Divulgao

Quim. Nova, Vol. 28, No. 3, 502-510, 2005

TCNICAS DE CARACTERIZAO PARA INVESTIGAR INTERAES NO NVEL MOLECULAR EM FILMES
DE LANGMUIR E LANGMUIR-BLODGETT (LB)
Marystela Ferreira*
Departamento de Fsica, Qumica e Biologia, Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista, CP 467,
19060-900 Presidente Prudente - SP
Wilker Caetano e Rosangela Itri
Departamento de Fsica Aplicada, Instituto de Fsica, Universidade de So Paulo, CP 66318, 05315-970 So Paulo - SP
Marcel Tabak
Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, CP 780, 13560-970 So Carlos - SP
Osvaldo N. Oliveira Jr.
Instituto de Fsica de So Carlos, Universidade de So Paulo, CP 369, 13560-970 So Carlos - SP
Recebido em 18/5/04; aceito em 27/8/04; publicado na web em 17/2/05

CHARACTERIZATION TECHNIQUES TO INVESTIGATE MOLECULAR-LEVEL INTERACTIONS IN LANGMUIR AND

LANGMUIR-BLODGETT (LB) FILMS. This paper discusses fundamental concepts for the characterization of Langmuir
monolayers and Langmuir-Blodgett (LB) films, with emphasis on investigations of material properties at the molecular level. By
way of illustration, results for phospholipid monolayers interacting with the drug dipyridamole are highlighted. These results
were obtained with several techniques, including in situ grazing incidence X-ray diffraction, Fourier transform infrared (FTIR)
spectroscopy, fluorescence microscopy, in addition to surface pressure and surface potential isotherms. Also mentioned are the
difficulties in producing Langmuir and LB films from macromolecules, and how molecular-level interactions in mixed polymer
LB films can be exploited in sensors.
Keywords: Langmuir and Langmuir-Blodgett (LB) films; characterization; air/water interface.

INTRODUO
Filmes nanoestruturados de materiais orgnicos so estudados
extensivamente, principalmente devido ao possvel controle de suas
propriedades no nvel molecular. Uma das tcnicas empregadas para
a fabricao de tais filmes a de Langmuir-Blodgett (LB)1, que permite a deposio de filmes camada por camada, em que cada camada
pode ter espessura de uma nica molcula. Nesta tcnica, um filme
monomolecular, em geral, formado sobre uma superfcie de uma
subfase aquosa, denominado filme de Langmuir, e depois transferido para um substrato slido, atravs da imerso e retirada do substrato,
verticalmente, da subfase. A repetio dos processos de imerso e
retirada permite deposio de multicamadas, que podem ser altamente organizadas. Os materiais tradicionais empregados com a tcnica LB so os anfiflicos, com partes polares e apolares bem definidas, tais como os cidos graxos, lcoois, steres e fosfolipdios de
cadeias longas. Vrias aplicaes tm sido sugeridas para os filmes
LB2-12, quase sempre explorando suas caractersticas de filmes
ultrafinos e com controle da arquitetura molecular. Para as aplicaes, todavia, geralmente so usados materiais no anfiflicos e at
macromolculas. Para estes ltimos, uma srie de fatores novos precisa ser levada em conta, e os filmes de Langmuir geralmente no
so monomoleculares.
A produo de filmes LB de boa qualidade requer a obteno de
filmes de Langmuir estveis sobre a subfase aquosa, o que nem sempre trivial, principalmente para as macromolculas. Portanto, a
caracterizao de filmes de Langmuir passa a ser um tpico com
importncia prpria. De fato, o estudo de monocamadas ou filmes
de Langmuir um ramo interessante da fsico-qumica, com aplica*e-mail: mstela@prudente.unesp.br

es em muitos campos da cincia e tecnologia. Devido pequena

quantidade de material no filme de Langmuir, tcnicas de caracterizao in situ muitas vezes so sofisticadas, como aquelas para verificar estrutura e propriedades espectroscpicas e morfolgicas. Essas tcnicas so utilizadas juntamente com os mtodos tradicionais
de anlises de monocamadas, que so as medidas de presso e potencial de superfcie. Este processo de caracterizao tambm essencial para otimizar as condies de transferncia da monocamada.
Alm disso, filmes de Langmuir constitudos de fosfolipdios representam um modelo simples para uma membrana celular, cujo
arcabouo formado por uma bicamada de fosfolipdios.
Neste artigo discutiremos tcnicas experimentais que tm sido
usadas para caracterizar filmes de Langmuir, principalmente com
nfase na interao no nvel molecular. A ttulo de ilustrao, mostraremos como a interao de frmacos com os filmes de Langmuir
pode ser estudada. Mencionaremos tambm as dificuldades de anlise dos filmes de Langmuir de materiais no anfiflicos, como os
polmeros. J para os filmes LB, analisaremos resultados em que a
interao em nvel molecular de dois componentes em filmes mistos, tambm detectada nos filmes de Langmuir, confere propriedades especiais aos filmes LB.
FILMES DE LANGMUIR
Molculas anfiflicas podem se orientar na interface de uma
subfase aquosa com uma fase gasosa ou uma fase lquida para
minimizar sua energia livre. O filme interfacial resultante tem a espessura de uma molcula e comumente chamado de camada
monomolecular ou simplesmente monocamada1,13. A denominao monocamada de Langmuir foi dada em homenagem ao cientista Irving Langmuir, cujo trabalho pioneiro foi fundamental para a

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Tcnicas de Caracterizao para Investigar Interaes no Nvel Molecular

consolidao desta rea de pesquisa14. As molculas anfiflicas (Figura 1) so constitudas por uma parte hidroflica e outra parte apolar
hidrofbica. A parte hidrofbica, freqentemente formada de cadeias alifticas, diminui a solubilidade das molculas na subfase aquosa. A parte hidroflica responsvel pelo espalhamento do filme na
superfcie da gua devido sua maior interao com a subfase aquosa.

