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ESCOLA DE VETERINRIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL
GOINIA
2006
ii
rea de Concentrao:
Sanidade Animal
Orientador:
Prof. Dr. Albenones Jos de Mesquita CPA, UFG
Comit de Orientao:
Prof. Dra. Iolanda Aparecida Nunes CPA, UFG
Prof. Dra. Wilia M. E. D. de Brito IPTSP, UFG
GOINIA
2006
iii
AGRADECIMENTOS
Para quem veio de outro pas e ficou quatro anos desenvolvendo este
trabalho praticamente impossvel fazer uma lista de todas as pessoas e
instituies que contriburam para realizao do mesmo. A Energia Universal
manifestou-se brindando apoio em todas as formas possveis, desde o trabalho
da Taq DNA polimerase at na forma de inmeras pessoas e Instituies.
Assim sendo, quero expressar meu reconhecimento especial para:
CAPES, que na celebrao do Convnio com a Universidade de la
Repblica do Uruguai fez possvel a realizao deste doutorado.
Universidade Federal de Gois, que abriu as portas para a realizao
deste trabalho.
Universidade de la Repblica do Uruguai, e especialmente Facultad de
Veterinria, e Instituto de Investigaciones Pesqueras.
Escola de Veterinria da UFG, e especialmente ao Programa de Psgraduao em Cincia Animal.
Ao Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinria que foi
minha casa durante este perodo.
Aos Professores e funcionrios, especialmente meu orientador Prof. Dr.
Albenones Jos de Mesquita pelo apoio constante e principalmente pela amizade
e sua qualidade humana.
Aos colegas da ps-graduao pelo bom companheirismo, apoio e estimulo
recebido.
minha famlia pela difcil tarefa de convivncia com um ps-graduando.
iv
SUMRIO
CAPITULO 1 1 CONSIDERAES GERAIS ..........................................
2 REVISO DA LITERATURA .........................................................................
3 OBJETIVOS ..................................................................................................
REFERNCIAS.................................................................................................
CAPITULO 2 CARACTERIZAO DE RANAVIRUS
ISOLADOS DE
GIRINOS DE R TOURO (Rana catesbeiana Shaw, 1802)
EM RANRIOS COMERCIAIS .......................................
RESUMO .........................................................................................................
ABSTRACT ......................................................................................................
1 INTRODUO...............................................................................................
2 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................
2.1 Amostras de Vrus .....................................................................................
2.2 Isolamento de vrus ...................................................................................
2.3 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
2.4 Seqenciamento ........................................................................................
3 RESULTADOS ..............................................................................................
3.1 Isolamento em cultura de clulas .............................................................
3.2 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
3.3 Seqenciamento ........................................................................................
4 DISCUSSO E CONCLUSES ..................................................................
REFERNCIAS ................................................................................................
CAPITULO 3 RANAVRUS ASSOCIADOS A MORTANDADE DE GIRINOS
(Rana catesbeiana Shaw, 1802) DE CRIAO INTENSIVA
NO BRASIL. ...................................................................
RESUMO .........................................................................................................
ABSTRACT ......................................................................................................
1 INTRODUO ..............................................................................................
2 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................
2.1 Amostragem de girinos ..............................................................................
2.2 Anlise Microbiolgica ...............................................................................
2.3 Histopatologia ............................................................................................
2.4 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
2.5 Microscopia eletrnica de transmisso ......................................................
2.6 Parasitologia ..............................................................................................
3 RESULTADOS ..............................................................................................
3.1 Epizootiologia ............................................................................................
3.2 Evidncias clnicas ....................................................................................
3.3 Necrpsia ...................................................................................................
3.4 Histopatologia ............................................................................................
3.5 Microbiologia .............................................................................................
3.6 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
3.7 Parasitologia ..............................................................................................
3.8 Microscopia eletrnica de transmisso.......................................................
4 DISCUSSO E CONCLUSES ..................................................................
4.1 Infeco em girinos jovens
4.2 Infeco em girinos na pr-metamorfose
REFERNCIAS ....
CAPITULO 4 QUADROS INFECCIOSOS EM RS DE CRIAO (Rana
catesbeiana Shaw, 1802) NA FASE PS-METAMRFICA
EM RANRIOS COMERCIAIS. .................................................
RESUMO .........................................................................................................
ABSTRACT ......................................................................................................
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1 INTRODUO ..............................................................................................
2 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................
2.1 Amostragem das rs ..................................................................................
2.2 Microbiologia ..............................................................................................
2.3 Histopatologia ............................................................................................
2.4 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
2.5 Microscopia eletrnica de transmisso .....................................................
2.6 Protenas sricas totais .............................................................................
2.7 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis .................................
2.8 Reproduo da Doena ............................................................................
3 RESULTADOS ............................................................................................
3.1 Epizootiologa ...........................................................................................
3.2 Sinais Clnicos ..........................................................................................
3.3 Achados de necropsia .............................................................................
3.4 Histopatologia .........................................................................................
3.5 Microbiologia ..............................................................................................
3.6 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
3.7 Microscopia eletrnica de transmisso ......................................................
3.8 SDS page das protenas sericas totais ......................................................
3.9 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis ..................................
3.10 Reproduo da doena ............................................................................
4 DISCUSSO E CONCLUSES ...................................................................
REFERNCIAS ..............................................................................................
CAPITULO 5 PROCESSO INFECCIOSO SUPER AGUDO SEMELHANTE
AO CHOQUE ENDOTXICO EM RS DE CRIAO (Rana
catesbeiana Shaw, 1802)
RESUMO .........................................................................................................
ABSTRACT ......................................................................................................
1 INTRODUO ..............................................................................................
2 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................
2.1 Amostragem das rs ..................................................................................
2.2 Anlise Histopatologica ..............................................................................
2.3 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
2.4 Anlise Microbiolgica ...............................................................................
2.5 Microscopia eletrnica de transmisso ......................................................
2.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis ..................................
3 RESULTADOS ..............................................................................................
3.1 Necrpsia ...................................................................................................
3.2 Histopatologia ............................................................................................
3.3 Microbiologia ..............................................................................................
3.4 Reao em cadeia da polimerase (PCR) ..................................................
3.5 Microscopia eletrnica de transmisso ......................................................
3.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis .................................
4 DISCUSSO E CONCLUSES ...................................................................
REFERNCIAS ...............................................................................................
CAPITULO 6 CONSIDERAES FINAIS .............................................
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144
vi
RESUMO
A presena de enfermidades tem inviabilizado a produo nos ranrios
constituindo um dos principais fatores limitantes para o crescimento da atividade.
Objetivou-se com o presente estudo determinar o papel dos vrus da Famlia
Iridoviridae gnero Ranavirus nas doenas de importncia econmica nos
ranrios comerciais, visando relacionar sua eventual presena com os quadros
clnicos observados. Para tanto, foram realizados estudos envolvendo as fases de
girino e de r, pesquisando os agentes etiolgicos, a epizootiologa das doenas,
a sintomatologia clnica, a anatomia patolgica macroscpica, a histopatologia, a
bacteriologia convencional, e a virologia, sendo esta por meio do emprego de
tcnicas moleculares, cultura de clulas e a microscopia eletrnica de
transmisso. Foi diagnosticada pela primeira vez em rs de criao do Brasil, uma
doena especfica que acomete girinos de at 30 dias de idade, determinada por
um vrus da Famlia Iridoviridae, gnero Ranavirus. O quadro, de tipo super
agudo, caracterizou-se por surtos de morbidade e mortalidade acima de 90% da
populao do ranrio. Clinicamente foram observados girinos com edemas e
ascite, assim como girinos finos ou emaciados. As leses localizaram-se
principalmente no fgado e nos rins, com destruio quase completa do
parnquima. Nenhum agente bacteriano pde ser incriminado na etiologia da
enfermidade. Observou-se uma homologia de quase 100% nas regies
seqenciadas do genoma entre o vrus isolado no Brasil com aquelas do Frog
Virus 3, indicando que o agente pode ter sido introduzido no pas pelas rs
importadas de Amrica do Norte. Formas clnicas diferentes foram observadas
nos girinos no perodo pr-metamorfose e nas rs, as que podem ser considerada
como Septicemia estreptoccica secundria devido abundante presena de
cocos Gram-positivos associados s leses. A morte foi conseqncia da
septicemia associada ao comprometimento funcional de rgos vitais como fgado
e rins. Foi identificado um quadro super agudo nas rs, sugerindo, a presena de
uma sndrome semelhante ao choque sptico. A sndrome denominada de perna
vermelha no foi observada em nenhuma das rs estudadas.
Palavras-chave: Aqicultura, estreptococos, ranicultura, septicemias, ranavrus.
vii
ABSTRACT
Diseases are an important limiting factor for frog farming development. This study
was developed to determine the role of virus of the Iridoviridae Family, genus
Ranavirus in economically important diseases affecting farmed frogs, aiming to
find relationships among these viruses and the clinical syndromes observed.
Studies had been carried out with frogs and tadpoles searching for etiological
agents, the epizootiology of the diseases, clinical symptoms, macroscopic
anatomo-pathology, histopathology, conventional bacteriology and virology by
molecular techniques, cell culture and transmission electron microscopy. A
specific illness affecting tadpoles up to 30 days old was characterized for the first
time in farmed frogs of Brazil. The etiological agent is a virus of the Iridoviridae
Family, genus Ranavirus. The syndrome is characterized by sudden outbreaks of
morbidity and mortality above of 90% of the farm population. Clinically, swollen
tadpoles with edemas and ascites were observed, as well as thin or emaciated
ones. Lesions were located mainly in liver and kidneys, with almost complete
tissue destruction. No bacterial agents could be incriminated in the etiology of the
disease. An homology of almost 100% was detected into the genomic areas
studied of the Brazilian virus, when compared with those of Frog Virus 3, indicating
that the agent may have been carried by the frogs from North America. Another
disease was found affecting tadpoles reaching the pre-metamorphic period and
frogs. The disease should be considered as a "secondary streptococci septicemia"
due to the abundance of Gram-positive cocci associated with the observed
lesions. Death was consequence of the septicemia, associated with the functional
damage of the liver and kidneys. A super acute syndrome was identified in frogs
suggesting the presence of septic shock like syndrome. The so-called "red leg
syndrome" was not observed in any of the frogs.
Keywords: Aquaculture, frog farming, septicemia, streptococci, ranavirus.
CAPITULO 1
1 CONSIDERAES GERAIS
A
aqicultura
na
Amrica
do
Sul
tem
experimentado
um
no ano 2000, e o fim das atividades no ano 2005 do maior ranrio do Brasil
situado no Municpio de Hidrolndia, so exemplos relevantes.
Sendo a ranicultura uma atividade relativamente nova, a experincia no
estudo cientfico das doenas em rs de criao ainda pode ser considerada
muito escassa, pois os produtores no tem conhecimento dos agentes etiolgicos
envolvidos e conseqentemente das medidas profilticas e teraputicas
apropriadas.
As descries relativas a mortalidades generalizadas em ranrios,
citam quadros de ascite e edemas em girinos e rs. Estes quadros podem estar
ou no acompanhados de sintomatologia nervosa e, s vezes, as mortes ocorrem
de forma sbita. fato comum que num mesmo surto ocorram os diversos
quadros clnicos que compem a sndrome.
Apesar da importncia econmica, diversos fatores tm dificultado o
estudo cientfico destas doenas, principalmente a inespecificidade dos sinais
clnicos em anfbios, bem como as condies particulares de manejo e
alimentao
artificial
que,
muito
provavelmente,
constituem
causas
2 REVISO DA LITERATURA
Surtos de doenas com alta mortalidade, caracterizados clinicamente
por edemas e ascite, com ou sem sintomatologia nervosa, tm sido observados
reiteradamente em girinos e rs de criao.
No que pese essas doenas terem sido objeto de diversos estudos nas
ltimas dcadas, estes foram direcionados principalmente identificao dos
agentes envolvidos em surtos ou episdios de mortalidade maior que a esperada,
seja na fase de girino ou na adulta (AMBROSKY et al., 1983; HIPLITO et al.,
1987, 1988a, b; BARROS et al., 1988; CARNEVIA & MAZZONI, 1988;
GUIMARAES et al., 1988; MOREIRA et al., 1988; SOUZA, 1988; PINHEIRO,
1989; MAGALHAES, 1991a, b, c, 1992; MAGALHAES et al., 1992; SILVA et al.,
1993, 1997; HIPLITO, 1995; MARTINS et al., 1995; FIORIO et al., 1997;
HIPLITO, 1997; LIMA & VALLES, 1997; LIMA et al., 1997; MORAES et al.,
1997; FERREIRA et al., 1998; HIPLITO, 1999; HIPLITO et al., 2000a; MAUEL
et al., 2002; PASTERIS et al. 2006). Somente em uma oportunidade foi realizada
pesquisa de vrus pela microscopia eletrnica (HIPOLITO et al., 2000). Em todos
os outros trabalhos, os diagnsticos concentraram-se exclusivamente no achado
de agentes parasitrios ou bacterianos, no sendo realizado um estudo dos
surtos no intuito de estabelecer o papel etiolgico dos agentes detectados e
outros aspectos das doenas que permitam a elaborao de medidas de
preveno e/ou controle. Em reviso, HIPLITO (2002) constatou que a maioria
dos trabalhos tratava de comunicados efmeros, no tendo continuidade no
estudo do caso.
As septicemias tm sido reportadas como a causa mais importante de
mortalidade em anfbios, sendo freqente o achado de animais mortos sem
sintomas premonitrios (CRAWSHAW, 1994). Porm existe ainda grande
incerteza em relao s caractersticas destas patologias. Nos estudos e
publicaes realizados desde o final do sculo XIX at o ano 1995, a maioria dos
trabalhos de diagnstico identificou bactrias como responsveis pelos surtos.
Estes estudos incluram a denominao de uma patologia chamada de perna
vermelha ou red leg. A patologia considerada como um complexo
microbiolgico ou sndrome, e foi apontada como a doena de maior importncia
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Objetivou-se com o presente trabalho determinar o papel dos vrus da
Famlia Iridoviridae, gnero Ranavirus, nas doenas de importncia econmica
em ranrios comerciais do Estado de Gois, bem como caracterizar as formas
clnicas das mesmas.
10
REFERNCIAS
11
12
13
34.
GUAYASAMIN, J.M.; BONACCORSO, E.; SPEARE, R.; MENDEZ, D. The
roles of climatic variation and pathogenic fungus in declining populations of
Aletopus cruciger (Anura: Bufonidae) in Venezuela. In:. Abstracts of the Joint
Meeting of the American Society of Ichthyologists and Herpetologists, 2002
[on line] Herpetologists' League, and Society for the Study of Amphibians and
Reptiles,
Kansas
City,
USA.
Disponvel
em:
http://www.asih.org/meetings/2002/Abstracts.pdf. Acesso em: 21 jan. 2003.
35.
GUIMARAES,N.; SILVEIRA,W.; RODRIGUES, M. Isolamentos de
bactrias patgenas nos ranrios de Gois e Par. In: VI ENCONTRO NACIONAL
DE RANICULTURA, 1988, Rio de Janeiro. Anais VI Encontro Nacional de
Ranicultura. Rio de Janeiro: ARERJ, 1988, p. 287-291.
