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Universidade Federal de Goiás

Engenharia Química
2013

Modelagem da cinética enzimática

Alunos: Igor de Paula Moura


Jéssica Gonçalves Barbosa
Lu Hsueh Yi
1. Resumo
Neste experimento, os dados da cinética enzimática foram fornecidos aos
alunos. Por meio de conhecimentos da engenharia bioquímica, os discentes utilizaram
três métodos gráficos distintos (recíprocos de Linewearver-Burk, Hanes-Woolf e
Woolf-Augustinsson-Hofstee) para estimar os valores de Km e Vmax, comparam-nos
um com outro para verificar se os valores foram os mesmos, teoricamente deveriam
ser iguais. Depois disso, plotaram o gráfico de Michaelis-Menten e, por último,
estudou-se o comportamento de cada tipo de inibição enzimática e os comparando
com a teoria. Todos os resultados foram processados utilizando a ferramenta Excel.

2. Objetivo
Este experimento tem o objetivo de ensinar aos alunos como encontrar os
parâmetros da cinética enzimática por métodos gráficos, estudar o comportamento da
equação de Michaelis-Menten e a inibição enzimática.

3. Introdução

Muitas reações cotidianas são catalisadas pelas enzimas, nos quais são os
catalisadores biológicos. Elas são proteínas de elevada massa molar e podem
apresentar estruturas simples ou complexas. Uma das características inerentes à ela é
a sua alta especificidade, isto é, cada enzima tem afinidade pelo seu substrato e o
converte com alto grau de produção do produto almejado e a rapidez com que obtenha
o mesmo. Hoje em dia, também existem catalisadores sintéticos, porém, apresenta
uma especificidade menor, ou seja, pode ocorrer a formação de compostos
indesejados, mas em compensação, apresenta uma faixa maior de tolerância aos
fatores que influenciam na cinética enzimática, que não é tão tolerante para um
catalisador biológico1,2.
A enzima é uma espécie de molécula que facilita a interação entre os
substratos, assim então, formando produtos. A região do espaço que ocorre esse
fenômeno é o sítio ativo, no qual é extremamente pequeno e apresenta conformação
tridimensional. O substrato é ligado à enzima por meio de múltiplas forças fracas e a
sua especificidade da ligação depende do arranjo precisamente definido no sítio ativo
da enzima.
Os catalisadores biológicos não interferem no equilíbrio da reação, eles
diminuem a barreira da energia de ativação, isto é, a energia necessária que se deve
fornecer ao sistema para que o reagente se transforme em produto. A enzima participa
da reação, no entanto, ela não é cosumida, ou seja, a sua concentração se mantém
inalterada e o equilíbrio termodinâmico de um sistema químico é mantido, ou seja,
tanto o estado inicial e final se mantém constante1.

Gráfico 1. Um gráfico mostrando a mesma reação química, porém, uma com enzima
(reação 2) e outro não (reação 1)2.

Em geral, as enzimas catalisam um único produto, entretanto, há alguns que


tem afinidade por mais um, isso é decorrente da especificidade das mesmas nas quais
estão relacionadas com a configuração complexa da proteína, localização do sítio
ativo e a configuração estrutural do substrato.
Os fatores que influenciam na cinética enzimática estão esquematizados a
seguir1:
Fatores Temperatura

Concentração pH Concentração de Força iônica


da enzima ligantes (inibidores,
substratos e
ativadores)

Para um sistema com um único substrato, a cinética enzimática pode ser


representada como mostrada a seguir:
𝐸 + 𝑆 ⇋ 𝐸𝑆 ⇋ 𝐸𝑃 ⇋ 𝐸 + 𝑃 (1)
Onde: E → enzima
S → substrato
ES → complexo enzima-substrato
EP → complexo enzima-produto
P → produto

Para a graduação, algumas considerações são feitas, tais como: EP é


desconsiderado e o produto não é revertido para o substrato inicial. Sendo assim,
pode-se escrever a equação como:
𝐸 + 𝑆 ⇋ 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃 (2)
Um dos modelos mais conhecidos de cinética enzimática é o modelo de Henri-
Michaelis-Menten1,2, no qual diz que a velocidade de reação está relacionada com a
concentração do substrato.
𝑉 .[𝑆]
𝑣 = 𝐾𝑚𝑎𝑥 (Eq.1)
+ [𝑆]
𝑠

Grafico 2. Gráfico de Henri-Michaelis-Menten1.

