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Continuada a Distncia
Curso de
Biotecnologia
Aluno:
Curso de
Biotecnologia
MDULO I
Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referncias Bibliogrficas.
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Sumrio
Mdulo I
Histria da biotecnologia e reviso de gentica
1. Introduo
1.1. Definio e histria
2. Reviso de gentica
2.1. Estrutura do DNA
2.2. Replicao do DNA
2.3. Mecanismos de replicao do DNA
2.4. Transcrio
2.4.1. Estrutura do RNA
2.4.2. RNA como molcula mensageira
2.5. Transcrio do DNA
2.5.1. Mecanismos envolvidos na transcrio gnica
2.5.1.1. Transcrio em procariotos
2.5.1.1.2. Iniciao da transcrio
2.5.1.1.3. Elongao da transcrio
2.5.1.1.4. Terminao da transcrio
2.5.1.2. Transcrio em eucariotos
2.6. Traduo
2.6.1. Cdigo gentico
2.7. Sntese proteica
2.7.1. Ribossomos
2.7.2. Iniciao da traduo em procariotos
2.7.3. Alongamento da sntese proteica em procariotos
2.7.4. Traduo em eucariotos
2.7.4.1. Iniciao da traduo em eucariotos
2.8. Processamento proteico
2.9. Regulao da transcrio
2.9.1. Regulao da transcrio em procariotos
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Mdulo IV
Aplicaes da biotecnologia
5. Introduo
5.1. Projetos genoma
5.2. Terapia gnica
5.3. Novas vacinas
5.4. Novos produtos
5.5. Novos kits de diagnstico
5.6. Seleo assistida com testes de DNA e clonagem
5.7. Animais transgnicos
5.7.1. Animais resistentes a doenas
5.7.2. Animais transgnicos como biorreatores
5.7.3. Animais transgnicos e as caractersticas de interesse econmico
5.7.4. Animais transgnicos na pesquisa biomdica e de xenotransplante
5.8. Alimentos geneticamente modificados
5.9. Biorremediao
Mdulo V
Introduo bioinformtica
6. Introduo
6.1. Banco de dados
6.1.1. Bancos de dados pblicos
6.2. Alinhamento de sequncias
6.3. A bioinformtica e os projetos genoma e transcriptoma
6.4. Base calling
6.5. Mascaramento de vetores
6.6. Agrupamento de sequncias
6.7. Anotao gnica
6.7.1. Blast
6.8. A bioinformtica e a anlise da estrutura proteica
6.8.1. Anlise da estrutura primria de protenas
6.8.2. Anlise da estrutura secundria
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MDULO I
Histria da biotecnologia e reviso de gentica
1. Introduo
1.1 Definio e histria
O termo biotecnologia pode ser definido como a aplicao de princpios
cientficos e tecnolgicos no processamento de materiais por agentes biolgicos
visando produo de servios e mercadorias. Dentro desta viso ampla, a
biotecnologia tradicional uma tecnologia utilizada desde os primeiros profissionais
que empregaram micro-organismos em processos fermentativos para a gerao de
iogurtes e cervejas, por exemplo.
No incio da dcada de 70, a biotecnologia tradicional era uma disciplina
confinada a departamentos de engenharia qumica e a programas de microbiologia.
Em 1971, o termo biotecnologia foi criado pelo engenheiro hngaro Karl Ereky.
Este pesquisador utilizou o termo para descrever seu experimento que visava
produo em larga escala de sunos alimentados com beterrabas cultivadas com
micro-organismos. Karl ento definiu biotecnologia como todas as linhas de pesquisa
que envolvem a gerao de produtos a partir de matrias-primas que receberam a
adio de materiais vivos. Contudo, esta terminologia permaneceu bastante
ambgua entre os cientistas e somente em 1961 o termo foi ento associado com o
estudo da produo industrial de bens e servios por procedimentos que utilizam
organismos, sistemas ou processos biolgicos. Isto se deve ao microbiologista
sueco Carl Gren Hedn, que sugeriu a mudana de ttulo de um jornal de
publicao cientfica na rea de microbiologia aplicada e fermentao industrial,
intitulado de Jornal de Microbiologia e Engenharia Bioqumica e Tecnologia para
Biotecnologia e Bioengenharia.