503

TCNICAS DE CARACTERIZAO
Uma grande variedade de tcnicas experimentais tem sido empregada no estudo de filmes de Langmuir. Um apanhado de resultados obtidos com as vrias tcnicas apresentado na ref. 15. Aqui
trataremos apenas de algumas utilizadas para o estudo da interao
de frmacos com filmes de Langmuir de fosfolipdios, que servem
como modelos simples de uma membrana celular.
PRESSO DE SUPERFCIE
A presso de superfcie () definida como a diferena em tenso superficial entre uma subfase na ausncia do material (o) e uma
subfase com a monocamada (), como representado na Equao 1:
= o -

Figura 1. Alguns compostos anfiflicos: cido esterico (1), cido palmtico

(2), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)] (sal de sdio)
(DPPG) (3), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina (4) (DPPC)

As monocamadas ou filmes de Langmuir so geralmente obtidos atravs da dissoluo da substncia apropriada em um solvente
apolar (de baixa constante dieltrica), voltil, seguida da sua distribuio sobre a superfcie da subfase. Filmes de Langmuir so produzidos numa cuba, usualmente de forma retangular e feita de um material hidrofbico, como o Teflon (poli(tetrafluoroetileno)), que contm a subfase aquosa. Para que o filme seja to fino a ponto de se
atingir a espessura de uma molcula, esta rea superficial deve ser
suficientemente extensa e/ou a quantidade de material espalhado
suficientemente pequena. A soluo espalhada sobre toda a superfcie e o solvente evapora em poucos minutos. Se a rea disponvel
por molcula for elevada, o filme se encontra no estado denominado
gasoso, onde as interaes entre as molculas do anfiflico so fracas
e podem ser desprezadas. Se a rea superficial para o filme for diminuda, atravs da compresso do filme com uma barreira mvel, as
molculas interagiro progressivamente medida que a rea mdia
ocupada por molcula diminuir. A Figura 2 mostra a cuba de
Langmuir com seus acessrios.

Figura 2. Cuba de Langmuir e acessrios utilizados na fabricao de filmes

de Langmuir e LB

(1)

Esta presso pode ser obtida medindo-se a fora por unidade de

comprimento sobre uma barreira mantida fixa atravs de uma
eletrobalana, ou medindo-se as tenses superficiais pelo mtodo da
placa de Wilhelmy, entre outras16. A mnima presso medida zero,
e a mxima para monocamadas bem estveis aproxima-se da
tenso superficial da subfase, que cerca de 73 mN/m (25 oC) para a
gua pura. Uma curva de presso de superfcie versus rea por molcula o anlogo bidimensional de uma isoterma presso-volume.
Podem ser definidas vrias fases para a monocamada. Para ilustrar
discutiremos a isoterma de um fosfolipdio, dipalmitoil fosfatidil
colina (DPPC), mostrada na Figura 3.
Como j mencionado, para reas superficiais extensas, as molculas encontram-se na fase gasosa (G). A fase lquida (L) ocorre quando
as molculas se aproximam umas das outras e a rea por molcula
diminui. Dependendo da molcula a ser estudada, podem estar presentes as fases lquido-expandida (LE) e/ou a lquido-condensada (LC),

Figura 3. Isoterma de presso de superfcie para uma monocamada de DPPC

puro. Representao esquematizada das fases de uma monocamada de
Langmuir com as diferentes regies de compresso do filme: regio I: fase
gasosa, as molculas esto muito longe umas das outras, no h interao
entre elas e a presso superficial zero; regio II: fase lquido-expandida
(LE), as molculas se aproximam, de tal modo que uma pode sentir sua
vizinha mais prxima, mais ou menos entre 100 e 80 2; regio III: fase
lquido-condensada (LC), aqui a proximidade entre as molculas aumenta
e algumas se tocam, aproximadamente entre 60 e 50 2. A regio IV (mais
ou menos entre 50 e 45 2) equivale fase condensada ou slida (S) em que
as molculas esto empacotadas de tal modo que se a monocamada for
comprimida um pouco mais ocorre colapso. Esta a regio V, em que o
colapso do filme pode dar lugar a agregados, dissoluo na subfase,
bicamadas e multicamadas, abaixo de aproximadamente 45 2

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Ferreira et al.

Quim. Nova

onde a compressibilidade (C), definida por C = -1/A (A/)T,P,ni (onde

n o nmero de moles do material), alta. Nesta ltima, a
compressibilidade menor que no caso LE, mas ainda no se tem o
empacotamento molecular da fase slida. Pode tambm ocorrer coexistncia das fases LE e LC, como mostrado na Figura 3. Para reas
ainda menores, a compressibilidade da monocamada diminui drasticamente, atingindo uma fase slida (S) ou melhor denominada como
condensada (C), prpria de um cristal bi-dimensional. O colapso
ocorre quando o ordenamento cristalino destrudo, a monocamada
forma estruturas diferentes daquela monomolecular. Uma linha traada
na regio da fase slida pode ser extrapolada ao eixo x, sendo esta
interseo conhecida como a rea limite da disperso molecular e representada como a rea ocupada por uma molcula que no pode ser
mais comprimida em uma monocamada de Langmuir.
Fatores que afetam as isotermas de presso de superfcie
Para um composto tradicional, como o cido esterico, a contribuio mais importante para a presso de superfcie medida a
repulso estrica entre as caudas, uma vez que o filme bastante
condensado ou seja, a presso de superfcie s comea a aumentar
significativamente para pequenas reas por molcula, em cerca de
25 2. Isso significa que no h interaes de longo alcance contribuindo para a presso, que s aumenta consideravelmente quando se
aproxima da rea mnima (de mximo empacotamento) ocupada por
uma cauda (20 2). A isoterma para o cido olico, cido carboxlico
com uma ligao dupla no incio da cauda hidrofbica, prximo do
COOH, por outro lado, consideravelmente mais expandida, uma
vez que a presso de superfcie deixa de ser nula para reas superiores a 40 2. Isto se deve s interaes de alcance mais longo entre o
grupo levemente polar introduzido pela ligao dupla com as molculas da gua. Efeitos ainda mais drsticos, com presses no nulas
para reas superiores a 100 2 em compostos com uma nica cadeia
hidrofbica, so observados em casos em que um grupo polar, como
um sulfxido, colocado no final da cadeia17.
J a insero de substncias num filme de Langmuir pode trazer
efeitos variados, dependendo da localizao da substncia e tambm
de se elas esto carregadas negativa ou positivamente, ou se so neutras no pH da gua. A maioria dos filmes tradicionais, de fosfolipdios
como o DPPG e o DPPC, tem sua rea no estado condensado
ditada pelas caudas. por isso que as reas por molcula sob altas
presses so em geral mltiplos de 20 2 (para compostos de uma
nica cadeia a rea por molcula na fase condensada de 20 2, para
um lipdio de cadeia dupla esta rea passa a ser da ordem de 40 2).
Assim, se uma dada substncia inserida na regio das caudas de um
filme de lipdio, deve-se esperar que a rea por molcula de lipdio
aumente (o filme se expande). Se a incorporao se der nas vizinhanas do grupo polar, mais difcil prever os resultados. A incorporao
tanto pode gerar um aumento de rea por lipdio como simplesmente
no afetar esta rea. Uma outra possibilidade que a incorporao da
substncia afete as prprias interaes entre as molculas do lipdio, e
neste caso at mesmo uma condensao do filme pode ocorrer, isto ,
a rea por molcula de lipdio diminui na presena da substncia.
Um exemplo de expanso da isoterma a incorporao de
dipiridamol (DIP), um frmaco vasodilatador18, a um fosfolipdio
(DPPC). A Figura 4a mostra que o filme de DPPC mais afetado
para concentraes em torno de 0,3 0,5 mol%. Analisando inicialmente os resultados de presso, notam-se dois regimes: para concentraes menores que 0,5 mol%, o filme misto apresenta uma rea por
molcula de DPPC menor do que para o filme puro. Ou seja, h
condensao da monocamada, mais evidente na regio compreendida entre as fases LE/LC. Isso indica que o DIP j altera o estado da
monocamada na razo de 1 molcula de DIP para > 100 molculas