36.
HADFIELD, C.; WHITAKER, B. Amphibian Emergency Medicine and Care.
Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine, v. 14, n. 2 , p. 79-89, 2005.
37. HANSELMANN, R.; RODRIGUEZ, A.; LAMPO, M,; FAJARDO-RAMOS
L.;ALONSO AGUIRRE, A.;. MARM KILPATRICK, A.; RODRIGUEZ J.P., DASZAK,
P. Presence of an emerging pathogen of amphibians in introduced bullfrogs Rana
catesbiana in Venezuela. Biological Conservation, Barking-Essex, v. 120, n. 1,
p. 115-119, 2004.
38. HE, J.; LU, L.; DENG, M.; HE, H.; WENG, S.; WANG, X.; ZHOU, S.; LONG,
Q.; WANG, X.; CHAN, S. Sequence analysis of the genoma completo of an
iridovirus isolated from the tiger frog. Virology, New York-NY, v. 292, n. 2, p.185197, 2002.
39. HERRERA, R.; STECIOW, M.; NATALE, G. Chytrid fungus parasitizing the
wild amphibian Leptodactylus ocellatus (Anura: Leptodactylidae) in Argentina.
Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen, v. 64, n. 3, p. 247252, 2005.
40. HIPLITO, M. Causas de mortalidade na Ranicultura. In: 1st. Technofrog- I
International Meeting on Frog Research and Technology & VIII ENAR, 1995,
Viosa. Anais 1st. Technofrog - I International Meeting on Frog Research and
Technology & VIII ENAR. Viosa, MG. ABETRA/ABCR, v. 2, p. 199-207, 1995.
41. HIPLITO, M. Causas de mortalidade e Sanidade. In: 2nd. TechnofrogInternational Meeting on Frog Research and Technology & IX ENAR, 1997,
Santos. 2nd. Technofrog- International Meeting on Frog Research and
Technology & IX ENAR. Santos, SP. ABETRA/ABCR, p. 5-9, 1997.
42. HIPLITO, M. Doenas na Ranicultura. In: X ENCONTRO NACIONAL DE
RANICULTURA 1999, So Miguel do Iguau. Anais X ENAR. So Miguel de
Iguau, PR, ABETRA/ABCR, p. 3-15, 1999.
43. HIPLITO, M. Patologias em r touro (Rana catesbeiana Shaw 1802).
Primeira reviso da bibliografia brasileira. Arquivos do Instituto Biolgico de
So Paulo. So Paulo, v. 69, n. 2, p. 113-120, 2002.
14
44. HIPLITO, M.; BALDASSI, L.; MOULIN, A.; CALIL, M.; BARBOSA, M;
CUNHA, R. Presena de agentes patognicos bacterianos em rs-touro gigante
(Rana catesbeiana). In: Encontro de Pesquisa Veterinria, 1987, Jaboticabal,SP.
Encontro de Pesquisa Veterinria, Jaboticabal, SP, p. 12. 1987.
45. HIPLITO, M. ; MOULIN, A.; CALIL, M. L.; PIRES, C. C.; SOUZA, C.;
SOUZA, J. Estudo da microbiota de anfbios capturados em ranrio comercial. In:
VI ENCONTRO NACIONAL DE RANICULTURA, 1988, Rio de Janeiro. Anais VI
Encontro Nacional de Ranicultura. Rio de Janeiro: ARERJ, 1988, , p. 149-154.
46. HIPLITO, M. ; SOUZA, C.; SOUZA, J. R. Presena de Streptococcus sp. ao
nvel de sistema nervoso central em Rana catesbeiana com sintomatologia
nervosa. In: VI Simposio Latinoamericano de Acuicultura & V SIMBRAQ, 1988,
Florianpolis. VI Simposio Latinoamericano de Acuicultura & V SIMBRAQ,
Florianpolis, Brasil, p. 46, 1988. [resumos].
47. HIPLITO, M. ; MOULIN, A.; MARACRUZ, R. Afeces neurolgicas em ra
touro (Rana catesbeiana Shaw 1802). In: X Reunio Anual do Instituto
biolgico. So Paulo, v. 64, p. 49, 1997.
48. HIPOLITO, M.; FERREIRA, C.M.; MACRUZ, R.; MARTINS, A.C.R.P.F.;BACH,
E.E. Petquias hemorrgicas em musculatura de r-touro (Rana catesbeiana
Shaw, 1802). In: ENCONTRO BRASILEIRO DE PATOLOGISTAS DE
ORGANISMOS AQUTICOS, 6. & ENCONTRO LATINOAMERICANO DE
PATOLOGISTAS DE ORGANISMOS AQUTICOS, 2., 2000, Florianpolis.
Resumos. Florianpolis:
ABRAPOA, 2000, p. 224.
49. HIPLITO, M.; CATROXO, M.; CURI, N.; BACH, E. Deteco ao microscpio
eletrnico de transmisso de partculas virais semelhantes aos grupos Herpes,
Toga e Paramixovrus em r-touro (Rana catesbeiana Shaw, 1802) criadas
comercialmente. Primeiras observaes no Brasil. Arquivos do Instituto
Biolgico de So Paulo. So Paulo, v. 70, n. 1, p. 107-111, 2003.
50. HIRD, D.; DIESCH, S.; MCKINNEL, R.; GORHAM, E.; MARTIN, F.; KURTZ,
S.; DUBROVOLNY, C. Aeromonas hydrophila in wild-caught frogs and tadpoles
Rana pipiens in Minnesota. Laboratory Animal Science, Memphis-TN, v. 31, n.
2, p. 166-169, 1981.
51. HYATT, A.; GOULD, A.; ZUPANOVIC, Z.; CUNNINGHAM, A.;
HENGSTBERGER, S.; WHITTINGTON, R.; KATTENBELT, J.; COUPAR, B.
Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses. Archives of Virology,
New York-NY, v. 145, n. 2, p.301-331, 2000.
52. JANCOVICH, J.; MAO, J.; CHINCAR, V.; WYATT, C.; CASE, S.; KUMAR, S.;
VALENTE, G.; SUBRAMANIAN, S.; DAVIDSON, E.; COLLINS, J.; JACOBS, B.
Genomic sequence of a ranavirus (family Iridoviridae) associated with salamander
15
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CAPITULO 2
CARACTERIZAO DE RANAVIRUS ISOLADOS DE GIRINOS DE R TOURO
(Rana catesbeiana Shaw, 1802) EM RANRIOS COMERCIAIS.
RESUMO
Vrus pertencentes famlia Iridoviridae, gnero Ranavirus, tm sido
diagnosticados como agentes etiolgicos de doenas de anfbios, peixes e rpteis
em diversas partes do mundo. Trabalhos recentes tm reportado a presena de
agentes do gnero Ranavirus em girinos de r touro do Brasil e Uruguai, por meio
do emprego da tcnica de PCR, revelando alta homologia nas regies
seqenciadas do genoma com a espcie prottipo da famlia Iridoviridae, Frog
Virus 3-FV3, alm de outros vrus geneticamente muito prximos. Objetivou-se
com o presente estudo caracterizar o vrus presente nas rs de criao visando
ampliar o conhecimento do agente, bem como estabelecer seu grau de homologia
com outros vrus do gnero. Aplicaram-se tcnicas de cultivo e isolamento em
clulas A6, microscopia eletrnica de transmisso, e reao em cadeia da
polimerase (PCR) visando amplificar e seqenciar o gene completo que codifica a
protena principal da cpside (MCP) dos iridovrus, bem como outras regies do
genoma. Foram obtidos resultados positivos para iniciadores direcionados a MCP
e para a RNA polimerase DNA dependente (Pol II), sendo o produto de PCR
correspondente a MCP de aproximadamente 1480 pares de bases, e o
correspondente Pol II de aproximadamente 377 pares de bases. O
seqenciamento revelou homologia com FV3, superior a 99% para MCP e 100%
para Pol II, indicando que, provavelmente, o vrus presente no Brasil pode ter sido
introduzido por as rs touro de criao importadas da Amrica do Norte. A
seqncia obtida para a MCP foi registrada no GenBank com o nmero
DQ897669.
Palavras chave: FV3, Iridoviridae, MCP, ranicultura, vrus.
21
ABSTRACT
Viruses from the family Iridoviridae, genus Ranavirus, have been identified as
etiological agents in amphibian, fish and reptile diseases all around the world.
Ranavirus with high sequence homology with Frog Virus 3, type species of the
Iridoviridae family, have been recently detected in farmed tadpoles from Brazil and
Uruguay by polymerase chain reaction-PCR technique. The goal of this study was
to amplify and sequence the complete major capsid protein gene (MCP) along with
other genomic regions to increase the knowledge about homology degree of
Brazilian virus related to other ranaviruses. Viral cell culture and isolation, as well
as transmission electron microscopy studies were also performed. Positive results
were obtained with primers directed to amplify MCP and RNA polymerase DNA
dependent-Pol II genes. Amplified PCR products for complete MCP were about
1480 bp and 377 bp for Pol II. Multiple alignments for obtained sequences
revealed homologies over 99% for MCP products and 100% for Pol II products
with FV3, suggesting the imported American bullfrogs probably introduced the
virus. Obtained sequence was deposited in GenBank with number DQ897669.
Key words: Frog farming, FV3, Iridoviridae, MCP, virus.
22
1 INTRODUO
Os ranavrus pertencem ao gnero Ranavirus da Famlia Iridoviridae,
que inclui ainda os gneros Lymphocystisvirus, Chloriridovirus, Iridovirus, e o
recentemente identificado Megalocytivirus. So vrus grandes, que medem de 120
a 300 nm de dimetro e apresentam simetria icosahdrica. O genoma composto
por uma nica molcula linear de DNA de fita dupla com tamanho varivel de 102
a 212 kbp, dependendo da espcie. O virin constitudo por trs estruturas
concntricas: uma cpside protica externa, uma membrana polipeptido-lipdica
intermediria e um ncleo central contendo um complexo DNA-protenas. Como
caracterstica nica entre os vrus que infectam animais, apresentam DNA
ciclicamente permutado e com terminaes redundantes, resultante da formao
de concatmeros no genoma durante a replicao. Todos os representantes da
famlia expressam a protena principal da cpside (MCP) de aproximadamente 50
kDa, cujas propriedades moleculares so utilizadas para caracterizao e
identificao de espcies (WEBBY et al., 1998; CHINCHAR et al, 2005;
WILLIAMS et al., 2005). A espcie prottipo da Famlia, frog virus-3 (FV3) foi
recentemente analisado e seu genoma completo seqenciado (TAN et al., 2004).
Os ranavrus so agentes infecciosos capazes de acometer trs
classes diferentes de animais pecilotrmicos vertebrados: peixes telesteos,
anfbios e rpteis (MAO et al., 1997; CAREY et al., 1999). Nos ltimos 20 anos, as
doenas produzidas por vrus desse gnero foram identificadas de forma
crescente em peixes, anfbios e rpteis ocasionando enfermidades de importncia
econmica em criaes comercias, e levando reduo das populaes de
anfbios na natureza. Nos ltimos anos, os ranavirus tm sido considerados como
patgenos emergentes (HEDRICK et al., 1992; HENGSTBERGER et al., 1993;
CUNNINGHAM et al., 1996; MAO et al., 1996; AHNE et al., 1998; ZUPANOVIC et
al., 1998; DASZAK et al., 1999; CHINCHAR & MAO, 2000; HYATT et al., 2000;
ZHANG et al., 2001; CULLEN & OWENS, 2002; HE et al., 2002; KIM et al., 2002;
MARSH et al., 2002; WENG et al., 2002; GANTRESS et al., 2003; JANCOVICH et
al., 2003; QIN et al., 2003; SPEARE, 2003; DO et al, 2005; WILLIAMS, 2005;
ZHANG et al., 2006) e recentemente as doenas produzidas por esse vrus foram
23
24
25
26
2 MATERIAL E MTODOS
2.1 Amostras de Vrus
O vrus foi obtido de girinos doentes de at 30 dias de idade com sinais
de edema e ascite, provenientes de trs ranrios localizados no Estado de Gois,
dois localizados no Municpio de Gameleira, 150 km ao sudoeste de Braslia e um
no Municpio de Hidrolndia, 250 km ao sudoeste de Braslia. Os girinos foram
preservados em etanol a 95% no local de colheita ou congelados a -20C no
laboratrio. Como controle positivo foi utilizada uma cepa cedida pelo Dr. V. G.
Chinchar da Universidade do Mississippi, Estados Unidos.
esterilizados
de
mL.
Procedeu-se
congelamento
27
28
Forward
Reverse
Produto
(bp)
MCP
ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA
AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)
1483
Pol II
TCACCGCCGCAGACATCTTTAG
GTAACCGTTCTTTTCGCAGTGG
377
IE
ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)
AAATGTCCTAATCTATACACC (2)
479
eIF2
CAACAACAGGGACATCAGAAAGAG
TCTCGTTCCAGACATCAGGGAG
289
(1) HYATT et al. (2000); (2) GALLI et al. (2006). Os restantes iniciadores so
originais do presente trabalho.
29
Final
t
(min)
t (min)
t
(seg)
t
(min)
t
(min)
MCP
N de
ciclos
40
90
94
60
60
72
1,5
72
Pol II
40
90
94
60
60
72
72
IE
30
90
94
45
40
72
72
eIF2
40
90
94
60
60
72
72
2.4 Seqenciamento
Os produtos amplificados e confirmados na leitura como correspondendo
ao peso molecular esperado, foram sequenciados no Laboratrio de Genoma de
Plantas, Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Gois. Todos
os produtos foram seqenciados pelo menos seis vezes em ambas as cadeias. A
reao de seqenciamento dos fragmentos ocorreu com cada oligonucleotdeo
iniciador separado. O protocolo utilizado foi o seguinte: 1L do produto de PCR,
2,5 pmol de oligonucleotdeo iniciador, 2 L de tampo SaveMoney (2 mL de TrisHCl 1M pH 9.0, 1 mL de MgCl2 50 mM, gua MiliQ-q.s.p. 10 mL), 1 L do kit
DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing (Pharmacia Biotech, EUA). A
reao foi realizada no termociclador GeneAmp PCR Systems 9700 (Applied
Biosystems), cujos ciclos foram de 95C durante 20 segundos e 60C por 1
minuto e 15 segundos.
A etapa de precipitao do DNA ocorreu da segunte manerira: 40 L
de isopropanol 65% foram adicionados aos 10 L de reao. A mistura foi
homogeneizada no vortex (TECNAL TE162) por 30 segundos. Deixou-se que a
precipitao ocorresse temperatura ambiente por 20 minutos. As amostras
foram, entanto, centrifugadas a 2000 rcf (fora de centrifugao relativa) por 45
minutos e o sobrenadante descartado. Ao precipitado, foram adicionados 250 L
de etanol 60% para lavagem do material, e centrifugado a 2000 rcf por 10
minutos. O processo de lavagem com lcool foi repetido utilizando 100 L do
mesmo e, o sobrenadante descartado. A placa contendo as amostras foi
30
centrifugada de maneira invertida a 500 rpm por um minuto para garantir que todo
o lcool fosse retirado da mesma. Uma secagem complementar foi realizada
deixando-se a placa por aproximadamente 10 minutos na capela de fluxo laminar.
