Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular

Print version ISSN 0102-7638

RevBrasCirCardiovascvol.21no.1SoJosdoRioPretoJan./Mar.2006
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-76382006000100014

ARTIGO ORIGINAL

Avaliao da interferncia da tolerncia oral na rejeio

do transplante de corao alognico avascular na
orelha de camundongo

Alberto ValenciaI; Eduardo Srgio BastosII; Vinicius da ConceioIII; Sylvia

Maria da Nicolau CamposIV; Isabela di Puglia CarvalhoV; Kalil MadiVI;
Gerlinde TeixeiraVII
Doutorado (Doutorando do Programa de Ps-Graduao em Cirurgia Geral - Setor
de Cirurgia Cardaca. Universidade Federal do Rio de Janeiro)
II
Cirurgio Cardiovascular (Professor da Universidade Federal do Rio de Janeiro)
III
Universitrio (Estudante)
IV
Nutricionista (Professora da Universidade Federal Fluminense)
V
Mdica (Mestranda Cardiologia da Universidade Federal Fluminense)
VI
Patologista (Professor Adjunto da Universidade Federal do Rio de Janeiro)
VII
Doutorado (Professora Adjunta da Universidade Federal do Rio de Janeiro)
I

Endereo para correspondncia

RESUMO
OBJETIVO: Apesar da evoluo das tcnicas cirrgicas que permitiram a
padronizao do transplante cardaco e da descoberta dos imunossupressores,
ainda hoje, a rejeio, os efeitos colaterais dos medicamentos e o processo de
vasculopatia crnica so os principais problemas nos ps-transplantados. A procura
por alternativas para superar estes impedimentos o objetivo principal deste
trabalho. Assim, foram realizados experimentos para determinar se a tolerncia oral
pode interferir no transplante cardaco.
MTODO: Camundongos C57BI/6J e C3H/HEJ, machos adultos foram divididos em
dois grupos. O grupo denominado tolerante recebeu amendoim ad libitum na dieta

por sete dias, enquanto o grupo imune foi mantido com uma dieta convencional
para murinos. Ambos foram imunizados com 100 mg de extrato protico derivado
do amendoim por via sc. O transplante de corao de BAL/C recm-nato, de 24h,
foi depositado no tecido subcutneo das orelhas dos animais de ambos os grupos,
com ou sem imunizao concomitante do antgeno alimentar.
RESULTADOS: Confirmamos que a administrao de protenas por via oral capaz
de induzir tolerncia sistmica, uma vez que os grupos tolerantes apresentam
ttulos de anticorpos especficos ao amendoim mais baixos que os grupos imunes. O
corao transplantado apresentou-se mais preservado no grupo de animais
C3H/HEJ tolerantes que foram desafiados concomitantemente com o antgeno da
dieta do que os demais grupos.
CONCLUSO: Foi determinado que os mecanismos de tolerncia oral interferem no
processo de rejeio de transplantes cardacos alognicos avasculares para a orelha
de camundongos adultos, no entanto, de maneira no homognea. Como os
mecanismos de tolerncia oral que alteram o sistema imunolgico de modo a
reduzir a rejeio ainda no foram esclarecidos, so precisos mais trabalhos nesta
linha de pesquisa.
Descritores: Tolerncia imunolgica. Transplante, corao. Rejeio de enxerto.
Camundongos.

INTRODUO
Na medicina contempornea, um dos feitos mais notveis foi o transplante de
corao, tendo evoludo desde a experimentao animal, nos primeiros anos do
sculo XX, at um tratamento ortodoxo, aceito para uma ampla variedade de
pacientes com cardiopatia terminal. O primeiro relato, na literatura, de transplante
de rgos foi apresentado por Carrel e Guthrie [1], em 1905, quando foi
transplantado o corao de um filhote para o pescoo de um co maior. Em
dezembro de 1967, Dr. Christian Barnard [2], que havia passado algum tempo com
Lower, na Virgnia, observando o transplante cardaco ortotpico, realizou o primeiro
transplante cardaco entre seres humanos, na Cidade do Cabo, na frica do Sul.
Passados cinco meses, em maio de 1968, foi realizado o primeiro transplante de
corao, no Brasil, pelo Dr. Zerbini [3].
Aps o perodo de entusiasmo pela descoberta da tcnica, o panorama tornou-se
sombrio devido aos insuperveis problemas com a rejeio cardaca, motivo pelo
qual os programas foram temporariamente suspensos. As alteraes prciclosporina foram inicialmente descritas por Billingham, em 1974, que desenvolveu
um sistema de classificao histolgica para rejeio, baseado nas bipsias
endomiocrdicas [4].Embora a infeco e a rejeio sejam as maiores causas de
insucesso nos transplantados, alteraes patolgicas tais como a isquemia, a
fibrose intersticial, a calcificao miocrdica, os infiltrados endomiocrdicos, a
hipertrofia de micitos e a coronariopatia crnica, so complicaes importantes
para a vida prolongada do enxerto. Dentre estas, a ltima a maior ameaa [5].
Durante o processo de rejeio, a presena dos linfcitos T e B, importante. Estes
regulam a secreo dos componentes moleculares que intermediaro a inflamao
responsvel pela rejeio [6]. Apesar da presena marcante de clulas T citotxicas