Figura 4a. Isotermas presso-rea para monocamadas (T=21C) de DPPC

puro sobre subfase aquosa e na presena de dipiridamol (1 a 15 mol%).
Reproduzida da ref. 18 com permisso da Elsevier

de DPPC. Nas concentraes a partir de 0,3-0,4 mol% um efeito de

reexpanso da monocamada comea a ser discretamente observado.
Com 2 mol% de DIP, possvel notar um efeito de saturao da
monocamada na presena do frmaco18,19. A partir desta concentrao at cerca de 15 mol% DIP, nenhum efeito adicional de expanso
observado nas isotermas. importante salientar que a condio
necessria para a existncia de camadas monomoleculares a de que
a substncia se espalhe na interface.
As isotermas de presso de superfcie de materiais no anfiflicos
so mais difceis de analisar. Em primeiro lugar, porque o filme de
Langmuir pode no ser monomolecular devido tendncia de agregao do material na interface ar/gua. Os polmeros, por exemplo, quando
espalhados na superfcie da gua possuem um empacotamento que
determinado, principalmente, pelas foras coesivas da cadeia com a gua.
Assumem uma conformao bem diferente das molculas anfiflicas,
devido tendncia de enovelamento20. A anlise das fases das isotermas
prejudicada pela polidispersividade (diferentes tamanhos de cadeia
das macromolculas) e pelas diferentes estruturas terminais que as
cadeias podem possuir, resultando em uma composio no homognea do sistema. Utiliza-se normalmente a massa do monmero como a
unidade para os clculos da rea somente para padronizao dos experimentos. A Figura 4b mostra a isoterma obtida para o filme de
polianilina, cuja estrutura est mostrada numa insero da Figura 4b.
Problemas experimentais durante as medidas de presso de superfcie podem ocorrer devido a impurezas na monocamada, na cuba
ou na subfase; solubilidade do material espalhado ou excesso de
material espalhado. Esses problemas se refletem na irreprodutibilidade
das isotermas.
POTENCIAL DE SUPERFCIE
Uma tcnica de medida utilizada h vrias dcadas para filmes
de Langmuir a da medida do potencial de superfcie, V. Este potencial definido como a diferena de potencial entre uma superfcie aquosa recoberta com o filme de Langmuir e uma superfcie sem
monocamada. O potencial pode ser medido empregando-se uma prova
de Kelvin ou prova do capacitor vibrante. Nesta tcnica, uma das
placas do capacitor vibra acima da superfcie da gua e a outra a
prpria superfcie da gua. Esta ltima serve como referncia, cujo
potencial determinado por uma placa metlica imersa na subfase.
A diferena de potencial (V) surge devido presena de dipolos
eltricos permanentes do material que compe o filme ou da dupla

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Tcnicas de Caracterizao para Investigar Interaes no Nvel Molecular

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potencial deixa de ser nulo e aumenta, muitas vezes abruptamente,

com a diminuio da rea por molcula. Em alguns casos, o potencial atinge um patamar, caracterstico de um filme mais organizado. A
rea crtica invariavelmente maior que aquela em que a presso de
superfcie deixa de ser nula, ou seja, o potencial de superfcie mais
sensvel organizao do filme de Langmuir. A Figura 6 mostra
uma curva tpica de potencial de superfcie para cido esterico. Esta
curva pode ser explicada com o modelo de Demchak e Fort24, a partir de hipteses de como as constantes dieltricas efetivas das 3 camadas se alteram com a rea por molcula.

Figura 4b. Isotermas presso-rea para a polianilina. A estrutura da

polianilina est mostrada na insero. Reproduzida da ref. 35 com permisso
da ACS

camada formada na interface filme/gua. Modelos tericos tm sido

empregados para relacionar os potenciais medidos com os momentos de dipolo das molculas constituintes do filme. O mais utilizado
o de Demchak e Fort (DF)21, no qual o filme tratado como um
capacitor de trs camadas, cada qual com um momento de dipolo
efetivo e uma constante dieltrica local (ver Figura 5). O potencial
de superfcie no modelo DF escrito como:
V = 1/A0 (1/1 + 2/2 + 3/3) + 0

(2)

onde A a rea mdia por molcula. 1, 2 e 3 so, respectivamente,

as contribuies dos dipolos da gua reorientada na interface da
monocamada com a subfase, dos dipolos na interface gua filme e
dos dipolos na interface ar-filme. 0 a contribuio da dupla camada de Gouy-Chapman22,23, que aparece quando se forma uma duplacamada para filmes parcial ou totalmente ionizados.