Este material foi ressuspenso em 10 L de formamida, vortexado por 1 minuto,
deixado temperatura ambiente por 5 minutos e levado em triplicatas ao
analisador automtico de seqncias 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems
ABI Prism).
Alinhamentos mltiplos foram realizados utilizando Clustal W (THOMPSON
et
al.,
1994)
ferramentas
disponibilizadas
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi).
no
GenBank
programa
PHYLIP
Instituto
A.N.
31
3 RESULTADOS
3.1 Isolamento em cultura de clulas
Aps 48 horas da inoculao, as clulas comearam a evidenciar
sinais de leso viral. A uniformidade do tapete comeou a desaparecer, as clulas
perderam seu contorno regular e desprenderam-se do tapete, alm de apresentar
lise celular. Muitas clulas mostraram-se alongadas ou com forma de estrela
(Figura 1).
3.2 PCR
Foram obtidos resultados positivos com os iniciadores utilizados na
amplificao do DNA genmico das amostras de girinos de at 30 dias de idade,
salvo com aqueles iniciadores direcionados ao gen eIF2-.
A temperatura de anelamento tima para amplificao completa da
MCP foi de aproximadamente 60C (Figura 2). O produto de amplificao
apresenta aproximadamente 1480 pares de bases.
32
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1500
bp
FIGURA 2
400 bp
FIGURA 3
33
3.3 Seqenciamento
A anlise das seqncias obtidas pela amplificao completa do gene
que codifica a MCP permitiu identificar uma srie de 1465 pares de bases, sendo
registrada no GenBank com o nmero de acesso DQ897669. Verificou-se
homologia de 99,7% com as seqncias AY548484 e U36913 correspondentes
FV3, com 1461 bp idnticas, entre o total de 1465. Os altos percentuais revelam a
grande homologia com outros vrus pertencentes ao gnero Ranavirus, sendo
apresentados no alinhamento mltiplo da Figura 4. A partir destes dados foi
realizado o alinhamento mltiplo das seqncias nucleotdicas completas,
elaborada uma matriz de distncias genticas entre os vrus (Tabela 1) e o
dendrograma correspondente (Figura 5).
Os percentuais na homologia do gene que codifica a protena MCP
continuaram elevados quando comparadas s seqncias de aminocidos
deduzidas.
tigrina ranavirus
34
DQ897669 1
ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGTTTAATCGACTTGGCCACTTATGAC 60
AY548484 97345 ......................................C..................... 97404
U36913
92
......................................C..................... 151
AF389451 95938 ......................................C..................... 95997
AY033630 1
......................................C..................... 60
AY187046 1
...................T..................C..T.................. 60
AY187045 17
..............C.......................C..................... 76
AY150217 17651 ..............C.......................C..................... 17592
DQ897669
AY548484
U36913F
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
61
97405
152
95998
61
61
77
17591
AATCTTGAGAGAGCAATGTACGGGGGTTCGGACGCCACCACGTACTTTGTCAAGGAGCAC
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
.............................A..............................
.....C....................C.................................
.....C...........A........C...........T....................T
120
97464
211
96057
120
120
136
17532
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
121
97465
212
96058
121
121
137
17531
TACCCCGTGGGGTGGTTCACCAAGCTGCCGTCTCTGGCTGCCAAGATGTCGGGTAACCCG
............................................................
............................................................
..................................................T.........
..................................................T.........
............................................................
......................................C..............C......
........A........T....................C..............C......
180
97524
271
96117
180
180
196
17472
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
181
97525
272
96118
181
181
197
17471
GCTTTCGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGTTCCCAGGTCGGGGGATTACATCCTCAACGCC
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
...................................................A........
240
97584
331
96177
240
240
256
17412
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
241
97585
332
96178
241
241
257
17411
TGGTTGGTGCTCAAGACCCCCGAGGTCGAGCTCCTGGCTGCAAACCAGCTGAGAGAAAAT
...................................................G....C...
...................................................G....C...
........A...........T.................C............G........
........A...........T.................C............G........
...................................................G....C...
...........................A..........C............G....C..C
...........................A..........C............G.......C
300
97644
391
96237
300
300
316
17352
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
301
97645
392
96238
301
301
317
17351
GGCACCATCAGGTGGACAAAGAACCCCATGCACAACATTGTGGAGAGCGTCACCCTCTCA
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
.....A......................................................
.....A........................................A.....A.......
....................A.........................A.....A.......
360
97704
451
96297
360
360
376
17292
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
361
97705
452
96298
361
361
377
17291
TTCAACGACATCAGCGCCCAGTCCTTTAACACGGCATACCTGGACGCCTGGAGCGAGTAC
............................................................
............................................................
.....................................................T......
.....................................................T......
............................................................
............................................................
............................................................
420
97764
511
96357
420
420
436
17232
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
421
97765
512
96358
421
421
437
17231
ACCATGCCAGAGGCCAAGCGCACAGGCTACTATAACATGATAGGCAACACCAGCGATCTC
............................................................
............................................................
......................T.....................................
......................T.....................................
...........A..........T.....................................
......................T.....................................
...........A..........T.....................................
480
97824
571
96417
480
480
496
17172
35
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
481
97825
572
96418
481
481
497
17171
ATCAACCCCGCCCCGGCCACAGGCCAGGACGGAGCCAGGGTCCTCCCGGCCAAGAACCTG
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
...........................A................................
...........................A...A.........T..................
540
97884
631
96477
540
540
556
17112
DQ897669 541
GTTCTTCCCCTCCCATTCTTCTTCTCCAGAGACAGCGGCCTGGCCCTGCCAGTCGTCTCC
AY548484 97885 ............................................................
U36913
632
............................................................
AF389451 96478 ......................................A.....................
AY033630 541
......................................A.....................
AY187046 541
............................................................
AY187045 557
............................................................
AY150217 17111 ............................................ .........T......
600
97944
691
96537
600
600
616
17052
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
601
97945
692
96538
601
601
617
17051
CTCCCCTACAACGAGATCAGGATAACAGTCAAGCTGAGGGCCATCCAGGACCTCCTGATC
...............................................C............
...............................................C............
............................................................
............................................................
...........T..A............................................T
............................................................
............................................................
660
98004
751
96597
660
660
676
16992
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
661
98005
752
96598
661
661
677
16991
CTCCAGCACAACACCACAGGGGCAATCAGCCCCATCGTGGCCTCCGACCTTGCGGGAGGT
............................................................
............................................................
..................................................C.........
..................................................C.........
..................................................C.........
..........................................G.......C.A.......
......................T...................G.......C.A.......
720
98064
811
96657
720
720
736
16932
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
721
98065
812
96658
721
721
737
16931
CTCCCCGACACCGTCGAGGCCAACGTCTACATGACCGTCGCCCTCATCACCGGGGACGAG
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
...........T..............T...........T.....................
780
98124
871
96717
780
780
796
16872
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
781
98125
872
96718
781
781
797
16871
AGACAGGCCATGAGCAGCACAGTCAGGGACATGGTTGTGGAGCAGGTGCAGGCCGCCCCA
............................................................
............................................................
..G.................................................T.......
..G.................................................T.......
............................................................
..G................................C........................
..G................................C........................
840
98184
931
96777
840
840
856
16812
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
AF157681
AF157669
AF157647
AF157645
AF157677
AF157675
AF157663
AF157661
AF157657
AF157655
AF157653
AF157649
AF157673
841
98185
932
96778
841
841
857
16811
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
GTCCACATGGTCAACCCCAGGAACGCGACCACCTTCCACACCGACATGCGGTTCTCACAC
............................................................
............................................................
...........................G................................
...........................G................................
...........................G....................A...........
...........................G................................
...........................G................................
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
900
98244
991
96837
900
900
916
16752
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
36
AF157671
AF157651
AF157679
AF157659
AF157667
AF157665
1
1
1
1
1
1
.
.
.
.
.
.
1
1
1
1
1
1
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
AF157681
AF157669
AF157647
AF157645
AF157677
AF157675
AF157663
AF157661
AF157657
AF157655
AF157653
AF157649
AF157673
AF157671
AF157651
AF157679
AF157659
AF157667
AF157665
901
98245
992
96838
901
901
917
16751
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
GCAGTCAAGGCCTTGATGTTTATGGTGCAGAACGTCACACACCCTTCCGTCGGCTCCAAT
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............C...............................................
............C.....................................T.........
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
960
98304
1051
96897
960
960
976
16692
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
61
DQ897669
AY548484
U36913
AF389451
AY033630
AY187046
AY187045
AY150217
AF157681
AF157669
AF157647
AF157645
AF157677
AF157675
AF157663
AF157661
AF157657
AF157655
AF157653
AF157649
AF157673
AF157671
AF157651
AF157679
AF157659
AF157667
AF157665
961
98305
1052
96898
961
961
977
16691
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
62
TACACCTGCGTCACTCCCGTCGTGGGAGTCGGCAACACGGTCCTGGAGCCAGCCCTTGCG
............................................................
............................................................
............................C...........................G...
............................C...........................G...
........................................................G...
..........C....................A........................G...
..........C............T................................G...
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
........................................................G...
........................................................G...
..........C.............................................G...
..........C.............................................G...
..........C....................A........................G...
..........C.............................................G...
1020
98364
1111
96957
1020
1020
1036
16632
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
121
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155
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567
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11
11
292
7850
262
41
Matriz de Distncias
1
2
3
4
5
6
7
*.
Ranavirus*
DQ897669
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BIV
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42
FIGURA 5
BRASIL 1
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BIV
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MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP
MSSVTGLGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP
MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP
MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP
BRASIL 61
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLRENGTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNDTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQPFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVKLLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVENVNLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGENGTIRWTKNPMHNIVESVTLS
AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVKLLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVENVNLS
BRASIL 121
FV3
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
43
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQNGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL
FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQNGARVLPAKNL
BRASIL 181
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TIV
EHNV
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPAVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVAADLEGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG
VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVAADLEGG
BRASIL 241
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNAATFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNAATFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQVAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH
BRASIL 301
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGAGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM
AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCATPVVGVDNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDI
BRASIL 361
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTSASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSMQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
GVEYYSLVQPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT
BRASIL 421
FV3
RGV 9506
RGV 9507
RGV 9508
BIV
TFV
EHNV
TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL 463
TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
TASAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL
FIGURA 6
44
Matriz de Distncias
Ranavirus*
1
2
3
4
5
*.
BR
0.000
FV3
0.000 0.000
TFV
0.036 0.036 0.000
ATV
0.065 0.065 0.030 0.000
RRV
0.262 0.266 0.254 0.261 0.000
1 Ranavrus isolado no Brasil (DQ987669)
2 FV3 (AY548484)
3 - Tiger Frog Virus (AF389451)
4 - Ambystoma tigrinum stebbensi virus (AY150217)
5 - "Regina ranavirus (AF368230)
FIGURA 7
45
4 DISCUSSO E CONCLUSES
Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam a presena de
um vrus pertencente ao gnero Ranavirus em rs touro criadas no Brasil.
Ressalta-se que a elevada homologia verificada entre as regies seqenciadas do
vrus em estudo e aquelas do FV3, corroboram as observaes de GALLI et al.
(2006) e indicam que o vrus detectado no Brasil foi, provavelmente, introduzido
no pas junto com as rs importadas da Amrica do Norte.
Segundo ESSANI & GRANOFF (1989), o vrus do edema do girinoTEV pode ser considerado uma cepa do FV3. Esse agente, isolado de rs touro
na Amrica do Norte, foi considerado endmico nesta espcie (WOLF et al.,
1968). Estas observaes concordam com as do presente estudo, no sentido de
que o vrus isolado nas rs touro do Brasil, pode ser o mesmo FV3 dos Estados
Unidos e no uma outra espcie autctone da Amrica do Sul.
HYATT et al. (2000) realizando comparaes entre 30 iridovirus
isolados de peixes e anfbios verificaram que as seqncias obtidas da protena
MCP indicavam que os vrus de diferentes regies agrupavam-se em clados
separados. Assim, os vrus da Venezuela formaram um clado individual, diferente
daqueles da Amrica do Norte. Os dados obtidos no presente trabalho situam o
vrus estudado no mesmo clado do FV3, portanto, geneticamente mais prximo a
este do que dos vrus geograficamente vizinhos, reforando a hiptese de que a
introduo do vrus no Brasil ocorreu atravs da importao de rs da Amrica do
Norte.
ZHANG et al. (2001) ao caracterizarem os ranavrus isolados de rs de
criao (R. grylio) na China, por meio de estudos da extremidade 5 da MCP
concluram que os trs vrus isolados eram semelhantes entre si e com o FV3,
diferenciando-se deste ltimo apenas por um nucleotdeo. Seus resultados
levaram os autores a considerarem que a entrada do vrus no pas deu-se a
travs das rs de criao importadas dos Estados Unidos. Provavelmente, o
mesmo aconteceu na Amrica do Sul com a introduo da r touro.
ZHANG et al. (2006) amplificaram e seqnciaram o gene que codifica
a MCP, tendo verificado maiores diferenas na extremidade 3, e homologia com
FV3 superior a 99% para RGV9506 e 9507, e de 97,4% para RGV9508. Estes
resultados so semelhantes aos obtidos no presente trabalho e indicam elevada
46
segundo
GOLDBERG
et
al.
(2003)
outras
tcnicas
de
47
que
incluam
perfil
de
protenas,
padro
AFLP
e,
48
REFERNCIAS
1. AHNE, W.; BEARZOTTI, M.; BREMONT, M.; ESSBAUER, S. Comparison of
European systemic piscine and amphibian iridoviruses with epizootic
haematopoietic necrosis virus and frog virus 3. Zentralbl Veterinarmed Berlin, v.
45, n. 6, p. 373-383, 1998.
2. BRENNER, S.; HORNE, R. A negative staining method for high resolution
electron microscopy of viruses. Biochimica et biophysica Acta. Amsterdam, n.
34, p. 103-110, 1959.
3. CHINCHAR, V. Ranaviruses (family Iridoviridae): emerging cold-blooded
killers. Archives of Virology, New York-NY, v. 147, n. 3, p. 447-470, 2002
4. CHINCHAR, V.; MAO, J. Molecular diagnosis of iridovirus infections in coldblooded animals. Seminars in avian and exotic pet medicine. v. 9, n.1, p. 27-35,
2000.
5. CHINCHAR, V.; BRYAN, L.; WANG, J.; LONG, S.; CHINCHAR, G. Induction
of apoptosis in frog virus 3-infected cells. Virology, New York-NY, v. 306, n. 2, p.
303-312, 2003.
6. CHINCHAR, V.; ESSBAUER, S.; HE, J.; HYATT, A; MIYAZAKI, T.; SELIGY,
V.;WILLIAMS, T. Iridoviridae. In: Virus Taxonomy: 8th. Report of the International
Committee on the Taxonomy of Viruses. FAUQUET, C.; MAYO, C.; MANILOFF,
J.; DESSELBERGER, U.; BALL, L. (Eds.) Elsevier, London, p. 163-175, 2005.
