Bioquímica/Bioquímica I Prática - Introdução teórica (espectrofotometria) 1

ESPECTROFOTOMETRIA

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação

electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre
níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos
comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho (Fig. 1).

Fig..1. Espectro electromagnético. A espectrofotometria utiliza a radiação compreendida entre o ultravioleta

(ultraviolet) e o infravermelho (infrared).

A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda

que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação electromagnética
(Fig. 2).
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400 500 nm 600 nm 700

nm nm
Ultra Infra
violeta vermelho
Fig2. Radiação luminosa.

O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 nm (Tabela 1).

Tabela 3.1: Comprimentos de onda da luz visível.

Comprimento de onda
Cor
(nm)
violeta 390 - 455

azul 455 - 492

verde 492 - 577

amarelo 577 - 597

laranja 597 - 622

vermelho 622 - 780

Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática

através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução
(Fig. 3). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes
comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz
branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de
um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber que
quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.
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Fig. 3. Espectrofotómetro. A luz é dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um
prisma óptico e passa através da amostra, contida numa cuvette ou célula de espectrofotómetro.

1. Espectros de absorção

O conjunto das absorvâncias aos vários comprimentos de onda para um composto chama-
se espectro de absorção e varia de substância para substância. Se uma substância é verde,
por exemplo, então deixa passar ou reflecte a cor nesse comprimento de onda, absorvendo
mais a luz na região do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias substâncias
diferentes (Fig. 4).

1.5

1.
0

0.5

Fig. 4. Espectros de absorção de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3:

clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substância 1, por exemplo, absorve pouco na região do
visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos.
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Uma vez que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a

espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu
espectro. Permite também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está
relacionada com a concentração da substância, como vamos ver adiante.
Às vezes uma substância, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar
um espectro de absorção diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar
essas mesmas alterações. Por exemplo, o NADH reduzido absorve a 340 nm, enquanto que
a forma oxidada não tem absorvância significativa a esse comprimento de onda (Fig. 5).

Fig. 5. Espectros de absorção do NAD+ e do NADH.

Essas diferenças de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso
de reacções que se esteja a estudar, por exemplo, reacções metabólicas que envolvam a
oxidação do NADH ou a redução do NAD+.

3.2. Espectrofotometria e quantificação

3.2.1. Princípios de absorção da luz:

1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada:

Io IT1
solução 10
feixe de luz de g/l
intensidade Io
Fig.6. Relação entre a
concentração de uma
solução e a luz absorvida.
Io IT2 A solução 20g/l absorve
o dobro da solução
10g/l.

solução 20 g/l
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2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe
luminoso através das amostras:

Io IT1
1 cm
feixe de luz de
intensidade Io

Io IT3
3 cm
Fig. 7. Relação entre a distância percorrida pelo feixe luminoso e a a luz absorvida por uma solução. A
solução contida na cuvette com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida na cuvette de 1 cm.

Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert:

constante
absorvânci (para um λ fixo)
a

Aλ = ελ.c.l
(λ fixo) distância percorrida
pelo feixe luminoso
através da amostra

concentração
da solução
absorvente

Nesta
equação,
Io
Aλ=log10
IT
Io – luz incidente
IT – luz transmitida
ελ – coeficiente de extinção molar ao comprimento de onda λ
c – concentração da substância (em moles/l)
l – distância percorrida pela luz através da substância
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Normalmente usam-se cuvettes com 1 cm de comprimento, de modo que a equação fica:

Aλ= ελ.c

Ou seja, a absorvância da luz a cada comprimento de onda λ é directamente

proporcional à concentração da solução contida na cuvette. Esta linearidade deixa de
ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nesses casos diluir
previamente a amostra a medir.

3.2.2. Métodos colorimétricos

Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas

complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda.
Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos - o composto a quantificar é
posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja
intensidade é directamente proporcional à concentração da substância na mistura original.
Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a
absorvância a 280 nm, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas se
quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método já não pode
ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos nucleicos, também
absorvem a este comprimento de onda. Neste caso podemos utilizar, por exemplo, o
reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as proteínas, originando um
complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a 540 nm.
Para quantificar espectrofotometricamente uma substância é necessário,
obviamente, saber o valor de ε. Para isso é necessário preparar uma série de soluções do
composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e
medir as absorvâncias aocomprimento de onda adequado (Fig. 8).

0 0.1M 0.2M 0.3 0.4 0.5M

M M

Fig. 8. Calibração de um método colorimétrico. A absorvância ao comprimento de onda escolhido é

directamente proporcional à concentração do composto na solução.
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No exemplo da Fig. 8, há uma relação linear perfeita entre a concentração da

substância (expressa em molaridade, M) e a absorvância ao comprimento de onda λ de
medida. Podemos assim obter uma recta do tipo

Aλ= ελ.c (ou Aλ= ελ.c + b, caso a recta não passe na origem)

em que Aλ é a absorvância ao comprimento de onda λ de medida, c a concentração em M

e ελ a constante de proporcionalidade. Sabendo esta relação, podemos fazer corresponder
uma absorvância medida,a uma concentração de substância na solução a analisar.
Muitas vezes o método só é linear até uma certa concentração da substância. Nesse
caso, utiliza-se a zona em que a relação é linear, diluindo a solução a medir, sempre que
necessário, de modo a que a absorvância resultante esteja contida no intervalo da recta de
calibração.

Bibliografia:

GORDON, D.B. 1995. Spectroscopic Techniques.pp. 324-344 in Principles and

Techniques in Practical Biochemistry. K. Wilson & J. Walker Eds., Cambridge University
Press, Cambridge

REED, R., HOLMES, D., WEYERS, J. & JONES,A.J. 1998. Practical Skills in
Biomolecular Sciences. Ed. Prentice Hall

Páginas da Internet:

"Photographic Chemistry 2076-302 Laboratory: 5 Spectrophotometry and Beer's

Law":
http://www.rit.edu/~bekpph/Chemistry/5_Spectrophotometry.html (teoria e prática da
espectrofotometria quantitativa)

"Color and Vision":

http://www.glenbrook.k12.il.us/gbssci/phys/Class/light/u12l2c.html
(breve descrição da luz e das suas propriedades, e da sua relação com a visão)

"Spectrophotometry":
http://fig.cox.miami.edu/~ddiresta/bil256/Lab1.htm
(Princípios da espectrofotometria)

"Visible Light Waves":

http://imagers.gsfc.nasa.gov/ems/visible.html (O espectro da radiação luminosa na região
do visível)