6S Rna

Instituto Superior Tcnico
Mestrado Integrado em Engenharia Biolgica

2013/2014
RNA 6S
Respostas Recentes,
Questes Futuras
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Jos Morais, 73297

Juliana Estrela, 73157
Pedro Franco, 731599
RNA 6S Respostas Recentes, Questes Futuras
ndice
Introduo ..................................................................................................................................... 2
Expresso e Funo de RNA 6S em Diferentes organismos: Dependncia da Fase de
Crescimento Celular e dos Factores Externos ............................................................................... 4
Detalhes estruturais e interaces especficas entre o RNA 6S e a RNAP .................................. 17
Que genes regula o RNA 6S? ....................................................................................................... 22
Efeitos fisiolgicos da sntese de pRNAs (product RNAs) ............................................................ 26
Papel do RNA 6S enquanto sentinela de recursos durante o stress ........................................... 32
Organismos eucariotas: homlogos de RNA 6S .......................................................................... 44
Perspectivas Futuras ................................................................................................................... 45
Referncias Bibliogrficas ........................................................................................................... 45
Nota introdutria: possvel que algumas seces do trabalho estejam semelhantes,

mas tal no foi alterado para manter a coerncia do texto e para manter a sequncia
apresentada no artigo em que este se baseia.
Introduo
O RNA 6S um RNA no codificante que se encontra presente em quase todos
os ramos filogenticos das bactrias. O RNA 6S foi descrito pela primeira vez em 1967
(figura 1). Estes sRNA abundantes, estveis e no traduzidos actuam em mltiplos
mecanismos utilizando conjugao de pares de bases RNA-RNA, interaces RNAprotena e a actividade intrnseca de RNA. Os
sRNA regulam diversas funes celulares, tais
como o processamento de mRNA, a estabilizao
do mRNA, a traduo, a estabilizao de protenas
e a secreo. No entanto, apesar do RNA 6S ter
sido um dos primeiros sRNA a ser sequenciado, a
sua funo efectiva em termos do metabolismo
Figura 1 - Primeiro modelo proposto para a estrutura secundria de

RNA 6S em E.coli. Adaptado de (Brownlee 1971)
celular permaneceu por desvendar durante cerca

de trs dcadas (Brownlee 1971).
Rapidamente se tornou evidente que o RNA 6S existe na clula enquanto parte
do grande complexo ribonucleoproteico (Lee et al. 1978), mas apenas no ano de 2000
se demonstrou que o local ao qual se liga a RNAP (Wassarman & Storz 2000). Vrios
estudos posteriores revelaram que o RNA 6S um tipo de RNA bastante abundante que
acumula dez vezes durante o ciclo de crescimento bacteriano (Wassarman & Storz
2000). Alm disso, j se provou que o RNA 6S est presente em diversas bactrias
diferentes e que tem uma estrutura secundria altamente conservada que consiste num
bolbo central flanqueado por duas cadeias filamentosas irregulares. Esta estrutura, que
se assemelha a um promotor de DNA aberto, permitiu a previso e posterior
identificao deste RNA regulador em mais de 100 espcies (Barrick, Sudarsan,
Weinberg & Ruzzo 2005). A estrutura secundria tambm levou proposta de que o
RNA 6S mimetiza os promotores de DNA, explicando-se assim a ligao especfica entre
o RNA 6S e a RNAP (Trotochaud & Wassarman 2005).
Em E.coli demonstrou-se que o RNA 6S inibe a transcrio de muitos mas no de

todos os genes durante a fase estacionria, devido sua alta concentrao e afinidade
pela holoenzima 70-RNAP (E70) (Trotochaud & Wassarman 2004; Cavanagh et al.
2008a). Assim sendo, o termo riborregulador foi utilizado pela primeira vez para este
RNA de caracterstica nicas, indicando que o RNA 6S afecta, directa e indirectamente,
a resposta da clula de um modo global. de salientar que, durante a fase estacionria,
o RNA 6S captura quase toda a E70, facilitando deste modo a eficincia da alterao do
factor . Esta alterao ocorre em E.coli entre o factor housekeeping 70 e o factor
especfico da fase estacionria 38 (Neusser et al. 2010; Trotochaud & Wassarman 2004;
Cavanagh et al. 2008a). O RNA 6S no se liga apenas RNAP mas, adicionalmente, tem
a notvel capacidade de actuar como um template para a sntese de pequenos produtos
de transcrio, denominados de pRNAs (Wassarman & Saecker 2006a; Gildehaus et al.
2007a). A sntese de pRNAs tem consequncias importantes porque estes so essenciais
para a libertao do RNA 6S da RNAP, terminando assim a represso dependente de
RNA 6S (Cavanagh et al. 2012a; Wassarman & Saecker 2006a).
A procura da funo fisiolgica do RNA 6S foi originalmente interrompida pela
falta de um fentipo detectvel, quer para estirpes deficitrias do RNA 6S, quer pela
sobre-expresso de estirpes de E. coli quando colocadas em condies laboratoriais ricas
(Lee et al. 1985; Hsu et al. 1985). Contudo, pode observar-se facilmente um fentipo
dependente de RNA 6S quando as clulas crescem em condies limitantes ou quando
se aplica um stress de longa durao. Por exemplo, condies do crescimento do fim de
fase estacionria provocam uma desvantagem competitiva numa estirpe deficiente em
RNA 6S comparativamente a uma estirpe selvagem. Para alm disso, estes mutantes
apresentam uma menor viabilidade depois de uma fase estacionria de longa durao
(Trotochaud & Wassarman 2004). Outro fentipo de crescimento, relacionado com a
perda de RNA 6S, foi descoberto em condies de pH elevado nas quais clulas sem RNA
6S esto mais aptas sobrevivncia do que clulas de estirpes selvagem. A regulao
directa por parte do RNA 6S do gene pspF, que codifica para um activador transcripcional
da resposta ao stress, foi identificada com um possvel alvo. Por norma, a transcrio do
gene pspF inibida pelo RNA 6S, suprimindo a resposta proteica a infeco por fagos.
Estes resultados levam proposio de que o RNA 6S contribui, por norma, a uma
3
distribuio eficiente dos nutrientes sob condies limitantes e stress (Trotochaud &
Wassarman 2006).
Expresso e Funo de RNA 6S em Diferentes organismos: Dependncia

da Fase de Crescimento Celular e dos Factores Externos
Aps a descoberta do RNA 6S de E. coli em 1971 por Brownlee (Brownlee, 1971),
um grupo de cientistas da Universidade de Massachusetts (Hsu et al., 1985) determinou
a localizao no genoma do gene que codifica para este pequeno RNA. Foi apenas
possvel determinar que este contm 184 nucletidos que no sofrem alteraes de
gerao para gerao. Apesar de se tratar de uma experincia ainda sem grande
informao acerca do tema, conseguiu-se provar que existe apenas uma cpia do gene
codificante para RNA 6S em E. coli. Digeriu-se o DNA cromossmico de E. coli com vrias
enzimas de restrio e realizou-se uma hibridao de Southern, utilizando como sonda
RNA 6S deste organismo marcado radioactivamente com fsforo-32 (32P). Para cada
produto de digesto, observou-se uma e apenas uma banda, o que indica que a
homologia entre a sonda e o DNA cromossmico nica no genoma.
Figura 2 Resultado do Southern blot de produtos de digesto do DNA cromossmico de E. coli por diversas enzimas,
utilizando uma sonda de RNA 6S marcada com 32P. A banda mais abaixo e esquerda (cerca de 1,3kB) equivale ao
sinal detectado com a digesto por Pst I. Para os ensaios posteriores, clonou-se em vectores o fragmento de menor
dimenso, ou seja, o referente digesto por Pst I. Adaptado de (Hsu et al. (1985))
Atravs de sucessivas clonagens em vectores e sequenciao de pequenos

pedaos de DNA, conseguiu determinar-se a sequncia exacta do gene que codifica para
o RNA 6S, passando a denomin-lo de ssrS. Este assunto voltou recentemente a
despertar o interesse da comunidade cientfica, havendo um nmero considervel de
publicaes na ltima dcada que abordam este tema. Em 2004, Kim e Lee
determinaram, com sucesso, que a transcrio do RNA 6S em E. coli est dependente de
dois promotores, P1 e P2 (Kim & Lee 2004). Estes dois promotores geram produtos de
dimenses
diferentes
que
sofrem
um
tratamento
diferente
por
endo/exoribonucleases, originando RNA 6S maduro por duas vias distintas. Contudo, o

facto mais peculiar associado a estes promotores reside em ambos serem dependentes
do factor 70, genericamente denominado house-keeping sigma factor, e apenas um
estar tambm dependente do factor 38 (equivalente ao factor S), que est associado
fase estacionria. Estes autores conseguiram comprovar que a expresso do RNA 6S ,
por um lado, dependente da fase de vida celular, e por outro lado, que as RNases que
fazem o tratamento dos diferentes fragmentos de RNA 6S aps transcrio so distintas.
No esquema abaixo, conseguimos constatar que o RNA 6S pode, ento, vir de duas
fontes, dependendo do promotor que foi utilizado para a sntese. Se P2 tambm Sdependente, ento presumivelmente a actividade deste promotor mantm-se
praticamente inalterada quando se entra na fase estacionria e a de P1 decresce.
Note-se que a transcrio envolve uma holoenzima (RNAP + factor associado);
d-se o nome de E70 holoenzima responsvel pela transcrio associada ao factor
de house-keeping e de ES equivalente mas na fase estacionria.
Figura 3 Mecanismo proposto por Kim et al. para a transcrio de RNA 6S e consequente processamento por endo
e exonucleases. data deste estudo, no se conheciam quais as RNases que actuavam em 3, mas haviam evidncias
fortes para acreditar que o trimming feito por exonucleases. Adaptado de (Kim et al. (2004))
Medindo a quantidade de RNA 6S ao longo das vrias fases de crescimento,

verifica-se que este pequeno RNA acumulado intracelularmente portanto, na fase
estacionria que se verificam os nveis mais elevados deste sRNA. Na entrada na fase
estacionria, e em resposta a factores externos, o RNA 6S interage com a holoenzima
E70 formando um complexo E70::RNA 6S e impede que esta se ligue aos promotores
70-dependentes, sendo utilizados apenas os promotores gnicos associados fase
estacionria (38-dependentes).
Um estudo recente do Departamento de Qumica do Superbacteria Research
Center permitiu avaliar a fora destes promotores e se h ou no auto-regulao dos
promotores pelo prprio RNA 6S, clonando as suas sequncias em vectores a montante
do gene lacZ (Lee et al. 2013). A influncia ou no da presena de RNA 6S e consequente
autoregulao tambm foi tida em conta, tendo-se para isso utilizado estirpes ssrS e
ssrS+.
Figura 4 Perfil de actividade de -galactosidade (em Unidades Miller) grfico da esquerda face fase de vida
celular grfico da direita. JY001 e JY002 contm plasmdeos onde se clonou P1 e lacZ, enquanto que JY003 e JY004
contm plasmdeos onde se clonou P2 e lacZ. Por outro lado, JY001 e JY003 so estirpes ssrS + enquanto que JY002 e
JY004 so ssrS. Verifica-se que a ausncia de RNA 6S no tem influncia no perfil de actividade de -galactosidase.
O primeiro par de grficos diz respeito ao crescimento celular em meio LB, e o segundo par de grficos ao crescimento
celular em meio mnimo M63. Adaptado de (Lee et al. (2013))
Tendo-se efectuado a clonagem dos promotores a montante do gene lacZ, a

