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Protocolos Microbiologia 2010 PDF
Protocolos Microbiologia 2010 PDF
Ana Mendes Ferreira, Antnio Ins, Maria Jos Saavedra, Arlete Mendes Faia
2009
As aulas prticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratrio de
Microbiologia. Nessas aulas sero utilizados vrios grupos de microrganismos, bactrias e fungos,
alguns dos quais podero ser patognicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras
de modo a evitar qualquer tipo de contaminaes.
1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ;
2- No fumar nem comer no laboratrio. No levar boca qualquer objecto nomeadamente lpis,
canetas, etc. No humedecer etiquetas com a boca;
3 - Manter a superfcie da bancada livre de todo o material que no for utilizar durante a
experincia;
4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao termin-lo lavar e desinfectar as mos;
5 - Desinfectar a superfcie da bancada que ir utilizar com lcool a 70%, antes e aps a execuo
do trabalho;
6 - Evitar que objectos ou produtos inflamveis fiquem prximos da chama;
7 - Todo o material usado (pipetas, lminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do
recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri sero
colocadas dentro do balde para posterior inactivao;
8 - O estudante com cabelos longos deve apanh-los, sobretudo quando o trabalho exige a
utilizao do bico de Bunsen, de forma a no os queimar.
9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspiraes
indevidas ;
10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do gnero corte, queimadura, etc.
11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte.
12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilizao;
13 - O microscpio deve ser manuseado com cuidado :
a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a coloc-la no final;
b) As lminas j observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que est em cima da
bancada para o efeito;
c) S dever remover a lmina da platina, depois deslocao da objectiva;
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Material necessrio: Erlenmeyer; Balana; gua destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos
de ensaio
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3g
Peptona ..............................................
5g
Agar ...................................................
15 g
1000 ml
Notas importantes:
A adio do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes
estarem dissolvidos;
O meio de cultura deve ser esterilizado logo aps a sua preparao;
Os fracos no devem conter mais de metade do seu volume;
Os frascos no devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilizao;
Material necessrio
-Culturas de microrganismos
-Placas de Petri com agar nutritivo
-Tubos com caldo nutritivo
-Tubos com agar nutritivo inclinado
-Tubos com agar nutritivo
-Ansas e agulhas
-Pipetas
-Estufa
Procedimento
1- Isolamento de colnias em meio slido
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Sementeira por esgotamento (streak plate) isolamento e obteno de cultura pura Com auxlio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma poro de
colnia que pretende isolar e espalhe superfcie da placa de Petri de modo a que as clulas
fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colnias individualizadas. Identificar a placa com
o nome do operador e a data. Incubar as placas temperatura apropriada para o microrganismo
em estudo.
2- Repicagem de colnias
Para agar inclinado- Com auxlio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida,
retire uma poro de colnia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe superfcie do
agar inclinado. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.
Para agar em tubo- Com auxlio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida,
retire uma poro de colnia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada
dentro do agar. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.
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Trabalho prtico 1
Diversidade e ubiquidade dos microrganismos
Os microrganismos existem no ar, na gua e principalmente no solo. Do solo podem ser
arrastados pelo vento atravs das partculas de poeira. Desenvolvem-se logo que as condies
ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favorveis ao seu crescimento. Cada
organismo aparece pelo menos num habitat natural especfico no qual pode ser normalmente
encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado.
Objectivos:
Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos
Material necessrio
-Placas de Petri com meio de agar nutritivo
-Pipetas
-Estufa
-Zaragatoas
Procedimento
1- Pesquisa de microrganismos do ar
Retirar a tampa de vrias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15
minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30C durante 3
dias.
2- Pesquisa de microrganismos das superfcies da sala de aulas
Passar um cotonete estril sobre uma superfcie da bancada antes e aps a sua desinfeco com
lcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfcie do meio de cultura. Identificar a
placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30C durante 3 dias.