A biotecnologia tradicional foca trs aspectos principais: (I) preparao da
matria-prima a ser utilizada como fonte para os micro-organismos; (II) o processo
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aumento
de
produo
significativo,
otimizao
do
processo
de
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Engenharia
Qumica
Biologia
Celular
Bioqumica
Biotecnologia
Molecular
Microbiologia
Biologia
Molecular
Gentica
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2. Reviso de gentica
2.1 Estrutura do DNA
Muitas descobertas na rea de gentica foram sendo feitas e acumuladas
para responder a uma pergunta inicial: como ocorria a transmisso da informao
gentica entre as geraes e como esta era armazenada. Para a biotecnologia, a
mesma pergunta pode ser feita de outra forma: como o conhecimento da informao
gentica pode ser aplicado para a gerao de bens comerciais. Nos anos de 1950
as dados a respeito deste assunto eram:
1.
4.
5.
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Deoxiguanilato (dGMP)
Deoxiadenilato (dAMP)
Deoxitimidilato (dTMP)
Deoxicitidilato (dCMP)
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mesmo se faz verdadeiro para a proporo entre C e G. Por outro lado, a quantidade
de A + T no necessariamente igual de G + C. Esta variao caracterstica de
cada micro-organismos que esteja sendo utilizado como modelo experimental.
Em 1953, Watson e Crick analisaram estes dois experimentos prvios e
juntaram as informaes por eles geradas. Ento, estes pesquisadores propuseram
o modelo da dupla hlice de DNA (Fig. 3). Neste, cada fita que a compe formada
por uma cadeia de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister. A figura tambm
demonstra que o empilhamento dos pares de bases na dupla hlice resulta na
formao de dois sulcos na sequncia ose-fosfato: o sulco maior e o sulco menor.
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Sulco maior
Sulco menor
A outra fita, por sua vez, corre no sentido inverso, de 3 para 5. Por esta
caracterstica afirma-se que o pareamento entre as fitas de DNA antiparalelo.
Timina
Adenina
Citosina
Guanina
Cada fita formada pela unio de nucleotdeos, sendo que a dupla hlice
constituda pela unio entre duas fitas de DNA que se orientam em sentidos
opostos: uma corre no sentido 3 - 5 e a outra, de 5 - 3. Para o pareamento de
bases, cada par contm uma base purnica (adenina A ou guanina G), e uma
base pirimidnica (timina T ou citosina C) ligadas por ponte de hidrognio. As
setas amplificam e demonstram com mais detalhes como ocorre o pareamento entre
as bases. Basicamente, adenina e timina se pareiam pela formao de duas pontes
de hidrognio; j a citosina e guanina se ligam por trs pontes de hidrognio. As
pontes de hidrognio esto representadas por trs barras em azul. (Figura
modificada de Griffiths et al., 2002).
As relaes entre as bases durante o pareamento demonstraram que T se
pareia somente com A e C somente com G. Outros tipos de pareamento no
ocorrem naturalmente no DNA. Para explicar este achado, Watson e Crick
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Fita
parental
Fita
filha
Fita
parental
dois dplex: um formado por duas fitas molde e outro por duas fitas filhas. A terceira
hiptese, a replicao dispersiva, cada dplex formada por fragmentos de dupla
fita contendo apenas segmentos de DNA parental e, na mesma molcula, h
tambm fragmentos de dupla fita contendo apenas segmentos recm-sintetizados.
Para discriminar entre as hipteses sugeridas como modelo para a
replicao do DNA, Matthew Meselson e Franklin Stahl realizaram um elegante
experimento em 1958. Estes pesquisadores analisaram vrias geraes de culturas
bacterianas que tiveram como fonte de nitrognio duas molculas que apresentam
densidades diferentes, o N15 e o N14. Inicialmente, as culturas foram supridas
somente com N15, os quais foram incorporados s bases nitrogenadas que estavam
sendo formadas durante a replicao do DNA.
Aps a diviso celular de algumas geraes, as mesmas clulas bacterianas
foram cultivadas em meio contendo somente o N14. O padro de replicao foi
diferenciado aps a separao do DNA em gradiente de cloreto de csio (Fig. 6). O
resultado obtido aps a centrifugao demonstrou a presena de uma banda
intermediria entre os dois nitrognios na primeira gerao com N14, e uma
intermediria e outra correspondente a somente o N14. Este experimento confirmou
que a replicao do DNA semiconservativa. Os mesmos resultados foram obtidos
em experimentos posteriores, validando ento o modelo.