Figura 6. Isoterma de potencial para o cido esterico

No caso de filmes de Langmuir de molculas maiores ou

polmeros, no possvel fazer um tratamento quantitativo do potencial de superfcie, pois no se sabe a orientao precisa dos grupos que contribuem para a componente vertical do momento de
dipolo. As curvas de potencial de superfcie so ento usadas para
comparao entre materiais diferentes ou mesmo para filmes obtidos do mesmo material sob condies diferentes. Por exemplo, quando h agregao de molculas mesmo em grandes reas por molcula, o potencial de superfcie no nulo. Alteraes considerveis da
orientao das molculas tambm causam mudanas detectveis na
curva de potencial.
DIFRAO DE RAIOS X EM NGULO RASANTE NA
INTERFACE AR-GUA (GIXD)

Figura 5. Modelo de Demchak e Fort para explicar o potencial de superfcie

da monocamada, onde a monocamada tratada como um capacitor de trs
camadas

Para grandes reas por molcula o potencial de superfcie devido ao filme geralmente zero, ou seja, as interaes entre as molculas so razoavelmente fracas para que a ponta de prova detecte alguma variao significativa no potencial da subfase lquida. Com o
filme no estruturado, os dipolos das molculas esto imersos em
um meio de constante dieltrica muito alta (basicamente gua), o
que tambm contribui para um potencial muito pequeno ou nulo.
Durante a compresso do filme, existe uma rea crtica na qual o

As tcnicas convencionais utilizadas na caracterizao das propriedades estruturais de monocamadas e filmes LB (presso, potencial de superfcie, FTIRRAS, etc.) no so capazes de fornecer informao direta do seu grau de ordenamento na interface (ar-gua
ou ar-slido). O advento de fontes de raios X com alta intensidade
de ftons, obtidos em vrios comprimentos de onda, gerada nos grandes laboratrios de luz sncrotron, em conjunto com o desenvolvimento da tcnica de difrao de raios X especfica para os estudos na
superfcie (GIXD), revolucionou o estudo de filmes de Langmuir na
ltima dcada. possvel, agora, investigar a estrutura cristalina desses filmes com uma resoluo prxima do nvel atmico25-27.
Nos experimentos de GIXD (abreviao de grazing incidence
X-ray diffraction), o princpio da reflexo total de raios X empregado25,26. Resumidamente, o aparato experimental e o princpio da
tcnica so representados nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Quando um feixe de raios X atravessa uma monocamada, depositada so-

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Ferreira et al.

Figura 7. Diagrama esquemtico de uma cuba de Langmuir acoplada ao

aparato de GIXD. Um detector linear sensvel posio move-se
horizontalmente para medir o perfil de difrao em funo do vetor de
transferncia de momento no plano qxy. PSD: detector sensvel posio

Figura 8. Geometria GIXD. A penetrao pode ser limitada em algumas

dezenas de ngstrons. Reproduzida da ref. 29 com permisso da Biophysical
Society

bre um substrato slido ou lquido, o espalhamento do substrato

dominante, uma vez que seu volume muito maior que o da monocamada. Para reduzir a intensidade espalhada do substrato, um prrequisito fundamental diminuir a profundidade de penetrao
da onda evanescente (Figura 8). Isto requer que o feixe de raios X
incida sobre a superfcie da gua ou substrato em ngulos muito
baixos (i ~ 0,1), onde o ngulo de incidncia i = 0,85c (ngulo
crtico para a reflexo total)25,26,28,29. Uma vez que o ndice de refrao para raios X ligeiramente menor que 1, o feixe incidente praticamente sofre reflexo total e apenas uma onda refratada evanescente
penetra na subfase (~ 50 ), decaindo exponencialmente com
25,26,28,29.
Os ftons espalhados so detectados acima da superfcie em vrias direes, em termos de espao recproco, em vrios valores de
componentes no plano e na direo normal ao plano da transferncia
de momento do vetor de espalhamento. Qualquer periodicidade nas
posies das molculas origina um pico da intensidade de radiao
espalhada. O feixe de raios X atinge a interface ar/gua em um ngulo i sobre a monocamada e refletido num ngulo f com um ngulo de difrao 2 em relao ao plano, como mostra a Figura 8. O
vetor da radiao espalhada dividido em uma componente no plano qxy (igual a (qx2 + qy2)1/2) e outra componente fora do plano qz (=
k(sini + sinf) ~ ksinf). A componente horizontal da estrutura no
plano, enfatizada neste trabalho, pode ser definida25 como:
Qhor = qxy =(qx2 + qy2)1/2 = k(cos2i + cos2f - 2cosicosfcos2)1/2 (3)
portanto:
qxy ~ 2ksen,

onde k = 2/

(4)