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Resultados:
-Examinar as placas e contar o nmero de colnias totais e o nmero de colnias diferentes em
cada placa;
-Descrever o tipo de colnias com base na descrio apresentada na Fig.1.
-Registar os resultados.
Cor
Forma
Elevao
Margem
Representao
(mm)
Escolher 2 ou 3 colnias que considere mais interessantes. Colocar uma alquota de lquido ou uma
poro de colnia (homogeneizar) numa lmina e cobrir com uma lamela. Observar ao
microscpio. Desenhe cada uma das suas observaes no Quadro:
Observao das clulas retiradas da
colnia 1
colnia 2
Colnia 3
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FORMA
Puntiforme
Circular
Filamentosa
Irregular
Rizoide
Pevide
ELEVAO
Plana
Convexa
Elevada
Em abbada
Mamilonada
MARGEM
Inteira
Ondulada
Lobada
Irregularmente
crenada
Filamentosa
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Frisada
Trabalho prtico 2
Morfologia bacteriana e mtodos de colorao
As bactrias so organismos unicelulares que podem apresentar formas esfricas (cocos),
cilndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). Reproduzem-se por ciso binria. Aps o
alongamento da clula, forma-se um septo que vai gradualmente progredindo at formao de
duas clulas. Estas podem separar-se ou no umas das outras. Com base no nmero e no plano
de diviso celular, as clulas podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos
aos pares); Streptococcus (cocos em cadeia); Staphylococcus (cocos em cacho); ttradas
(agrupamentos de quatro cocos); sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). Os bacilos
tambm podem aparecer isolados, aos pares e em cadeia. O tamanho das clulas varivel. O
exame das bactrias pode ser feito directamente da suspenso, atravs de preparaes a fresco
em gota pendente. As preparaes coradas permitem observar caractersticas morfolgicas e
evidenciar diferenas entre espcies (Bactrias Gram positivo e Gram negativo).
Objectivos:
Observar clulas vivas e mobilidade, distinguir microrganismos por colorao do meio envolvente e
distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo.
Material necessrio
-Culturas de microrganismos
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Procedimento
Retirar as lminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Limpar com papel
absorvente. Manipular tocando apenas nos bordos das lminas. Identificar a lmina numa
extremidade.
Observao a fresco- Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar
com gua) numa lmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio.
Colorao simples- Colocar uma alquota de lquido ou uma poro de colnia (homogeneizar
com gua) numa lmina, adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela.
Observar ao microscpio.
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Colorao negativa- Aps fixar, espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a
preparao. Deixar secar o corante e observar com a lente de imerso. Esta colorao poder ser
usada na observao de cpsulas. Neste caso a preparao previamente corada com fucsina,
lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina.
Colorao de esporos
Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com gua em ebulio;
Cobrir o esfregao com um quadrado de papel de filtro;
Colocar algumas gotas de verde malaquite (soluo aquosa a 5%). Deixar actuar durante 5
minutos; Passar por gua;
Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com gua e secar com papel
absorvente;
Examinar ao microscpio com a objectiva de imerso.
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ser dimrficos,
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Material necessrio
-Culturas de leveduras;
-Microscpio;
-ansas;
-Lminas e lamelas;
Procedimento
Examinar macroscopicamente as colnias de diversas leveduras;
Para o exame microscpico a fresco colocar uma gota de gua sobre a lmina, adicionar uma
poro de colnia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscpio.
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CILNDRICA
Pichia membranaefaciens
Saccharomyces cerevisiae
GARRAFA
APICULADA
Pitysporum ovale
TRIANGULAR
Trigonopsis variable
Kloeckera apiculata
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Os bacterifagos (fago: do grego phagein: comer) comedores de bactrias foram descobertos por Frederick Twort e
Felix dHerelle na 2 dcada do sec. XX
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Objectivos:
Contagem de placas fgicas
Material necessrio
Por grupo:
8 eppendorfs com 0.9 ml de meio LB
8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 C)
8 tubos vazios esterilizados
1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 C)
8 caixas de Petri esterilizadas
1 micropipeta
1 caixa com pontas amarelas esterilizadas
1 tubo com a cultura de clulas hospedeiras (Escherichia coli 5911)
1 eppendorf com a suspenso do fago T72
Procedimento
No nicio da aula, distribuir o meio de cultura LBs (slido) pelas caixas de Petri formando uma
camada fina no fundo. Deixar solidificar.
