade e com a alterao na morfologia celular durante a fase de
adeso.
Devido a limitao de testar a biocompatibilidade de materiais in vivo,
os modelos in vitro com culturas de clulas so os mais freqentemente
utilizados para avaliar as etapas iniciais de osseointegrao em biomateriais.
Esses modelos criam microambientes bem controlados, acessveis e
fornecem dados consistentes para anlise (Schmalz, 1994; Hanks et al.,
1996; Cooper et al.,1998; Li, 1999; Brunette, 1999).
Os ensaios de biocompatibilidade em novas superfcies de titnio so
realizados com diferentes tipos de clulas (primrias, clones, imortalizadas)
que guardam propriedades especficas quanto ao grau de interao com o
microambiente do material. As clulas osteoblsticas permitem estudar as
interaes

clula/material

essenciais

no

desenvolvimento

de

novos

materiais. Muitos trabalhos so realizados com linhagens de clulas

imortalizadas com o potencial de expressar caractersticas fenotpicas dos
osteoblastos como SaoS2, MG-63, L929, ROS17/2.8, MC3T3 (Jayamaran,
2004; Faghihi et al., 2006; Abdizina et al., 2007).
A escolha pelo tipo celular adotado no estudo foi baseada no fato de
as clulas MC3T3 serem consideradas uma linhagem pr-osteoblstica
(osteoblast-like) obtida a partir da calvria de ratos com potencial de
diferenciao. Estudos de diferenciao demonstram a capacidade das
MC3T3 em expressar fosfatase alcalina e sintetizar matriz extracelular

86

contendo osteocalcina, osteopontina, osteonectina e colgeno tipo I,

tornando-as viveis para estudos de biocompatibilidade de novos materiais
(Cooper et al., 1998; Eisenbarth, 2002; Linez-Batailon et al., 2002).
A resposta celular na interface influenciada pelas condies de
superfcie, tais como tipo e pureza do material, rugosidade, molhabilidade e
energia de superfcie. A ateno tem se voltado para a energia de superfcie
e para a molhabilidade como parmetros importantes na resposta celular,
embora a rugosidade tambm atue diretamente (Lampin et al., 1997; Placko
et al., 2000; Shibata et al., 2002; Ponsonnet et al., 2003).
As clulas MC3T3 reagiram de modo particular tanto topografia
quanto a composio qumica das superfcies expostas. A adeso celular foi
mais pronunciada no controle. O plstico representa tanto uma superfcie
mais lisa como quimicamente diferente do titnio, alm de ser o ambiente
padro

para

cultivo

celular.

Esse

comportamento

observado

freqentemente em estudos de biocompatibilidade de superfcies (Lincks et

al., 1998;Anselme et al., 2000; Linez-Batailon et al., 2002).
Entre as diferentes superfcies do titnio a adeso foi mais
pronunciada na superfcie com maior rugosidade, indicando que a
microarquitetura favorece a acomodao da celular. Os discos tratados na
configurao de gaiola catdica apresentaram superfcie mais rugosa do que
na configurao planar e mais clulas aderidas em 24horas. Os resultados
sugerem um efeito positivo da gaiola na capacidade de gerar superfcies
texturizadas homogneas, pela concentrao de ons energizados prximos
s amostras, uma vez que as condies de temperatura, presso do reator e