7. CULLEN, B.; OWENS, L. Experimental challenge and clinical cases of Bohle
iridovirus (BIV) in native Australian anurans. Diseases of Aquatic Organisms,
Amelinghausen, v. 49, n. 2, p.83-92, 2002.
8. CUNNINGHAM, A.; LANGTON, T.; BENNETT, P.; LEWIN, J.; DRURY, S.;
GOUGH, R.; MACGREGOR, S. Pathological and microbiological findings from
incidents of unusual mortality of the common frog (Rana temporaria).
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B,
Biological Sciences. London, v. 351, n. 1347, p. 1539-1557, 1996
9. DASZAK, P.; BERGER, L.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A.; GREEN, D.;
SPEARE, R. Emerging infectious diseases and amphibian population declines.
Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 5, n. 6, p. 735-748, 1999.
10. DASZAK, P.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A. Emerging Infectious Diseases of
Wildlife - Threats to biodiversity and human health. Science. Washington-DC v.
287, n. 5452, p. 443-449, 2000
11. DASZAK, P.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A. Infectious Diseases and
amphibian population declines. Diversity and Distributions. Oxford-UK, v. 9, n.
2, p. 141-150, 2003.
49
12. DO, J.; CHA, S.; KIM, J.; AN, E.; LEE, N.; CHOI, H.; LEE, C.; PARK, M.; KIM,
J.; KIM, Y.; PARK, J. Phylogenetic analysis of the major capsid protein gene of
iridovirus isolates from cultured flounders Paralichthys olivaceus in Korea.
Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen, v. 64, p.193-200, 2005.
13. GALLI, L.; PEREIRA. A. ; MARQUEZ, A.; MAZZONI, R. Ranavirus detection
by PCR in cultured tadpoles (Rana catesbeiana Shaw 1802) from South America.
Aquaculture, Amsterdam, v., 257, n. 1-4, p. 78-82, 2006.
14. GANTRESS, J.; MANIERO, G.; COHEN, N.; ROBERT, J. Development and
characterization of a model system to study amphibian immune responses to
iridoviruses. Virology, New York-NY, v. 311, n. 2, p. 254-262, 2003.
15. GOLDBERG, T.; COLEMAN, D.; GRANT, E.; INENDINO, K.; PHILIPP, D.
Strain variations in an emerging iridovirus of warm-water fishes. Journal of
Virology, Washington-DC, v. 77, n. 16, p. 8812-8818, 2003.
16. GRANOFF, A. Viruses of Amphibia. Current topics in Microbiology and
Immunology. New York-NY. n. 50, p. 107-137, 1969.
17. HE, J.; LU, L.; DENG, M.; HE, H.; WENG, S.; WANG, X.; ZHOU, S.; LONG, Q.;
WANG, X.; CHAN, S. Sequence analysis of the genoma completo of an iridovirus
isolated from the tiger frog. Virology, New York-NY, v. 292, n. 2, p.185-197, 2002.
18. HEDRICK , R.; McDOWELL, T.; AHNE, W.; TORHY, C.; KINKELIN, P.
Properties of three iridovirus-like agents associated with systemic infections of
fish. Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen, v. 13, p. 203-209, 1992.
19. HENGSTBERGER, S.; HYATT, A.; SPEARE, R.; COUPAR, B. Comparison of
epizootic haematopoietic necrosis and Bohle iridoviruses, recentrly isolated
Australian iridoviruses. . Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen, v. 15,
p. 93-107, 1993
20. HERNIOU, E.; LUQUE, T.; CHEN, X.; VLAK, J.; WINSTALNLEY, D.; CORY,
J.; OREILY, D. Use of whole genome sequence data to infer baculovirus
phylogeny. Journal of Virology, Washington-DC, v. 75, p. 8117-8126, 2001.
21. HYATT, A.; GOULD, A.; ZUPANOVIC, Z.; CUNNINGHAM, A.;
HENGSTBERGER, S.; WHITTINGTON, R.; KATTENBELT, J.; COUPAR, B.
Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses. Archives of Virology,
New York-NY, v. 145, n. 2, p.301-331, 2000.
22. JANCOVICH, J.; DAVIDSON, E.; MORADO, J.; JACOBS, B.; COLLINS, J.
Isolation of a lethal virus from the endangered tiger salamander, Ambystoma
tigrinum stebbinsi Lowe. Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen v. 31,
p. 161167, 1997.
23. JANCOVICH, J.; DAVIDSON, E.; PARAMESWARAN, N.; MAO, J.;
CHINCHAR, V.; COLLINS, J.; JACOBS, B. Evidence for emergence of an
50
51
52
45. ZUPANOVIC, Z.; MUSSO, C.; LOPEZ, G.; LOURIERO, C.; HYATT, A.;
HENGSTBERGER, S.; ROBINSON, A. Isolation and characterization of
iridoviruses from the giant toad Bufo marinus in Venezuela. Diseases of Aquatic
Organisms, Amelinghausen, v. 33, n. 1, p. 1-9, 1998c.
53
CAPITULO 3
RANAVRUS ASSOCIADOS A MORTANDADE DE GIRINOS (Rana
catesbeiana Shaw, 1802) DE CRIAO INTENSIVA NO BRASIL.
RESUMO
Doenas que cursam com alta mortalidade, caracterizadas clinicamente por
edemas e ascite, tm sido observadas reiteradamente em girinos de criao. O
conhecimento destas doenas escasso, tornando necessrio determinar os
agentes etiolgicos envolvidos, visando sugerir as correspondentes medidas
profilticas e teraputicas. Agentes virais pertencentes Famlia Iridoviridae,
gnero Ranavirus, tm sido confirmados recentemente em girinos de criao por
meio da tcnica de reao em cadeia da polimerase. Assim, objetivou-se com o
presente trabalho a caracterizao das doenas nos girinos, visando
principalmente determinar a participao etiolgica dos vrus. Foram realizados
estudos em trs ranrios comerciais do Estado de Gois, incluindo necropsias,
anlises histopatolgicas, microbiolgicas, parasitolgicas, moleculares e de
microscopia eletrnica de transmisso. Foram identificados dois quadros clnicos
diferentes, sendo um deles em girinos jovens de at quatro semanas de vida, com
mortalidade acima de 90% da populao, cuja etiologia foi atribuda a um vrus do
gnero Ranavirus, Famlia Iridoviridae. O outro em girinos na pr-metamorfose,
cuja presena de cocos Gram-positivos constitui a causa principal das leses
encontradas e dos sinais clnicos evidenciados. Pela primeira vez foi identificada
uma doena produzida por iridovirus no Brasil, tornando um achado de
importncia para a ranicultura, e tambm para a aqicultura em geral, tendo em
vista que estes agentes podem acometer outros grupos de organismos aquticos.
Palavras chave: Aqicultura, estreptococos, ranicultura, septicemia, vrus.
54
ABSTRACT
Diseases with high mortality, clinically characterized by oedema and ascites, have
been frequently observed in farmed tadpoles. Since there is scarce information
about these diseases, it is necessary to determine etiological agents involved, for
recommending appropriate prophylactic and therapeutic measures. Viruses
belonging to the Family Iridoviridae, genus Ranavirus, have been recently
detected in farmed tadpoles by polymerase chain reaction. So, the objective of this
study was the characterization of the diseases affecting farmed tadpoles, aiming to
determine the etiological role of viruses. There were performed studies in three
commercial farms located at Gois State, including necropsy, histopathological
analysis, microbiology, parasitology, and molecular studies. There were
determined two different clinical patterns, one of them in young tadpoles till four
weeks old, with mortality above 90% of population, etiologically related to a virus
(Ranavirus, Family Iridoviridae). The second one in tadpoles reaching the premetamorphic period, where the presence of Gram-positive cocci was the main
cause for observed lesions and clinical signs. For the first time a disease produced
by iridoviruses was identified in Brazil, being an important fact for frog farming, as
well as for aquaculture, considering that these infectious agents can infect other
aquatic organisms from different groups.
Key words: Aquaculture, frog farming, streptococci, septicemia, virus.
55
1 INTRODUO
A ranicultura uma atividade em expanso na Amrica do Sul sendo a
espcie cultivada a r-touro Americana (Rana catesbeiana Shaw, 1802)
introduzida no Brasil em 1935, mas as populaes atualmente criadas foram
originadas de 300 casais importados da Amrica do Norte em 1970 ao Brasil
(MATHIAS & SCOTT, 2004). Em decorrncia do clima favorvel, da excelente
adaptao da r touro, e da tecnologia desenvolvida pelos produtores e
pesquisadores brasileiros, a ranicultura constitui uma atividade importante no
Brasil, particularmente no Estado de Gois. Com o melhoramento nos
conhecimentos sobre manejo e alimentao, a ranicultura transformou-se numa
atividade super intensiva, com altas densidades de populao e com estrita
dependncia dos alimentos balanceados. Entretanto, os mtodos intensivos de
cultivo favoreceram o aparecimento de doenas que constituem uma ameaa
para a viabilidade tcnica e econmica dos criatrios de organismos aquticos
(AUSTIN, 1984).
As doenas infecciosas septicmicas em anfbios tm caractersticas
etiolgicas pouco claras, devido principalmente aos sinais inespecficos e aos
achados de diversos agentes que atuam em forma conjunta, sendo na maioria
das vezes, oportunistas. As bactrias incriminadas nas doenas em larvas de
vrias espcies de anfbios so todas elas habitantes do ambiente e convivem de
forma permanente com os animais afetados. Este fato sugere que os girinos
adoecem quando causas estressantes ou debilitantes colaboram para produzir
uma queda na imunidade e conseqentemente a invaso pelos microrganismos
presentes (GLORIOSO et al., 1974; AMBROSKY et al., 1983; GREEN et al.,
2002; MAUEL et al., 2002; PASTERIS et al., 2006).
Os iridovirus que infectam animais aquticos possuem uma distribuio
mundial e esto associados a doenas severas (CUNNINGHAM et al., 1996;
AHNE et al.,1998; DASZAK et al., 1999; HYATT et al., 2000; SPEARE, 2001;
ZHANG et al., 2001; CHINCHAR, 2002; HE et al., 2002; MARSH et al., 2002;
WENG et al., 2002; GREER et al. 2005; ROBERT et al., 2005; ZHANG et al.,
2006). Os girinos tm maior suscetibilidade podendo sofrer mortalidade de at
100% da populao. Por outro lado, os iridovrus podem infectar outras espcies
56
57
2 MATERIAL E MTODOS
Foram estudados girinos criados em trs ranrios localizados no Estado
de Gois, dois localizados no Municpio de Gameleira, 150 km ao sudoeste de
Braslia e um no Municpio de Hidrolndia, 250 km ao sudoeste de Braslia. , no
perodo de 2003 a 2005. Um dos ranrios realizava exclusivamente a fase de
reproduo, ecloso e cria de girinos at 30 dias de vida quando eles ainda esto
no estgio 25 segundo GOSNER (1960). O outro ranrio recebia girinos do
anterior, dedicando-se metamorfose e engorda de rs. O terceiro criatrio
realizava todas as fases do ciclo na mesma estrutura. Todos os ranrios
utilizavam fontes de gua superficial.
Os girinos foram alimentados com raes fareladas contendo 45% de
protena bruta, principalmente de origem animal.
A gua dos tanques foi constantemente renovada e a densidade
mantida na faixa de um girino por litro de gua. Toda vez que um tanque de
criao era esvaziado, drenava-se a gua e realizava-se limpeza e desinfeco
final com cloro.
58
cocos
Gram-positivos
complementares.
As
foram
UFC
estudados
identificadas
mediante
provas
primariamente
pela
2.3 Histopatologia
Girinos inteiros de at 30 dias de idade, ou fgado, rins e bao de
girinos com mais de 30 dias, foram extrados e preservados em formol tamponado
a 10% (vol-vol) e processados segundo a rotina no laboratrio de Histopatologia
do Hospital das Clnicas da Universidade Federal de Gois pelos mtodos de
59
Forward
Reverse
Produto
(bp)
MCP
ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA
AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)
ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)
AAATGTCCTAATCTATACACC (2)
1483
IE
479
60
61
2.6 Parasitologia
Estudos da pele e das guelras foram realizados a fresco em
microscpio tico mediante raspagens com lmina de bisturi esterilizada.
(REICHENBACH-KLINKE & ELKAN, 1965).
62
3 RESULTADOS
3.1 Epizootiologia
Em girinos jovens de at 30 dias de idade, a doena foi detectada no
Estado de Gois em todas as pocas do ano, sendo a maior freqncia
observada no perodo das chuvas, ou seja, de Novembro a Abril. A mortalidade
pode atingir percentuais elevados de 90 at 100% da populao total.
Verificou-se
que
girinos
aparentemente
saudveis
morriam
63
poucos
animais
que
sobreviveram,
continuaram
seu
3.3 Necropsia
3.3.1 Achados macroscpicos em girinos jovens
Observou-se um grau varivel de ascite com lquido sero-hemorrgico
abertura da cavidade celmica e tonalidade plida do fgado.
64
3.4 Histopatologia
3.4.1 Achados microscpicos em girinos jovens
microscopia os rgos mais afetados foram os rins, seguidos pelo
fgado. Nos rins, observou-se morte celular generalizada, afetando glomrulos e
tbulos, com abundante picnose e cariorexia, com perda total da estrutura normal
do parnquima (Figura 2A). Notou-se, tambm, uma marcada infiltrao de
eosinfilos.
No fgado os hepatcitos mostraram-se vacuolizados, com esteatose e
reas de morte celular com marcada picnose e cariorexia (Figura 2B). Notou-se
um infiltrado inflamatrio predominantemente mononuclear e, em algumas
regies, infiltrao de eosinfilos.
Em girinos de at trs semanas de idade, os cortes histolgicos
corados pelo mtodo de Gram, no revelaram a presena de bactrias no
parnquima dos rgos afetados, ou na mucosa dos rgos digestivos.
Entretanto, em girinos com quatro semanas de idade foram identificados cocos
Gram-positivos nas mucosas do estmago e intestino e colonizao inicial de
diversos tecidos. Os cortes revelaram tambm a presena de cocos grampositivos no contedo gastro intestinal.
3.4.2 Achados microscpicos em girinos na pr-metamorfose
3.4.2.1 Achados em animais aparentemente sadios
Girinos sem sinais aparentes de doena revelaram diversos graus de
leso quando estudados histopatologicamente. Os principais rgos afetados
foram os rins e fgado. Os rins apresentaram infiltrao mononuclear abundante.
O fgado mostrou diversos graus de esteatose e quantidade varivel de
65
FIGURA 2
66
67
3.5 Microbiologia
3.5.1 Girinos jovens
As culturas a partir de amostras de tecidos ou lquido asctico no
revelaram a presena de bactrias na fase inicial dos sintomas.