em um aloenxerto, as clulas TCD4+ so as responsveis por iniciar e orquestrar a

resposta imune deste processo [7].
No mecanismo de rejeio de transplantes, a parte nevrlgica do processo o
reconhecimento das novas molculas do Complexo Principal de
Histocompatibilidade (MHC - Major Histocompatibility Complex), que so as
molculas mais polimrficas de que se tem registro. Para a espcie humana,
podemos utilizar a nomenclatura geral (MHC) ou a especfica HLA (Human
Leucocyte Antigens). Este complexo gnico d origem a dois grupos de protenas
que esto envolvidas diretamente com o reconhecimento celular entre linfcitos e
as clulas do organismo, as molculas de classe I e II [8].
medida que se vai conhecendo a complexidade do sistema imunolgico e os
mecanismos de rejeio, possvel buscar formas e estratgias que consigam
bloque-la. Na rotina clnica, medicamentos com propriedades imunossupressoras
so amplamente utilizados. A ciclosporina A e o FK506 bloqueiam a ativao de
citocinas como IL-2, enquanto a azatioprina e ciclofosfamida inibem o crescimento
de linfcitos. O sirolimo (rapamicina) age bloqueando o crescimento das clulas T
em resposta a IL-2. Outra droga utilizada o glicocorticide que atua sobre as
clulas T, ativando endonucleases que clivam o DNA, levando morte por apoptose.
Os medicamentos imunossupressores mais novos, como, por exemplo, o FK-506
(tacrolimus), so promissores, uma vez que aumentam a imunossupresso,
reduzindo seus efeitos colaterais [9].
O tratamento com anticorpos contra o receptor de clulas T (TCR), administrados
antes da realizao do transplante, uma entre as vrias estratgias pesquisadas
para bloquear a rejeio [10]. Estes produzem um estado de hipo-responsividade
aos aloenxertos cardacos, com a diminuio intra-enxerto de citocinas de tipo Th1
(IL-2 e IFN-g) e conseqente aumento de citocinas de tipo Th2. A sobrevivncia
mais longa est associada inibio da atividade pr-inflamatria Th1. Tambm
nesta linha, o tratamento com anticorpos anti-CD3 e/ou especificamente anti-CD4
tambm prolonga a sobrevivncia de aloenxertos, uma vez que diminui a populao
de linfcitos T, inibindo o infiltrado no enxerto [11-13].
Outro caminho muito promissor no bloqueio da rejeio de transplantes a
utilizao de estratgias que procuram modular as molculas do microambiente
para onde migram os linfcitos efetores. O tratamento antilaminina nos aloenxertos
cardacos, em ratos, promoveu diminuio do acmulo de linfcitos nos linfonodos
de drenagem, bem como no corao transplantado [14], mesmo nos transplantes
cardacos alognicos avasculares de camundongos [15].
Ehrlich [16], em 1900, demonstrou que o sistema imunolgico no reage aos seus
prprios constituintes, mas capaz de reagir com coisas estranhas a ele. Era
preciso, ento, explicar o fato de que em condies normais o sistema imunolgico
no gera auto-agresses, levando a doenas, enquanto capaz de reagir com o
que vem de fora.
Ao contrrio do que comumente pensamos, a maior superfcie de contato com o
meio externo no a pele, mas sim as mucosas, dentre estas, as do tubo digestivo,
que apresenta uma rea cerca de 300 a 600 vezes maior que a da pele [17]. Esta
porta de entrada representa a maior fonte de perturbao da atividade imunolgica
no organismo. No entanto, na maioria das vezes, a penetrao de antgenos por
essa via no determina as respostas imunolgicas classicamente esperadas,
causando, ao contrrio, o fenmeno denominado "tolerncia oral".