Fundir o meio LBss (semi-slido) e manter os tubos em banho a 50 C. (Consulte o fluxograma em
anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental)
1. Preparar diluies seriadas (10-1 at 10-8) da suspenso fgica, adicionando (0.1 ml) da
suspenso inicial ao meio lquido estril LB (0.9 ml/eppendorf).
2. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluies realizadas. Retirar 0.1 ml de cada
diluio e colocar nos respectivos tubos.
3. Adicionar 0.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm1.0) a cada um dos tubos
anteriores.
4. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluies efectuadas (10-1 at 108
).
5. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em
banho a 50 C. Misturar os contedos dos tubos por agitao suave (evitar a formao de bolhas)
e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfcie da camada de LBs das caixas
O fago T7 um dos vrios colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. Possui uma molcula linear de DNA em
cadeia dupla. Apresenta cabea, cauda curta, no contrctil e pertence famlia Podoviridae (Para mais informaes
consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.htm)
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Resultados
Observar as caixas e determinar o n de placas fgicas (plaque-forming units-pfu), partculas
fgicas infecciosas, por ml da suspenso original. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fgicas
devem ser consideradas.
pfu/0.1 ml = n de placas fgicas x factor de diluio
Como apenas foram plaqueados 0.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml
pfu/1.0 ml = n de placas fgicas x factor de diluio x 10
placa fgica
camada de E. coli
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Figura 6- Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado, em batch (sistema
descontnuo)
Objectivos:
Comparao de mtodos de avaliao do crescimento microbiano
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Procedimento
Colocar na cmara uma gota da suspenso de microrganismos;
Cobrir com a lamela;
Contar o nmero de clulas por quadrado (Na zona central esto gravadas duas grelhas que so
constitudas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um com uma rea de
1/400 mm2); Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e
determinar a mdia;
Resultados
O nmero de microrganismos/ml = Nx
1
x1000 ;
profundidadexreadoquadrado
Numa cmara em que a profundidade seja de 0,1 mm e a rea do quadrado de 1/400 = 0.0025
mm2, o nmero de microrganismos/ml ser igual ao valor mdio por quadrado x 4 x 106.
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Material necessrio
-Culturas de microrganismos
-Tubos de ensaio com 9 ml de gua estril (soluo salina)
-Placas de Petri com meio apropriado cultura
-Agitador de tubos
-Pipetas esterilizadas de 1 ml
Procedimento
Pipetar 1 ml da suspenso da cultura para um tubo com 9 ml de gua estril (diluio de 1:10);
Homogeneizar muito bem num agitador;
Transferir 1ml do tubo da diluio 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de gua estril (diluio de
1:100);Homogeneizar muito bem num agitador
Fazer isto sucessivamente at obter a diluio desejada que permita contar as ufc;
Espalhar uniformemente em placas de Petri 0,1 ml de cada uma das diluies (Identificar cada
uma das placas com a diluio respectiva, data e nome do operador);
Incubar as placas a 30C durante 3 dias;
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Procedimento
Ligar o espectrofotmetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm;
Transferir para a cuvete caldo no inoculado e acertar a absorvncia a zero;
Transferir as suspenses bacterianas para cuvetes do espectrofotmetro (pode ser necessrio
diluir as amostras); Proceder leitura da absorvncia (DO).
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Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
000
0,0
120
1,1
221
3,0
311
7,5
001
0,3
121
1,5
222
3,5
312
11,5
010
0,3
130
1,6
223
4,0
313
16,0
011
0,6
200
0,9
230
3,0
320
9,5
020
0,6
201
1,4
231
3,5
321
15,0
100
0,4
202
2,0
232
4,0
322
20,0
101
0,7
210
1,5
300
2,5
323
30,0
102
1,1
211
2,0
301
4,0
330
25,0
110
0,7
212
3,0
302
6,5
331
45,0
111
1,1
220
2,0
310
4,5
332
110,0
333
140,0
Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
Caract.