Nos girinos com mais de quatro semanas, as anlises bacteriolgicas
apresentaram resultados inespecficos, com presena de cocos Gram-positivos
dos
gneros
associados
Streptococcus,
bastonetes
Enterococcus,
Gram
negativos
Aerococcus
dos
gneros
Leuconostoc,
Aeromonas,
68
3.7 Parasitologia
Os estudos parasitolgicos revelaram a presena de parasitas da pele
cujas leses recebem o nome genrico de opacidade contagiosa da pele, onde
o protozorio mais freqentemente encontrado foi o Oodinum spp.
360 nm
FIGURA 3 -
69
4 DISCUSSO E CONCLUSES
Os dados do presente estudo permitiram considerar a existncia de
duas sndromes diferenciadas, uma delas em girinos jovens, de at um ms de
vida e outra em girinos sobreviventes, na pr-metamorfose.
70
bagres
71
(SHOEMAKER et al., 2000, 2001) e tilapias (CHANG & PLUMB, 1996; EVANS et
al., 2000a, 2000b; KLESIUS et al., 2000; SHELBY et al., 2002a, 2002b).
No foi possvel, nas condies deste estudo, determinar a causa
primria que antecede a invaso dos tecidos pelos estreptococos. A ao dos
ranavrus nas etapas iniciais dos girinos pode ter sido um fator desencadeante,
atuando isoladamente ou associado a fatores ambientais relacionados ao manejo
e, principalmente, a uma alimentao desbalanceada. A metamorfose constitui
um perodo de acentuado estresse, portanto, parece lgico pensar que girinos
debilitados podem morrer ao longo do processo. Do equilbrio entre a resposta
imune, a presena dos microrganismos, e o grau de leso pr-existente nos
diversos tecidos, surge a severidade da doena neste perodo especfico. Estas
afirmaes esto em concordncia com aquelas j assinaladas, mencionando que
os girinos adoecem quando causas estressantes ou debilitantes colaboram para
produzir queda na imunidade e conseqente invaso pelos microrganismos
presentes (GLORIOSO et al., 1974; AMBROSKY et al., 1983; GREEN et al.,
2002; MAUEL et al., 2002; PASTERIS et al., 2006).
A presena de diversas espcies sem a determinao de um patgeno
permanente ou constante, indica o carter secundrio da infeco. Porm, o
papel dos cocos no pode ser descartado na evoluo da doena e, portanto,
devem ser levados em conta nos planos de controle sanitrio dos ranrios
comerciais.
No foram associados agentes virais s mortes de girinos nesta fase.
As leses identificadas na histopatologia, diferem daquelas descritas para os
ranavrus, e nos estudos de PCR s 10% dos girinos estudados foram positivos
para esses vrus. Estes resultados indicam que o papel dos vrus nos quadros de
mortalidade em girinos na pr-metamorfose no fundamental. Os achados da
histopatologia sugerem que a patognese do quadro seja de leso estreptoccica
secundria. Aps ao primria do vrus, os estreptococos penetram atravs das
paredes dos rgos digestivos e colonizam diversos tecidos, iniciando assim, o
processo de infeco, formao de granulomas e septicemia. O papel do vrus na
depleo imunitria que habilita a penetrao das bactrias, no foi determinado,
mas poderia ser uma das causas envolvidas.
72
73
9 REFERNCIAS
1. AGIUS, C.; ROBERTS, R. Melano-macrophage centres and their role in fish
pathology. Journal of Fish Diseases. Oxford, n. 26, p. 499-509, 2003.
2. AHNE, W.; BEARZOTTI, M.; BREMONT, M.; ESSBAUER, S. Comparison of
European systemic piscine and amphibian iridoviruses with epizootic
haematopoietic necrosis virus and frog virus 3. Zentralbl Veterinarmed Berlin, v.
45, n. 6, p. 373-383, 1998.
3. AKHLAGHI, M.; MUNDAY, B.; WHITTINGTON, R. Comparison of passive and
active immunization of fish against streptococcosis (enterococcosis). Journal of
Fish Diseases. Oxford, n. 19, p. 251-258, 1996.
4. AMBORSKI, R. L.; SNIDER, T. G.; THUNE, R. L.; CULLEY, D. D. A nonhemolytic, group B Streptococcus infection of cultured bullfrogs, Rana catesbiana,
in Brazil. Journal of Wildlife Diseases. Ames-IO, v.19, n. 3, p. 180-184, 1983.
5. AUSTIN, B. The future of bacterial fish vaccines. Vaccine. London, v.2, n. 4, p.
249-254, 1984.
6. BACHRACH, G.; ZLOTKIN, A.; HURVITZ, A.; EVANS, D. L.; ELDAR, A.
Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish previously vaccinated with a
streptococcus vaccine, Applied and environmental microbiology. WashingtonDC, v. 67, n. 8, p. 3756-3758, 2003.
7. BERRIDGE, B. R.; FULLER, J. D.; DE AZAVEDO, J.; LOW, D. E.;
BERCOVIER, H.; FRELIER, P. F. Development of specific nested oligonucleotide
PCR primers for the Streptococcus iniae 16S-23S ribosomal DNA intergenic
spacer. Journal of Clinical Microbiology. Washington-VA, v. 36, n. 9, p. 27782781, 1998.
8. BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Mtodos
analticos oficiais para anlises microbiolgicas para o controle de produtos de
origem animal e gua. Instruo Normativa 62, de 26 de agosto de 2003. Dirio
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 18
set., 2003. Seo I, p.14-50.
9. BRENNER, S.; HORNE, R. A negative staining method for high resolution
electron microscopy of viruses. Biochimica et Biophysica Acta. Amsterdam, n.
34, p. 103-110, 1959.
10. CHANG, P.; PLUMB, J. Histopathology of experimental Streptococcus sp.
infection in tilapia, Oreochromis niloticus (L.), and channel catfich, Ictalurus
punctatus (Refinsque). Journal of Fish Diseases. Oxford, v. 19, p. 235-241,
1996.
11. CHANG, P.; LIN, P.; LEE, Y. Lactococcus graviae infection of cultured rainbow
trout, (Oncorhynchus mikiss) in Taiwan and associated biophysical characteristics
74
75
22. GANTRESS, J.; MANIERO, G.; COHEN, N.; ROBERT, J. Development and
characterization of a model system to study amphibian immune responses to
iridoviruses. Virology, New York-NY, v. 311, n. 2, p. 254-262, 2003.
23. GLORIOSO, J. C.; AMBORSKI, R. L.; AMBORSKI, G. F.; CULLEY, D. D.
Microbiological studies on septicaemic bullfrogs (Rana catesbiana). American
Journal of Veterinary Research. Chicago-IL, v. 35, n. 9, p. 1241-1245, 1974.
24. GONZALES-SANTANDER, R. Tcnicas de microscopia eletrnica en biologa.
Madrid, Aguilar, 1969, 666 p.
25. GOSNER, K. A simplified table for staging anuran embryos and larva with
notes on identification. Herpetologica, Austin-TX, v. 16, p. 183-190, 1960.
26. GRANOFF, A. Viruses of Amphibia. Current topics in Microbiology and
Immunology. New York-NY. v. 50, p. 107-137, 1969.
27. GREEN. D.; CONVERSE, K.; SCHRADER, A. Epizootiology of sixty-four
amphibian morbidity and mortality events in the USA, 1996-2001. Annals of the
New York Accademy of Science, New York, v. 969, p. 323-339, 2002.
28. GREER, A.; BERRILL, M.; WILSON, P. Five amphibian mortality events
associated with ranavirus infection in south central Ontario, Canada. Diseases of
Aquatic Organisms, Amelinghausen, v. 67, p. 9-14, 2005.
29. HE, J.; LU, L.; DENG, M.; HE, H.; WENG, S.; WANG, X.; ZHOU, S.; LONG, Q.;
WANG, X.; CHAN, S. Sequence analysis of the genoma completo of an iridovirus
isolated from the tiger frog. Virology, New York-NY, v. 292, n. 2, p.185-197, 2002
30. HYATT, A.; GOULD, A.; ZUPANOVIC, Z.; CUNNINGHAM, A.;
HENGSTBERGER, S.; WHITTINGTON, R.; KATTENBELT, J.; COUPAR, B.
Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses. Archives of Virology,
New York-NY, v. 145, n. 2, p.301-331, 2000.
31. JANCOVICH, J.; DAVIDSON, E.; MORADO, J.; JACOBS, B.; COLLINS, J.
Isolation of a lethal virus from the endangered tiger salamander, Ambystoma
tigrinum stebbinsi Lowe. Diseases of Aquatic Organisms, Amelinghausen v. 31,
p. 161167, 1997.
32. KLESIUS, P.; SHOMAKER, C.; EVANS, J. Efficacy of single and combined
Streptococcus iniae isolate vaccine administred by intraperitoneal and
intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus). . Aquaculture. Amsterdam,
v. 188, p. 237-246, 2000.
33. LUFT, J. A. Improvements in an epoxy resin embedding methods. Journal of
Biophysics, Biochemestry and Cytology, v. 9, p. 409-414, 1961.
34. LUNA, L.G. Manual of histology staining methods of the Armed Forces
Institute of Pathology. 3.ed. New York : McGraw-Hill, 1968. 258p.
76
77
46. ROBERT, J.; MORALES, H.; BUCK, W.; COHEN, N.; MARR, S.; GANTRESS,
J. Adaptive immunity and histopathology in frog virus 3-infected Xenopus.
Virology, New York-NY, v. 332, n. 2, p. 667-675, 2005.
47. ROMALDE, J.; LORES, F.; MAGARIOS, B.; BARJA, J.; TORANZANO, A.
Study of cell surface associated virulence factors of Streptococcus parauberis
strains pathogenic for turbot. Bulletin of the European Association of Fish
Pathologists. The Netherlands, v. 20, n. 6, p. 244-251, 2000.
48. SAMBROOK, J.; FRITCSH, E.; MANIATIS, T. Molecular cloning: A
laboratory manual. 2. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 3v.
3104p.
49. SHELBY, R.; KLESIUS, P.; SHOEMAKER, C.; EVANS, J. Passive and active
immunization of tilapia, Oreochromis niloticus (L.), with anti-Streptococcus iniae
whole sera. Journal of Fish Diseases. Oxford, v. 25, p. 1-6, 2002.
50. SHELBY, R.; SHOEMAKER, C.; KLESIUS, P. Detection of Streptococcus
iniae infection of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus, by a monoclonal antibodybased ELISA. Journal of Applied Aquaculture. Binghamton-NY, v. 12, n. 3, p.
23-31, 2002.
51. SHOMAKER, C.; EVANS, J.; KLESIUS, P. Density and dose: factors affecting
mortality of infected tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture. Amsterdam, v.
188, p. 229-235, 2000.
52. SHOEMAKER, C.; KLESIUS, P.; EVANS, J.. Prevalence of Streptococcus
iniae in tilapia, hybrid stripped bass and channel catfich on commercial fish farms
within the United States. American Journal of Veterinary Research. Chicago-IL,
v.62, n. 2, p. 174-177, 2001.
53. SPEARE, R. Summary of formidable infectious diseases of amphibians.
In: AMPHIBIAN DISEASE HOME PAGE. Webmaster SPEARE, R. School of
Public Health and Tropical Medicine, James Cook University, 2001
Disponvel em: http://www.jcu.edu.au/school/phtm/PHTM/frogs/formidable.htm.
Acesso em: 11 jan.2003.
54. TORANZO, A.; DEVESA, S.; ROMALDE, J.; LAMAS, J.; RIAZA, A.; LEIRO, J.;
BARJA, J. Efficay of intraperitoneal and immersion vaccination against
Enterococcus sp. infection in turbot. Aquaculture. Amsterdam, v. 134, n. 1, p. 1727, 1995.
55. WATSON, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy
metals. Journal of Biophysics, Biochemestry and Cytology, v. 4, p. 75-478,
1958.
56. WENG, S.; WANG, Y.; HE, J.; DENG, M.; LU, L.; GUAN, H.; LIU, Y.; CHAN, S.
Outbreaks of na iridovirus in red drum, Scianenops ocellata (L.), cultured in
78
79
CAPITULO 4
QUADROS INFECCIOSOS EM RS DE CRIAO (Rana catesbeiana Shaw,
1802) NA FASE PS-METAMRFICA EM RANRIOS COMERCIAIS.
RESUMO
Doenas com alta mortalidade tm sido comuns em todos os ranrios. Apesar dos
numerosos trabalhos realizados, existe ainda desconhecimento dos agentes
etiolgicos envolvidos, e principalmente do papel dos vrus. Objetivou-se com o
presente trabalho realizar a caracterizao dos processos infecciosos em rs de
criao, dando nfase participao etiolgica dos ranavrus. Um ranrio
comercial do Estado de Gois foi utilizado para estudos clnicos e obteno de
amostras para anlises complementares que envolveram necropsia, anlises
histopatolgicas, microbiolgicas, moleculares e de microscopia eletrnica de
transmisso. Foram identificados quatro quadros diferentes, subclnico, super
agudo, agudo e crnico. No quadro subclnico os animais no apresentaram
sinais clnicos evidentes. Nos casos agudos predominaram sintomas inespecficos
como apatia, edemas e, s vezes, manifestaes nervosas. As leses atingiram
diversos rgos internos, com predominncia no fgado, rins e bao. Necrose,
degenerao e granulomas, associados presena de cocos Gram-positivos
constituram os achados de maior significncia na histopatologia. No quadro
crnico as rs apresentaram-se debilitadas e com sintomas nervosos evidentes.
As leses neste quadro se assemelharam quelas do quadro agudo, sendo mais
graves e incluindo, em todos os casos, alteraes no sistema nervoso central. Os
quadros observados foram identificados como septicemias estreptoccicas
secundrias. Foi descartado o papel dos vrus na produo dos sinais clnicas e
leses macro e microscpicas encontradas nesta fase da criao.
Palavras chave: Aqicultura, estreptococos, ranicultura, septicemias.
80
ABSTRACT
Disease outbreaks with high mortality have been frequent events in all frog farms.
In spite of several papers been published on this issue, there is still a lack of
knowledge about etiological agents involved, and mainly the role of virus in adult
frog diseases. The goal of this study was a primary characterization of farmed frog
diseases, stressing on the determination of an eventual viral etiology. Clinical
observations, as well as frog sampling for necropsy, histopathology, microbiology,
molecular studies and transmission electron microscopy were performed at a frog
farm from Gois State. Four different syndromes were identified: sub clinical,
super-acute, acute and chronic. The sub clinical syndrome showed no evident
disease signs. Both acute syndromes showed mainly non-specific symptoms like
apathy, edemas and nervous signs. Several internal organs were affected, mostly
liver, kidney and spleen. Most common histopathological findings were necrosis,
degeneration and granulomas, in association with Gram-positive. On the chronic
syndrome frogs were weak, with evident nervous symptoms. Lesions resemble
those found at the acute syndrome but with more severe pattern, including, in all
cases, central nervous system disorders. The disease was characterized as
secondary streptococcal septicemia. No viral role was detected in the disease.
Key words: Aquacultre, frog farming, septicemia, streptococci.