avaliao da sua fora pode ser feita seguindo a actividade da -galactosidase. Verificouse, ento, que ambas as estirpes, com e sem o gene ssrS, seguem o mesmo perfil de
actividade de -galactosidase, tanto em meio LB rico como em meio mnimo M63, pelo
que se conclui que a ausncia de RNA 6S no um factor determinante para a fora dos
promotores. Vemos tambm que, durante a fase exponencial, a actividade de P1
(expresso em JY001 e JY002) cerca de 2-3x maior face de P2; contudo, ao entrar na
fase estacionria, observa-se um decaimento muito acentuado da actividade de galactosidase associado a P1, e podemos ver que P1 e P2 tendem para a mesma
actividade (vide Figura 3, primeiro par de grficos).
A sobre-expresso de ssrS via induo por IPTG num plasmdeo desenhado para
o efeito permitiu concluir que uma grande quantidade de RNA 6S leva a um acrscimo
significativo da fora do promotor P1 e um decrscimo tambm significativo da fora do
promotor P2. Presume-se, aqui, a existncia de uma relao de activao/inibio por
7
feedback; contudo, so necessrios mais ensaios para poder tirar concluses mais
assertivas sobre esta matria.
Aps a identificao do gene que codifica para RNA 6S, e com a ajuda de
ferramentas computacionais, foi possvel situar o gene ssrS e os seus promotores no
genoma de E. coli. Observou-se que este gene est inserido num opero onde existe um
outro gene (ygfA), que codifica para uma 5-formil-tetrahidrofolato-cicloligase. Esta
enzima est associada ao metabolismo C1. Genericamente, este metabolismo serve para
a clula conseguir responder necessidade de, por exemplo, executar metilaes (e.g
silenciamento de genes). O tetrahidrofolato utilizado como shuttle de grupos C1 neste
metabolismo, onde intervm tambm a protena YgfA.
Figura 5 Opero onde est inserido o gene ssrS, em E. coli. TssrS assinala uma zona de terminao dependente do
factor . Adaptado de (Chae et al. (2011))
Chae demonstrou que o fim da transcrio de ssrS depende de um factor , uma

protena com actividade de helicase que se liga cadeia de RNA que est a ser
sintetizada e se move de 5 para 3 na direco da RNAP, e tem como funo dissociar o
transcrito do complexo RNAP::Factor (holoenzima). No entanto, ao inibir a funo do
factor com biciclomicina, nota-se um aumento bastante considervel do mRNA
associado ao gene ygfA, concluindo-se, assim, que o factor no s cria as extremidades
3 do RNA 6S mas tambm intervm activamente na regulao e co-transcrio de ygfA,
associada transcrio de ssrS (Chae et al. 2011).
Uma caracterstica curiosa e interessante associada ao gene ygfA reside no facto
de estar presente em clulas multiresistentes a antibiticos, principalmente quando
associadas em biofilmes. Num estudo da Northeastern University, em Boston,
cultivaram-se clulas multiresistentes expondo culturas em LB a diversos antibiticos,
aumentando progressivamente a concentrao de antibitico. Fazendo mutantes de
eliminao para diversos genes, comparou-se a resistncia das clulas WT
(multiresistentes) com cada mutante de eliminao, utilizando como termo de
comparao a percentagem logartmica de sobreviventes, que nos d uma ideia da

ordem de grandeza das diferenas entre ensaios (anloga escala de Richter para os
terramotos, que utiliza logaritmo de base decimal e compara ordens de grandeza).
Figura 6 Anlise da resistncia a antibiticos em estirpes mutantes para os genes assinalados e respectivo resultado
para a estirpe selvagem (WT). Adaptado de (Hansen et al. (2008))
Analisando a Figura 5, conclumos que ygfA tem um papel muito importante na

resistncia ampicilina, pois observamos um decrscimo de cerca de 80 vezes face ao
nmero de sobreviventes face ao WT (grfico C). Em geral, Chae demonstrou que todas
estas protenas esto associadas capacidade multiresistente das clulas - YigB tem
actividade de fosfatase sobre a riboflavina, DksA um regulador da transcrio de rRNA,
YgfA codifica para uma ciclo-ligase que intervm no metabolismo C1 enquanto que DnaJ
e DnaK so chaperonas. Em ltima anlise, podemos conclur que o RNA 6S est de certo
modo relacionado com a expresso de ygfA e, portanto, com a possibilidade de formar
clulas multiresistentes.
O RNA 6S no exclusivo de E. coli. J em 1997 tinha sido identificado na
cianobactria Synechococcus um pequeno RNA com cerca de 200 nucletidos, que
serviu posteriormente de sonda num Southern blot para identificar o gene que o
codifica, denominado ssaA. Apesar de ter aproximadamente o mesmo nmero de
nucletidos do RNA 6S de E. coli, a sua composio e distribuio intracelular so muito
distintas. Em Synechococcus, o RNA 6S acumulado intracelularmente em todas as fases
9
do crescimento celular, observando-se um decrscimo acentuado na fase estacionria,

o que leva a crer que o RNA 6S de Synechococcus funcional apenas quando as clulas
se dividem activamente (Watanabe et al. 1997). Em Prochlorococcus, outra
cianobactria, descobriu-se em 2007 uma estrutura opernica semelhante existente
em E. coli, com dois promotores distintos que originam sRNAs de diferentes tamanhos
um maior, com 333 nucletidos e associado a um incio de transcrio denominado
TIS2, e um menor, com 220 nucletidos e associado a outro incio de transcrio
denominado TIS1 (Axmann et al. 2007). Uma particularidade muito interessante destes
dois tipos de RNA 6S reside no facto de a sua expresso intracelular ser distinta de
acordo com a exposio celular luz solar. Fazendo culturas sincronizadas destes
organismos podemos avaliar a expresso do RNA 6S de acordo com a hora do dia. A
quantidade intracelular do fragmento mais pequeno aumenta desde cerca da meia noite
e tem um pico por volta do meio dia, enquanto que o fragmento maior revela um
mnimo ao anoitecer (por volta das 19h) e um mximo ao amanhecer (por volta das 9h).
Estas concluses levam a crer que estes sRNA esto envolvidos em algum
processo regulatrio associado exposio solar. Provavelmente, com a evoluo da
espcie, o sistema fisiolgico evoluiu nesse sentido, e a expresso do RNA 6S
acompanhou essa evoluo.
10
Figura 7 Em cima - Opero do gene ssrS que codifica para o RNA 6S em Prochlorococcus, com os respectivos incios
de transcrio assinalados. Em baixo Quantificao dos dois produtos de transcrio de acordo com as horas do dia.
O cultivo iniciou-se s 11h e terminou pelas 11h do dia seguinte. Observam-se claramente os picos referentes
quantidade de transcrito supracitados. Adaptado de (Axmann et al. (2007))
Dois ensaios praticamente simultneos permitiram descobrir outros dois sRNA

em Bacillus subtilis. Em 2002, Suzuma e Ando identificam dois pequenos RNA, que
denominaram respectivamente BS201/190 e BS203. A designao numrica de cada
pequeno RNA est associada ao nmero de nucletidos que contm. No caso de
Suzuma, provou-se que o verdadeiro sRNA o BS190, sendo obtido por aco de
RNases que actuam em BS201. Em ambos os casos, recorrendo a uma anlise in silico,
determinou-se o gene codificante, verificando que ambos se inserem em regies
intergnicas, tendo-se atribudo a denominao de bsrA para BS190 e bsrB para BS203.
Para determinar a influncia destes sRNA no metabolismo e crescimento celular,
cresceram-se mutantes bsrA e bsrB em meio LB lquido e observou-se que o mutante
de eliminao para bsrA apresenta menor DO a 660nm face a WT utilizando culturas
sincronizadas. Ao plaquear em meio LB slido, tambm se constata que as colnias de
bsrA tm menor tamanho do que WT e conclui-se portanto que BS190 tem um papel
muito importante no crescimento celular (Suzuma et al. 2002; Barrick, Sudarsan,
Weinberg, Ruzzo, et al. 2005; Beckmann et al. 2011).
11
Figura 8 Curva de crescimento celular para culturas sincronizadas. Com losangos (curva de cima) est representado
o crescimento de WT, e com crculos (curva de baixo) est representado o crescimento de bsrA. Observa-se que as
colnias WT tm sempre DO superior a partir do incio da fase exponencial de crescimento, revelando o papel
determinante do BS190 no crescimento de B. subtilis. Adaptado de (Suzuma et al. (2002))
Quanto s colnias de bsrB, no apresentaram menor crescimento ou menor

resistncia a concentraes salinas elevadas (at 10% NaCl), a temperatura (45C) ou
esporulao num meio mnimo - cerca de 80% esporulou, resultado tambm verificado
em colnias WT o que leva a concluir que BS203 no tem um papel metablico e
fisiolgico evidente. (Ando et al. 2002).
Um ensaio posterior permitiu verificar que o BS190 de B. subtilis tem uma funo
semelhante ao de E. coli serve de template para a sntese de pRNA. Uma das funes
propostas para este tipo de RNA em B. subtilis o de competir activamente com o
complexo RNAP::RNA 6S, desfazendo-o e ligando-se ao RNA 6S, permitindo assim
reactivar a transcrio de genes associados ao factor 70. Esta funo particular deste
pRNA ser discutida mais tarde; no entanto de especial interesse salient-la para este
organismo, pois revela um mecanismo bastante refinado de auto-regulao do RNA 6S;
em resposta ao meio nutricional externo, a sntese de pRNA feita de forma a permitir
s clulas sarem da fase estacionria. Por outro lado, mutantes bsrA revelam maior
latncia sada da fase estacionria quando inoculadas em meio LB fresco, mas acabam
eventualmente por atingir a mesma DO mxima e com o mesmo tempo de replicao
de WT (Cavanagh et al. 2012).
12
Figura 9 Perfil de crescimento celular aps inoculao de clulas de B. subtilis em fase estacionria em meio YT
fresco. Observa-se claramente a maior latncia antes da entrada na fase de crescimento exponencial, aps inoculao
dos mutantes bsrA face a todas as outras estirpes. Curiosamente, o duplo mutante bsrA bsrB no revelou uma
maior latncia, o que leva a crer que a presena de BS203 na ausncia de BS190 que causa o atraso no crescimento
celular. As causas e mecanismo deste processo no so ainda conhecidas. Adaptado de (Cavanagh et al. (2012))
Um estudo muito recente permitiu tambm concluir que mutantes bsrA e

bsrA bsrB, quando cultivados num meio que promove esporulao, o fazem
relativamente antes e, portanto, em maior quantidade para o mesmo instante temporal,
do que mutantes bsrB e WT. Este resultado leva a crer que de alguma maneira estes
mutantes para BS190 (bsrA) esto a utilizar ineficazmente os nutrientes do meio,
consumindo-os mais rapidamente e portanto provocando esporulao precoce
(Cavanagh & Wassarman 2013a). Este facto pode tambm resultar da falta do BS190 em
B. subtilis se traduzir um sinal intracelular para iniciar a esporulao, suportando ento
o argumento de que este sRNA bastante relevante para a fisiologia e metabolismo
desta espcie. Uma vez mais, o mecanismo de aco deste tipo de RNA no conhecido
e carece de estudos mais detalhados.
13
Figura 10 Comparao da percentagem de endsporos formada aps inoculao de colnias em meio que promove
esporulao. Nota-se a percentagem superior de endsporos para o mutante bsrA face a WT. No entanto, ao fim de
40h, observa-se que ambas as estirpes tm a mesma percentagem de endsporos, pois neste instante temporal
que as clulas atingem o mximo de esporulao possvel, e portanto j no dependem de, por exemplo, BS190.
Adaptado de (Cavanagh & Wassarman (2013)).
semelhana de E. coli e B. subtilis, tambm Helicobacter pylori apresenta um