Microrg.
000
0,0
203
1,2
400
1,3
513
8,5
001
0,2
210
0,7
401
1,7
520
5,0
002
0,4
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0,9
402
2,0
521
7,0
010
0,2
212
1,2
403
2,5
522
9,5
011
0,4
220
0,9
410
1,7
523
12,0
012
0,6
221
1,2
411
2,0
524
15,0
020
0,4
222
1,4
412
2,5
525
17,5
021
0,6
230
1,2
420
2,0
530
8,0
030
0,6
231
1,4
421
2,5
531
11,0
100
0,2
240
1,4
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3,0
532
14,0
101
0,4
300
0,8
430
2,5
533
17,5
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0,6
301
1,1
431
3,0
534
20,0
103
0,8
302
1,4
432
4,0
535
25,0
110
0,4
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1,1
440
3,5
540
13,0
111
0,6
311
1,4
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17,0
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0,8
312
1,7
450
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25,0
120
0,6
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2,0
451
5,0
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0,8
320
1,4
500
2,5
544
35,0
122
1,0
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1,7
501
3,0
545
45,0
130
0,8
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2,0
502
4,0
550
25,0
131
1,0
330
1,7
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6,0
551
35,0
140
1,1
331
2,0
504
7,5
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60,0
200
0,5
340
2,0
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3,5
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90,0
201
0,7
341
2,5
511
4,5
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160,0
202
0,9
350
2,5
512
6,0
555
180,0
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Objectivos:
Avaliar o efeito dos factores fsicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano.
Material necessrio
-Culturas de microrganismos
-Placas com meio de cultura
-Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH 3, 5, 7, 9
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Procedimento
1- Efeito do pH
Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura a diferentes valores
de pH,
Incubar as placas a 30C durante 3 dias;
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
2- Efeito da temperatura
Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura;
Incubar a 5, 25 e 55C durante 3 a 7 dias;
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
Resultados
Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos.
Figura 10 Classificao dos microrganismos com base nos valores de pH ptimo de crescimento
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Objectivos:
Avaliar o efeito letal de alguns agentes fsicos - temperatura e radiaes UV.
Material necessrio
-Culturas de microrganismos
-Placas com meio de cultura
- Tubos com meio de cultura lquido
Procedimento
1- Efeito da temperatura
Inocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura;
Introduzir os tubos num banho-maria a 70 C durante 5, 10 e 15 minutos;
Aps o tempo referido, semear 0,1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas
diferentes para uma placa;
Incubar as placas a 30C durante 3 dias;
Observar o crescimento do microrganismo nas trs condies.
Resultados
Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos
microrganismos.
Verificar o efeito das radiaes no crescimento de cada um dos microrganismos.
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Objectivos:
Avaliao de actividades enzimticas em alguns microrganismos. Apresentao de alguns testes
bioqumicos usados na deteco e ou identificao de alguns microrganismos
1- Hidrlise de polmeros
Amilases
Proteases
2- Reaces de fermentao
Fermentao de acares
Produo de sulfetos
Reaces ImVic
3- Reaces respiratrias
Catalase
Citocromo oxidase
4- Outras reaces
Urease
1- Pesquisa de amilase
Alguns microrganismos hidrolizam molculas orgnicas de elevado peso molecular, como por
exemplo o amido, utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos
metablicos. Ao juntar-se uma soluo de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um
complexo com cor azul se no tiver sido hidrolizado. Caso contrrio, no h reaco com o iodo.
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Procedimento
Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas seces com um marcador.
Semear uma das seces com E. Coli e a outra com Bacillus subtilis;
Identificar as seces;
Incubar as placas a 37C durante 24 a 48 horas;
Resultados:
Aps o aparecimento das colnias, colocar algumas gotas de soluo de iodo e verificar o
aparecimento ou no da cor azul.