Embora no reconhecida como tal, a tolerncia oral foi o primeiro fenmeno com
bases imunolgicas a aparecer na literatura aps o relato de Jenner, em 1798,
sobre a vacinao antivarilica. Embora tenha sido descrito diversas vezes desde o
incio do sculo XIX, para diversas protenas como para a protena do leite, do milho
e do ovo, o fenmeno da tolerncia oral tem sido sistematicamente esquecido ou
negligenciado.
Parte das macromolculas ingeridas absorvida in natura pela mucosa, entrando
em contato direto com os linfcitos intra-epiteliais e das placas de Peyer [18]. A
rpida absoro de macromolculas intactas para a circulao pode ser evidenciada
tanto por mtodos laboratoriais, como clinicamente, onde nas alergias alimentares
levam a manifestaes generalizadas, segundos a minutos aps a ingesto do
alimento alergnico. Existem evidncias de que os organismos tambm se
imunizam para agentes infecciosos atravs das mucosas como, por exemplo, para o
vrus da poliomielite, na qual a vacinao por via oral mostrou-se eficaz [19].
Considerando-se os fatos relatados, ser que poderamos pensar em realizar
transplantes cardacos livres de drogas imunossupressoras, utilizando o mecanismo
de tolerncia oral? Sabamos que o caminho era longo, porm poderamos comear
dando um pequeno passo e, para isso, pensamos em usar um modelo experimental
de implante de corao em camundongo, segundo o modelo proposto por Fulmer et
al. [20], tcnica exeqvel e que no requer grande sofisticao [21]. Assim, o
objetivo geral foi induzir a tolerncia oral e realizar o transplante, com ou sem
estimulao concomitante com o antgeno para o qual foi tolerizado e verificar se os
efeitos indiretos da tolerncia oral impedem ou retardam a rejeio de transplantes
alognicos de corao.

MTODO
Animais
Utilizamos camundongos isognicos criados e mantidos no Ncleo de Animais de
Laboratrio, na Universidade Federal Fluminense (UFF), com rao e gua ad
libitum. Os receptores foram adultos com 6-8 semanas, do sexo masculino, das
linhagens C3H/HeJ e C57Bl/6J e os doadores BALB/C recm-natos com at 24h de
vida.
Cada linhagem de camundongos foi dividida em quatro subgrupos (Tabela 1) com
n=5 (20 C3H/HeJ e 20 C57Bl/6J). As manipulaes animal e imunoqumica foram
realizadas no laboratrio de Imunologia Gastrintestinal do Departamento de
Imunobiologia da UFF. As tcnicas histolgicas foram realizadas no Departamento
de Patologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Protenas do amendoim
As protenas foram extradas de acordo com a metodologia desenvolvida para
extrao de protenas do amendoim [19].
Em resumo, as sementes descascadas foram modas em moedor eltrico, tipo de
caf. O material resultante foi colocado em tubo de 15ml e suspenso em tampo de
extrao (tampo borato pH 9,7), na proporo de 1:10 p/v, sob agitao por
inverso, durante 30 minutos, temperatura ambiente. A seguir, o material foi
centrifugado 5 C e 3000 rpm, durante 30 minutos e o sobrenadante, recolhido. A
concentrao de protenas foi determinada pela tcnica de Lowrey et al. [22].
Induo de tolerncia oral com sementes in natura
Os animais receberam no cocho, junto com a rao, o amendoim, por um perodo
de 7 a 10 dias.
Imunizaes com extratos brutos de amendoim
Na imunizao primria, cada animal recebeu 100g da protena do amendoim mais
1mg de Al(OH)3(adjuvante) em um volume final de 200l por via subcutnea no
dorso. Aps 21-28 dias, os animais receberam a imunizao secundria pela
mesma via e concentrao protica, sem acrscimo do adjuvante.
Sangrias
Foram retirados 200 l de sangue do plexo retro-orbitrio aps 7 dias de exposio
aos antgenos por via parenteral. O sangue foi diludo a 10% v/v em soluo salina.
Aps a retrao dos cogulos, foi centrifugado 1500rpm, os soros recolhidos e
guardados a -20C at serem analisados.
Avaliao dos ttulos de anticorpos antiprotenas das sementes
Para a avaliao dos ttulos de anticorpos antiprotenas do amendoim foi utilizada a
tcnica de ELISA. Placas de microtitulao foram cobertas com 4g de protena em
100 l de PBS por poo e incubados durante 12-18 horas, 4C. Em seguida,
foram lavadas duas vezes com uma soluo de PBS-Tween 0,05% e cobertas com
PBS-gelatina durante 1 hora, temperatura ambiente. Os soros a serem testados
foram diludos e incubados por 3h. Aps lavagem com PBS-Tween, foi adicionado o
anticorpo de cabra anti-cadeia de camundongo, conjugado com peroxidase. Aps
nova incubao de 3h, as placas foram lavadas e foram adicionados 50l da soluo
do substrato (OPD - 4mg, H2O2 - 4l, em 10ml de tampo citrato fosfato). A reao
foi interrompida aps 20 minutos com uma soluo 0,1M de H2SO4. As densidades