sRNA que se verifica ser muito idntico ao RNA 6S j abordado em pargrafos anteriores
por exemplo, ao nvel da estrutura secundria. Tal como em E. coli, este pequeno RNA
tambm se liga holoenzima E70, inibindo, na fase estacionria, a transcrio dos genes
cujos promotores dependam deste factor. de salientar que o RNA 6S deste organismo
possu tambm um mecanismo de auto-regulao, pois serve como template para a
sntese de pRNA, que faz dissociar o complexo E70::RNA e reactivar a transcrio dos
promotores dependentes de 70 (Sharma et al. 2010a). Por outro lado, um ensaio com
Burkholderia cenocepacia baseado em microarrays permitiu determinar a existncia de
um homlogo de RNA 6S neste organismo e concluir que a presena deste pequeno RNA
confere resistncia ao stress oxidativo (Peeters et al. 2010). No entanto, para ambos os
patognicos, h a necessidade de efectuar estudos em maior detalhe, para determinar
a extenso da influncia do RNA 6S na fisiologia e metabolismo destes organismos.
Outros exemplos de RNA 6S podem ser encontrados em Bradyrhizobium
japonicum, tanto em simbiose (ndulos em razes) como em organismos livres. No
organismo livre, observa-se que o RNA 6S no acumulado substancialmente durante
a fase estacionria, o que leva a concluir que o papel desempenhado e o mecanismo de
aco deste sRNA muito distinto do de E. coli, por exemplo (Voss et al. 2009).
14
Figura 11 Acumulao intracelular de diferentes sRNA, em B. japonicum. Os valores obtidos para DO600 = 0,4 foram
normalizados e as restantes barras representam valores relativos DO600 = 0,4. Observa-se que para uma DO600 de
3,0 o contedo de RNA 6S intracelular apenas cerca de duas vezes superior ao equivalente a DO600, o que revela
que no existe praticamente nenhuma acumulao de RNA 6S ao longo do crescimento celular. Adaptado de (Voss
et al. (2009))
Um estudo posterior permitiu concluir que, quando em simbiose nos ndulos de

razes da planta de soja, detectou-se um aumento de sinal face ao organismo livre, em
fase exponencial de crescimento, quando se utilizou como sonda de um Northern blot
um fragmento de RNA 6S especfico para o terminal 5 denominada RNA 6S-3. Esta
sonda detecta a presena de uma forma truncada especfica deste sRNA. Este resultado
bastante surpreendente, pois estas formas truncadas podem revelar produtos de
degradao, havendo portanto uma funo relevante do RNA 6S na simbiose em
ndulos de razes da planta de soja (Madhugiri et al. 2012).
Um estudo do Medical Center da Universidade Columbia, em Nova Iorque, EUA,
indiciu sobre Legionella pneumophila, um agente patognico oportunista, conhecido
por causar a Doena dos Legionrios (Faucher et al. 2010). Uma vez mais, o gene que
codifica para o RNA 6S foi localizado numa regio intergnica e denominado ssrS, em
concordncia com o gene homlogo de E. coli. Em semelhana a outros organismos j
mencionados, este pequeno RNA acumula-se ao longo do crescimento celular e tem
uma estrutura secundria muito semelhante ao RNA 6S de E. coli, segundo uma previso
feita com recurso a ferramentas bioinformticas. Por outro lado, a transcrio de ssrS
em L. pneumophila tem associado um promotor especfico e uma terminao
independente do factor Rho (formao de um gancho numa zona rica em citosinas e
guaninas), por oposio a E. coli, cujo gene ssrS est inserido num opero.
15
A principal concluso retirada deste estudo reside no facto de uma experincia

de microarray conseguir provar que, para um mutante ssrS, existe uma inibio de uma
panplia de genes de L. pneumophila, estando grande parte deles associados
virulncia e infeco de clulas de protozorios e de humanos, sistemas de excreo do
tipo IV e resposta ao stress oxidativo. Sem a correcta expresso destes genes, este
patognico perde a capacidade de se conseguir reproduzir eficazmente no ambiente
intracelular do hospedeiro.
Figura 12 Classificao dos genes analisados por funcionalidade e/ou fentipo observvel. esquerda Genes que
so regulados positivamente pela ausncia de RNA 6S. direita Genes que so regulados negativamente pela
ausncia de RNA 6S. H que notar a regulao negativa de, por exemplo, 9 genes associados replicao e reparao
de DNA, bem como 21 genes associados sntese de protenas de transporte e da membrana celular externa. A classe
FUN representa genes de funo desconhecida e a sigma OMP representa outer membrane protein. Adaptado de
(Faucher et al. (2010))
O desenvolvimento das ferramentas bioinformticas permite a deteco de um

nmero cada vez maior de sRNA, e, em L. pneumophila, foi detectado recentemente um
segundo RNA 6S por uma anlise in silico, tendo sido denominado RNA 6S-2. No entanto,
nada ainda se sabe sobre a funcionalidade deste segundo sRNA, sendo necessrio
efectuar mais estudos (Weissenmayer et al. 2011).
Em suma, demonstrou-se a existncia de RNA 6S para diversos organismos, com
diversas funcionalidades e padres de acumulao em funo do crescimento celular
muito distintos o desenvolvimento de mais pesquisa e de tcnicas de anlise mais
refinadas ir decerto levar identificao de mais sRNA deste tipo. Existe ainda uma
panplia de organismos para analisar e testar, sendo que a principal dificuldade reside
nos genes estarem, grande parte das vezes, codificados em regies intergnicas e muitas
vezes no revelarem um fentipo evidente.
16
Detalhes estruturais e interaces especficas entre o RNA 6S e a RNAP

O RNA 6S media a resposta celular ao stress ambiental em E. coli quando h falta
de nutrientes. Este RNA altamente conservado forma um complexo estvel e especfico
com E70, inibindo a transcrio de muitos promotores 70-dependentes.
A actividade do RNA 6S depende a um grande nvel das suas caractersticas
estruturais, nomeadamente do seu bolbo central ladeado por duas cadeias duplas
filamentosas. Experincias realizadas na Universidade de Wisconsin-Madison revelaram
a especificidade da interaco entre o RNA 6S e a RNA polimerase e a capacidade deste
pequeno RNA de inibir directamente a transcrio.
Figura 13 - Estrutura secundria prevista para o RNA 6S de diferentes bactrias. Adaptado de ((Trotochaud &
Wassarman 2005))
Atravs destas mesmas experincias testou-se a importncia de certos elementos

dentro da estrutura secundria conservada para a actividade do RNA 6S, nomeadamente do
bolbo central e das cadeias duplas que o ladeiam. Ao suprimir a cadeia simples do bolbo,
reduzindo o tamanho da cadeia (RNA 6S (M5) e RNA 6S (M6)), verifica-se que h perda de
actividade; ao introduzir alteraes que permitam o emparelhamento de bases na estrutura
central (RNA 6S (M9)), verifica-se tambm a perda de actividade; no entanto, ao aumentar o
tamanho da regio de cadeia simples (RNA 6S (M23)), no se verifica qualquer alterao a nvel
das ligaes, levando a crer que o aumento do tamanho da cadeia no exerce qualquer
influncia nesta conexo. Avaliada a importncia da estrutura central do RNA 6S, basta saber se
as regies de cadeia dupla contm alguma especificidade adicional. Considerando inicialmente
que estas cadeias no contribuem de qualquer forma para a especificidade da molcula,
esperar-se-ia que estas estruturas fossem intercambiveis entre si; no entanto, ao permutar as
regies de cadeia simples entre si (RNA 6S (M8 + M9)), verifica-se que a molcula s apresenta
50% de actividade. Isto verifica-se porque at pequenos bolbos de nucletidos ou pequenos
17
loops podem fornecer estabilidade ligao entre a RNA polimerase e o RNA 6S e podem
fornecer at orientao s regies de cadeia dupla (Trotochaud & Wassarman 2005b).
Uma ligao ptima entre este RNA e a RNA polimerase implica flexibilidade, interaces
especficas entre nucletidos, bem como interaces tercirias, entre outras possveis
caractersticas desconhecidas.
Demonstrando experimentalmente que a estrutura secundria conservada crucial
para a funcionalidade do RNA 6S, pode-se utilizar esta caracterstica como parmetro para
efectuar uma busca alargada de RNA 6S.
Um estudo realizado no Institut fr Physikalische Biologie, teve como objectivo estudar
se as interaces entre o RNA 6S e a RNAP s se davam com o complexo holoenzimtico E70,
ou se se davam tambm com outras formas desta molcula. Chegou-se concluso que, embora
haja de facto interaces entre o RNA 6S e E38, 70 ou at com o ncleo da prpria enzima,
estas tm uma estabilidade bastante reduzida, devido falta de especificidade. Por outro lado,
no se verifica qualquer tipo de conexo entre o RNA 6S e as restantes subunidades da RNAP
isoladas. De notar que, na ausncia de DNA, o RNA 6S catalisa a sntese de transcritos de novo,
no s com E70, mas tambm com E38 e at com o ncleo da RNAP (Gildehaus et al. 2007b).
O RNA 6S no o nico RNA no codificante a regular a transcrio. Em ratos, o RNA B2,
que transcrito pela RNAP III, inibe a transcrio do mRNA dependente da RNAP II, em resposta
ao choque trmico. Sendo o mecanismo de inibio deste RNA relativamente semelhante ao do
RNA 6S, interessante considerar se RNAs eucariticos e bacterianos podem ter caractersticas
paralelas ao nvel da regulao da transcrio (Gildehaus et al. 2007b).
Podemos dizer que a interaco entre o RNA 6S e a RNAP no s altamente especfica,
como altamente eficiente. O RNA 6S acumula-se nas clulas durante a fase estacionria e
media alteraes especficas na RNAP durante o crescimento. Experincias in vitro mostraram
que o RNA 6S interage directamente com E70 e que a formao desse complexo inibe a
transcrio (Wassarman & Storz 2000).
Tendo em conta este mecanismo de regulao da transcrio dependente do RNA 6S,
as provas existentes apoiam o modelo de mimetismo do promotor, que baseado na
conservao da estrutura central em loop. A anlise de crosslinking apresentada para identificar
as posies do RNA 6S que esto em contacto com a RNAP, revelam resultados que apoiam a
importncia da estrutura central em loop e das regies filamentosas flanqueantes. O facto de
apenas a cadeia mais a jusante do bolbo central poder ser cruzada, indica que as duas sequncias
18
de cadeia simples do loop central ocupam diferentes posies na superfcie da RNAP (Gildehaus
et al. 2007b).
Foi confirmada uma ligao preferenciada pelo RNA 6S a E70, embora tambm se tenha
verificado uma ligao residual a E38. A anlise das experincias de crosslinking revelaram
contacto directo entre o bolbo central do RNA 6S e as subunidades , e .
A proposta de que o RNA 6S inibe a transcrio competindo directamente com o
promotor de DNA, baseia-se na semelhana entre a conformao do DNA quando este inicia a
transcrio e a estrutura do RNA 6S; baseia-se tambm no facto de o RNA 6S contactar
directamente com a subunidade 70 de E70 e no facto de a RNAP sou se ligar ou ao RNA 6S ou
ao DNA.
Para testar hiptese, em que a inibio da transcrio por parte do RNA 6S se baseia na
competio directa com o DNA, foram realizados estudos na Universidade de Wisconsin
Madison, onde se analisou a ligao do promotor de DNA a E70 na presena e na ausncia de
RNA 6S. Na ausncia de RNA 6S verifica-se a ligao do referido promotor a E70, enquanto que
na presena deste RNA, o nmero de ligaes observadas diminui significativamente; testou-se
ainda a ligao do promotor de DNA a E70 na presena de um mutante de RNA 6S sem a regio
de cadeia simples e verificou-se que no h qualquer perda de ligao entre o DNA e a
holoenzima, reforando a importncia da estrutura central deste pequeno RNA (Gildehaus et al.
2007b).
Ainda neste estudo, chegou-se concluso de que os locais de acoplagem do RNA 6S na
holoenzima E70 so anlogos aos centros activos aos quais o DNA se conecta para iniciar a
transcrio; dada esta semelhana testou-se se seria possvel que o RNA 6S fosse um molde
para a sntese de RNA e a resposta foi positiva, sendo a especificidade do molde confirmada com
um mutante de RNA 6S (Wassarman & Saecker 2006b).
Posteriormente, um estudo no Departamento de Bacteriologia da Universidade de
Wisconsin, mostrou que a regio 4.2 da subunidade 70 tem especial importncia para a fora
da conexo entre a holoenzima E70 e o RNA 6S, pois contm resduos carregados
positivamente, caracterstica esta que essencial para esta ligao. A localizao da regio de
cadeia simples do RNA 6S no centro activo de E70 e a identificao da regio de molde de
pequenos RNAs, orienta o RNA 6S relativamente a E70 e permite-nos especular que uma regio
do RNA 6S mais a montante possa estar posicionada de forma a contactar com a regio 4.2 por
analogia ao modo de ligao do promotor do DNA. No entanto, no podemos assumir que a
19
ligao entre a RNAP e o DNA e entre a RNAP e o RNA 6S igual, visto que esta regio do RNA
6S no apresenta totalmente uma cadeia dupla nem apresenta grande conservao ao nvel da
sequncia primria. Alis, o facto de diferentes resduos contriburem para a ligao do DNA e
do RNA RNAP, leva a concluir, que esta interaco de facto diferente (Cavanagh et al. 2008b).
Neste mesmo estudo, foi proposto que a regio C-terminal tem influncia no
posicionamento da regio 4.2 na aba da RNAP para permitir que haja espao no s para o
reconhecimento dos promotores -10 e -35 de DNA, mas tambm para permitir a elongao. De
facto, os resduos mais importantes para a ligao do RNA 6S encontram-se mais prximos da
regio C-terminal do que aqueles mais relevantes para a ligao do DNA. proposto que a perda
de ligao do RNA 6S a E70 devida perda de posicionamento da regio 4.2 e no devido a
uma possvel perda de contacto directo entre a regio C-terminal e o RNA 6S. Um espaamento
e um posicionamento apropriados da regio 4.2 em 70 relativamente ao restante complexo so
necessrios para uma conexo eficiente do RNA 6S ao centro activo (Cavanagh et al. 2008b).
Chegando concluso que o RNA 6S compete com o DNA
pela ligao a E70, a pergunta que se segue se o RNA 6S mimetiza
a estrutura do DNA. Um estudo efectuado no Departamento de
Bacteriologia da Universidade de Wisconsin mostrou que, embora o
RNA possa adoptar a forma de hlice em B que imita o principal
passo do DNA (como observado no aptmero de RNA ao ligar-se ao
complexo NF-B), a forma adoptada pelo RNA 6S (hlice em A) no
permite efectuar o mesmo tipo de contactos (Klocko & Wassarman
2009).
Adicionalmente,
estudou-se
mecanismo
de
Figura 13 - Estrutura secundria prevista do