Material necessrio
-Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris;
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham);
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham);
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham);
Procedimento
Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios;
Identificar cada um dos tubos com a espcie inoculada e com acar adicionado;
Incubar as placas a 37C durante 24 horas;
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Espcie
Lactose
Sacarose
3- Reaces respiratrias
Pesquisa de Catalase
Este teste bioqumico utilizado para comprovar a presena de catalase, enzima que destri o
perxido de hidrognio, originando H2O e O2. A maioria dos seres vivos possui catalase.
Material necessrio
-Lminas;
-Culturas de Bacillus sp;
-Culturas de Lactobacillus sp.;
-gua oxigenada (3%);
Procedimento:
Colocar numa lmina uma poro de cultura;
Adicionar uma gota de gua oxigenada a 3%;
Resultados:
Verificar se h ou no desprendimento gasoso;
Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espcies.
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Material necessrio
-Cultura microbiana a testar
-Papel de filtro
-Tetrametil-parafenildiamina.HCl (1% W/V em gua).
Procedimento
Misturar a cultura em estudo com uma soluo de tetrametil-parafenildiamina.HCl numa folha de
papel de filtro.
Resultados:
Verificar a alterao da cor. Este indicador incolor na forma reduzida e adquire uma cor prpura
na forma oxidada (resultado positivo)
Material necessrio
-Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli;
-Tubos com Agar de ureia;
Procedimento
Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli ; Incubar a 37
C durante 24 horas.
Resultados:
Verificar a alterao da cor do meio e preencher o quadro:
Espcie
Urease
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Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos noesporulados, Gram negativo, anerbios facultativos que fermentam a lactose com produo de
gs.
Objectivos:
Pesquisa de coliformes em guas e determinao do NMP de coliformes
Pesquisa de Escherichia coli
Material necessrio:
-Tubos com caldo de lactose
-Placas com Agar Endo
-Tubos com caldo MR-VP
-Tubos com gua peptonada
-Tubos com Agar de Citrato-Simmons
-Filtros de 0,45
1- Pesquisa de Coliformes:
1.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose
Procedimento
Pipetar 1 ml da amostra de gua para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo Durham
invertido. Incubar a 35 C durante 24 a 48 horas.
Resultados:
Observao dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. A presena de gs em pelo menos 1/4 do tubo
Durham indicativa da presena de coliformes. Neste caso fazer a determinao do NMP de
coliformes por 100 ml de gua com base nas tabelas de MacGrady.
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Resultados:
O aparecimento de colnias carmim indicativo da presena de Escherichia coli. Devero ser
efectuados os testes IMViC.
Procedimento
Semear 0,1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo;
Incubar a 35 C durante 24 horas;
Resultados:
O aparecimento de colnias carmim indicativo da presena de coliformes no ficando
estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Poder ser Enterobacter aerogenes.
3- Testes IMViC
A distino entre as duas espcies, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita
efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol, o M de Methyl-red, o V de
Voges-Proskauer e o C de Citrato.
Espcies
Indol
Methyl-red
Voges-proskauer
Citrato
Escherichia coli
E. aerogenes
Procedimento
Pipetar 0, 1 ml da amostra de gua para um tubo com gua peptonada;
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Resultados:
A reaco positiva quando aparece um anel vermelho superfcie resultante da reaco do p-dimetil-aminobenzaldedo (reagente de Kovacs) com o indol; a reaco negativa quando aps a
adio do reagente o anel se mantm amarelo/alaranjado.
Procedimento
Pipetar 0,1 ml de amostra de gua para um tubo com caldo MR-VP;
Incubar a 37C durante 5 dias.
Resultados:
Confirmar o crescimento no meio de cultura. Adicionar ao meio inoculado, algumas gotas de
vermelho de metilo. Se houver produo de cidos, h um abaixamento de pH para valores
inferiores a 4,4. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo), a pH 4,4 fica
vermelho e a pH 6,2 amarelo.