Quim. Nova

Nos experimentos convencionais a difrao de um conjunto de

planos em cristais 3D possuindo espao interplanar de distncia d
ocorre apenas quando a lei de Bragg obedecida. Portanto, o vetor
de espalhamento |q| = |kr - ki| = (4/)sin = 2d*, onde d* = ha* +
kb* + lc*. d* o recproco de d e os termos a*, b* e c* so os vetores
recprocos da cela unitria a,b e c; h,k,l so nmeros inteiros que
representam os ndices de Miller. Para um cristal 2D (bidimensional)
no existe restrio sobre o componente do vetor de espalhamento
qz, normal ao filme. Assim, o espalhamento de Bragg estende-se como
bastes contnuos (denominados Bragg rods25) alm dos pontos
do retculo 2D. O vetor qz estende-se sobre um intervalo finito pois a
espessura do cristal 2D finita. Portanto, uma monocamada condensada que apresenta uma periodicidade no plano pode ser considerada como um p bidimensional, consistindo de pequenos cristais
2D aleatoriamente orientados na interface25. necessria apenas uma
varredura em qxy ou 2 no plano da monocamada para medir o seu
padro de difrao, fazendo com que a anlise dos dados seja similar
de um padro de p 3D convencional. As reflexes podem ser
indexadas por dois ndices de Miller, h e k. Suas posies angulares
2hk correspondem a qhk = (4/)senhk levando s distncias repetidas dhk = 2/qxy-mx da estrutura do retculo 2D, onde qxy-mx = qhk
representa o valor do vetor de transferncia de momento na posio
mxima em que os picos de Bragg so determinados19.
Como um exemplo da aplicao da tcnica de GIXD, mostramos
as alteraes observadas em monocamadas de DPPC devido presena de DIP19, com a posterior comparao com os efeitos nas isotermas
de presso (Figura 4a). Uma informao direta do empacotamento
molecular utilizando medidas de GIXD nas monocamadas de lipdio
na interface lquida pode ser til para avaliar se a expanso observada
na fase LE-LC principalmente devida a uma expanso real do
empacotamento do DPPC devido interao droga-lipdio, e no apenas devido partio de DIP em uma certa frao de rea na
monocamada. As Figuras 9 e 10 mostram os picos de difrao no
plano (integradas em qz) para DPPC puro e para as monocamadas
mistas com 2 e 10% de DIP, respectivamente, adquiridos respectivamente em 20 e 45 mN/m19. Os valores de qxy estimados dos mximos
dos picos para DPPC em diversas presses e concentraes de DIP
so apresentados na Tabela 1. Pela posio do mximo dos picos, os
valores de distncias do retculo 2D podem ser diretamente calculados
e sua simetria de retculo estimada. Os dois picos obtidos em todas as
regies de presso (ver Tabela 1) podem ser indexados como um pico
degenerado contendo as reflexes 1,1 + 1,1', e 0,2 para um
empacotamento com retculo retangular centrado descrito na literatura19,27. Um pico mximo em qz > 0 para o pico contendo as reflexes
1,1 + 1,1', indicando inclinao da cadeia em relao ao vizinho prximo (NN) observado para todas as presses26,28,29.
As distncias estimadas do retculo hexagonal distorcido d02 e
d1125,26 e a rea (2Axy) da cela unitria para o sistema DIP/DPPC so
tambm apresentadas na Tabela 1. O valor de rea para a cela unitria obtida dos experimentos de difrao de 45 2, em tima concordncia com os valores de rea de DPPC puro29, e tambm com o
valor de 44,5 2 para uma monocamada condensada de DPPC obtida das isotermas -A na fase condensada C (40 mN/m). Alm disso,
os dados obtidos de GIXD apresentam o mesmo valor de rea por
cela unitria para as monocamadas condensadas acima de 30 mN/m
(Tabela 1), mesmo na presena de 2 ou 10% de DIP, o que sugere
que as molculas de droga no afetam o empacotamento do DPPC
na monocamada na sua fase condensada.
Os dados de GIXD permitiram construir um modelo no qual a
expanso observada na fase LE-LC principalmente devida a uma
expanso real do empacotamento do DPPC, e no apenas devida
partio de DIP. Levando-se em conta os dados de GIXD e das
isotermas, pode-se observar que a expanso do retculo ocorreu atra-

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Tcnicas de Caracterizao para Investigar Interaes no Nvel Molecular

Figura 9. Intensidade de espalhamento no plano de monocamadas mistas

DIP/DPPC em funo de qxy em = 20 mN/m: (a) DPPC puro, (b) DPPC
mais DIP 2% e (c) DPPC mais DIP 10%. As linhas cheias representam o
ajuste dos pontos experimentais por duas lorentzianas (=1.488).
Reproduzida da ref. 19 com permisso da Elsevier

507

Figura 10. Intensidade de espalhamento integrado em qz de monocamadas

mistas DIP/DPPC em funo de qxy em = 45 mN/m: (i) DPPC puro, (j)
DPPC mais DIP 2% e (l) DPPC mais DIP 10%

Tabela 1. Parmetros do retculo recproco qxy e real dhk, respectivos valores de rea molecular total 2Axy para DPPC, obtidos de medidas de
GIXD em monocamadas mistas DIP-DPPC em vrios valores de presso de superfcie: a. DPPC puro; b. na presena de 2% de DIP; c. na
presena de 10% de DIP
(mN/m)
20

qxy1[-1]

qxy2[-1]

d02[]

d11[]

2Axy[2]*

1.461 0.001
1.457 0.003
c
1.459 0.001
a
1.463 0.001
b
1.464 0.001
c
1.461 0.001
a
1.472 0.001
b
1.470 0.001
c
1.471 0.001

1.37 0.01
1.32 0.01
1.36 0.01
1.379 0.005
1.384 0.008
1.369 0.005
1.396 0.002
1.399 0.003
1.396 0.005

4.30
4.31
4.30
4.29
4.29
4.30
4.27
4.27
4.27

4.60
4.82
4.61
4.56
4.54
4.58
4.50
4.49
4.50

46.4
49.9
47.3
46.2
46.0
46.5
45.2
45.2
45.2

30

45

* 2Axy estimado de (a x b) [19], b=2d02 e a2=1/(d11-2 b-2).

508

Ferreira et al.

Quim. Nova

vs da interao do DIP basicamente na regio de cabea polar. Alm

disso, um efeito menor sobre o empacotamento do retculo do lipdio
foi observado para fraes molares mais altas de droga.
ESPECTROSCOPIA DE ABSORO-REFLEXO DE
INFRAVERMELHO (FT-IRRAS)
A tcnica de espectroscopia na regio do infravermelho ( na
regio de 1-100 m) fornece informaes a respeito dos modos de
vibrao das ligaes qumicas de uma molcula. O nmero de modos vibracionais associados com as molculas poliatmicas pode ser
significativo. Uma molcula de N tomos pode conter 3N-5 modos
normais de vibrao se ela linear e 3N-6 se no-linear30. A forma
destas vibraes pode ser obtida do conhecimento dos comprimentos das ligaes e ngulos, e das constantes de fora do estiramento
e de flexo (deformao) dos ngulos da ligao (outros modos de
vibrao tambm podem estar presentes alm destes dois). Por outro
lado, nem todas as partes da molcula so caracterizadas por vibraes de grupos ligados. Muitos modos normais envolvem fortes
acoplamentos entre modos de estiramento ou flexo de tomos em
cadeias lineares ou anis. Tais vibraes so denominadas vibraes
do esqueleto e tendem a ser especficas para uma molcula particular. Por esta razo, a regio do espectro onde estas vibraes ocorrem para uma molcula, geralmente abaixo de 1400 cm-1, denominada de regio de impresso digital da molcula.
No estudo de filmes de Langmuir e LB tm sido empregadas trs
variedades da tcnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR): medidas de absoro em transmisso
(FTIR), reflexo-absoro em ngulo rasante (FT-IRRAS ou RAIRS)
e refletncia total atenuada (FT-ATR), mais comum em filmes LB.
No modo de FTIR transmisso, o filme LB atravessado pelo
feixe e as intensidades das bandas de absoro informam a possvel
quantidade relativa e conformao de vrios grupos qumicos presentes nas molculas do filme. As outras tcnicas fornecem informao adicional a respeito da orientao dos grupos moleculares no
substrato: a tcnica de FT-IRRAS, com feixe polarizado, sensvel
ao componente de um momento de dipolo perpendicular ao substrato.
A tcnica de FT-ATR com feixe polarizado, que envolve a reflexo
interna mltipla do feixe da radiao dentro do substrato, pode fornecer valores de razes dicricas de vrias bandas de absoro, que
podem ser analisadas para se obter a orientao mdia de um dado
grupo qumico. Apesar do seu potencial no estudo estrutural das
monocamadas, a aplicao da tcnica de FT-IRRAS in situ na interface
ar-gua apresenta algumas dificuldades inerentes. Em primeiro lugar, os momentos de transio so relativamente fracos; os coeficientes de absoro so, tipicamente, cerca de 20 a 1000 vezes menos
intensos que os momentos de transio eletrnica. Um outro fator
que a refletividade do infravermelho na gua pequena. Alm disso,
h um efeito significativo do background nas medidas, pois a intensidade de absoro ou reflexo resultante da interao da radiao IV com a monocamada ou filme LB muito baixa, devido ao
pequeno nmero de molculas na amostra (filme). Contribuem para
este background as bandas intensas de gua lquida e vapor de gua
e CO2, que costumam interferir na regio do infravermelho-mdio.
A utilizao de FT-IRRAS em filmes de Langmuir de DPPC com
dipiridamol permitiu que se determinasse a localizao exata da
interao do frmaco com o filme18, observando-se quais regies do
filme eram afetadas. A Figura 11 mostra uma comparao das bandas
referentes aos diferentes modos de vibrao da regio da cabea polar
do DPPC31,32. Estas incluem a banda de estiramento da carbonila
(s(C=O) em 1735 cm-1); as bandas dos modos de estiramento do grupo fosfato (as(PO2)- e s(PO2)- em ~ 1228 e 1085 cm-1, respectivamente) e a banda atribuda ao modo de estiramento do grupo C -N+-C na