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Semiconservativa
Conservativa
Duas bandas
N15N14 e N14N14
Uma banda
N15N14
Dispersiva
Duas bandas
N15N15 e N14N14
Duas bandas
N15N15 e N14N14
Uma banda
N15N14
Dupla fita em vermelho representa fitas compostas somente por N15; as duas
fitas azuis seriam compostas por somente N14. Aps a primeira seta da esquerda
so representadas a primeira e a segunda gerao de clulas crescidas em meio
contendo somente N14. O padro de bandas da legenda se refere ao obtido aps a
centrifugao em cloreto de csio. (Figura modificada de Griffiths et al., 2002).
Diversos modelos experimentais foram propostos para explicar como a estrutura
do DNA. O modelo da dupla hlice explicou bem alguns processos envolvidos com a
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direo 5- 3;
II.
incorretas;
III.
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da
prvia
existncia
de
um
pequeno
oligonucleotdeo
de
aproximadamente 30 pb. Este primer pode ser sintetizado tanto por uma RNA
polimerase (RNAP) como pela enzima denominada primase. Portanto, somente aps
a sntese do primer complementar a uma determinada sequncia de DNA, haver a
extenso da cadeia pela DNAP.
A sntese de novas cadeias pela DNAP ocorre na direo 5- 3. Pela
natureza antiparalela da fita de DNA a enzima se move sobre a fita molde na direo
3 - 5. A sntese de uma nova fita, designada leading contnua. Por outro lado, a
desnaturao do DNA tambm expe outra fita molde que corre no sentido 5- 3, a
lagging. Ento, a forquilha de replicao ponto em que as duas fitas de DNA se
separam para permitir a replicao de cada fita tem de seguir no sentido contrrio
da outra fita para que a polimerizao seja de 5- 3.
Para que a replicao ocorra ao mesmo tempo nas duas fitas, a
polimerizao na lagging realizada em pequenos segmentos descontnuos.
Inicialmente, um primer de RNA sintetizado de forma complementar ao DNA. Em
seguida, ocorre ento a polimerizao e elongao da fita de DNA pela DNAP. Estes
fragmentos de DNA foram identificados pela primeira vez por Reiji Okazaki e, por
isso, so denominados fragmentos de Okazaki. A atividade exonuclesica no
sentido 5- 3 da DNAP I remove os primers de RNA e preenche esta sequncia
com um segmento fita simples de DNA. Estes so ento selados pela enzima DNA
ligase, que catalisa a ligao do fosfato 5 a um grupo 3 OH adjacente. Esta ligao
ocorre assim que a forquilha expe a fita lagging e prossegue at que o fragmento
precedente seja alcanado.
Para que a replicao seja simultnea entre as duas fitas do DNA foi
proposto um modelo que est demonstrado na Fig. 7. A fita lagging sofre uma volta
sobre o complexo enzimtico responsvel pela replicao do DNA. Esta volta
permite que a DNAP III sintetize ambas as fitas filhas. Depois de percorridos
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estabilizada pela ligao da protena SSB, que se liga fita simples de DNA e,
com isso, retarda a formao do dplex.
Ambas as DNAP I e III possuem atividade exonuclesica 3 - 5, o que
permite verificar e editar bases inseridas erroneamente ou mal pareadas. Esta
atividade fundamental para a manuteno da fidelidade da informao gentica.
Mutantes deficientes nesta atividade apresentam maior taxa de mutao.
Muitos questionamentos foram feitos aps a descoberta da estrutura e de
outros processos que envolvem o DNA. Entre eles, o que realmente intrigava e
fascinava os pesquisadores era a descoberta de como a informao gentica
presente em sequncias de DNA so transmitidas at a sntese de protenas. O
primeiro passo para atingir este objetivo foi entender o processo de transcrio.
2.4 Transcrio
Aps a descoberta do DNA, os pesquisadores ento queriam entender como
a informao gentica contida nesta sequncia de bases era traduzida em protenas.
A primeira especulao poderia ser que esta transferncia era realizada diretamente
do DNA em protenas. Contudo, a unio da gentica e da citologia permitiu elucidar
muitos fatos. A observao de que o material gentico em clulas eucariotas se
encontrava no ncleo e as protenas no citoplasma demonstravam a necessidade de
uma molcula intermediria. Posteriormente, o processo foi elucidado e o
intermedirio nesta transferncia de informaes o RNA.
2.4.1 Estrutura do RNA
A estrutura bsica do RNA bem semelhante a do DNA. Ambos so
formados por uma cadeia constituda pela unio de nucleotdeos por meio de
ligaes fosfodisteres. Apesar da semelhana, o RNA apresenta algumas
diferenas estruturais se comparado ao DNA:
I.
eles podem ser compostos por quatro bases distintas: adenina, citosina, guanina e
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Ribose
Deoxirribose
III.