pticas foram lidas a 492nm, em um leitor de ELISA (Anthos 2010). A anlise dos
resultados foi realizada pela comparao do somatrio das densidades pticas de
cada soro, denominado de ELISA*.
Transplante de corao no lobo auricular de camundongos
Sob anestesia, os animais foram submetidos anti-sepsia com lcool iodado, em
sentido distal base da orelha. Em seguida, com uma lmina de bisturi, realizou-se
uma pequena inciso anterior, entre a transio da pele com a cartilagem de lobo
auricular, poupando-se os vasos auriculares principais. A partir do local de inciso,
confeccionou-se um tnel subcutneo at o stio de implantao do enxerto, com
auxlio de uma pina de disseco.
O camundongo recm-nascido doador foi acondicionado em recipiente de isopor,
contendo gelo seco e, aps tornar-se ciantico, foi submetido a uma inciso
transversal e longitudinal na regio traco-abdominal anterior, ao que se seguia a
exposio do corao por leve compresso do corpo do animal. O corao foi
retirado com uma pina de ponta delicada, tomando-se o cuidado de no perfurlo. Este foi transferido para uma placa de Petri, contendo gaze embebida em soro
fisiolgico. Finalmente, os enxertos cardacos foram conduzidos por uma pina e
introduzidos atravs do tnel confeccionado sob a pele da orelha do camundongo.
Para concluir, o local de inciso foi brevemente comprimido por uma pina
anatmica, sendo o fechamento realizado por segunda inteno.
Coleta do transplante
Realizada no 15 dia ps-transplante. O animal foi sacrificado, subtendo-o
anestesia profunda. Imediatamente aps a coleta, a orelha foi colocada em um
cassete apropriado para histologia e submerso em soluo de lquido de Holland por
24h e iniciada a incluso em parafina. Os tecidos fixados e cortados foram corados
por hematoxilina-eosina (HE).
Avaliao histolgica
Cada lmina foi avaliada em duas oportunidades com intervalo de uma semana,
com vista panormica, aumento de 100x e 400x, anotando-se as caractersticas em
cada leitura das lminas, visando diminuir a subjetividade. Cada lmina foi lida
levando-se em considerao quatro parmetros: ndulo, infiltrado perifrico,
infiltrado central ou massa e tecido de granulao.
Ndulo - tamanho do espcime, que se refere ao tamanho do enxerto. O
dimetro foi medido em milmetros.
Infiltrado perifrico - A intensidade da celularidade na periferia dos enxertos
foi medida de forma subjetiva em cruzes de 0 a 4 (zero a quatro cruzes), onde o
zero equivale a nenhuma infiltrao e 4, infiltrao mxima (0 a 4+).
Infiltrado central - A intensidade do infiltrado linfocitrio no enxerto
propriamente dito tambm foi medida de forma subjetiva de zero a quatro cruzes
(0 a 4+), utilizando o mesmo critrio.
Tecido de granulao - o parmetro referente substituio do enxerto
destrudo por tecido de granulao (este um estgio mais avanado e agressivo
da rejeio). Da mesma forma, a medio foi subjetiva de zero a quatro cruzes (0 a
4+), onde zero equivale ausncia de granulao e 4, granulao mxima.

Avaliao estatstica
Foi utilizado o teste estatstico de Tukey com significncia mnima de p<0,05.

RESULTADOS
Clinicamente no observamos diferenas marcantes entre os grupos de cada
linhagem, no entanto, aps o procedimento cirrgico do transplante nas orelhas, os
camundongos da linhagem C57BI/6J ficaram mais agitados e sensveis
manipulao do que os animais da linhagem C3H/HeJ, e assim permaneceram at
serem sacrificados.
Tolerizao e imunizao com antgenos do amendoim
A Figura 1 mostra que os animais imunes apresentaram ttulos de anticorpos antiamendoim significativamente mais elevados que os controles normais e tolerantes.
Os animais C57Bl/6J que receberam amendoim na dietaad libitum, antes das
imunizaes, apresentam ttulos de anticorpos especficos para o amendoim
significativamente menores do que aqueles que foram imunizados e que no
comeram o amendoim, mas sem diferena significativa para os animais normais. Da
mesma forma, os animais C3H/HeJ que receberam amendoim na dieta ad libitum,
antes das imunizaes, apresentam ttulos de anticorpos especficos para o
amendoim significativamente mais baixos do que aqueles que foram imunizados e
que no comeram o amendoim. Diferente dos C57Bl/6J, h diferena significativa
dos animais tolerantes para os animais normais.

Avaliao histolgica
O infiltrado perifrico sempre misto, composto de clulas polimorfonucleares,
macrfagos e mononucleares. AFigura 2 demonstra que camundongos C3H/HeJ do
grupo tolerante apresentam um infiltrado perifrico significativamente menor
(p<0,001) do que os animais imunes e normais, bem como menos tecido de
granulao ao redor do enxerto, sugerindo que o enxerto demorou mais a ser
invadido pelas clulas da resposta imunitria e, portanto, o processo de rejeio se
instalou de forma mais tardia.