87

tempo de tratamento foram idnticos em ambas as configuraes. Ainda, as

amostras nitretadas em gaiola catdica, podem ter a superfcie com mais
compostos de TiN devido a alta densidade de ons concentrada sobre as
amostras, de modo que a clula interage com uma superfcie nos aspectos
topogrficos e qumicos.
A adeso celular parece ser favorecida em superfcies rugosas em
comparao a polidas (Lampin et al., 1996; Martin et al., 1996; Bchle,
Kohal, 2004) embora sem preferncia quanto ao TIcp e liga de Ti Al 6V4
(Placko et al., 2000). No presente trabalho todas as amostras foram obtidas
do titnio puro grau II e nenhuma considerao pode ser feita quanto a
nitretao alterar de modo diferente o titnio puro e suas ligas. O estudo de
diferentes mtodos de preparo de superfcie do titnio e ao inoxidvel
revela que nem a amplitude da rugosidade nem a composio do material
influenciam a adeso celular, exceto em substratos de titnio puro tratados
com jateamento de areia. Entretanto, atribui-se alta significncia entre os
diferentes processos de preparo e a morfologia e composio qumica da
camada superficial resultante de cada mtodo (Anselme, Bigerelle, 2006;
Faghihi et al., 2006). De outro modo, estudos com clulas MG-63, derivadas
de fibroblasto humano, demonstram que o aumento na rugosidade do titnio
diminui a proliferao e aumenta a diferenciao celular (Wirth et al., 2008).
Aparentemente existe uma relao entre a rugosidade superficial e a
adeso celular onde os osteoblastos aderem mais em superfcies mais
rugosas at um determinado limite. Portanto, o desenvolvimento de novas
superfcies, independente do mtodo, conduzido com alteraes nos

88

parmetros da tcnica (plasma, ataque cido, jateamento) com o objetivo de

estabelecer a melhor condio de topografia que possa induzir uma resposta
biolgica mais favorvel (Mustafa et al., 2000).
A proliferao celular apresentou um comportamento semelhante em
relao ao controle, embora no tenha havido diferenas estatsticas
significativas entre as superfcies polida e nitretada, nestas, independente da
configurao de tratamento. Este achado um indicador da no toxicidade
do filme de nitreto de titnio .
O crescimento celular aumentou de modo linear no grupo controle nos
perodos de avaliao. As clulas proliferaram de modo expressivo em 48
horas com discreta diferena dentro do grupo planar de 24 para 48 horas.
Os resultados indicam que a adeso sofre mais impacto das caractersticas
superficiais do titnio, pois a medida que as clulas tendem a confluncia, as
camadas sobrepostas j tm pouco contato com a topografia original.
Embora no tenha havido seguimento das clulas por um maior perodo de
tempo, a reduo no nmero de clulas pode corresponder ao incio do
processo de diferenciao celular, onde h reduo na atividade proliferativa
e o incio da produo de matriz extracelular.
A morfologia dos osteoblastos variou de acordo com o padro da
superfcie do titnio. Nas amostras polidas com baixos valores de Ra a
clula adquiriu a forma achatada, aparentemente seguindo uma orientao
paralela s linhas de orientao causadas pelo lixamento e mantendo
poucas regies de contato entre as clulas. Nas superfcies rugosas,
observa-se projees dendrticas, distribudas aleatoriamente pela superfcie

89

e discretos filopdios, representando pontos de adeso focal em resposta a

rugosidade superficial, embora no tenha sido possvel identificar claramente
diferenas na morfologia da celular entre as diferentes superfcies.
O titnio possui estruturas policristalinas com diferentes orientaes
que so identificadas por difrao de raios X. As propriedades fsicas desse
material dependem da distribuio e orientao dos cristais. Clulas prosteoblsticas MC3T3 expostas a amostras de Ti AL6 V4

com duas

orientaes cristalogrficas sugerem que a adeso e a proliferao celular

sofrem efeito da orientao tridimensional dos cristais e que o tipo de
processamento determinante dessa modificao (Faghihi et al., 2006).
Muitos estudos so direcionados para definir a natureza das
interaes entre a caracterstica da camada do Ticp e os tecidos
circunvizinhos e os efeitos biolgicos do tratamento de superfcie. Apesar do
potencial de se controlar propriedades especficas, as caractersticas
desejveis no so completamente definidas ou compreendidas. A
combinao dos efeitos da textura e da composio qumica deve ser levada
em considerao.
Os modelos adotados para o estudo do comportamento da clula em
relao a uma nova superfcie do titnio apresentam grande variao nos
desenhos experimentais, incluindo o mtodo de preparo da amostra,
esterilizao e tipo celular, gerando controvrsias sobre o real papel que
cada fator desempenha nos resultados. Portanto, imprescindvel que os
resultados sejam analisados considerando que diferentes mtodos de