Procedimento
Pipetar 0,1 ml da amostra de gua para um tubo com caldo MR-VP
Incubar a 37 C durante 5 dias.
Resultados:
Confirmar o crescimento no meio. Adicionar ao meio, -naftol a 6% e hidrxido de potssio
(40%). Misturar bem. Se existir acetona no meio, a adio de -naftol e hidrxido de potssio,
Pgina 37
Procedimento
Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons;
Incubar a 37 C durante 5 dias;
Resultados:
A utilizao de citrato provoca uma alcalinizao do meio que detectada pela modificao da cor
do indicador (azul de bromotimol). Verificar se houve ou no modificao da cor do meio (verde
para azul).
Pgina 38
Objectivos:
Determinar o fentipo a diferentes grupos de antibiticos
Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI
Material necessrio:
- Zaragatoas
- Pinas estreis
- Ansas
- Rgua
- Discos de antibiticos (Oxoid)
- Meio de Cultura (Muller-Hinton agar)
- Soro fisiolgico
- Para testar a eficcia aos antibiticos sero utilizadas trs espcies bacterianas (E. coli,
Mergulhar uma zaragatoa na suspenso bacteriana retirando o excesso; Semear placas de agar
Mueller-Hinton;
Aplicar os discos dos antibiticos a testar (utilizar o dispenser como se representa na Figura)
sobre a superfcie do meio de cultura, aps a secagem do inculo;
Incubar a 37 C, durante 24 horas.
Pgina 39
Laboratory Standards). Assim, a medida do halo de inibio ser comparada com os valores da
tabela, onde a bactria classificada, nas categorias de sensvel (S), intermdia (I) ou resistente
(R).
Figura 11 Representao da aplicao de discos de antibiticos num meio de cultivo inoculado com uma
estirpe em anlise ( esquerda). Resultados obtidos aps crescimento bacteriano ( direita).
Antibitico
Dimetro do halo
Classificao
Pgina 40
Antibitico
Dimetro do halo
Classificao
Antibitico
Dimetro do halo
Classificao
Pgina 41
Legohemoglobina no ndulo
ndulo
Objectivos:
Observao da nodulao em diferentes leguminosas. Observao dos bacterides.
Isolamento de Rhizobium a partir dos ndulos.
Material necessrio
-Microscpio
-Lminas e lamelas
-Caixas de Petri esterilizadas
-Ansa, Pina e tesoura
-lcool a 70%
Pgina 42
Plantas
Forma dos
Disposio ao longo do
Ndulos
sistema radicular
Constituio interna
Observaes
Resultados:
Tomar nota e desenhar as formas das clulas observadas ao microscpio directamente do ndulo;
Registar as caractersticas das colnias formadas no meio de manitol levedura simples e com
adio dos indicadores - vermelho do Congo e azul de Bromotimol;
Retirar uma poro de uma colnia para uma lmina e misturar com uma gota de gua estril;
Pgina 43
BIBLIOGRAFIA
Benson, H. 1994. Microbiological applications. 6th ed. WCB Publishers, Dubuque, IA 52001.
Martinko, J. Madigan, M. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Prentice-Hall Inc.,
New Jersey.
Canas-Ferreira, W. e J.C.F. de Sousa, 1998. microbiologia. Vol 1. Lidel Editora, Lisboa.
Schelegel, H. 1993. General Microbiology. 7th ed. Cambridge University Press, Cambridge
Stanier, R., E. Adelberg,J. Ingraham e M. Wheelis 1979. Introduction to the microbial world.
Prentice-Hall Inc., New Jersey.
Wheelis, M. e W.Segel 1979. Introduction to the microbial world Laboratory manual. PrenticeHall Inc., New Jersey.
Pgina 44
3g
Peptona ...................................................
5g
Agar ........................................................
15 g
1000 ml
Caldo nutritivo:
Extracto de carne .....................................
3g
Peptona ...................................................