Quanto ao infiltrado central, o grupo de camundongos C3H/HeJ, tolerantes, foi

menos evidente na massa central, indicando que o enxerto foi protegido e a
rejeio demorou em aparecer. Este achado sugere que o enxerto estava em um
estgio mais conservado, corroborando com os dados anteriores de que animais
tolerantes ao amendoim e que foram imunizados concomitantemente realizao
do enxerto apresentam mecanismos protetores do enxerto.
Quanto aos enxertos realizados nos camundongos C57Bl/6J, a Figura 3 demonstra
que os ndulos de enxerto e os infiltrados perifricos se mantiveram com tamanhos
aproximados entre os grupos tolerantes, normais e imunes, portanto, sem

diferenas significativas. O infiltrado central foi mais evidente, sugerindo que, ao

contrrio dos animais C3H/HeJ, o enxerto no foi protegido do processo de rejeio,
portanto no diferindo dos animais imunes. Nesta figura, o que diferente do
esperado o grupo normal que, sem contato algum com a imunizao com
amendoim, apresentou menos tecido de granulao no enxerto, demonstrando que
o enxerto estava em um estgio mais conservado do que nos demais grupos,
sugerindo que a tolerncia nesta linhagem no teve papel protetor como na
linhagem C3H/HeJ.

Nas Figuras 4 e 5, analisamos o tecido de granulao nas linhagens de

camundongos C3H/HeJ e C57Bl/6J. Nas duas linhagens, os animais tolerantes
apresentaram menor quantidade de tecido de granulao que os demais grupos. O
grupo tolerante C3H/HeJ apresentou menor infiltrado perifrico, infiltrado central e
tecido de granulao, quando comparado aos outros grupos da mesma linhagem e
tambm em comparao aos camundongos da linhagem C57Bl/6J. Este fato
certamente se explica por uma menor reao ao enxerto no grupo de tolerantes
C3H/HeJ. No grupo de tolerantes C57Bl/6J, tambm poderamos esperar esta
resposta, porm a mesma no foi evidenciada. Cabe ressaltar que o tecido de

granulao nos animais tolerantes menor que nos grupos imunes e normais e o
tecido central maior. O fato de terem menos tecido de granulao, que o estgio
mais avanado de rejeio, sugere melhor grau de proteo. Se os espcimes
fossem obtidos com menos tempo (10-12 dias), talvez fosse mais evidente esta
diferena.

DISCUSSO
O transplante de tecidos para substituir rgos doentes , atualmente, uma
importante terapia mdica. O transplante ortotpico do corao representa um
procedimento rotineiro no tratamento da insuficincia cardaca terminal.
Atualmente, trs mil transplantes so realizados a cada ano no mundo. A sobrevida
do receptor aps o transplante cardaco cerca de 80% em um ano e 65% em
cinco anos. Na mdia, a sobrevida tem sido estimada em 8,5 anos e, quando

calculada para os receptores que permanecem vivos ao final do primeiro ano,

atinge onze anos [23].
Nesse experimento, ao fazermos aloenxerto de corao de camundongo de uma
linhagem para outra, queremos contribuir para que este sonho se realize no futuro
com melhor sobrevida que os j relatados. Aqui esto includos o transplante, a
rejeio e a tolerncia, tudo isto no meio do complexo inteligente e ainda no bem
compreendido sistema imunolgico.
Consideramos a tolerncia a tecidos prprios e no-prprios como aspectos do
mesmo mecanismo bsico, que consiste na induo direta de tolerncia na
periferia, por deleo, anergia ou ignorncia imunolgica (neste ltimo, as clulas T
e antgenos coexistem sem se afetarem mutuamente). Finalmente, existem
mecanismos que envolvem as interaes entre os vrios tipos de clulas T
regulatrias.
Primeiramente falaremos sobre a tolerncia. Como o nome indica, tolerar aceitar
ou incluir algo como prprio. No sistema imunolgico, h a tolerncia central que
estabelecida durante o desenvolvimento dos linfcitos nos rgos linfides centrais,
durante o processo de desenvolvimento ou maturao e a tolerncia perifrica, que
adquirida pelos linfcitos maduros, j nos rgos perifricos. Existe, ainda, a
tolerncia aos antgenos que entram no organismo pelas mucosas. Esta forma de
tolerncia conhecida por tolerncia oral.
Optamos por trabalhar com a tolerncia oral na tentativa de atingir o objetivo de
realizar transplantes sem utilizao de drogas imunossupressoras. Dos trs grupos
de camundongos, apenas os animais que ingeriram amendoim antes da imunizao
se tornaram tolerantes. Estado que foi constatado pela mensurao dos anticorpos
por ELISA, onde o ttulo menor de anticorpos foi estatisticamente significante,
quando comparado aos demais grupos. Este fenmeno j foi demonstrado
claramente na linha de pesquisa de vrios investigadores, como Teixeira [19].
Quando expandimos este experimento para os animais de outras linhagens, este
fenmeno se repete se comparamos com animais da mesma linhagem que foram
imunizados, mas no tiveram a exposio oral prvia. No entanto, observamos uma
diferena importante na concentrao de anticorpos entre as linhagens. Devemos
ressaltar que existe diferena nos ttulos de anticorpos entre as linhagens de
camundongos C57BL/6J e C3H/HeJ, sendo que os ltimos apresentam ttulos mais
altos de anticorpos de modo generalizado.
Restava agora saber se esta tolerncia podia de alguma forma influenciar no
sistema imunolgico. Ento, o desafio deste trabalho consistiu em fazer o
transplante avascular alognico de corao, na orelha de camundongo, nos grupos
previamente tolerizados, medidos pelo grau de rejeio que os diferentes grupos
apresentaram.
Nos experimentos realizados com camundongos da linhagem C57Bl/6J, vimos que
embora no haja muita diferena nos parmetros de infiltrado perifrico e central,
houve uma diferena quanto ao tecido de granulao que, de certa forma, traduz
uma etapa mais avanada de rejeio e, neste caso, o grupo tolerante menos
afetado. Talvez se o sacrifcio dos animais tivesse sido feito no oitavo ou dcimo
dia, esta diferena se confirmasse no infiltrado central e perifrico tambm.
Estamos em fase de reelaborao do experimento na tentativa de responder a esta
e a outras perguntas.