Por fim, o RNA constitudo por uma fita simples e no por uma fita
citoplasma
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Portanto, a hiptese de que o RNA era sintetizado a partir do DNA por meio da
especificidade do pareamento de bases era um bom modelo experimental.
A complementaridade de bases entre DNA e RNA ainda pde ser
comprovada em estudos de hibridizao. Inicialmente, a dupla fita de DNA
desnaturada e uma regio complementar a uma determinada sequncia ento
estudada. Para isto, as molculas que se deseja estudar, no caso o RNA, so postas
em soluo s fitas de DNA. A molcula de RNA neste tipo de experimento
denominada sonda. Esta mistura ento submetida a condies que permitem a
renaturao das fitas hbridas.
Como o dplex de DNA tem densidade diferente daquele formado por
DNA/RNA, estes hbridos podem ser separados por ultracentrifugao em cloreto de
csio. Aps a realizao deste experimento foi possvel observar a presena da
banda correspondente formao do hbrido DNA/RNA. Este resultado confirma
ento a complementaridade de bases entre DNA e RNA, pois a formao de hbridos
ocorre somente quando h uma grande regio com similaridade de bases.
O estudo de complementaridade de bases ainda permitiu elucidar outro
aspecto da transcrio: se o RNAm ou no transcrito a partir das duas fitas de
DNA. As duas fitas constituintes do dplex de DNA apresentam diferentes
propores das bases purinas e pirimidinas. Considerando este fato, Mamur e
colaboradores, em estudos com o fago SP8 de Bacillus subtilis, foram capazes de
manter as duas fitas de DNA desnaturadas e ento verificar a quais fitas o RNAm se
hibridizava. Os cientistas verificaram que o transcrito se hibridizava a somente uma
das fitas. Devido a esta revelao, a transcrio dita assimtrica.
Os estudos iniciais sobre a transcrio esclareceram, portanto, que a sntese
de RNA se d de maneira assimtrica e que a base para a sua realizao a
especificidade de pareamento de bases. O passo seguinte foram ento estudos que
permitiram desvendar como ocorre o mecanismo da transcrio de genes.
2.5.1 Mecanismos Envolvidos na Transcrio Gnica
2.5.1.1 Transcrio em Procariotos
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holoenzima
promotor
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Ala em
grampo
Pareamento
de bases
Resduos de uracila
Figura 11: Estrutura em grampo para a finalizao da transcrio.
A
DNA
RNA
Stio rut
Ribossomo
B
Figura
12:
Modelo
da
terminao da transcrio
pela ao da protena R.
II-
III- RNA polimerase III, que sintetiza RNA transportador (RNAt) e outros
RNAs e suas molculas.
Em relao constituio da enzima, algumas das subunidades
constituintes da RNAP so similares em procariotos e eucariotos. Entretanto, a dos
ltimos
possui
outras
subunidades
diferentes
so
consideradas
como
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A) RNA monocistrnico
B) RNA policistrnico
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Cap
exon
intron
exon
intron
Exon AUUAAA
3
A
A
A
exon
intron
exon
intron
Exon AUUAAA
AAAAAAA
Cauda de poliA
Estas
reaes
so
catalisadas
por
um
complexo
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exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intro
Diferentes RNAm
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
exon
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II.
III.
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Alm
disso,
subunidade
maior
do
ribossomo
possui
dois
carrega a cadeia polipeptdica que est sendo formada. Assim que a polimerizao
da cadeia polipeptdica prossegue e h a translocao do ribossomo, ou seja, esta
estrutura se move sobre um cdon, o RNAt que se encontra no stio P liberado do
complexo. Isto permite a transferncia do RNAt do stio A ao P. Para fins didticos, a
sntese proteica dividida em trs passos distintos: iniciao, alongamento e
trmino.
2.7.2 Iniciao da Traduo em Procariotos
Em procariotos, o primeiro passo da iniciao ocorre com o reconhecimento
do cdon de incio, que em E. coli pode ser representado tanto por AUG como por
GUG e UUG. Dentre eles, o mais representativo o AUG, sendo que os outros dois
so denominados cdons alternativos. Observa-se que a escolha de um ou outro
cdon varia com o gene em questo; contudo, sequncias que contenham cdons
de incio diferentes possuem taxas de traduo diferenciadas.