aptmero de RNA ao ligar-se ao complexo
NF-B; Adaptado de (Cassiday & Maher
(2002))
reconhecimento do RNA 6S pela regio 4.2 de 70. As interaces

electroestticas entre os resduos carregados positivamente e a extremidade fosfato do RNA
carregada negativamente contribuem para esta ligao. Por outro lado, verifica-se, em primeiro
lugar, que existem resduos especficos em locais totalmente distintos que tm efeitos
dramticos nesta conexo; em segundo lugar a regio do RNA 6S que interage com a regio 4.2
particularmente sensvel substituio de nucletidos, indicando que estes nucletidos
assumem um papel especialmente importante (Cavanagh et al. 2008b).
At hoje no se chegou qualquer tipo de concluses relevantes relativamente
estrutura tridimensional do RNA 6S. Recentemente, em 2013, num estudo cristalogrfico
realizado na Faculdade de Cincia e Tecnologia da Universidade de Sophia sobre o RNA 6S de
20
Aquifex aeolicus que se observou um duplex de RNA desta estirpe contendo 12 pares de bases
a uma resoluo de 2.6 (Kondo et al. 2013).
Tambm em 2013, estudos realizados por Steuten et. al, permitiram a obteno de
informao suficiente para ser reproduzida a estrutura tridimensional do RNA 6S de E. coli
complexado com a holoenzima E70 da RNAP (Steuten et al. 2013).
Figura 14 - Estrutura terciria do complexo RNA 6S :: E70. Adaptado de

(Steuten, Setny, Zacharias, & Wagner, 2013).
Identificaram-se tambm os locais de ligao do RNA 6S RNAP, atravs da utilizao

do reagente FeBABE. Este reagente ligou-se RNAP, nomeadamente subunidade 70 em
determinados locais. O FeBABE usualmente associado a resduos de cistena, que, por sua vez
esto associados a pontes dissulfureto. Verifica-se que na presena de FeBABE no ocorre
ligao do RNA 6S RNAP, levando a concluir que os locais de ligao de FeBABE so tambm
os locais de ligao do RNA 6S. Verificou-se que, para alm da regio 4.2 na subunidade 70, o
RNA 6S tambm contacta com as regies 2.1, 2.3, 3.1 e 3.2 (Steuten et al. 2013).
21
Que genes regula o RNA 6S?

Grande parte do conhecimento sobre o mecanismo de seleco de genes
sensveis ao RNA 6S baseado em estudos efectuados em E. coli. A partir de um estudo
efectuado na Universidade de Wisconsin-Madison (Trotochaud et al. 2004), conclui-se
que o RNA 6S no interage directamente com o factor 38 nem
com E38 mas interage com E70, uma vez que no foi possvel
purificar em conjunto o factor 38 e o RNA 6S de clulas em
estado estacionrio mas, no entanto, foi possvel purificar
eficientemente complexos E70-RNA 6S endgenos. Alm
disso, demonstrou-se que as interaces entre 38/E38 e o
RNA 6S no so detectveis atravs de experincias de crosslinking e de reconstituies experimentais in vitro, experincias
nas quais se detectam interaces entre E38/ 70 e RNA 6S.
Estes estudos foram feitos para outros factores sigma, tendose obtido resultados concordantes, pelo que se conclui que o
RNA 6S se liga exclusivamente a E70, mas no se liga, ou
apenas fracamente, com o ncleo da RNAP ou outras
holoenzimas RNAP com diferentes factores sigma.
Esta especificidade das ligaes reflecte a inibio
preferencial de promotores 70-dependentes j observada,
contudo existe um certo nmero de excepes, pelo que o
Figura 15 (A) Expresso do gene rsdP2

aps 18h de crescimento em estirpes
selvagens ou ssrS1 (sem RNA 6S) na
presena de um vector vazio (pKK*) ou na
presena de um vector que expressa o RNA
6S (pHH-6S*). (B) Actividades de galactosidase em diversos promotores
dependentes de 70 em estirpes selvagens
ou ssrS1. Actividade da -galactosidase em
unidades Miller. Adaptado de (Trotochaud
et al. 2004)
mecanismo de seleco de promotores dependentes de RNA 6S ainda no

completamente entendido (Figura 15).
Num estudo realizado por Nina Gildehaus (Gildehaus et al. 2007b) confirmou-se
a ligao preferencial do RNA 6S com E70, mas tambm se observou uma ligao mais
fraca com E38. A anlise do crosslinking revelou um contacto directo entre o elemento
central da sequncia do RNA 6S e as subunidades / e . A formao do complexo
promotor e a anlise da transcrio in vitro com promotores especficos da fase
exponencial e da estacionria e correspondentes holoenzimas demonstraram que o
RNA 6S interfere com a iniciao da transcrio mas, normalmente, no distingue entre
promotores especficos de cada uma das fases. Excepes tambm se verificaram num
22
estudo realizado na Universidade de Wisconsin (Cavanagh et al. 2008b), onde se

verificou que o elemento -10 dos promotores tem papel fundamental na regulao por
RNA 6S uma vez que promotores com elementos -35 moderados so fracamente ou no
so sequer afectados pelo RNA 6S na ausncia do elemento -10 estendido, no entanto,
se o mesmo se encontrar presente, so fortemente regulados pelo RNA 6S. Para alm
do referido anteriormente, j se observou que, quer a inibio, quer a activao de
promotores 38-dependentes esto sujeitas a aco do RNA 6S. (Cavanagh et al. 2008b;
Neusser et al. 2010).
Grande parte da inibio de promotores 70-dependentes identificada no fim da
fase estacionria tem sido caracterizada atravs de dois elementos do ncleo do
promotor que determinam a sensibilidade em relao regulao por RNA 6S. Esses
elementos so a sequncia na regio -10 (elemento -10) que tem a sequncia consenso
TATAAT e a sequncia na regio -35 (elemento -35) que tem a sequncia consenso
TTGACA. Estes elementos encontram-se antes do local de inicio de transcrio e do local
de ligao da RNAP. Foi demonstrado que a fora relativa do elemento -35, que
determinada tendo em conta a diferena de bases em relao sequncia consenso,
um factor determinante para a sensibilidade relativa ao RNA 6S, assim como a presena
de um elemento -10 estendido (elemento -10 com um par de bases conservado
adicional TG localizado anteriormente). A combinao destes dois elementos do
ncleo do promotor resulta na modulao de diferenas na expresso de diferentes
promotores dependentes de RNA 6S, confirmando-se assim que o RNA 6S um
regulador global, pois a expresso de centenas de genes alterada na fase estacionria
de um modo dependente do RNA 6S (Cavanagh et al. 2008b).
No que diz respeito fora relativa do elemento -35, mostrou-se que promotores
com elementos -35 fracos (isto , com 3 ou menos correspondncias com a sequncia
consenso) so muito sensveis aco do RNA 6S enquanto que promotores com
elementos -35 fortes (totalmente compatveis com a sequncia consenso) no so
sensveis. Este facto juntamente com os resultados obtidos em (Cavanagh et al. 2008b),
demonstram a importncia da regio 4.2 do factor 70 para a ligao entre o RNA 6S e
E70, sugerindo que existe competio entre o RNA 6S e o promotor de DNA pela ligao
regio 4.2. Neste modelo, promotores com elementos -35 mais fracos esto em
23
Figura 16 - Alinhamento da regio 4 e da cauda C-terminal de 70 e 38/S de E. coli. Adaptado de (Cavanagh et al.
2008b)
desvantagem competitiva relativamente ao RNA 6S e, consequentemente, so