5g
1000 ml
10 g
Dextrose ..................................................
40 g
Agar ........................................................
15 g
1000 ml
Y Malte Agar
Extracto de malte .....................................
3g
3g
Peptona ...................................................
5g
Glucose ...................................................
10 g
Agar .........................................................
20 g
1000 ml
Y Malte Caldo
Extracto de malte .....................................
3g
3g
Peptona ...................................................
5g
Glucose ...................................................
10 g
1000 ml
Agar de amido
Extracto de carne .....................................
3g
10 g
Pgina 45
15 g
1000 ml
10 g
1g
5g
0,018 g
1000 ml
Agar de ureia
Peptona ...................................................
1g
Dextrose ...................................................
1g
5g
2g
Ureia .......................................................
20g
0,012 g
100 ml
Acertar a pH 6,8. Esterilizar a mistura por filtrao (A). Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de
gua a 121C durante 15 minutos (B). Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de Distribuir em tubos e
inclinar.
Caldo de lactose
Extracto de carne ......................................
3g
Peptona ....................................................
5g
D-lactose .................................................
5g
1000 ml
gua peptonada
Peptona ....................................................
10 g
5g
1000 ml
Agar Endo
Peptona ...................................................
10 g
Pgina 46
10 g
2,5 g
3,5 g
Agar ........................................................
15 g
0,5 g
1000 ml
0,2 g
5g
1g
1g
2g
Agar ........................................................
15 g
1000 ml
Caldo MR-VP
Peptona ....................................................
7g
5g
Dextrose ...................................................
5g
1000 ml
Agar de Manitol-levedura
Fosfato de potssio ....................................
0,5 g
0,2 g
0,1 g
Manitol .....................................................
10 g
0,4 g
Agar ........................................................
15 g
1000 ml
10 g
5g
10 g
1000 ml
Pgina 47
10 g
5g
10 g
15 g
1000 ml
Pgina 48
0,3
30 ml
1 ml
0,5 g
perfazer a 100 ml
Soluto de Lugol
Cristais de iodo .........................................
1,0 g
2,0 g
300 ml
Soluo de Safranina
Safranina ..................................................
lcool etlico a 95% ...........................
2,5 g
10 ml
Soluo de Fucsina
Fucsina bsica ...........................................
1g
Etanol .....................................................
10 ml
100 ml
Soluo de Nigrosina
Nigrosina .................................................
10 g
5g
Soluo de iodo
Cloreto de sdio .......................................
2,25 g
0,12 g
0,105 g
0,05 g
Pgina 49
perfazer a 1 L
Soluo de tetrametil-parafenildiamina.HCl
Tetrametil-parafenildiamina.HCl .............
gua destilada .......................................
0,1 g
at 10 ml
0,1 g
etanol .......................................................
300 ml
200ml
Reagente de Kovacs
lcool amlico ..........................................
150 ml
p- dimetil-aminobenzaldedo .......................
10 g
50 ml
Dissolver o aldedo no lcool, a 60 C, deixar arrefecer e adicionar o cido gota a gota. Guardar no frigorfico.
Soluo de -Naftol
-Naftol ....................................................
5 ml
2,25 g
0,12 g
0,105 g
0,05 g
perfazer a 1 L
100 ml
fenol .......................................................
100 g
glicerol .....................................................
100 ml
100 ml
Dissolver o fenol em gua, sem aquecer. Adicionar depois o cido lctico e o glicerol.
azul de algodo
sol. Saturada de azul de algodo ................
10 ml
glicerol .....................................................
10 ml
80 ml
Pgina 50
4g
B - Soluo de iodo
Iodo ............................................................ 1 g
Iodeto de potssio ........................................ 2 g
Etanol .......................................................... 25 ml
gua destilada .............................................. 100 ml
C - lcool iodado
Soluo de iodo ............................................ 5 ml
Etanol .......................................................... 95 ml
D - Safranina
2,5% de safranina em lcool .......................... 10 ml
gua destilada .............................................. 100 ml
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