Antes de iniciar a traduo, as subunidades ribossmicas encontram-se
separadas. Para iniciar a sntese, a subunidade menor 30S se liga primeiramente ao
RNAm. Esta ligao estimulada pelo fator proteico de iniciao IF3 e IF1. O fator
IF1 se liga somente ao complexo inicial, sendo que a sua localizao impede a
ligao da subunidade maior.
Um detalhe interessante como esta subunidade reconhece o cdon de
incio correto. Apesar de a maioria dos genes terem como cdon de incio o AUG,
que codifica uma metionina, a sequncia do RNAm possui outros representantes
desta mesma trinca, inclusive em locais a jusante do cdon de incio. Ento, como
se d esse reconhecimento do correto cdon?
A questo do reconhecimento do verdadeiro cdon de incio foi respondida
aps estudos realizados por John Shine e Lynn Dalgarno. Estes pesquisadores
notaram que o verdadeiro cdon de incio era precedido por uma sequncia de
aproximadamente oito nucleotdeos, sendo complementar poro 3 final do RNAr
16S da subunidade menor do ribossomo. Em uma homenagem a estes
pesquisadores, esta sequncia foi denominada de Shine-Dalgarno. Este passo
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(A) subunidade 30S se liga ao RNAm com o auxlio dos fatores IF1 e IF3; (B)
IF2 se liga ao RNAt ligado N-formilmetionina e controla a sua entrada no
ribossomo; (C) os fatores de iniciao so liberados e a subunidade maior se liga ao
complexo inicial, formando o ribossomo completo. (Figura modificada de Lewin,
2004).
2.7.3. Alongamento da Sntese Proteica em Procariotos
O alongamento da cadeia proteica dependente de trs fatores proteicos:
EF-Tu, Ef-Ts e EF-G. O EF-Tu medeia a entrada do RNAt contendo o aminocido
correspondente ao cdon que se encontra no stio A do ribossomo, um processo
dependente de energia. Em seguida, h a ao do fator EF-Ts, responsvel pela
liberao do primeiro fator do ribossomo. Este fator ainda consegue regenerar a
energia gasta no processo com o fator EF-Tu. No passo da translocao, a cadeia
polipeptdica transferida ao RNAt carregado com aminocido e presente no stio A.
O ribossomo ento se move sobre o RNAm na direo 5 - 3 do mesmo. Este passo
mediado pelo fator de elongao EF-G. Assim, h a liberao do RNAt presente no
stio P e que no se encontra mais carregado. Posteriormente, h a transferncia do
RNAt contendo a cadeia polipeptdica em formao do stio A para o P.
O trmino da sntese proteica ocorre quando o cdon seguinte ao processo
de translocao, presente no stio A, um cdon de parada. Estes cdons no so
reconhecidos por RNAt, mas sim por fatores proteicos que so designados pelas
abreviaes RF1, RF2 e RF3. A diferena entre estes fatores se deve ao
reconhecimento diferencial dos cdons de parada. O RF1 reconhece UAA e UAG; o
RF-2, os cdons UAA e UGA. O RF-3 auxilia em processos de catlise envolvidos
com a terminao da cadeia. O fator de liberao ento se liga ao cdon no stio a e
o polipeptdeo ento liberado do stio P. A finalizao do processo se d com a
dissociao do ribossomo em suas subunidades maior e menor.
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Genes estruturais
RNA polimerase
DNA
RNAm
Conformao
da protena
Protena
repressora
lactose
RNAm
Suplemento
Beta glactosidase
Permease
transacetilase
Figura 21: Esquema geral da regulao do operon Lac. (Figura modificada de Griffiths et al.,
2002).
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CpG
-90
Boxe CCAAT
-75
TATA boxe
-25
+1
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silenciador
Ativador
Intensificador
Intensificador
Ativador
Ativador
RNA
polimerase
Protena
TATA
Figura 23: Modelo proposto para explicar o mecanismo de ao dos intensificadores e dos
silenciadores.
como os intensificadores e os
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organismo at chegar ao seu local de ao. Por serem molculas lipossolveis, elas
conseguem passar pela membrana plasmtica, sem exigir mecanismos mais
sofisticados. Na clula, hormnios esteroides se ligam a fatores de transcrio
presentes no ncleo e os regulam.
2.9.2.6 Estrutura das Protenas Reguladoras
Anlises
reguladoras
das
sequncias
procariotas
eucariotas
comparaes
indicam
que
estruturais
as
de
protenas
mesmas
possuem
Contatos no polares:
estabilizam o motivo
Giro
giro-hlice
Hlice de
reconhecimento
de
protenas
com o DNA.
62
Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores
His
Cys
His
Cys