transcritos em menor quantidade durante a fase estacionria enquanto o RNA 6S
bastante abundante.
Os elementos -10 estendidos tambm so importantes em promotores
regulados por RNA 6S, dado que levam a que promotores com elementos -35 de
moderada fora sejam ainda assim regulados pelo RNA 6S e a que promotores com
elementos -35 fracos sejam ainda mais inibidos pelo RNA 6S. De salientar, que no caso
do elemento -10 estendido no se encontrar presente, promotores com elementos -35
de moderada fora so fracamente ou nem so sequer afectados pelo RNA 6S.Os
mecanismos moleculares relativos contribuio do elemento -10 estendido para a
especificidade da regulao de promotores por RNA 6S ainda no totalmente
entendido. Uma possibilidade que a interaco entre a regio 3.0 do 70 e o elemento
-10 altera a fora das interaces da regio 4.2 com o elemento -35, tornando-os alvo
de competio por parte do RNA 6S. Alternativamente, considera-se que a ligao entre
o RNA 6S e E70 pode bloquear a ligao entre a regio 3.0 e o elemento -10, de um
modo diferente e independente do modelo de competio proposto. (Cavanagh et al.
2008b)
Com base nestas duas caractersticas, previu-se que centenas de promotores
mapeados de E. coli fossem inibidos por aco do RNA 6S e uma posterior anlise de
microarrays de transcriptomas do fim da fase estacionria reforou a ideia de inibio
de transcrio dependente do RNA 6S para 68% dos genes previstos. (Cavanagh et al.
2008b)
Um estudo posterior revelou que o RNA 6S regula a expresso de relA, que
codifica para a sntese de ppGpp. A regulao da expresso de relA dependente do RNA
6S resulta num aumento dos nveis de ppGpp durante o inicio da fase estacionria em
24
clulas sem RNA 6S. Estas alteraes nos nveis de ppGpp, embora modestas, so
suficientes para resultar na alterao da regulao da transcrio de promotores 70dependentes sensveis ao ppGpp, incluindo aqueles que promovem a expresso de
genes envolvidos na sntese de aminocidos e RNA ribossmico. Estes dados colocam o
RNA 6S como outro elemento associado manuteno apropriada da expresso
gentica em clulas a transitar para a fase estacionria e no apenas em clulas j na
fase estacionria. Neste estudo foi ainda possvel distinguir dois mecanismos pelos quais
o RNA 6S regula a expresso de genes que codificam para a biossntese e captao de
aminocidos: (1) um mecanismo indirecto no incio da fase estacionria (6h), em que
mudanas nos nveis de ppGpp dependentes de RNA-6S levam a alteraes na
transcrio em todos os promotores testados sensveis a ppGpp e (2) um mecanismo
independente de relA no fim da fase estacionria (>24h), onde as alteraes na
transcrio dependente do RNA 6S no so mediadas com alteraes no nvel de ppGpp.
(Cavanagh et al. 2010)
Tendo em conta o conhecimento acerca da actuao do RNA na regulao da
transcrio durante a fase estacionria e, posteriormente tendo-se descoberto que o
mesmo tambm actua na fase de transio entre a fase de crescimento exponencial e a
fase estacionria, elaboraram-se estudos, baseados em anlise de microarrays, para
determinar se o RNA 6S tambm actua durante a fase exponencial. De acordo com a
anlise de microarrays, um respeitvel nmero de genes (aprox. 500) expresso de
forma diferente durante o crescimento exponencial, quando a concentrao de RNA 6S
mnima. Face a estes dados, sugere-se que pode haver represso directa destes genes
pelo RNA 6S ou uma compensao funcional indirecta devido falta de RNA 6S. De
qualquer modo, esta descoberta sugere que existem funes adicionais do RNA 6S
diferentes da inibio de certos genes 70-dependentes durante a fase estacionria.
Alm disso, muitos transportadores (20), reguladores, incluindo sistemas de dois
componentes, tambm demonstraram nveis de expresso reduzidos durante o
crescimento exponencial, fortalecendo a hiptese do RNA 6S ter relevncia funcional
durante o crescimento exponencial (Neusser et al. 2010).
Para muitos genes cuja expresso diferenciada, as caractersticas dos
promotores explicadas acima no so completamente aplicveis. Muitos dos
25
promotores afectados pelo RNA 6S tambm so regulados por factores trans que muitas
vezes determinam o tempo global e a extenso da transcrio. Sugere-se assim que o
papel do RNA 6S o de diminuir a expresso de muitos genes durante a fase
estacionria, em vez de regulao on-off entre a fase exponencial e a fase estacionria.
(Cavanagh et al. 2008b).
de salientar, contudo, que em experincias com microarrays a expresso de
muitos reguladores afectada na ausncia de RNA 6S e, deste modo, efeitos directos ou
indirectos podem ter impacto na expresso diferenciada de muitos genes.
Concluindo, pode-se afirmar que o estudo da regulao da transcrio pelo RNA
6S tem sofrido grandes desenvolvimentos, desde o mecanismo de regulao em si,
passando pelos modelos de seleco de genes que so afectados e ainda pelas fases do
ciclo celular em que a aco do RNA 6S mais evidente. No entanto, as regras para
prever que promotores so sensveis ao RNA 6S so aplicveis em muitos casos mas,
obviamente, no cobrem todas as possibilidades. Assim sendo, so necessrios mais
estudos para acabar com as muitas ambiguidades ainda existentes.
Efeitos fisiolgicos da sntese de pRNAs (product RNAs)

A sntese de pRNAs (product RNAs) um mecanismo de regulao crucial ara a
sada das clulas da fase estacionria. Esta sntese verifica-se em diversos organismos,
entre os quais, E. coli, B. sutilis, H. pylori, L. pneumohila e tambm bastantes
cianobactrias (por exemplo, Synechocystis, Synechococcus, ProchlorococcuseNostoc).
Num estudo efectuado na Universidade Simon Fraser, no Canad, foi avaliada a
actividade do RNA 6S de E. coli na presena de baixas e de altas concentraes de
nutrientes. No primeiro caso, verificou-se que o RNA 6S suprime a transcrio ligandose a E70 e, no segundo caso, verificou-se que sintetiza pRNAs utilizando-se a si prprio
como modelo.
Durante a libertao do RNA 6S ocorre a formao de uma estrutura em forma
de gancho que se verificou ser conservada em todas as proteobactrias.
26
Figura 17 - RNA 6S de -proteobactrias; os resduos altamente conservados esto

representados a roxo; o pRNA est representado a azul; esta imagem ilustra a formao do
gancho entre as posies 132 e 153. Adaptado de (Panchapakesan & Unrau 2012)
Experincias envolvendo a adio gradual de nucletidos mostraram que a

ejeco da subunidade 70 ocorre abruptamente, quando o pRNA atinge um
comprimento de 9 nucletidos. Este tamanho exacto do pRNA parece ser importante
por duas razes: em primeiro lugar, um pRNA com 9 nucletidos permite o
emparelhamento da regio -10 com os resduos nas posies 144 a 153 (Fig. 17); em
segundo lugar, aquando da sntese de um pRNA com exactamente 9 nucletidos, o
centro activo da RNA polimerase localiza-se exactamente no bolbo localizado nas
posies 154 a 158 (Fig. 17). Aps ejeco da subunidade 70, mais 4 nucletidos so
adicionados at que o complexo pRNA::RNA 6S seja libertado da RNAP.
Mutaes envolvendo modificaes na sequncia do RNA 6S de E. coli, de forma
a excluir a estrutura em forma de gancho, levam a uma diminuio da velocidade de
libertao do RNA 6S, mas no alteram a forma abrupta com que a subunidade 70
ejectada; no entanto, o tamanho do pRNA para que esta ejeco ocorra passa de 9
nucletidos para 14 nucletidos.
Podemos ento concluir que um papel importante da formao deste gancho
o enfraquecimento da ligao do RNA 6S com 70. Aps a ejeco desta subunidade, o
27
complexo pRNA::RNA 6S ainda est conectado ao ncleo da RNA polimerase e as

interaces mais a jusante aumentam.
Considerando que nas -proteobactrias ocorre a formao de um gancho que
enfraquece a ligao da regio -10 subunidade 70, parece razovel concluir que este
tipo de bactrias conseguem que a libertao do RNA 6S seja mais abrupta,
comparativamente com outras eubactrias. Tendo ainda em mente que as proteobactrias so ricas em organismos patognicos, uma transio abrupta da fase
estacionria para um crescimento rpido seria um benefcio para estes organismos
(Panchapakesan & Unrau 2012).
No entanto, uma questo que se levanta : Porque que o rearranjamento da
estrutura do RNA 6S e a subsequente ejeco da subunidade 70 se d aquando da
sntese de pRNAs, mas no se d aquando da transcrio do DNA?. Esta questo foi
respondida tambm em 2012 por Steuten e Wagner, na Universidade de Heinrich-Heine
em Dsseldorf. Sob condies normais de transcrio, a estabilidade do duplex formado
pela cadeia simples de DNA e a cadeia emergente de RNA no superior estabilidade
da cadeia dupla de DNA, havendo ento a libertao do RNA. No entanto, no caso do
RNA 6S, como a complementaridade entre o RNA 6S e o pRNA superior da cadeia
dupla de RNA original, d-se um rearranjo preferencial da estrutura do RNA e a
formao da estrutura em forma de gancho termodinamicamente estvel (Steuten &
Wagner 2012).
In vivo, os complexos RNA 6S::pRNA sem a proteco da RNAP so degradados
rapidamente e a RNAP e a subunidade 70 esto ento disponveis para transcrio do
mRNA. Tambm em Bacillus subtilis se verifica o mesmo processo de sntese de pRNAs
como mecanismo de regulao, embora com algumas diferenas. Em primeiro lugar, o
RNA 6S de E. coli divide-se em RNA 6S-1 e em RNA 6S-2, de entre os quais, apenas o RNA
6S-1 que capaz de sintetizar pRNAs. Este fenmeno pode ser explicado pela
sensibilidade da RNAP de B. subtilis ao primeiro nucletido do molde de RNA: para uma
sntese eficiente de pRNAs, necessria uma iniciao com guanosina trifosfato (GTP);
no caso do RNA 6S-2, o incio da sequncia virtualmente responsvel por esta sntese
contm uma adenosina trifosfato (ATP) (Cabrera-Ostertag et al. 2013). Em segundo
28
lugar, verifica-se que um pRNA com 8 nucletidos incapaz de estabelecer uma

associao estvel com o RNA 6S-1, ou seja s pRNAs com 12 a 14 nucletidos que tm
a capacidade de induzir um rearranjo da estrutura do RNA 6S-1. No entanto, um LNA
(Locked Nucleic Acid) de 8 nucletidos capaz de induzir este rearranjo (Beckmann et
al. 2012).
Outras diferenas, embora menos importantes, foram observadas entre E. coli e
B. subtilis, como, por exemplo, a frequncia de transcritos abortivos e a estabilidade do
complexo aberto.
Figura 18 - Rearranjo estrutural no RNA 6S-1 de B. subtilis induzido por pRNAs com 14 nucletidos (laranja) ou pelo
LNA com 8 nucletidos (vermelho). A orientao das hlices aps este rearranjo desconhecida. Adaptado de
(Beckman et. al, 2012).
Um estudo conduzido na Universidade de Wisconsin-Madison, focado nas

semelhanas entre E. coli e B. subtilis, concluiu que, em ambos os organismos, uma das
principais caractersticas da sntese de pRNAs para se dar a sada da fase estacionria
a libertao abrupta do RNA 6S da RNAP, sendo que o primeiro est complexado com o
pRNA sintetizado aquando desta ejeco (Cavanagh et al. 2012a).
Em 2011, Shephard et. al verificaram que a taxa de libertao do RNA 6S
relativamente insensvel concentrao de DNTPs, mas que bastante sensvel aos
nveis de magnsio livres. A taxa de libertao do RNA 6S pode ento ser vista como um
mecanismo de ajuste dos nveis de transcrio celular sob determinadas condies
29
atravs da captura do ncleo da enzima durante um determinado espao de tempo