Figura 11. Comparao entre as freqncias de vrios modos de vibrao

do lipdio, determinada por FT-IRRAS, em monocamadas de DPPC puro
(smbolos cheios) e DPPC com 5% de DIP (smbolos vazios) T = 211 C.
Reproduzida da ref. 18 com permisso da Elsevier

colina (s(CN+C) em~ 975 cm-1). As bandas menos intensas foram

atribudas ao modo de flexo das cadeias acila ((CH2) em ~ 1470 cm-1)
e a de absoro do grupo ster C-O-C (as(C-O-C) em ~1170 cm-1),
que se apresentaram com baixa intensidade e resoluo. Diferenas
significativas em relao ao lipdio puro na associao do DIP com a
interface foram observadas em valores altos de presso de superfcie
(> 30 mN/m), e somente para o grupo fosfato, o que consistente com
o fato de os modos de estiramento do fosfato terem se mostrado sensveis associao perifrica de molculas adsorventes33. Variaes de
~ 7 e 2 cm-1 (com uma resoluo de 4 cm-1 e aquisio de 1024
espectros) foram observadas respectivamente para as(PO2)- e s(PO2)no estado ordenado LC. As bandas dos outros estados vibracionais
apresentaram-se idnticas dentro da resoluo experimental das medidas com e sem DIP. Tambm no foram afetadas as bandas caractersticas das caudas do DPPC. Com estes resultados, foi possvel concluir
que o DIP se associa ao grupo fosfato do dipolo inico do DPPC.
MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA
A anlise da fluorescncia emitida com a excitao de filmes de
Langmuir pode fornecer informaes estruturais bem como a dinmica de possveis mudanas qumicas ou estruturais. Quando as
molculas constituintes dos filmes contm corantes ou cromforos
que emitem luz, o filme pode ser estudado por microscopia de
fluorescncia. A fluorescncia de um material ou de um corante incorporado na monocamada pode ser excitada pela incidncia de luz
tanto da gua como do ar no modo de transmisso ou reflexo. Uma
vez que a solubilidade da sonda de fluorescncia depende do estado
da monocamada, o contraste gerado nas imagens indica as mudanas desses estados. As informaes obtidas por estas tcnicas so,

Vol. 28, No. 3

Tcnicas de Caracterizao para Investigar Interaes no Nvel Molecular

em geral, associadas formao de agregados moleculares e de domnios nos diversos estgios de compresso do filme. A Figura 12
mostra uma micrografia de fluorescncia para um fosfolipdio, DPPC,
com o filme de Langmuir em diferentes estgios de compresso,
com e sem a presena de DIP. Filmes de DPPC apresentam uma
transio de fase nas isotermas de presso, que corresponde ao estgio em que o filme passa de um empacotamento lquido-expandido
para um lquido-condensado. Como o DPPC no fluorescente, as
micrografias so obtidas em filmes de DPPC que contm uma sonda
fluorescente, usualmente rodamina. A sonda tem preferncia pelos
domnios com molculas na fase lquido-expandida gerando, portanto, o contraste visualizado nas micrografias, em que os domnios
escuros correspondem a molculas no estado lquido-condensado. A
evoluo da morfologia mostra, assim, como o arranjo molecular
evolui do estado lquido-expandido para o lquido-condensado. Os
domnios bem definidos consistem basicamente de estruturas quirais
que se apresentam na forma de braos ou hlices e que se orientam na direo anti-horria. Esta orientao preferencial assumida
pelos domnios est diretamente relacionada ao tipo de quiralidade
da molcula de lipdio empregada nos experimentos18,34. Nos valores
de presso de cerca de 9 mN/m e maiores (c-d), as micrografias de
fluorescncia revelam a transio para a fase LC e LC-C da
monocamada. A visualizao da fuso dos domnios, ou transio
para a fase condensada pelo microscpio, resulta em um ambiente
mais homogneo sentido pela sonda, principalmente observada atravs de perda significativa do contraste, com supresso parcial ou
total da fluorescncia, dependente do anfiflico.
Para as monocamadas contendo a droga DIP (Figuras 12 b-d), as
estruturas dos domnios so afetadas e mais bem visualizadas na
regio de transio de fase LE-LC. Na concentrao de 0,2 mol% de
DIP, os domnios possuem uma maior quantidade de estruturas na
forma de braos ou multi-hlices que o observado nos domnios de
lipdio puro. As mudanas visuais causadas pela droga na morfologia
dos domnios progridem com a compresso para formas de estruturas alongadas e finas, espiraladas ou na forma helicoidal surgindo
nas regies de fronteira e centros de nucleao dos domnios e que,
em todos os casos, sempre parecem se orientar na direo anti-horria. A quiralidade dos fosfolipdios , portanto, preservada nas
monocamadas mistas DIP/DPPC.
O DIP possui uma intensa fluorescncia centrada em 500 nm
(emisso de luz verde, exc ~ 415 nm), porm foi necessrio o uso de