90

preparo podem gerar superfcies com potencial de induzir respostas distintas

na reao celular.
No presente trabalho foi

possvel observar dificuldades com o

controle do equipamento de nitretao. Pequenas alteraes no fluxo de gs

e da presso interna do reator podem alterar as caractersticas de superfcie
das amostras submetidas ao plasma. Portanto pode-se afirmar que o
controle rgido de todo o processo importante para se obter amostras com
homogeneidade e confiabilidade dos resultados.
O tempo de execuo do processo pode ser considerado um ponto
crtico do ponto de vista experimental, uma vez que a temperatura de
trabalho obtida aps cerca de 45 minutos de iniciado o sistema e as
amostras s podem ser retiradas aps o resfriamento do reator, elevando
assim o tempo total de cada ciclo de nitretao em aproximadamente trs
horas. O tamanho do porta-amostra tambm um fator limitante na
quantidade de discos que podem ser expostos ao plasma por unidade de
tempo. Essas limitaes devem ser superadas em trabalhos futuros e no
desenvolvimento de equipamentos de nitretao em escala industrial.
No caso da nitretao a plasma, os resultados obtidos confirmam a
viabilidade do uso da tcnica e seu efeito positivo nos eventos celulares
iniciais do processo de osseointegrao. Este mtodo capaz de produzir
modificaes topogrficas e na composio qumica da camada superficial,
mantendo as caractersticas de biocompatibilidade dessa nova superfcie
como demonstrado pelos ensaios de adeso e proliferao
condies estabelecidas por este estudo.

celular nas

91

7 CONCLUSES

Considerando a proposio do estudo realizado com amostras de

titnio puro grau II para avaliar a resposta celular em novas superfcies
modificadas por nitretao em plasma, pode-se concluir que:
1. A nitretao de titnio por descarga luminescente foi eficaz na
modificao da topografia e na alterao da estrutura qumica da
camada superficial.
2. Para mesmas presses e temperaturas de trabalho, observou-se
que em gaiola catdica, a superfcie mais rugosa

que na

configurao planar.
3. A nitretao a plasma capaz de produzir superfcies com
caractersticas hidroflicas principalmente na configurao de
gaiola catdica.
4. A molhabilidade da superfcie foi maior nas amostras com maior
rugosidade.
5. Ambas as configuraes produzem superfcies compatveis com
adeso e proliferao de clulas pr-osteoblsticas.
6. A adeso celular influenciada pela composio qumica e
rugosidade da superfcie do substrato.

92

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102

APNDICE

103

Morfologia celular das Clulas aderidas nas diferentes superfcies do titnio

em 24 horas por microscopia eletrnica de varredura (MEV)

Figura 1 - Adeso celular no titnio polido

Figura 2 - Adeso celular no titnio nitretado em modo planar

Figura 3 - Adeso celular no titnio nitretado em gaiola catdica

104

Morfologia celular das Clulas aderidas nas diferentes superfcies do titnio

em 24 horas por microscopia eletrnica de varredura (MEV)

Figura 4 - Adeso celular no titnio polido

Figura 5 - Adeso celular no titnio nitretado em modo planar

Figura 6 - Adeso celular no titnio nitretado em gaiola catdica

105

Textura das diferentes superfcies dos discos de titnio por microscopia

eletrnica de varredura (MEV)

Figura 1- MEV amostra polida em slica coloidal

Figura 2 - MEV amostra nitretada em configurao planar

106

Figura 3 - MEV amostra nitretada em configurao de gaiola catdica

107

Topografia das diferentes superfcies dos discos de titnio por microscopia de fora atmica

Figura 7 - Microscopia de fora atmica de amostra nitretada em plasma com configurao

de gaiola catdica

Figura 8 - Microscopia de fora atmica de amostra nitretada em plasma com configurao

de gaiola catdica

108

Figura 9 - Microscopia de fora atmica de amostra nitretada em plasma com configurao

plana

Figura 10 - Microscopia de fora atmica de amostra nitretada em plasma com

configurao planar

109

Figura 11 - Microscopia de fora atmica de amostra polida com slica coloidal

Figura 12 - Microscopia de fora atmica de amostra polida com slica coloidal