81
1 INTRODUO
A pesar de constituir uma das atividades mais novas dentro da
aqicultura mundial a criao de rs uma atividade em expanso em toda a
Amrica do Sul, especialmente no Brasil. A r touro (Rana catesbeiana Shaw,
1802) foi introduzida ao Brasil em 1935, mas as populaes atualmente criadas
foram originadas de 300 casais importados da Amrica do Norte em 1970
(MATHIAS & SCOTT 2004). Em decorrncia do clima favorvel, e da excelente
adaptao da espcie, assim como da tecnologia desenvolvida pelos produtores e
pesquisadores brasileiros, a ranicultura constitui uma atividade importante no
Brasil, particularmente no Estado de Gois. Dados referentes produo obtida
entre os anos 2000 e 2004 indicam que Gois ocupa o primeiro lugar no ranking
nacional com 150 toneladas anuais, das quais 90% destina-se exportao
(SILVA, 2005).
Com os avanos no conhecimento sobre manejo e alimentao, a
ranicultura transformou-se numa atividade intensiva, com altas densidades de
populao e estrita dependncia dos alimentos balanceados artificiais fatores que
produzem estresse e conseqentemente maior suscetibilidade a doenas de
diversas etiologias (ROTTMAN et al., 1992).
Sendo a ranicultura uma atividade nova, a experincia do estudo
cientfico com as doenas em rs de criao ainda incipiente. Diversos
trabalhos nas ltimas dcadas foram direcionados principalmente para a
identificao dos agentes envolvidos em surtos ou em episdios de mortalidade
maior que a esperada, seja na fase de girino ou adulta (AMBROSKY et al., 1983;
HIPLITO et al., 1987; GUIMARAES et al., 1988; HIPLITO et al., 1988a, b, c;
HIPLITO, 1995; FIORIO et al., 1997; HIPLITO, 1997; HIPLITO et al., 1997;
HIPLITO, 1999; HIPLITO, 2002; MAUEL et al., 2002; HIPLITO et al., 2003;
PASTERIS et al. 2006). Os diagnsticos concentraram-se exclusivamente na
identificao de agentes parasitrios e bacterianos, no sendo realizado
acompanhamento dos surtos, no intuito de estabelecer o papel etiolgico dos
agentes detectados e de outros aspectos das doenas que permitam a
elaborao de medidas de preveno ou controle. Segundo HIPLITO (2002), a
82
83
CHINCHAR, 2002; CULLEN & OWENS, 2002; GREEN et al., 2002; HE et al.,
2002; KIM et al., 2002; MARSH et al., 2002; WENG et al., 2002; DASZAK et al.,
2003; GANTRESS et al., 2003; JANCOVICH et al., 2003; GREER et al. 2005.
ROBERT et al., 2005; ZHANG et al., 2006). Porm existem dvidas em relao a
patogenicidade destes agentes em rs adultas da espcie Rana catesbeiana, pois
foram detectados tanto em anfbios sadios como em doentes (WOLF et al., 1968)
alm de ter sido detectados em outras espcies de anfbios (ZUPANOVIC et al.,
1998; ZHANG et al., 2001; GANTRESS et al., 2003, GREER et al. 2006).
Fato semelhante est ocorrendo com uma doena emergente
produzida pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis que tem sido implicada com
muita freqncia em surtos de mortalidade e reduo de populaes ao redor do
mundo (BERGER et al., 1998, 1999; DASZAK et al., 1999; LONGCORE et al.,
1999; SPEARE & BERGER, 2000; MAZZONI, 2000a, b; BERGER et al., 2002;
GUAYASAMIN
et
al.,
2002;
MAZZONI
et
al.,
2003;
SPEARE,
2003;
HANSELMANN et al., 2004; BLAUSTEIN & DOBSON, 2006). O fungo tem sido
identificado na Amrica do Sul, Equador (BERGER et al., 1999; RON & MERINO,
2000), Venezuela, (GUAYASAMIN et al., 2002; BONACCORSO et al., 2003;
HANSELMAN et al., 2004), Uruguai (MAZZONI, 2000a, b; MAZZONI et al., 2003),
Argentina (HERRERA et al., 2005) e Brasil (CARNAVAL et al., 2006). Apenas no
Uruguai, o diagnstico foi realizado em rs de criao da mesma espcie
cultivada no Brasil.
84
85
2 MATERIAL E MTODOS
O presente estudo se refere a surtos de uma doena ocorridos durante
quatro anos consecutivos, de 2002 at 2005. Apesar da doena ter sido reportada
em quase todos os ranrios do Brasil, a descrio aqui apresentada baseou-se
fundamentalmente nas observaes realizadas em um ranrio localizado no
Municpio de Hidrolndia, Estado de Gois. Aloja constantemente um milho de
girinos e 400.000 rs. As rs, logo aps a metamorfose, foram confinadas em
baias de concreto de seis m2 localizadas em galpes fechados. Quando
alcanaram aproximadamente 50 g foram transferidas para novas baias de 12 m2.
Todas as baias possuam uma piscina de cinco cm de profundidade que ocupava
20% da superfcie total. A gua foi obtida a partir de uma represa de 20 hectares
alimentada por vrias nascentes. A represa possua uma variada populao de
peixes, bem como rpteis, outras espcies de anfbios e aves.
As rs foram alimentadas duas vezes por dia com rao artificial
extrusada contendo 45% de protena bruta. Somente as rs aps a metamorfose
receberam como complemento 5% de larvas de mosca domstica, produzida no
prprio ranrio, por um perodo de 21 dias para estimular o consumo da rao.
Outras prticas de manejo incluram a eliminao diria do alimento
mido no consumido e dos animais mortos. A gua das piscinas era
constantemente renovada, e drenada completamente uma vez ao dia, juntamente
com os sedimentos das fezes. A baia inteira era lavada pelo menos duas vezes
na semana. Periodicamente as rs eram submetidas a um processo de triagem
para manter os tamanhos uniformes e reduzir o canibalismo. A densidade foi
mantida na faixa de 150 rs por m2 durante a fase inicial, at diminuir para 40 por
m2 na etapa de terminao. Toda vez que uma baia era esvaziada, a gua era
drenada e realizava-se uma limpeza e desinfeco final com cloro.
86
principalmente
em
relao
aos
resultados
das
anlises
2.2 Microbiologia
Uma vez sacrificados os exemplares foram submersos em soluo de
cido peractico a 0,2%. Aps abertura da pele e da cavidade celmica, fgado,
rins, bao, pulmes, corao e crebro foram extrados assepticamente. As
amostras foram processadas imediatamente no laboratrio de bacteriologia do
Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinria da Universidade
Federal de Gois, sendo inoculadas em caldos BHI (Brain Heart Infussion Broth),
Casoy (Tripticase Soy Broth), Glicose Azide e Selenito-Cistina, segundo os
mtodos rotineiros (BRASIL, 2003). Todas as amostras foram incubadas a 30C
por 24-72 h. O perodo de 72 horas deveu-se ao crescimento lento de alguns
estreptococos, e procurou-se de esta forma propiciar um tempo suficiente para o
desenvolvimento, evitando a ocorrncia de falsos negativos. Assim que foi
observado crescimento bacteriano foram semeadas alquotas em placas de gar
sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, e incubadas a 30C,
determinando-se as caractersticas hemolticas e morfologia das colnias-UFC.
As UFC isoladas, com diferente morfologia, foram selecionadas para colorao de
Gram, observao em microscpio de contraste de fase, e identificao mediante
provas bioqumicas complementares. Os cocos Gram-positivos foram estudados
mediante
provas
bioqumicas
complementares.
As
UFC
identificadas
87
2003)
presena
de
cocos
Gram-positivos
como
descrito
anteriormente.
2.3 Histopatologia
Fragmentos de fgado, rins, bao, estomago, pulmes, corao e
crebro foram extrados e preservados em formol tamponado a 10% (vol-vol) e
processados segundo a rotina de estudos de histopatologia no laboratrio de
Histopatologia do Hospital das Clnicas da Universidade Federal de Gois,
utilizando as tcnicas propostas por LUNA (1968). Os blocos parafinados foram
secionados em cortes de 4-5 e corados com hematoxilina-eosina (H&E) para as
avaliaes primrias das leses. Adicionalmente, os cortes selecionados foram
tambm corados pelo mtodo de Gram para visualizao de bactrias em geral,
pelo mtodo de Fite para deteco de micobacterias e colorao de PAS para
visualizao de fungos.
88
precoce (IE) ICP-18 utilizaram-se iniciadores propostos por GALLI et al. (2006), e
para o gene que codifica a protena MCP foram utilizados iniciadores localizados
nas extremidades 5e 3 da seqncia de FV3 (TAN et al., 2004) sendo que o
iniciador forward original do presente trabalho e o reverse j utilizado por
HYATT et al. (2000) segundo apresentado no Quadro 1.
Forward
Reverse
Produto
(bp)
MCP
ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA
AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)
ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)
AAATGTCCTAATCTATACACC (2)
1483
IE
479
89
90
material obtido foi colocado sobre uma lmina de vidro, corado com uma mistura
de KOH 10% e azul de algodo em propores de 50:50 (vol-vol) e coberto por
lamnula para observao em microscpio ptico, segundo descrio de
MAZZONI et al. (2003).
91
3 RESULTADOS
Observou-se
existncia
de
quatro
diferentes
formas
de
3.1 Epizootiologa
A enfermidade pode aparecer repentinamente na forma aguda
espalhando-se pelo criatrio inteiro ou permanecer na forma latente, com baixa
morbidade e mortalidade, podendo aumentar a severidade ao longo do ano.
Merece destaque o fato de que durante o perodo mais frio a morbidade e a
mortalidade foram menores, mas quando a temperatura voltou a subir, a doena
recrudesceu.
92
93
FIGURA - 1
94
graus
de
alterao
heptica
foram
observados,
independentemente
da
idade,
incluindo
rs
recentemente
95
3.4 Histopatologia
3.4.1 Forma subclnica ou inaparente
Rs sem sinais aparentes da doena revelaram diversos graus de
leso nos estudos histolgicos, independentemente da idade. Os principais
rgos afetados foram o rim e o fgado. Enquanto o fgado mostrou diversos
graus de esteatose e uma quantidade varivel de granulomas em suas fases
iniciais (Figura 2), os rins apresentaram infiltrao mononuclear abundante e
alguns tbulos esclerosados. A colorao de Gram aplicada aos cortes revelou a
presena de cocos Gram-positivos (Figura 2).
3.4.2 Forma aguda
Um quadro de leses septicmicas foi constatado na maioria das rs
estudadas. Fgado, rins, bao, corao, pulmes e crebro foram afetados em
grau varivel de severidade. Uma resposta inflamatria focal mltipla e
granulomas bacterianos foram observados distribudos no parnquima dos
diversos rgos e nas serosas das vsceras. reas de necrose associadas
presena de macrfagos e uma grande infiltrao linfocitria foram identificadas
na maioria dos tecidos (Figura 3). O nmero de focos de melanomacrfagos
distribudos no fgado foi muito reduzido e, s vezes, ausente por completo.
Macrfagos, contendo em seu interior cocos fagocitados, constituiu um achado
comum no parnquima do fgado, e notou-se forte relao entre esta resposta e o
aparecimento dos granulomas. Estes mostraram regies necrticas rodeadas por
macrfagos e fibroblastos (Figura 3). A esteatose hepatocitria com perda da
estrutura normal do tecido associada a necrose foi outro achado comum. As
96
glomrulos
com
espessamento
da
membrana
basal,
97
98
C
C
99
Em particular o estudo do
3.5 Microbiologia
Verificou-se que 90% das rs estudadas foram positivas para cocos
Gram-positivos; 50% para Edwarsiella tarda e Escherichia coli.; 40% para
Citrobacter spp.; 25% para Pseudomonas spp. e Proteus spp; e menos de 10%
para Aeromonas hydrophyla, sempre associada a outros microorganismos. Dentre
os cocos, foram isolados principalmente Streptococcus uberis, S. agalactie, S.
faecalis, S. dysgalactiae e Enterococcus spp.
A anlise das amostras de rao e da gua de abastecimento do
ranrio
no
revelaram
contaminao
por
Streptococcus.
As
condies
100
mdio encontrado para rs sadias foi de 2,56 g/dL, para rs na fase aguda da
doena foi de 0,725 g/dL, e 1,24 g/dL para animais na fase crnica.
101
DISCUSSO E CONCLUSES
Os resultados obtidos confirmaram que nos ranrios comerciais de
Gois existe uma doena severa, com alta morbidade e mortalidade que
acarretam significativos danos econmicos. Epizootiologicamente h maior
prevalncia nas pocas de temperaturas mais elevadas, sendo acometidas rs
em todas as fases do ciclo produtivo, principalmente animais em bom estado
geral.
A sintomatologia foi inespecfica, cursando de forma subclnica,
super aguda, aguda ou crnica. No quadro subclnico, os animais no
apresentaram sintomas evidentes. Nos casos agudos, as rs morriam
rapidamente sem evidenciar sinais prvios ou se apresentaram letrgicas,
ascticas ou edematosas. s vezes tambm eram evidentes sintomas nervosos.
Um quadro especfico super agudo
nervoso
de
carter
crnico
caracterizado
por
leses
severas
102
et
al
(2002)
estudaram
um
surto
com
semelhantes
identificaram
os
seguintes
microrganismos:
A.
hydrophila,
103
104
pelos
ranicultores
detalhadamente,
na
bibliografia
cientfica
em
outras
espcies,
105
nas
rs
ps-metamorfose.
Observaram-se
sinais
clnicos
106
que
doena
avana
no
parnquima
dos
rgos
internos,
107
tcnicas
moleculares.
necropsia,foram
observados
hepatomegalia
presente estudo.
ROBERT et al. (2005) descreveram leses produzidas pelo vrus FV3
em Xenopus laevis experimentalmente inoculadas. Os autores comprovaram o
tropismo do agente pelo rim, observando que sinais de edemas e hemorragias
foram os mais evidentes e tem ntima relao com leso do rgo. Nos cortes
corados pela H&E, os autores observaram leses de necrose principalmente nos
tbulos proximais e glomrulos. Nos tbulos distais foi observada apenas a
presena de cilindros hialinos. No fgado, foi verificada necrose celular, mas em
menor grau. Ao contrrio do presente estudo, os autores no detectaram leses
degenerativas e granulomatosas.
GREER et al. (2005) estudaram cinco surtos de mortalidade em girinos
de Rana sylvatica e rs ps-metamorfose da espcie Rana pipiens, no Canad.
Baseados em observaes a campo, na avaliao histopatolgica e em tcnicas
moleculares, atriburam aos ranavirus a causa dos surtos. Porm, relataram que
resultados positivos foram obtidos na PCR para rs sadias criadas em laboratrio
e ovos coletados em locais onde infeces por iridovrus haviam sido reportadas.
A partir desses resultados, notou-se a importncia da realizao de diagnstico
diferencial consistente, devido semelhana dos sinais clnicos e da preferncia
ou eleio de rgos como o fgado e o rim. Os fungos envolvidos nas doenas
de anfbios j citadas, tambm no foram detectados.
A sndrome denominada de perna vermelha no foi observada em
nenhuma das rs quando a anlise foi realizada com o animal ainda vivo.