Figura 12. Micrografias de filmes de Langmuir de DPPC puro (a), e misto

com 0,2 mol% de DIP (b-d). A presso de superfcie aumentou da micrografia
b para a d. Reproduzida da ref. 18 com permisso da Elsevier

509

uma sonda fluorescente devido impossibilidade de visualizao

dos domnios do DPPC monitorado pela fluorescncia da prpria
droga. Este efeito poderia ser atribudo a uma partio da droga igualmente nas duas fases coexistentes da monocamada.
FILMES LANGMUIR-BLODGETT (LB)
A organizao das molculas em filmes LB (nanoestruturados)
pode gerar propriedades bastante distintas daquelas observadas para
o mesmo material em outras formas, como em filmes mais espessos
ou em pastilhas. No caso de filmes mistos, o contato ntimo das
molculas dos componentes diferentes pode provocar interaes que
tambm no ocorrem em outros tipos de filmes. No incomum que
as propriedades dos filmes mistos difiram consideravelmente das
propriedades dos materiais em separado. A interao ainda no filme
de Langmuir, sobre subfase aquosa, pode ser identificada mesmo
para compostos macromoleculares. H duas possibilidades principais para filmes mistos com 2 componentes: i) separao de fases
entre os componentes, caso em que a rea por molcula varia linearmente com a concentrao relativa dos componentes. Neste caso,
no h interao no nvel molecular entre os componentes ii) com
interao no nvel molecular, e no havendo miscibilidade ideal, a
rea por molcula no varia linearmente com a concentrao relativa. Os valores experimentais sero maiores ou menores que os previstos numa dependncia linear se a interao for repulsiva ou atrativa, respectivamente. A Figura 13 mostra que para filmes de
Langmuir de polianilina (PANI) e um complexo bifosfnico denominado Rupy, a rea por molcula aumenta no linearmente com a
porcentagem de Rupy adicionada PANI, indicando a interao em
nvel molecular35.
A interao entre os componentes no filme de Langmuir tambm se manifesta nos filmes LB depositados sobre substratos slidos. Para PANI-Rupy a condutividade varia com a concentrao de
Rupy, como mostra a Figura 14. A explicao para uma diferena
to grande com o comportamento esperado se houvesse separao

Figura 13. rea extrapolada para vrios filmes de Langmuir versus % em

mol de Rupy no filme. Os valores de 0 e 100% em mol representam Pani
pura e Rupy puros, respectivamente. A linha corresponde ao comportamento
esperado para componentes imiscveis (a). Estrutura do Rupy (b).
Reproduzida da ref. 35 com permisso da ACS

510

Ferreira et al.

de fases, marcado pela linha na Figura 13, que o Rupy contribui

para a oxidao da PANI, como foi observado atravs dos espectros
Raman e voltametrias cclicas36,37.

Figura 14. Medidas de condutividade para um filme LB com 31 camadas

de PANI, Rupy puros e filmes mistos de PANI/Rupy 90, 70 e 50% em mol de
PANI com Rupy. Os filmes foram depositados sobre eletrodos interdigitados
de Au. Reproduzida da ref. 36 com permisso da Elsevier

A obteno de propriedades distintas em filmes LB mistos alterando-se a concentrao relativa dos componentes pode ser explorada em aplicaes. Em primeiro lugar, pode-se otimizar uma propriedade de interesse. Alm disso, pode-se obter filmes com resposta
eltrica diferenciada, a partir dos mesmos componentes. Este foi o
caso do sensor de paladar produzido com filmes LB mistos de PANI
com Rupy2-6 ou filmes LB de polipirrol (py) mistos com Rupy. Notese, tambm, que a prpria capacidade de sensoriamento dos filmes
LB est diretamente relacionada interao com os analitos. No caso
dos sensores de paladar, a interao entre as molculas do filme e o
analito no especfica. H casos, entretanto, que a interao pode
ser especfica, o que conseguido quando o filme LB formado por
materiais com capacidade de reconhecimento molecular. Por exemplo, filmes LB de enzimas imobilizadas, tais como glicose oxidase
(GOX)38,-39 e urease40, tm sido amplamente utilizados como biossensores para a deteco de glicose e uria, respectivamente.
COMENTRIOS FINAIS
Neste artigo procuramos mostrar que a evoluo recente de tcnicas de caracterizao de superfcies beneficiou enormemente a capacidade de pesquisadores em estudar interaes no nvel molecular
em filmes de Langmuir. Tomando como exemplo principal a interao
de frmacos com filmes de fosfolipdios, que representam modelos
simples de membranas celulares, enfatizamos como tais tcnicas
podem ser empregadas para determinar a localizao do frmaco e
os efeitos causados sobre o filme. As tcnicas mais sofisticadas abordadas aqui foram a microscopia de fluorescncia, difrao de raios
X com radiao sncrotron e espectroscopia infravermelho in situ.
Foram mencionadas tambm as tcnicas de presso e potencial de
superfcie, que so as mais empregadas na caracterizao de filmes
de Langmuir. Como a caracterizao de filmes de Langmuir essencial para obter filmes LB de alta qualidade, discutimos as dificuldades de formao de filmes de Langmuir e LB de polmeros, cujo
potencial de aplicaes enorme. Isto foi ilustrado com a meno ao
emprego de filmes LB em sensores, em que se explora a interao
em nvel molecular de componentes dos filmes.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem FAPESP e ao CNPq.