(Shephard et al. 2010).
A sntese de RNA tambm afecta a estabilidade do RNA 6S, pois os nveis deste
s atingem valores mximos aps transio para a fase estacionria. Esta estabilidade
reduzida pode ser resultado de um maior acesso de nucleases celulares ao RNA 6S
aquando da libertao da RNA polimerase ou pode ser resultado do reconhecimento
directo do duplex RNA 6S-pRNA (Wassarman & Saecker 2006b).
Em E. coli, experincias com rifampicina, que um inibidor de transcrio,
mostram que para a desintegrao do complexo RNAP::RNA 6S necessrio que ocorra
transcrio. O RNA 6S no s inibe a transcrio durante a fase estacionria, como
permite que as clulas cresam rapidamente num meio favorvel aps um perodo com
falta de nutrientes (Wurm et al. 2010).
Figura 19 - Esquema ilustrando a influncia do RNA 6S e dos pRNAs na actividade da RNAP durante a fase
exponencial, durante a fase estacionria e durante a sada da fase estacionria. Adaptado de (Wurm et. al
2010).
30
Um modelo proposto por Kugel e Goodrich (2007) afirma que durante a fase
estacionria, o RNA 6S est ligado RNAP e reprime a transcrio devido a
concentraes insuficientes de nucletidos para a sntese de pRNAs; o aumento destas
concentraes no final da fase estacionria permite a sntese de pequenos RNAs,
diminuindo a represso
Podemos concluir que o RNA 6S sintetiza o seu prprio RNA regulatrio, que
reverte a inibio por si prprio causada.
Curiosamente, uma hora aps a sada da fase estacionria, complexos RNA 6S ::
E70 ainda eram detectveis. A importncia destes complexos ps-fase estacionria
ainda est por determinar (Kugel & Goodrich 2007).
Uma reverso rpida e eficiente desta represso de extrema importncia para
a adaptao da clula a alteraes ambientais. Foi efectuada uma mutao em E. coli,
tornando esta bactria incapaz de sintetizar pRNAs e, consequentemente, de ejectar a
subunidade 70, que resultou num atraso na sada da fase estacionria. Ainda neste
estudo verificou-se que a sobre-expresso deste mutante leva a uma menor viabilidade
celular, sugerindo que a sntese de pRNAs tambm importante noutras fases do
crescimento celular(Cavanagh et al. 2012a).
Por fim, abordada a sntese de pRNAs nos restantes organismos referidos no
incio deste captulo (H. pylori, L. pneumohila e as cianobactrias).
Relativamente a H. pylori, experincias in vitro confirmaram que o RNA 6S adopta
uma estrutura em forma de gancho, semelhante estrutura apresentada por E. coli. O
ponto mais interessante relativamente a esta bactria o facto de esta sintetizar dois
tipos diferentes de pRNAs: um deles sintetizado na zona anloga adenosina no
interior do bolbo central de E. coli; o outro pRNA sintetizado na cadeia oposta (Sharma
et al. 2010b).
No caso de L. pneumophila, o seu RNA 6S tem um papel significativo a nvel da
multiplicao intracelular. No entanto, no mutante de eliminao que no inclui o RNA
6S, verificou-se que existe um reduzido nmero de genes cuja expresso alterada
como consequncia (Weissenmayer et al. 2011). Adicionalmente, verificou-se que este
31
RNA apresenta importncia a nvel da virulncia deste organismo(Faucher & Shuman

2011).
Por fim, nas cianobactrias, h pequenas diferenas a nvel estrutural,
possivelmente relacionadas com a temperatura ptima de crescimento, se bem que a
estrutura secundria apresenta um elevado nvel de conservao. Todas as
cianobactrias testadas (Synechocystis, Synechococcus, Prochlorococcus e Nostoc)
foram capazes de se ligar especificamente a E70 de E. coli e de inibir a transcrio in
vitro. Surpreendentemente, o RNA 6S destas cianobactrias tambm foi capaz de
sintetizar pRNAs (Rediger et al. 2012).
Papel do RNA 6S enquanto sentinela de recursos durante o stress

Um resultado bastante informativo obtido a partir da anlise do transcriptoma
do genoma de clulas de E. coli deficientes em RNA 6S foi a descoberta que o RNA 6S
afecta a expresso de muitos genes envolvidos no metabolismo central. Salienta-se a
inibio combinada da expresso de genes constituintes do sistema de traduo (genes
para protenas ribossomais, RNA ribossomal, factores de traduo e enzimas
responsveis pela modificao e montagem dos ribossomas) que foi observada no incio
da fase estacionria. De modo a melhor entender o papel do RNA 6S durante o stress
importante saber a influncia da biossntese de ribossomas sobre a capacidade de
adaptao aos crescimento. (Wagner, 2009)
A biossntese de ribossomas determinada pela velocidade de sntese de rRNA
enquanto que o processo de sntese de componentes proteicos um processo
subordinado a este. A sntese de rRNA est intrinsecamente ligada ao crescimento
celular e determina em grande parte a capacidade do sistema de traduo de clulas
bacterianas. Estes processos tm grande importncia para a clula pelo que no normal
que estejam sujeitos a uma regulao bastante complexa e eficiente. A sntese de rRNA
controlada por um conjunto complexo de redes de regulao, envolvendo duas
molculas efectoras semelhantes a hormonas: a guanosina 3,5-bis(difosfato) (ppGpp)
e a guanosina 3-difosfato, 5-trifosfato (pppGpp). Estas duas molculas tm grande
importncia na adaptao da sntese de rRNA a alteraes nas condies ambientais e
a privaes nutricionais. A resposta provocada por estes dois nucletidos efectores
32
rpida e pode ser bastante drstica, por exemplo, sob condies de escassez de
aminocidos em que a sntese de rRNA imediatamente suspensa. Por outro lado, a
resposta pode levar a uma adaptao gradual e balanceada das taxas de sntese de
rRNA, permitindo a adaptao de clulas que esto em diferentes fases de crescimento.
A distino entre os dois tipos de resposta pode ser feita a partir da concentrao que a
(p)ppGpp atinge na clula. A resposta rpida e drstica (resposta estringente)
despoletada por elevadas concentraes (mM) das molculas reguladoras enquanto
que a resposta relaxada, onde h uma adaptao da sntese de rRNA aos diversos
estados do crescimento, acontece quando as concentraes se encontram na zona dos
M. Esta resposta pode ser denominada de controlo da taxa de crescimento. Uma
caracterstica do controlo da taxa de crescimento que as alteraes na taxa de sntese
de rRNA so aproximadamente proporcionais ao quadrado das alteraes na taxa de
crescimento (Wagner 2002).
De modo a facilitar o entendimento do metabolismo da ppGpp e da sntese de
rRNA, apresenta-se abaixo um esquema (Figura 20), assim como a sua explicao.
Figura 20 - Metabolismo de ppGpp e controlo da sntese de rRNA. Adaptado de (Wagner 2002).
33
A resposta estringente representa a consequncia da privao de aminocidos para a clula. A falta

de disponibilidade de um ou vrios aminocidos causa que os correspondentes tRNAs no sejam
suficientemente carregados. Assim, o rcio de tRNAs carregados vstRNAs no carregados altera-se.
O aparecimento de tRNAs no carregados e a no existncia de aminocidos livres, representa um
sinal para a clula alterar um grande nmero de actividades metablicas. Os sensores do controlo
estringente so os ribossomas. Quando um tRNA no carregado se liga ao local A do ribossoma, a
protena associada ao ribossoma RelA catalisa a sntese de pppGpp transferindo um pirofosfato do
ATP para o grupo OH na extremidade 3 do GTP. A guanosina pentafosfatada rapidamente
convertida em ppGpp por aco da pppGpp 5 fosfohidrolase (GPPase). No completamente claro
se o regulador penta ou tetrafosfato exibe comportamentos diferentes. Com base em estudos in
vitro, ambas as molculas aparentam ser indistinguveis no que sua actividade reguladora diz
respeito.
Com o rpido aumento do nvel celular de (p)ppGpp da gama dos M para os mM,
observam-se mudanas em muitas actividades metablicas. O efeito mais dramtico a represso
imediata da transcrio de RNA estveis (tRNA e rRNA). Contudo, outras alteraes celulares podem
ser observadas como consequncia directa ou indirecta do aumento dos nveis de (p)ppGpp. Por
exemplo, d-se uma inibio combinada da sntese de componentes que fazem parte do sistema
tradutor (rRNA, protenas ribossomais de iniciao de traduo e factores de elongao como o
tRNA). Para alm disso, a sntese de subunidades da RNAP reprimida, enquanto que a expresso
de factores sigma especficos de condies de stress aumentada. A transcrio de operes
responsveis pela biossntese de aminocidos tambm activada. Para alm disso, a protelise
activada e o transporte inibido. A sntese de DNA, da parede celular e o metabolismo de
fosfolpidos so inibidos. Tambm se verificam alteraes na sntese de peptidoglicano e na
tolerncia a penicilina. Por outro lado, a fidelidade da traduo reduzida e a frequncia de
mutaes aumenta. Muitas destas reaces podem ser consideradas como consequncias
indirectas.
34
Simultaneamente com a inibio de componentes para a biossntese de

ribossomas, verificou-se um aumento correspondente do regulador global do controlo
da taxa de crescimento e da resposta estringente (ppGpp) na ausncia de RNA 6S
(Neusser et al. 2010). Conclui-se que a inibio dos componentes do sistema tradutor
durante a fase estacionria provavelmente resultado do aumento do nvel basal da
ppGpp em resposta falta do RNA 6S. Estes resultados apoiaram a ideia de que a ppGpp
compensa a deficincia na adaptao do crescimento na ausncia do RNA 6S. de
salientar que este aumento dos nveis basais de ppGpp mediado por uma alterao da
actividade da enzima SpoT e no est dependente da presena ou ausncia da enzima
RelA dado que se obtiveram os mesmos resultados em estirpes relA+ e relA- deficitrias
em RNA 6S.
Num estudo realizado por Edgardo Baracchini e Hans Bremer mostrou-se que o
nvel basal de ppGpp est directamente relacionado com o crescimento celular. Contudo
no se verificaram grandes alteraes no crescimento celular em estirpes sem RNA 6S
que apresentam nveis elevados de ppGpp. Induziram-se respostas estringentes fracas
e controlo da taxa de crescimento (resposta relaxada) em E. coli (relA+), usando um
meio pobre em aminocidos ou um tratamento com cloranfenicol em baixas
concentraes. Desta forma, a concentrao intracelular do nucletido ppGpp pde ser
variada numa gama de concentraes de 0 a 1000pmol de ppGpp por unidade DO460 por
massa de cultura. Simultaneamente, a taxa de sntese de RNAs estveis (rs= rRNA e
RNAt) foi medida, relativamente taxa total de sntese de RNAs (rT). A correlao entre
a concentrao citoplasmtica de ppGpp e a actividade do gene de RNAs estveis (rs/rT)
foi a mesma observada anteriormente com espcies relA+ e relA- em crescimento
exponencial com diferentes taxas em meios diferenciados. Isto sugere que a distino
entre controlo de crescimento e o controlo estringente da sntese de RNAs estveis
arbitrrio, e que ambos os tipos de controlo reflectem o mesmo fenmeno de
dependncia de ppGpp (Baracchini & Bremer 1988). Chegou-se s mesmas concluses
anos mais tarde (2011), onde se reavaliou o efeito do ppGpp sobre o contedo
macromolecular em clulas com diferentes estados de crescimento, dado que ainda
existiam muitas incertezas acerca do regulador ppGpp enquanto principal regulador do
controlo de crescimento. Descobriu-se que quando o ppGpp est ausente, os rcios
35
RNA/protena e RNA/DNA so equivalentes em clulas com crescimento acelerado ou