Quando as rs foram encontradas mortas, ou moribundas, os sinais clssicos de
eritema na regio ventral do corpo e patas comearam a ser evidentes. Estes
resultados so coincidentes com aqueles citados por GREEN et al. (2002) que
estudando surtos em anfbios dos Estados Unidos, no diagnosticaram red leg.
So concordantes tambm quanto constatao de que a maioria das
mortalidades atribudas sndrome de perna vermelha refere-se a diagnsticos
incompletos, nos quais a premissa bsica de no realizar estudos microbiolgicos
em rs em fases terminais ou mortas no foi cumprida, bem como, no foi
108
potencialmente
patognicos
podem
colonizar
de
forma
morte
das
rs
causada
por
septicemia
associada
ao
109
de
imprescindveis
medidas
em
de
outras
biossegurana
criaes
com
bsicas,
maior
comprovadamente
desenvolvimento
110
REFERNCIAS
1. AGIUS, C.; ROBERTS, R. Melano-macrophage centres and their role in fish
pathology. Journal of Fish Diseases. Oxford, n. 26, p. 499-509, 2003.
2. AMBORSKI, R. L.; SNIDER, T. G.; THUNE, R. L.; CULLEY, D. D. A nonhemolytic, group B Streptococcus infection of cultured bullfrogs, Rana catesbiana,
in Brazil. Journal of Wildlife Diseases. Ames-IO, v.19, n. 3, p. 180-184, 1983.
3. A.V.M.A. 1993 Report of the A.V.M.A. Panel for euthanasia. Journal of the
American Veterinary Medical Association, v. 202, n.2, p. 229-249, 1993.
4. BERCOVIER, H.; GHITTINO, C.; ELDAR, A Immunization with bacterial
antigens: infections with streptococci and related organisms. Developments in
Biological Standardization. Basel-NY, v. 90, p. 153-160, 1997.
5. BERGER, L.; SPEARE, R.; DASZAK, P.; GREEN, D.; CUNNINGHAM, A.;
GOGGIN, C.; SLOCOMBE, R.; RAGAN, M.; HYATT, A.; MCDONALD, K.; HINES,
H.; LIPS, K.; MARANTELLI, G.; PARKES, H. Chytridiomycosis causes amphibian
mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and
Central America. Proceedings of the National Academy of Science,
Washington- DC, v. 95, n. 15, p. 9031-9036, 1998.
6. BERGER, L.; SPEARE, R.; HYATT, A. Chytrid fungi and amphibian declines:
Overview, implications and future directions. Ed. A. Campbell. Declines and
Disappearances of Australian Frogs. Environment Australia: Canberra. p. 2333, 1999.
7. BERGER, L.; HYATT, A.; OLSEN, V.; HENGSTBERGER, S.; BOYLE, D.;
MARANTELLI, G.; HUMPHREYS, K.; LONGCORE, J. Production of polyclonal
antibodies to Batrachochytrium dendrobatidis and their use in an
immunoperoxidase test for chytridiomycosis in amphibians. Diseases of Aquatic
Organisms, London, v. 48, n 3, p.213-220, 2002.
8. BERRIDGE, B. R.; FULLER, J. D.; DE AZAVEDO, J.; LOW, D. E.;
BERCOVIER, H.; FRELIER, P. F. Development of specific nested oligonucleotide
PCR primers for the Streptococcus iniae 16S-23S ribosomal DNA intergenic
spacer. Journal of Clinical Microbiology. Washington-DC, v. 36, n. 9, p. 27782781, 1998.
9. BLAUSTEIN, A.; DOBSON, A. Extinctions: A message from the frogs. Nature,
London, v. 439, n. 7073, p. 143, 2006
10. BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Mtodos
analticos oficiais para anlises microbiolgicas para o controle de produtos de
origem animal e gua. Instruo Normativa 62, de 26 de agosto de 2003. Dirio
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 18
set., 2003. Seo I, p.14-50.
111
11. BRENNER, S.; HORNE, R. A negative staining method for high resolution
electron microscopy of viruses. Biochimica et Biophysica Acta. Amsterdam, v.
34, p. 103-110, 1959.
12. CARNEVIA, D.; MAZZONI, R. Estudio de un brote de Sindrome de Edema
Generalizado (SEG) en Rana catesbeiana. In: VI ENCONTRO NACIONAL DE
RANICULTURA, 1988, Rio de Janeiro. Anais VI Encontro Nacional de
Ranicultura. ARERJ, 1988, p; 329-333.
13. CHANG, P.; PLUMB, J. Histopathology of experimental Streptococcus sp.
infection in tilapia, Oreochromis niloticus (L.), and channel catfich, Ictalurus
punctatus (Refinsque). Journal of Fish Diseases. Oxford, v. 19, p. 235-241,
1996.
14. CHANG, P.; LIN, P.; LEE, Y. Lactococcus graviae infection of cultured rainbow
trout, (Oncorhynchus mikiss) in Taiwan and associated biophysical characteristics
and histopathology. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists.
The Netherlands, v. 22, n. 5, p. 319-327, 2002.
15. CHINCHAR, V. Ranaviruses (family Iridoviridae): emerging cold-blooded
killers. Archives of Virology, New York-NY, v. 147, n. 3, p. 447-470, 2002
16. CHINCHAR, V.; MAO, J. Molecular diagnosis of iridovirus infections in coldblooded animals. Seminars in avian and exotic pet medicine. v. 9, n.1, p. 2735, 2000.
17. COLORN, A.; DIAMANT, A.; ELDAR, A.; KVITT, H.; ZLOTKIN, A.
Streptococcus iniae infections in Red Sea cage-cultured and wild fishes. Diseases
of Aquatic Organisms. Amelinghausen, v. 49, n. 3, p. 165-170, 2002.
18. COPPO, J. El medio interno de la rana toro (Rana catesbeiana, Shaw 1802).
Revisin bibliogrfica. Revista Veterinaria, Corrientes, v. 14, n. 1, p. 25-41,
2003.
19. COSGROVE, G. Amphibian carea and diseases. In: Current Veterinary
Therapy VII, Kirk, R. W. Ed. W. Saunders and Co. Phyladelphia, p. 616-618, 1980.
20. COTRAN R.; KUMAR,V.; ROBBINS.S. Robbins - Pathologic basis of
disease. 5 ed. Philadefphia, Saunders Company, 1994. 1400p.
21. CRAWSHAW, G. Medicina de anfibios. In: Teraputica veterinaria de
pequeos animles. KIRK, R. W. & BONAGURA, J.D. Eds. Interamericana-Mc
Graw Hill. Mxico, 1994, p. 1355-1369.
22. CULLEN, B.; OWENS, L. Experimental challenge and clinical cases of Bohle
iridovirus (BIV) in native Australian anurans. Diseases of Aquatic Organisms,
Amelinghausen, v. 49, n. 2, p.83-92, 2002.
112
23. CUNNINGHAM, A.; LANGTON, T.; BENNETT, P.; LEWIN, J.; DRURY, S.;
GOUGH, R.; MACGREGOR, S. Pathological and microbiological findings from
incidents of unusual mortality of the common frog (Rana temporaria).
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B,
Biological Sciences, London, v. 351, n. 1347, p. 1539-1557, 1996.
24. DASZAK, P.; BERGER, L.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A.; GREEN, D.;
SPEARE, R. Emerging infectious diseases and amphibian population declines.
Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 5, n. 6, p. 735-748, 1999.
25. DASZAK, P.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A. Emerging Infectious Diseases of
Wildlife - Threats to biodiversity and human health. Science. Washington-DC v.
287, n. 5452, p. 443-449, 2000
26. DASZAK, P.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A. Infectious Diseases and
amphibian population declines. Diversity and Distributions. Oxford-UK, n. 9, p.
141-150, 2003.
27. DUREMDEZ, R.;
AL-MARZOUK, A.;
QASEM, J.;
AL-HARBI, A.;
GHARABALLY, H. Isolation of Streptococcus agalactiae from cultured silver
pomfret, Pampus argenteus (Euphrasen), in Kuwait. Journal of Fish Diseases,
Oxford, v. 27, n. 5, p. 307, 2004.
28. ELDAR, A.; BEJERANO, Y.; BERCOVIER, H. Streptococcus shiloi and
Streptococcus difficile: Two new Streptococcal species causing a
meningoencephalitis in fish. Current Microbiology. New York-NY, v. 28, p. 139143, 1994.
29. ELDAR, A.; BEJERANO, Y.; LIVOFF, A.; HOROVITCZ, A.; BERCOVIER, H.
Experimental streptococcal meningo-encephalitis in cultured fish. Veterinary
Microbiology. Amsterdam, v. 43, p. 33-40, 1995.
30. ELDAR, A.; HOROVITCZ, A.; BERCOVIER, H. Development and efficacy of a
vaccine against Streptococcus iniae infection in farmed rainbow trout. Veterinay
Immunology and Immunopathology. Amsterdam, v. 56, n. 1-2, p. 175-183,
1997.
31. ELDAR, A. ; GHITTINO, C. Lactococcus garvieae and Streptococcus iniae
infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: similar, but different diseases.
Diseases of Aquatic Organisms. Amelinghausen, v. 36, n. 3, p. 227-231, 1999.
32. EMERSON, H.; NORRIS, C. Red-Leg, an infectious disease of frogs. Journal
of Experimental Medicine, New York, v. 7, n. 1, p. 32-58, 1905.
33. EVANS, J.; KLESIUS, P.; GILBERT, P.; SHOEMAKER, C.; AL SARAWI, M.;
LANDSBERG, J.; DUREMDEZ, R.; AL MARZOUK, A.; AL ZENKI, S.
Characterization of -haemolytic Group B reptococcus agalactiae in cultured
seabream, Sparus auratus L., and wild mullet, Liza klunzingeri (Day), in Kuwait.
Journal of Fish Diseases. Oxford, v. 25, p. 505-513, 2000.
113
114
115
116
117
118
119
120
121
CAPITULO 5
PROCESSO INFECCIOSO SUPER AGUDO SEMELHANTE AO CHOQUE
ENDOTXICO EM RS DE CRIAO (Rana catesbeiana Shaw, 1802).
RESUMO
Na realizao de estudos de doenas septicmicas em rs de criao foi
observado uma forma super aguda que acontece em 15 a 20% dos animais
doentes. O objetivo do presente trabalho foi estudar as caractersticas particulares
desta forma da infeco, mediante estudos clnicos e para-clnicos que
envolveram
amostragem
de
exemplares
para
necropsia,
anlises
histopatolgicas, microbiolgicas, moleculares e de microscopia eletrnica de
transmisso. Os sinais clnicos observados incluem modificaes da postura
normal, depresso, e diminuio da reao aos estmulos externos. As rs
morrem em curto perodo de tempo apresentando incoordenao, opisttomo e
convulses, permanecendo em quadro tetnico com os membros estendidos.
necropsia, foram observados aumento do tamanho do fgado e colorao
anormal, geralmente cinzenta ou amarelada, bao pardo-escuro e aumentado de
tamanho, rins e pulmes hemorrgicos e ascite leve com exsudato sorohemorrgico. histopatologia, observou-se um quadro caracterstico de leses
produzidas por sepse generalizada. Fgado, rins, bao, corao, pulmo e crebro
foram afetados. Verificou-se nesses rgos uma resposta inflamatria mltipla,
necrose associada presena de macrfagos e infiltrao linfocitria.
Granulomas bacterianos foram observados distribudos no parnquima dos
diversos rgos. A alterao histopatolgica mais freqente neste quadro foi o
aparecimento de aglomerados basoflicos arredondados distribudos na maioria
dos rgos afetados, correspondendo a cocos Gram-positivos. O quadro clnico
super agudo, associado aos achados de necrpsia e histopatologia sugerem a
ocorrncia de um choque que, devido a quantidade e distribuio generalizada
dos microrganismos, indicam origem sptica. Por tanto, a anlise dos resultados
do presente estudo permitem-nos concluir sobre a presena de uma sndrome
semelhante sndrome de choque endotxico ou choque sptico em rs de
criao.
Palavras chave: Aqicultura, choque, estreptococos, ranicultura.
122
ABSTRACT
During the study of septicemic diseases in farmed frogs, it was detected a
particular syndrome characterized by super acute mortality affecting 15 to 20% of
the sick population. Clinical signs included abnormal posture, depression, and low
reaction to external stimuli. Frogs died in a very short time showing incoodination,
opistotonous and convulsions with tetany, remaining with the four legs extended.
Necropsy findings included hepatomegaly with abnormal color, generally grayish
or yellowish, dark red and swollen spleen, hemorrhagic kidneys, strongly
hemorrhagic lungs and slight ascites with serum-hemorrhagic exudate.
Histopathologically, a septicemic pattern was observed. Liver, kidney, spleen,
heart, lungs and brain showed a multiple inflammatory response with necroses in
association with macrophage and lymphocitic infiltration. Bacterial granuloma were
observed spread in all organs. The most frequent histopathological lesion were
basophilic aggregates spotted through all affected organs. The super acute
condition, associated with necropsy and histopathological findings suggested
shock syndrome that, due to bacterial quantity and distribution indicated a septic
origin. These results resembled the existence of a toxic shock syndrome or septic
shock in farmed frogs, and indicate that this kind of disease could be an usual
finding in other aquaculture species.
Key words: Frogs, septicemia, streptococci, shock
123
1 INTRODUO
Com os avanos nos conhecimentos sobre manejo e alimentao, a
ranicultura transformou-se numa atividade intensiva, com altas densidades de
populao e estrita dependncia de alimentos balanceados artificiais. Os mtodos
intensivos de cultivo favorecem o aparecimento de doenas que constituem
ameaa viabilidade tcnica e econmica dos ranrios e so considerados
fatores que limitam o crescimento da atividade (NACE, 1974; AMBROSKY et al.,
1983; GUIMARAES et al., 1988; CRAWSHAW, 1994; MAZZONI, 2000a;
MAZZONI & CARNEVIA, 2000; ZHANG et al., 2001; MAZZONI, 2003).
No Brasil, conforme reviso realizada por HIPLITO (2002), a maioria
dos trabalhos relativos ao assunto, foram comunicados efmeros, no tendo
continuidade
no
estudo
do
caso.
Os
diagnsticos
concentraram-se
124
125
2 MATERIAL E MTODOS
O presente estudo foi realizado em um ranrio de ciclo completo
localizado no Estado de Gois, no Municpio de Hidrolndia. As rs, logo aps a
metamorfose, foram confinadas em baias de concreto localizadas em galpes
fechados. Todas as baias possuam piscina de cinco cm de profundidade
ocupando 20% da superfcie total. A gua foi obtida a partir de uma represa de
20 hectares alimentada por vrias nascentes.
As rs foram alimentadas duas vezes por dia com rao extrusada
apresentando 45% de protena bruta. De forma peridica, as rs foram
submetidas a triagem para manter tamanhos uniformes e reduzir o canibalismo. A
densidade foi mantida na faixa de 150 animais por m2 durante a fase inicial, at
alcanar 40 por m2 na etapa de terminao.