Quim. Nova

REFERNCIAS
1. Petty, M. C.; Langmuir-Blodgett Films An Introduction, Cambridge
University Press: Cambridge, 1996.
2. Ferreira, M.; Dinelli, L. R.; Wohnrath, K.; Batista, A. A.; Oliveira Jr., O.
N.; Thin Solid Films 2004, 446, 301.
3. Ferreira, M.; Riul Jr., A.; Wohnrath, K.; Fonseca, F. J.; Oliveira Jr., O. N.;
Mattoso, L. H. C;. Anal. Chem. 2003, 75, 953.
4. Riul Jr., A.; Santos Jr., D. S.; Wohnrath, K.; Di Tommazo, R.; Carvalho,
A. C. P. L. F.; Fonseca, F. J.; Oliveira Jr., O. N.; Taylor, D. M.; Mattoso,
L. H. C.; Langmuir 2002, 18, 239.
5. Borato, C. E.; Riul Jr., A.; Ferreira, M.; Oliveira Jr., O. N.; Mattoso, L. H.
C.; Instrum. Sci. Tech. 2004, 32, 21.
6. Riul Jr., A.; Sousa, H. C.; Malmegrim, R. R.; Santos, D. S.; Carvalho, A.
C. P. L. F.; Fonseca, F.J.; Oliveira Jr., O. N.; Mattoso, L. H. C.; Sens.
Actuators, B 2004, 98, 77.
7. Singhal, R.; Gambhir, A.; Pandey, M. K.; Annapoorni, S.; Malhotra, B. D.;
Biosen. Bioelectron. 2002, 17, 697.
8. Tsuji, H.; Mitsubayashi, K.; Electroanal. 1997, 9, 161.
9. Mndez-Rodriguez, M. L.; Gorbunova, Y.; Saja, J. A.; Langmuir 2002, 18,
9560.
10. Babudri, F.; Farinola, G. M.; Giancane, S.; Naso, F.; Rella, R.; Scarpa, A.;
Valli, L.; Mater. Sci. Eng., C 2002, 22, 445.
11. Kalina. D. W.; Crane, S. W.; Thin Solid Films 1985, 134, 109.
12. Cook, M. J.; Dumm, A. J.; Daniel, M. F.; Hart, R. C. O.; Richardson, R.
M.; Roser, S. J.; Thin Solid Films 1988, 159, 395.
13. Oliveira Jr., O. N.; Cincia Hoje 1990, 12, 18.
14. Davies, J. T.; Rideal, E. K.; Interfacial Phenomena, San Diego, Acad. Press:
EUA, 1962.
15. Dynarowicz-Latka, P.; Dhanabalan, A.; Oliveira Jr., O. N.; Adv. Colloid
Interface Sci. 2001, 91, 221.
16. Schwartz, D. K.; Surf. Sci. Rep. 1997, 27, 241.
17. Oliveira Jr., O. N.; Taylor, D. M.; Lewis, T. J.; Salvagno,S.; Stirling, C. J.
M.; J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1 1989, 85, 1009.
18. Caetano, W.; Ferreira, M.; Tabak, M.; Sanchez, M. I. M.; Oliveira, O. N.;
Kruger, P.; Schalke, M.; Losche, M.; Biophys. Chem. 2001, 91, 21.
19. Haas, H.; Caetano, W.; Borissevitch, G. P.; Tabak, M.; Mosquera Sanchez,
M. I.; Oliveira Jr., O. N.; Scalas, E.; Goldmann, M.; Chem. Phys. Lett. 2001,
335, 510.
20. Oliveira Jr., O. N.; Raposo, M.; Dhanabalan, A. Em Handbook of Surfaces
and Interfaces of Materials; Nalwa, H. S., ed.; Academic Press, 2001, vol.
4, chapter 1, p. 1.
21. Demchak, R. J.; Fort Jr., T. J.; J. Colloid Interface Sci. 1974, 46, 191.
22. Davies, J. T.; Proc. R. Soc. London A 1951, 208, 224.
23. Davies, J. T.; J. Colloid. Sci. 1956, 11, 377.
24. Oliveira Jr., O. N.; Taylor, D. M.; Morgan, H.; Thin Solid Films 1992, 210,
76.
25. Kjaer, K.; Als-Nielsen, J.; Helm, C. A.; Laxhuber, L. A.; Mohwald, H.;
Phys. Rev. Lett. 1987, 58, 2224.
26. Jacquemain, D.; Wolf, S. G.; Leveiller, F.; Deutsch, M.; Kjaer, K.; AlsNielsen, J.; Lahav, M.; Leiserowitz, L.; Angew. Chem., Int. Ed. 1992, 31,
130.
27. Kaganer, V. M.; Mhwald H.; Dutta, P.; Rev. Mod. Phys. 1999, 71, 779.
28. Mhwald, H.; Annu. Rev. Phys. Chem. 1990, 41, 441.
29. Bhm, C.; Mhwald, H.; Leiserowitz, L.; Als-Nielsen, J.; Kjaer, K.;
Biophys. J. 1993, 64, 553; Helm, C. A.; Tippmann-Krayer, P.; Mhwald,
H.; Als-Nielsen, J.; Kjaer, K.; Biophys. J. 1991, 60, 1457.
30. Hollas, J. M.; Modern Spectroscopy, Willey ed.: Chichester, 1992.
31. Mendelson, R.; Brauner, J. W.; Gericke, A.; Annu. Rev. Phys. Chem. 1995,
46, 305.
32. Binder, H.; Anikin, A.; Lantzsch, G.; Klose, G.; J. Phys. Chem. B 1999,
103, 461.
33. Flach, C. R.; Brauner, J.W.; Mendelsohn, R.; Biophys. J. 1993, 65, 1994.
34. Weis, R. M.; McConnell, H. M.; Nature 1984, 310, 47.
35. Ferreira, M.; Wohnrath, K.; Torresi, R. M.; Constantino, C. J. L.; Aroca,
R. F.; Giacometti, J. A.; Oliveira Jr., O. N.; Langmuir 2002, 18, 540.
36. Ferreira, M.; Constantino, C. J. L.; Riul Jr., A.; Wohnrath, K.; Aroca, R.
F.; Giacometti, J. A.; Oliveira Jr., O. N.; Mattoso, L. H. C.; Polymer 2003,
44, 4205.
37. Ferreira, M.; Wohnrath, K.; Oliveira Jr., O. N.; Synth. Met. 2003, 135, 455.
38. Singhal, R.; Takashima, W.; Kaneto, K; Samanta, S. B.; Annapoorni, S.;
Malhotra, B. D.; Sens. Actuators, B 2002, 86, 42.
39. Singhal, R.; Chaubey, A.; Kaneto, K; Takashima, W.; Malhotra, B. D.;
Biotechnol. Bioeng. 2004, 85, 277.
40. Singhal, R.; Gambhir, A.; Pandey, M. K.; Annapoorni, S.; Malhotra, B. D.;
Biotechnol. Bioeng. 2002, 17, 697.