Uma das explicaes para que camundongos C3H/HEJ apresentem ttulos de

anticorpos mais elevados para as protenas das sementes, mesmo nos animais
tolerantes, pode ser o fato destes animais apresentarem alteraes genticas (no
apresentam o receptor Toll-4, portanto, no respondem ao LPS lipopolissacardeo). Uma segunda explicao para os altos nveis de anticorpos
vistos nestes animais pode ser aquela proposta por Caramalho et al. [24], que
demonstraram que as clulas T CD4 regulatrias so capazes de controlar
negativamente as reaes inflamatrias estimuladas por bactrias comensais e
patgenos oportunistas. Este mecanismo regulatrio pode se dar atravs da
ativao de molculas pr-inflamatrias do prprio sistema imunitrio ou
diretamente pelos produtos bacterianos.
Caramalho et al. [24] testaram a segunda hiptese, ou seja, a hiptese de que a
populao de linfcitos regulatrios ativada por receptores de linha germinativa,
entre estes, os receptores Toll-like (TLR), uma das molculas reconhecedoras de
padres moleculares, tpicas da superfcie destes microorganismos. Estes autores
demonstraram que a populao linfocitria que exerce a funo regulatria, as
clulas T CD45RB(low) CD25(+), expressa seletivamente os TLR-4, -5, -7, e -8 e,
quando expostas ao ligante de TLR-4, o lipopolissacardeo (LPS), ocorre uma
regulao positiva da expresso de vrias molculas de ativao celular, alm de
aumentar sua capacidade proliferativa e de sobrevida. Esta proliferao ocorre de
forma independente da clula apresentadora de antgenos, mas intensificada pela
estimulao do receptor para antgenos (TCR) e estimulao pela IL-2. Outro ponto
importante demonstrado por Caramalho et al. [24] que o tratamento de clulas T
CD4(+) CD25(+) com LPS aumenta em uma ordem de grandeza sua eficincia
supressora. Esta atividade supressora quando testada ex-vivo no encontrada na
subpopulao CD4(+) CD45RB(low) CD25( ). Outro achado interessante deste
grupo o fato de que clulas T regulatrias ativadas com LPS controlam
eficientemente clulas T naive nas doenas consumptivas. Assim, estes autores
demonstram que linfcitos T regulatrios podem ser diretamente ativados por
produtos bacterianos pr-inflamatrios, contribuindo, dessa maneira, para o
controle do processo inflamatrio e retorno ao estado de homeostasia de cada
tecido.
Nossa hiptese com relao aos camundongos C3H/HeJ de que a no ativao da
populao de clulas T regulatrias pela falta do TLR-4 seja responsvel pelos altos
nveis de imunoglobulinas sricas, tanto nos animais tolerantes como imunes. Os
resultados preliminares indicam que animais tolerantes apresentam mecanismos de
regulao alternativos aos classicamente descritos.
As respostas imunes so barreiras importantes contra a eficcia dos transplantes de
tecidos, destruindo-os por meio de uma resposta imune adaptativa a protenas
estranhas. Essas respostas podem ser mediadas por clulas TCD8 citotxicas, por
clulas Th1 ou por ambas.
As clulas T efetoras alorreativas, que se ligam diretamente s molculas
alognicas MHC de classe 1 em transplante de rgos, so uma causa importante
da rejeio ao enxerto. Isso denominado alorreconhecimento direto. Antes que
possam causar rejeio, as clulas T virgens alorreativas devem ser ativadas por
clulas apresentadoras de antgenos (APCs), que apresentam as molculas
alognicas e possuem atividades co-estimulatrias.
Um segundo mecanismo de reconhecimento do aloenxerto, que pode levar
rejeio do mesmo, a captao de protenas alognicas pelas clulas
apresentadoras de antgenos e sua apresentao s clulas T por molculas do
prprio MHC. Isto reconhecido como alorreconhecimento indireto.