lento. Alm disso, clulas deficientes em ppGpp com crescimento lento e com um
elevado contedo em RNA apresentam uma composio de subunidades de ribossomas
normais embora o contedo de polissomas seja reduzido quando comparado com
clulas de estirpes selvagens com crescimento acelerado. A partir destes dados, concluise que o controlo das taxas de crescimento no ocorre na ausncia de ppGpp. Alm
disso, o aumento artificial de ppGpp ou a introduo de mutantes rgidos de RNAP em
clulas deficientes em ppGpp restaura este controlo. Estas descobertas so argumentos
a favor do ppGpp e contra a regulao redundante de crescimento celular por outros
factores em E. coli e em outras bactrias entricas (Potrykus et al. 2011).
Em E. coli, a concentrao celular de ppGpp ajustada pela aco de duas
enzimas diferentes, a RelA e a bi-funcional SpoT. A enzima RelA, que est associada aos
ribossomas, tem apenas a actividade de sntese uma vez que a sua actividade hidroltica
se encontra inibida. J a protena SpoT tem apenas actividade hidroltica dado que
variantes da sequncia limitam a sua actividade de sntese. Assim sendo, a RelA vista
como especializada para a sntese por causa de uma sequncia HD (His-Asp) inactiva e a
SpoT vista como especializada para a hidrlise com uma fraca capacidade de sntese.
A regulao do balano destas duas actividades opostas das enzimas RSH crucial.
Igualmente activas, as actividades de hidrolase e de sintetase no reguladas iriam
catalizar um ciclo intil de hidrlise e sntese de (p)ppGpp. Muita sintetase aumenta os
nveis de (p)ppGpp, que provoca uma resposta estringente, inibe o crescimento e, em E.
coli, ajusta a expresso gentica para reduzir actividades desnecessrias em clulas que
no crescem. Baixos nveis de (p)ppGpp devido ao excesso de hidrolases torna as clulas
menos aptas para responder apropriadamente ao stress nutricional. Resultados de
experincias com vrias protenas RSH (Fig. 21 A) indicam que o domnio N-terminal
(NTD) e o domnio C-terminal (CTD) podem contribuir para a regulao. A activao da
actividade de sintetase parece ocorrer atravs de um sinal comum (Figura 21, B). Este
sinal envolve a incapacidade da aminoacilao do tRNA responder s exigncias da
sntese proteica, normalmente provocada, in vivo, pela escassez de aminocidos ou pela
adio de inibidores de aminoacil tRNAsintetases. A regio conservada TGS do CTD
tambm est envolvida na regulao de uma forte actividade de hidrolase e uma fraca
36
actividade de sintetase da SpoT. Tem sido complicado entender a capacidade da SpoT

sentir as fontes do stress nutricional como a privao de aminocidos e de responder
limitando a actividade hidroltica, mas foi descoberto um mecanismo que permite que
a SpoT detecte a limitao da sntese de cidos gordos. A protena ACP liga-se regio
TGS da SpoT e esta ligao provavelmente influenciada pelo rcio celular entre a ACP
no acilada e a ACP acilada. A escassez de cidos gordos leva a uma alterao no balano
entre as duas actividades da SpoT a favor da actividade sinttica. Os autores do estudo
apontam para um paralelo entre a enzima SpoT e a RelA no que diz respeito
capacidade de deteco de stress (Potrykus & Cashel 2008).
Figura 21 (A) Domnios conservados de uma protena RSH (protenas com homologia com Rel e Spo. (B) Papel
da E. coli na RelA (esquerda) e na SpoT (direita) mostrando a actividade de hidrolase e sintetase do domnio NTD
(smbolo yin e yang) e do domnio CTD (quadrado), com o balano de hidrolase/sintetase mostrado como o rcio
entre pontos verdes e laranjas. (Lado esquerdo) A activao da sintetase de RelA necessita de um tRNA no carregado,
de um ribossoma (amarelo) com um local A vazio devido a falta de um tRNA carregado e a proetna-r L11. A sntese
de (p)ppGpp de GTP envolve a transferncia de um grupo pirofosforil de ATP e acompanhada pela libertao da
RelA. (Lado direito) A regulao da SpoT descrita de duas maneiras. A ACP com falta cidos gordos (tringulo roxo)
liga-se regio TGS do CTD da enzima SpoT, o que altera o balano das actividades a favor da actividade de sntese.
Este efeito tambm requer outras funes do CTD. Outras condies de stress provocam um alterao semelhante
no balano das actividades atravs de mecanismos desconhecidos. A hidrlise da (p)ppGpp regenera o GTP/GDP
atravs de uma reaco dependente de Mn2+, libertando um pirofosfato. Adaptado de (Potrykus&Cashel 2008).
As alteraes dos nveis de ppGpp dependentes de RNA 6S podem ser

demonstrados em estirpes relA+ e relA- indicando que a sntese de ppGpp (dependente
37
da SpoT) provavelmente responsvel pela aumento da quantidade da molcula

sinalizadora. Com base na anlise de microarrays e em anlises bioqumicas props-se
um cenrio possvel (Neusser et al. 2010). Durante o crescimento estacionrio na
ausncia de RNA 6S, o balano entre a actividade hidroltica e sinttica da SpoT
afectado, dando origem a um aumento do nvel do nucletido efector. Este no tem um
impacto directo mensurvel no crescimento celular mas causa um decrscimo subtil nos
constituintes ribossomais dado que os genes fundamentais do directamente afectados
pelo ppGpp. improvvel que o RNA 6S tenha um efeito directo na SpoT, embora se
tenha demonstrado que molculas de tRNA no carregadas inibem a actividade
hidroltica da SpoT. Se o RNA 6S tivesse uma funo semelhante, seria expectvel que o
nvel de ppGpp diminusse na ausncia de RNA 6S. Considerando o impacto directo do
RNA 6S no metabolismo de purinas prope-se que um nvel alterado nos nucletidos de
purina um dos sinais celulares mais importantes, que podem afectar a actividade da
SpoT.
Noutro estudo, props-se que o RNA 6S no altera o mecanismo de activao de
RelA, nem os sinais e as molculas envolvidas na reduo dos nveis de ppGpp no incio
da fase estacionria. Em vez disso, o RNA 6S regula a transcrio de relA, portanto altera
os nveis de RelA disponveis para responder a esses sinais e leva a alteraes dos nveis
de acumulao de ppGpp, o que leva a um aumento dos nveis de ppGpp em estirpes
sem RNA 6S. Demonstra-se ainda que as alteraes do ppGpp dependentes do RNA-6S
durante o inicio da fase estacionria so suficientes para resultar numa maior expresso
dos genes regulados positivamente pelo ppGpp e uma menor expresso em promotores
regulados negativamente. No entanto, alteraes no nvel de ppGpp no podem ser
contabilizadas para todas as mudanas de transcrio dependente de RNA 6S. O RNA
6S regula muitos promotores no final da fase estacionria quando os nveis de ppGpp
so indetectveis e promotores que no so sensveis ao ppGpp tambm continuam
regulados por RNA 6S na ausncia de ppGpp, mesmo durante o inicio da fase
estacionria (Cavanagh et al. 2010).
Neste trabalho demonstrou-se ainda que o ppGpp no influencia a
funcionalidade do RNA 6S. Especificamente, no fim da fase estacionria, quando os
nveis de ppGpp no so detectveis, muitos promotores so inibidos pelo RNA 6S e
38
permanecem sensveis ao mesmo em espcies relA e relAspoT. No inicio da fase

estacionria, promotores que no so inerentemente sensveis ao ppGpp continuam
sensveis ao RNA 6S mesmo na ausncia de ppGpp, indicando que o funcionamento do
RNA 6S no depende do ppGpp. Conclui-se assim que a actividade do RNA 6S
necessria para acumulao apropriada de ppGpp durante o inicio da fase estacionria,
mas o ppGpp no contribui para a capacidade do RNA 6S funcionar (Cavanagh et al.
2010). No entanto considera-se que so necessrias muitas mais experincias para
tornar clara a relao entre o RNA 6S e a molcula ppGpp.
Uma questo importante a este respeito descobrir se o RNA 6S actua como um
efector directo na enzima SpoT, como mostrado noutras molculas reguladoras. No
trabalho realizado por Aurlia Battesti e Emanuelle Bouveret (Battesti & Bouveret 2006),
caracterizou-se pela primeira vez a interaco fsica entre a enzima SpoT e a ACP usando
co-purificaes por afinidade e sistemas de dois hbridos em E. coli. A enzima ACP, como
um co-factor central na sntese de cidos gordos, pode ser o candidato ideal a mediador,
sinalizando a escassez nutricional SpoT. Assim sendo, mostra-se que a interaco
ACP/SpoT especfica das funes de ambas as enzimas porque a ACP no interage com
a protena homloga RelA e porque a SpoT no interage com a enzima ACP no
funcional. Com o uso de protenas SpoT fuso truncadas, demonstra-se que a ACP ligase ao domnio central TGS da SpoT, consistente com o papel na regulao. O
comportamento de mutantes pontuais de SpoT que no interagem com a ACP revelam
modificaes no balano entre as duas actividades catalticas opostas da SpoT, pelo que
h alteraes nos nveis de (p)ppGpp. Mais importante, estes mutantes falham nos
despoletar da acumulao de (p)ppGpp em resposta inibio da sntese de cidos
gordos, apoiando a hiptese que a interaco ACP/SpoT pode estar envolvida na
resposta ao stress dependente da SpoT. Estas informaes levaram proposta de um
modelo no qual a ACP transporta informao acerca do metabolismo celular dos cidos
gordos, que por sua vez pode despoletar a alterao conformacional na SpoT, levando
acumulao de ppGpp (Figura 22).
39
Figura 22 ACP enquanto influenciador do balano das actividades da SpoT. No caso de escassez de aminocidos, a
ligao RelA atravs do domnio C-terminal com os ribossomas detecta os tRNA no carregados, despolentando a sua
activao simultaneamente com a sua dissociao. Em paralelo, a ACP interage com o domnio TGS da SpoT. Quando
h escassez de cidos gordos, a natureza dos derivados ligados ACP mudam e do-se alteraes conformacionais
na ACP que so transmitidas SpoT, favorecendo a actividade de sntese de ppGpp em relao degradao. O
domnio de degradao representado pela letra D e o domnio de sntese representado pela letra S. Adaptado de
(Battesti & Bouveret 2006).
Noutro estudo, mostra-se que a eliminao de CgtA em Vibrio cholerae causa