126
Nome
Forward
Reverse
Produto
(bp)
MCP
ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA
AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)
ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)
AAATGTCCTAATCTATACACC (2)
1483
IE
479
127
provas
bioqumicas
complementares.
As
UFC
identificadas
128
2003)
presena
de
cocos
Gram-positivos
como
descrito
anteriormente.
129
material obtido foi colocado sobre uma lmina de vidro, corado com uma mistura
de KOH 10% e Azul de Algodo em propores de 50:50 (vol-vol) e coberto por
uma lamnula para observao em microscpio ptico, segundo a descrio de
MAZZONI et al. (2003).
130
3 RESULTADOS
Os resultados da epizootiologa, microbiologia, PCR e microscopia
eletrnica de transmisso no diferem daqueles descritos para rs septicmicas
em trabalhos anteriores (MAZZONI et al. dados no publicados) pelos autores.
Rs doentes e mortas foram detectadas em todas as etapas do ciclo
de vida no sendo encontrado relao com o manejo, tipo de alimentao ou
localizao dentro do ranrio. Observou-se que entre 15 e 20% dos animais
afetados evoluram para um quadro super agudo. Esse quadro coexiste no
mesmo ranrio, inclusive nas mesmas baias, com outros quadros da doena
(MAZZONI et al., dados no publicados). No foram observados sinais
premonitrios que pudessem indicar que uma determinada r seria afetada.
Os sinais
clnicos
FIGURA 1 -
131
3.1 Necrpsia
As rs doentes mostraram diversos graus de leses nos rgos
internos, mas sem um padro definido. As leses de maior freqncia foram:
aumento do volume e colorao anormal do fgado, geralmente cinzenta ou
amarelada, bao aumentado de volume e com colorao pardo-escura alm de
rins hemorrgicos. s vezes, observaram-se pulmes fortemente hemorrgicos e
ascite leve contendo exsudato sero-hemorrgico.
A maioria dos animais apresentou alimento no tubo digestivo, incluindo
o estmago e o duodeno, enquanto o corpo adiposo apresentava-se com
caractersticas normais.
3.2 Histopatologia
Foi observado um quadro de leses inflamatrias e vasculares
produzidas pela sepse na maioria das rs afetando o fgado, rins, bao, corao,
pulmo e crebro.
Foram observados resposta inflamatria mltipla, localizada nas
serosas das vsceras bem como granulomas bacterianos distribudos no
parnquima dos diversos rgos. Tambm ocorreram reas de necrose
associadas presena de macrfagos e grande infiltrao linfocitria na maioria
dos tecidos.
A alterao mais freqente neste quadro foi o aparecimento de focos
basoflicos
arredondados
distribudos
na
maioria
dos
rgos
afetados,
132
FIGURA 2
133
Figura 3 -
FIGURA 4 -
134
3.3 Microbiologia
Todas as rs estudadas com esta sndrome albergaram cocos Grampositivos
de
diversas
espcies
gneros.
Assim,
foram
identificados
135
4 DISCUSSO E CONCLUSES
A anlise do conjunto de resultados permite evidenciar a presena de
um quadro particular, do tipo septicmico e super agudo, mediado principalmente
pelos estreptococos, que aps um perodo varivel de infeco sub-clnica,
conseguem proliferar em quantidades muito elevadas que rapidamente levam a
morte.
As septicemias tm sido reportadas como a causa mais importante de
mortalidade em anfbios, sendo freqente o achado de animais mortos sem
sintomas premonitrios (CRAWSHAW, 1994). Este mesmo autor assinala que os
microrganismos normais do meio ambiente podem tornar-se patognicos quando
os anfbios so submetidos a condies de estresse, sendo que a sintomatologia
observada no depende do tipo de microrganismo envolvido. Os resultados das
pesquisas realizadas confirmaram estas observaes.
Apesar da importncia das septicemias nos anfbios, o risco de isolar
bactrias oportunistas que entram no organismo submetido a condies de
choque e colapso generalizado elevado (NACE, 1974). O autor recomenda
utilizar amostras para processamento microbiolgico oriundas de rs que
sobreviveram pelo menos oito horas aps a colheita. As observaes do citado
trabalho indicaram que os resultados da bacteriologia para este quadro clnico
no so de completa validade.
Apesar dessas consideraes, os estudos microbiolgicos revelaram a
constante presena de cocos Gram-positivos. histopatologia, as quantidades
elevadas destas bactrias, formando verdadeiros aglomerados no parnquima
dos rgos, indicam o papel fundamental das mesmas no quadro. importante
ressaltar que estes microrganismos foram observados nos estgios prvios da
doena, em amostras obtidas de rs sem sinais evidentes, assim como em rs
com sintomatologia aguda (MAZZONI et al., dados no publicados). Isto sugere
que estas bactrias no pertencem aos invasores oportunistas. Esses cocos
foram detectados nos cortes de tecidos e nos esfregaos sanguneos, podendo o
quadro ser nomeado de septicemia estreptoccica.
136
137
bacterianas,
principalmente
de
Staphylococcus
aureus
138
zooepidemicus
pertencente
ao
grupo
de
Lancefield.
139
REFERNCIAS
1. AMBORSKI, R. L.; SNIDER, T. G.; THUNE, R. L.; CULLEY, D. D. A nonhemolytic, group B Streptococcus infection of cultured bullfrogs, Rana catesbiana,
in Brazil. Journal of Wildlife Diseases. Ames-IO, v.19, n. 3, p. 180-184, 1983.
2. A.V.M.A. 1993 Report of the A.V.M.A. Panel for euthanasia. Journal of the
American Veteterinay Medical Association, Ithaca-NY, v. 202, n. 2, p. 229-249,
1993.
3. BERGER, L.; SPEARE, R.; DASZAK, P.; GREEN, D.; CUNNINGHAM, A.;
GOGGIN, C.; SLOCOMBE, R.; RAGAN, M.; HYATT, A.; MCDONALD, K.; HINES,
H.; LIPS, K.; MARANTELLI, G.; PARKES, H. Chytridiomycosis causes amphibian
mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and
Central America. Proceedings of the National Academy of Science,
Washington- DC, v. 95, n. 15, p. 9031-9036, 1998.
4. BERGER, L.; SPEARE, R.; HYATT, A. Chytrid fungi and amphibian declines:
Overview, implications and future directions. Ed. A. Campbell. Declines and
Disappearances of Australian Frogs. Environment Australia: Canberra. p. 2333, 1999.
5. BERGER, L.; HYATT, A.; OLSEN, V.; HENGSTBERGER, S.; BOYLE, D.;
MARANTELLI, G.; HUMPHREYS, K.; LONGCORE, J. Production of polyclonal
antibodies to Batrachochytrium dendrobatidis and their use in an
immunoperoxidase test for chytridiomycosis in amphibians. Diseases of Aquatic
Organisms, London, v. 48, n 3, p.213-220, 2002.
6. BLAUSTEIN, A.; DOBSON, A. Extinctions: A message from the frogs. Nature,
London, v. 439, n. 7073, p. 143, 2006.
7. BOHACH, G.; FAST, D.; NELSON, R.; SCHLIEVERT, P. Staphylococcal and
streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related
illnesses. Critical Reviews in Microbiology. Boca Raton-FL. v. 17, n. 4, p. 251272, 1990.
8. BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Mtodos
analticos oficiais para anlises microbiolgicas para o controle de produtos de
origem animal e gua. Instruo Normativa 62, de 26 de agosto de 2003. Dirio
Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 18
set., 2003. Seo I, p.14-50.
9. BRENNER, S.; HORNE, R. A negative staining method for high resolution
electron microscopy of viruses. Biochimica et Biophysica Acta. Amsterdam, v.
34, p. 103-110, 1959.
10. CRAWSHAW, G. Medicina de anfibios. In: Teraputica veterinaria de
pequeos animales. KIRK, R. W. & BONAGURA, J.D. Eds. Interamericana-Mc
Graw Hill. Mxico, 1994, p. 1355-1369.
140
11. CUNNINGHAM, A.; LANGTON, T.; BENNETT, P.; LEWIN, J.; DRURY, S.;
GOUGH, R.; MACGREGOR, S. Pathological and microbiological findings from
incidents of unusual mortality of the common frog (Rana temporaria).
Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B,
Biological Sciences, London, v. 351, n. 1347, p. 1539-1557, 1996.
12. DASZAK, P.; BERGER, L.; CUNNINGHAM, A.; HYATT, A.; GREEN, D.;
SPEARE, R. Emerging infectious diseases and amphibian population declines.
Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 5, n. 6, p. 735-748, 1999..
13. ENCICLOPEDIA MDICA EN ESPAOL, Coordenador KAUFMAN, D.2004.
Shock bactermico; shock endotxico; shock septicmico; shock caliente.
Disponvel
em:
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000668.htm Acesso em:
17 mar 2005.
14. GALLI, L.; PEREIRA. A. ; MARQUEZ, A.; MAZZONI, R. Ranavirus detection
by PCR in cultured tadpoles (Rana catesbeiana Shaw 1802) from South America.
Aquaculture, Amsterdam, v., 257, n. 1-4, p. 78-82, 2006.
15. GLORIOSO, J. C.; AMBORSKI, R. L.; AMBORSKI, G. F.; CULLEY, D. D.
Microbiological studies on septicaemic bullfrogs (Rana catesbiana). American
Journal of Veterinary Research. Chicago-IL, v. 35, n. 9, p. 1241-1245, 1974.
16. GONZALES-SANTANDER, R. Tcnicas de microscopia eletrnica en
biologa. Madrid, Aguilar, 1969, 666 p.
17. GREEN. D.; CONVERSE, K.; SCHRADER, A. Epizootiology of sixty-four
amphibian morbitidy and mortality events in the USA, 1996-2001. Annals of the
New York Accademy of Science, New York, v. 969, p. 323-339, 2002.
18. GUAYASAMIN, J.M.; BONACCORSO, E.; SPEARE, R.; MENDEZ, D. The
roles of climatic variation and pathogenic fungus in declining populations of
Aletopus cruciger (Anura: Bufonidae) in Venezuela. In:. Abstracts of the Joint
Meeting of the American Society of Ichthyologists and Herpetologists, 2002
[on line] Herpetologists' League, and Society for the Study of Amphibians and
Reptiles,
Kansas
City,
USA.
Disponvel
em:
http://www.asih.org/meetings/2002/Abstracts.pdf Acesso em: 21 jan. 2003.
19. GUIMARAES,N.; SILVEIRA,W.; RODRIGUES, M. Isolamentos de bactrias
patgenas nos ranrios de Gois e Par. In: VI ENCONTRO NACIONAL DE
RANICULTURA,1988, Rio de Janeiro. Anais VI Encontro Nacional de
Ranicultura. Rio de Janeiro: ARERJ, 1988, p. 287-291.
20. HANSELMANN, R.; RODRIGUEZ, A.; LAMPO, M,; FAJARDO-RAMOS
L.;ALONSO AGUIRRE, A.;. MARM KILPATRICK, A.; RODRIGUEZ J.P., DASZAK,
P. Presence of an emerging pathogen of amphibians in introduced bullfrogs Rana
141
142
143
em:
46. TORANZO, A.; DEVESA, S.; ROMALDE, J.; LAMAS, J.; RIAZA, A.; LEIRO, J.;
BARJA, J. Efficay of intraperitoneal and immersion vaccination against
Enterococcus sp. infection in turbot. Aquaculture. Amsterdam, v. 134, p. 17-27,
1995.
47. WATSON, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy
metals. Journal of Biophysics, Biochemestry and Cytology, v. 4, p. 475-478,
1958.
48. WENG, S.; HE, J.; WANG, X.; LU, L.; DENG, M.; CHAN, S-M. Outbreaks of an
iridovirus disease in cultured tiger frog, Rana tigrina rugulosa, in southern China.
Journal of Fish Diseases, Oxford, v. 25, n. 11, p. 423-427, 2002.
49. WHITE, W. Role of Superantigens in Staphylococcal and Streptococcal Toxic
Shock
Syndrome.
Disponvel
em:
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Immunology/Students/spring2000/white/restrict
ed/TSS.html Davidson College Department of Biology, Davidson, NC, 2000. Acesso
em: 16 nov. 2005.
50. ZHANG, Q.; XIAO, F.; LI, Z.; GUI, J.; MAO, J.; CHINCHAR, V. Characterization
of an iridovirus from the cultured pig frog Rana grylio with lethal syndrome.
Diseases of Aquatic Organisms, Amerlinghausen, v. 48, n. 1, p. 27-36, 2001.
51. ZHANG, Q.; ZHE, Z.; XIAO, F.; LI, Z.; GUI, J. Molecular characterization of
three Rana grylio virus (RGV) isolates and Paralichthys olivaceus lymphocystis
disease virus (LCDV-C) in iridoviruses. Aquaculture, Amsterdam, v. 251, n. 1, p.
1-10, 2006.
144
CAPITULO 6
CONSIDERAES FINAIS
Foi caracterizada pela primeira vez em rs de criao do Brasil, uma
doena especfica que acomete girinos de at 30 dias de idade, cujo agente
etiolgico um vrus da Famlia Iridoviridae, gnero Ranavirus. Clinicamente foram
observados girinos com abdome aumentado de tamanho, com edemas e ascite,
assim como girinos finos ou emaciados. Revelaram leso localizada principalmente
no fgado e nos rins, com destruio quase completa do parnquima. Nenhum
agente bacteriano pde ser incriminado na etiologia da enfermidade. A presena
constante nos resultados da PCR de um vrus do gnero Ranavirus, associada aos
achados na histopatologia e na microscopia eletrnica de transmisso, confirmaram
o papel fundamental deste microrganismo nesta enfermidade.
Estudos de epidemiologia molecular realizados permitem incluir o vrus
detectado dentro do gnero Ranavirus. Observou-se homologia de quase 100%
nos setores do genoma estudado com aqueles do Frog Vrus 3, o que indica sua
possvel introduo com as rs importadas da Amrica do Norte.
Foi identificado quadro especfico em girinos na pr-metamorfose, no
qual o papel dos vrus no pde ser determinado. Nesta fase, bactrias
oportunistas, principalmente cocos Gram-positivos foram encontradas em
associao s leses. Estas predominam no fgado e rins, mas tambm alcanam
outros rgos internos. A leso de tipo necrtico-degenerativo, com resposta
inflamatria predominantemente de linfcitos mononucleares e formao de
granulomas. O quadro insidioso, apresentando-se com edemas, ascites e s
vezes lceras na pele. A leso estreptoccica coincide com os achados descritos
em criaes de trutas, linguados, bagres, e tilapias.
Nas rs, foi caracterizado quadro septicmico com sintomatologia
inespecfica, cursando de forma super aguda, aguda ou crnica. Nas fases
agudas predominam sintomas como letargia, apatia, edemas e ascite sendo que,
s vezes, as rs apresentam sintomas nervosos. histopatologia e microbiologia
o quadro comporta-se de forma semelhante quela observada nos girinos na prmetamorfose.
morte
conseqncia
da
septicemia
associada
ao
145
inicialmente
os
tecidos
do
animal,
produzindo
leses
sem
146
fungo
Batrachochytrium
dendrobatidis,
agente
produtor
da