Estas respostas podem levar rejeio. Como no podemos suprimir

especificamente a resposta ao enxerto, sem comprometer as defesas do
hospedeiro, a maioria dos transplantados requer imunossupresso generalizada, o
que pode causar toxicidade significativa e aumentar o risco de neoplasias e
infeco. O feto um aloenxerto natural que deve ser aceito, e sua funo quase
sempre para a sobrevivncia da espcie. A tolerncia ao feto pode ser a chave para
a tolerncia especfica aos enxertos ou pode ser um caso especial no aplicvel
terapia de substituio de rgos.
No transplante alognico do corao, assim como em outros rgos, os antgenos
HLA so os principais indutores da resposta imune contra o enxerto. Estas
molculas desempenham um papel fundamental na resposta imunitria, sendo as
responsveis pela apresentao de peptdeos antignicos aos linfcitos.
O conceito atual de ativao de linfcitos baseado no modelo de "dois sinais",
proposto originalmente por Bretscher & Cohn [25] em relao sntese de
anticorpos. Em seguida, esta teoria foi adaptada para a ativao de clulas T. O
primeiro sinal desencadeado pela ligao do receptor de clulas T (TCR, de T Cell
receptor) ao complexo MHC-peptdeo antignico que participa na transduo do
primeiro sinal. O segundo sinal, ou sinal co-estimulatrio desencadeado pela
interao entre molculas da superfcie das APCs e seus ligantes na superfcie de
clulas T.
Os linfcitos T so classificados em dois subtipos, de acordo com a expresso das
molculas CD4 ou CD8, na superfcie celular. Aproximadamente 65% das clulas
Tb+ expressam CD4 e 35% expressam CD8. As respostas das clulas TCD4+ so
restritas s molculas do MHC de classe II, enquanto as clulas TCD8+reconhecem
antgenos no contexto de MHC de classe I. Estas se diferenciam em clulas efetoras
citotxicas (CTL).
A rejeio crnica do aloenxerto cardaco responsvel por 23 a 30% das mortes
aps o primeiro ano de transplante e caracterizada por uma resposta difusa e
proliferativa da ntima das artrias do rgo transplantado. A rejeio crnica
parece ter incio aps o alorreconhecimento do endotlio do enxerto, com
subseqente infiltrao de linfcitos e produo de citocinas, quimiocinas e fatores
de crescimento. Em camundongos CD4- ou em camundongos atmicos (nude), no
h leses da ntima dos vasos em coraes transplantados, demonstrando, assim,
que as clulas CD4 tm a capacidade de promover sozinhas a rejeio ao enxerto
cardaco [26].
Todas estas pesquisas e descobertas nos fazem compreender em parte quo
misterioso e complexo so os mecanismos de defesa e rejeio. Certamente no
grupo tolerizado, especialmente nos camundongos C3H/HeJ se conseguiu retardar o
mecanismo de rejeio. Nestes camundongos, que foram alimentados com semente
de amendoim antes das imunizaes sistmicas, observa-se a tolerncia. Este
grupo o mais interessante porque nos mostra mais claramente que o mecanismo
de rejeio foi mais leve que nos grupos imunes e normais. Esses resultados
mostram que existem muitos caminhos para bloquear a resposta imunolgica. O
experimento simples e no temos autoridade para falar em que nvel o sistema foi
temporariamente bloqueado, j que existem vrias maneiras para se desenvolver a
rejeio. Se a rejeio ocorreu por via direta ou indireta, se foi em nvel de clulas
CD4 ou CD8, certamente estamos falando em vias de especulaes tericas. Os
autores concordam que este um mar aberto para este tipo de pesquisa.
Assim, podemos concluir que embora no houvesse preservao total do enxerto, a
tolerncia oral influenciou na capacidade de reagir aos componentes externos,

neste caso, o enxerto alognico. Na reviso bibliogrfica, no encontramos estudos

sobre tolerncia oral e transplante. Isto nos permite dizer que nosso trabalho
original, mesmo considerando este pequeno experimento.
Com respeito tcnica, podemos afirmar o que outros autores j constataram que
uma tcnica simples e que pode ser reproduzida.

CONCLUSES
Podemos concluir com este trabalho que, embora no de forma homognea, a
tolerncia oral interfere nos mecanismos de rejeio de coraes alognicos
transplantados de forma ectpica em murinos, sugerindo um papel importante para
as clulas T regulatrias caractersticas do processo de tolerncia.