mudanas globais na expresso gentica que so consistentes com a induo de uma
resposta clssica ao stress nutricional ou de uma resposta estringente (Figura 23). Provase ainda que a eliminao do CgtA leva a um aumento dos nveis de ppGpp que esto
correlacionados com a induo da resposta ao stress global e com o fim do crescimento
e confirmou-se que a CgtA interage com a SpoT num sistema de dois hbridos. Sugerese, por fim, que a funo essencial da CgtA como repressora da resposta estringente,
que actua regulando a actividade da SpoT para manter os nveis de ppGpp baixos
quando as bactrias esto a crescer num meio rico em nutrientes (Raskin et al. 2007).
40
Figura 23 Genes inibidos em comum em clulas sem CgtA e em clulas onde se induziu uma resposta estringente.
(A) Conjunto de todos os genes inibidos; (B) Genes envolvidos na sntese de protenas inibidos devido eliminao
da CgtA. Adaptado de (Raskin, 2007)
No que diz respeito a efectores da enzima SpoT, Dietmar Richter demonstrou

que a reaco de converso de pppGpp em ppGpp realizada pelo produto do gene spoT
(ppGppase) significativamente inibida na presena de tRNA no carregado de
levedura. No entanto, pouca ou nenhuma inibio se observou com Phe-tRNAPhe,
tRNAPhe-CpCpAoxi-red ou com RNA ribossmico (16S e 23S), demonstrando assim que
o tRNA um efector directo na enzima SpoT (Richter 1980).
De acordo com o papel do RNA 6S no metabolismo geral da clula, em E. coli,
muitos genes dependentes do RNA 6S so expressos diferencialmente durante a fase de
crescimento exponencial (Neusser et al. 2010). A seguir aos transportadores e aos
reguladores das respostas ao stress, muitas enzimas do metabolismo das purinas so
afectadas. Notavelmente, muitos genes envolvidos no metabolismo das purinas so cotranscritos ou so directamente genes flanqueantes do RNA 6S bacteriano. Exemplos
disso incluem o gene ygfA em E. coli, o gene purK muitas vezes encontrado acima (em
termos de sequncia) dos genes de RNA 6S em cianobactrias ou o gene purD que se
encontra depois dos genes de RNA 6S em H. pylori.
Sabe-se que alteraes no reservatrio de NTPs vo levar em ltima instncia a
alteraes na sntese de ribossomas. Uma represso coordenada dos constituintes dos
ribossomas foi uma das grandes descobertas da anlise de transcritos no estudo
efectuado pelo grupo de investigao de Ren Geissen (Geien et al. 2010). A biognese
41
de ribossomas depende directamente da taxa de sntese de rRNA porque a transcrio

de rRNA determina a taxa de formao de ribossomas. Entre os muitos componentes
reguladores envolvidos na transcrio de rRNA, a concentrao inicial de nucletidos
tem consequncias especficas para a transcrio de rRNA sob condies de stress
nutricional quando a sinalizao por ppGpp induzida porque a transcrio de
promotores de rRNA particularmente sensvel s concentraes de NTP em
concentraes elevadas de ppGpp. Neste estudo mostrou-se tambm que o RNA 6S
afecta indirectamente a transcrio de rRNAs. Sabendo-se que 6 dos 7 promotores P1
de rRNA de E. coli necessitam de ATP como o NTP inicial, sendo a excepo o promotor
P1 do gene rrnD que necessita de um GTP, analisou-se a influncia do RNA 6S na
actividades dos promotores P1. A anlise foi realizada com o promotor P1 de rrnB
(comea com um A) e com o promotor P1 de rrnD (que comea com um G) que foram
inseridos em plasmdeos, sendo depois transformados em clulas selvagens e nas
correspondentes clulas mutantes deficientes no gene ssrS. Observou-se que na estirpe
sem ssrS os transcritos provenientes do promotor P1 rrnD so muito menos que os
transcritos do promotor rrnB. Quando se realizou a mesma anlise com um promotor
P1 rrnD mutado, no qual a posio inicial foi alterada de um G para um A, no se verificou
diferenas no nmero de transcritos. Estes resultados apoiam a hiptese de existirem
quantidades diferentes de GTP e ATP nas estirpes ssrS-. De notar que necessrio um
aumento na quantidade de NTP para a sntese de sRNAs, o que por sua vez afecta a
actividade do RNA 6S. Concluindo, pode dizer-se que so necessrios mais estudos para
revelar a relao complexa entre o RNA 6S e os nveis celulares desejveis de
nucletidos.
Mais provas que apoiam a funo do RNA 6S como regulador do uso econmico
dos escassos recursos existentes sob limitaes de crescimento ou stress so baseadas
num estudo recente que analisa o fentipo de B. subtilis, em que o RNA 6S-1 foi
eliminado. Descobriu-se que o RNA 6S-1 importante para um tempo de incio de
esporulao apropriado em B. subtilis, sendo que os esporos so formados mais cedo
em culturas de clulas sem RNA 6S-1 do que em clulas de uma estirpe selvagem. A
eficincia e o tempo de incio da germinao, tal como o tempo para gerar um esporo
maturo assim que a deciso de esporular foi tomada, no se alteram em clulas com ou
42
sem RNA 6S-1. Mostrou-se que os genes associados esporulao so induzidos mais
cedo em clulas sem RNA 6S-1 do que em clulas de estirpe selvagem. Juntos, estes
dados apoiam a hiptese de que o tempo de inicio de esporulao que alterado em
clulas em que no est presente RNA 6S-1. Interessantemente, a presena de clulas
bsrA em co-cultura com clulas selvagens leva a que ambos os tipos de clula exibam
o fentipo de esporulao antecipada. Prope-se que a funo do RNA 6S-1 em clulas
bsrA leva a um aumento da utilizao de nutrientes. Para alm disso, mostrou-se que
vrias vias, que se sabe terem impacto no incio da esporulao, no so necessrias
para as alteraes mediadas por RNA 6S-1, sugerindo que estas no so alvo de
regulao por RNA 6S-1. Interessantemente, o RNA 6S-2 no influencia o tempo de incio
de esporulao, fornecendo mais indcios das diferentes funcionalidades destes dois
tipos de RNA em termos de fisiologia celular. Os dados obtidos apoiam as concluses de
que a actividade do RNA 6S-1 leva a alteraes no ambiente local, sendo que essas
alteraes promovem uma esporulao antecipada e so dominantes sobre o gentipo
de clulas em crescimento. de grande interesse saber que alteraes especficas
existem entre um meio selvagem condicionado e um meio condicionado bsrA pelo que
se postularam dois modelos: (i) clulas bsrA utilizam nutrientes a uma velocidade
diferente de clulas selvagens, levando a um gasto mais rpido dos nutrientes essenciais
e a um incio de esporulao mais cedo; (ii) clulas bsrA geram e segregam um sinal de
esporulao no meio mais cedo, levando a uma esporulao antecipada
independentemente do estado nutricional.
Outro mecanismo de resposta limitao nutricional em Bacillus subtilis o
canibalismo que permite que clulas individuais dentro de uma populao produzam
uma toxina que mata as clulas vizinhas, utilizando-as como fonte de nutrientes. A
eliminao de um ou de ambos os operes que se sabe serem importantes para
respostas de canibalismo independente (skf e sdp) resulta num fentipo de esporulao
antecipada semelhante ao fentipo observado em clulas bsrA. Contudo, nem o skf
nem o sdp so necessrios para as alteraes do tempo de inicio de esporulao
dependentes de RNA 6S-1.
Assim, conclui-se que estas vias de canibalismo no so alvo da regulao de RNA
6S-1 responsvel pelas mudanas na esporulao de clulas bsrA. Assim sendo, ps-se
43
a hiptese de que o RNA 6S importante para uma gesto apropriada dos recursos em
E. coli, permitindo que as clulas conservem energia, limitando a respostas a diversos
stresses ambientais. O equilbrio permite o aumento da sobrevivncia ptima em fases
estacionrias de longa durao. intrigante que o RNA 6S-1 tambm esteja
provavelmente envolvido na conservao dos nutrientes em B. subtilis. A esporulao
bastante regulada, em parte para balancear a sobrevivncia ptima com a flexibilidade
a alteraes nas condies ambientais. Por exemplo, se um grande nmero de clulas
esporularem cedo, a capacidade da populao responder rapidamente a uma alterao
na qualidade ou quantidade dos nutrientes fica comprometida. Contudo, se a
esporulao dor atrasada, podem no existir recursos suficientes para completar a
formao dos endsporos depois desta comear, levando a um decrscimo da
sobrevivncia a longo prazo das populaes de clulas. Por isso, prope-se que o RNA
6S-1 de B. subtilis e o RNA 6S de E. coli desempenham um papel na gesto dos recursos
e na sobrevivncia das clulas (Cavanagh & Wassarman 2013b).
Organismos eucariotas: homlogos de RNA 6S

Em relao aos organismos eucariotas, pesquisas recentes denotam a existncia
de um homlogo do RNA 6S, tendo-se descoberto recentemente que, para alm do
complexo proteico que envolve os factores de transcrio TFIIA, TFIIB e TFIID a TFIIH,
existe regulao da transcrio por sRNA. O B2 RNA de rato e o Alu RNA humano ligamse RNA Polimerase II e co-ocupam o binding site dos promotores, em resposta ao
choque por calor. Estudos bioqumicos revelam que estes pequenos RNA impedem a
ligao
correcta da RNA
Polimerase
II ao
DNA,
criando um
complexo
transcripcionalmente inactivo. Estes dois sRNA so transcritos de regies intergnicas

pela RNA Polimerase III, sendo bastante expressos em resposta, por exemplo, ao calor
externo. Ao contrrio do RNA 6S bacterial, o B2 RNA de rato no origina pRNA, mas pode
servir como template para a extenso de 18 nucletidos no seu terminal 3, o que
destabiliza a ligao RNA Polimerase II RNA, regulando assim o fim da transcrio em
resposta a factores externos (Yakovchuk et al. 2009; Wagner et al. 2013; Ponicsan et al.
2013).
44
Perspectivas Futuras
Esta rea de investigao est cada vez mais a despertar o interesse da comunidade
cientfica. Desde Fevereiro de 2014, foram submetidos e aceites para publicao em
diversas revistas especializadas 8 artigos (Fonte: ISI Web of Science), ainda indisponveis
para consulta. Algumas questes relevantes foram aqui abordadas e carecem de
resposta, sendo que a grande maioria reside na determinao exacta dos mecanismos
de regulao mediados pelo RNA 6S, bem como a vantagem competitiva que este
pequeno RNA pode conferir clula, em termos de utilizao eficaz dos nutrientes,
replicao celular ptima, patogenicidade acrescida, resistncia ao stress oxidativo e a
condies de falta de nutrientes. Decerto que ser um tema a acompanhar atentamente
num curto prazo de tempo, pelas razes aqui apresentadas e pelo que est ainda por
descobrir, descrever e explicar.
widespread regulator of eubacterial
RNA polymerase that resembles an
open promoter 6S RNA is a
open promoter. , pp.774784.
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of 6S RNA by pRNA synthesis is
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transcription is determined by core
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