REFERNCIAS
1. Carrel A, Guthrie C. The transplantation of veins and organs. Am Med.
1905;10:1101.
[ Links ]
2. Barnard CN. The operation. A human cardiac transplant: an interim report of a
successful operation performed at Groote Schuur Hospital, Cape Town. S Afr Med J.
1967;41(48):1271-4.
[ Links ]
3. Decourt LV, Zerbini JE. Transplante de corao humano: consideraes sobre trs
casos. Rev Hosp Clin Fac Med So Paulo. 1970;25(4):207-26.
[ Links ]
4. Billingham ME. Some recent advances in cardiac pathology. Hum Pathol.
1979;10(4):367-86.
[ Links ]
5. Pomerance A, Stovin PG. Heart transplant pathology: the British experience. J
Clin Pathol. 1985;38(2):146-59.
[ Links ]
6. Mason DW, Dallman MJ, Arthur RP, Morris PJ. Mechanisms of allograft rejection:
the roles of cytotoxic T-cells and delayed-type hypersensitivity. Immunol Rev.
1984;77:167-84.
[ Links ]
7. Bishop DK, Shelby J, Eichwald EJ. Mobilization of T lymphocytes following cardiac
transplantation. Evidence that CD4-positive cells are required for cytotoxic T
lymphocyte activation, inflammatory endothelial development, graft infiltration, and
acute allograft rejection. Transplantation. 1992;53(4):849-57.
[ Links ]
8. Auchincloss Jr. H, Sultan H. Antigen processing and presentation in
transplantation. Curr Opin Immunol. 1996;8(5):681-7.
[ Links ]
9. Second International Workshop on FK 506. A potential breakthrough in
immunosuppression: clinical implications. October 31, 1989, Barcelona, Spain.
Proceedings. Transplant Proc. 1990;1:5-113.
[ Links ]

10. Tsuchida M, Hirahara H, Matsumoto Y, Abo T, Eguchi S. Induction of specific

unresponsiveness to cardiac allografts by short-term administration of anti-T cell
receptor alpha beta antibody. Transplantation. 1994;57(2):256-62.
[ Links ]
11. Goldstein G. Overview of the development of Orthoclone OKT3: monoclonal
antibody for therapeutic use in transplantation. Transplant Proc. 1987;19(2 suppl.
1):1-6.
[ Links ]
12. Heidecke CD, Hancock WW, Westerholt S, Sewczik T, Jakobs F, Zantl N et al.
Alpha/beta-T cell receptor-directed therapy in rat allograft recipients. Long-term
survival of cardiac allografts after pretreatment with R73 mAB is associated with
upregulation of Th2-type cytokines. Transplantation. 1996;61(6):94856.
[ Links ]
13. Binder J, Lehmann M, Graser E, Hancock WW, Watschinger B, Onodera K et al.
The effects of nondepleting CD4 targeted therapy in presensitized rat recipients of
cardiac allografts. Transplantation. 1996;61(5):804-11.
[ Links ]
14. Kupiec-Weglinski JW, De Sousa M. Lymphocyte traffic is modified in vivo by antilaminin antibody. Immunology. 1991;72(2):312-3.
[ Links ]
15. Rieder I. Rejeio de transplante cardaco alognico em camundongos:
envolvimento da laminina. In: Biologia celular e molecular. Rio de Janeiro:Instituto
Oswaldo Cruz;2002.
[ Links ]
16. Ehrlich P. The collected papers of Paul Ehrlich. New York;1901.

[ Links ]

17. Moog F. The lining of the small intestine. Sci Am. 1981;245(5):15462.
[ Links ]
18. Pappo J, Ermak TH. Uptake and translocation of fluorescent latex particles by
rabbit Peyer's patch follicle epithelium: a quantitative model for M cell uptake. Clin
Exp Immunol. 1989;76(1):144-8.
[ Links ]
19. Teixeira GAPB. Um modelo murino de inflamao intestinal crnica tolerncia e
imunizao oral: antigenicidade versus temporalidade. In: Patologia.
Niteri:Universidade Federal Fluminense;2003. p.239.
[ Links ]
20. Fulmer RI, Cramer AT, Liebelt RA, Liebelt AG. Transplantation of cardiac tissue
into the mouse ear. Am J Anat. 1963;113:273-85.
[ Links ]
21. Simes AP. Reproduo de um modelo experimental de enxerto de corao em
orelha de camundongo. HU Revista. 1998;24:11-5.
[ Links ]
22. Lowrey JL, Savage ND, Palliser D, Corsin-Jimenez M, Forsyth LM, Hall G et al.
Induction of tolerance via the respiratory mucosa. Int Arch Allergy Immunol.
1998;116(2):93-102.
[ Links ]
23. Hosenpud JD, Bennett LE, Keck BM, Fiol B, Novick RJ. The Registry of the
International Society for Heart and Lung Transplantation: Fourteenth official report1997. J Heart Lung Transplant. 1997;16(7):691-712.
[ Links ]
24. Caramalho I, Lopes-Carvalho T, Ostler D, Zelenay S, Haury M, Demengeot J.
Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by
lipopolysaccharide. J Exp Med. 2003;197(4):403-11.
[ Links ]

25. Bretscher P, Cohn M. A theory of self-nonself discrimination. Science.

1970;169(950):1042-9.
[ Links ]
26. Fischbein MP, Yun J, Laks H, Irie Y, Fishbein MC, Bonavida B et al. Role of CD8+
lymphocytes in chronic rejection of transplanted hearts. J Thorac Cardiovasc Surg.
2002;123(4):803-9.
[ Links ]