Quando a constante da reação da primeira etapa k1 é muito maior do que a k2,


considera-se que ks=km (constante de Michaelis-Menten), isto é, significa que a
dissociação ES para E e S é muito mais rápida do que a formação de P. Quando o
valor de ks for alto, a ligação é fraca; quando o seu valor é baixo, representa que a
ligação é forte.
Para estimar os parâmetros Km e Vmax da Equação 1, pode-se utilizar os
métodos gráficos, tais como: Recíprocos de Lineweaver-Burk1,2, Hanes-Woolf1,2,
Woolf-Augustinsson-Hofstee1, Eadie-Scatchard1 e entre os outros. Neste relatório será
monstrada as três primeiras.

● Gráfico dos recíprocos de Linewearver-Burk (1/v vs 1/[S])


É um método baseado no rearrajo da equação de Henri-Michaelis-Menten
numa forma linear (y=mx+b) que é mostrada a seguir:
1 𝐾𝑚 1 1
= × [𝑆]
+ (Eq.2)
𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉
𝑚𝑎𝑥

Gráfico 3. Método gráfico dos recíprocos de Lineweaver-Burk para estimar o Km e


Vmax2.

Através do gráfico 1, percebe-se que ao plotar o mesmo, a reta que corta o


eixo abscissa nos fornece o valor do Km e depois substitui-se no coeficiente angular
da reta (Km/Vmax), assim encontra-se o valor de Vmax. Este último parâmetro também
pode ser obtido ao pegar o valor que a reta intersecta no eixo y.

● Gráfico de Hanes-Woolf ([S]/v vs [S])


Este método também é um rearranjo da equação 1 numa forma linear:
[𝑠] 𝐾 [𝑆]
= 𝑚 + (Eq.3)
𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

Gráfico 4. Método gráfico de Hanes-Woolf para estimar o Km e Vmax1.

Os parâmetros podem ser encontrados primeiramente obtendo tanto o valor do


Vmax ou Km, conseguindo um dos valores, o outro pode se obtido com o valor que a
reta intersecta com o eixo y.

● Gráfico de Woolf-Augustinsson-Hofstee (v vs v/[S])

Gráfico 5. Método gráfico de Woolf-Augustinsson-Hofstee para estimar o Km e Vmax.


Da mesma maneira, pode-se obter um dos valores do parâmetro e obtendo o
outro em seguida, como mostrado no gráfico.

Sabe-se que a enzima reduz a energia de ativa de uma reação química, logo,
pode-se utilizar a equação de arrhenius em forma logaritimica:
𝐸𝑎 1
ln(𝐴) = ln(𝐴∗ ) − 𝑅 . 𝑇 (Eq.4)
Onde: A → Atividade enzimática
A* → Fator de frequência para a reação
Ea → Energia de ativação
T → Temperatura

Tendo os dados de ln(A) e temperatura, por meio de um gráfico ln(A) vs 1/T,


obtém-se os valores de A* e Ea.

Durante uma reação química, pode haver outros fatores que influenciam na
cinética enzimática, além dos citados anteriormente, que são a presença de inibidor,
no qual é uma substancia que reduz a taxa de uma reação. Os inibidores podem ser
classificados em irreversíveis ou reversíveis.

● Inibição reversível
Este tipo de inibição é subdividido ainda em competitiva, não competitiva e
acompetitiva.

- Competitiva
Um inibidor competitivo é uma substância que se combina com uma enzima
livre de uma forma tal que impede a ligação do substrato. Isto é, o inibidor e o
substrato são mutuamente exclusíveis, em geral, porque há uma verdadeira
competição pelo mesmo sítio. A combinação do inibidor com a enzima provoca uma
mudança na conformação da mesma que deforma o sitio do substrato, sendo assim,
impede o substrato de se ligar. A seguir está alguns desenhos desse tipo de inibição:

Figura 1. (1) modelo clássico , S e I competem pelo mesmo sitio de ligação. (2) I e S
são mutuamente excludentes por causa de impedimento estéreo. (3) I e S possuem um
sitio comum de ligação. (4) os sítios de ligação para I e S são distintos, mas se
sobrepõem. (5) a ligação de I em um sitio inibidor distinto causa uma mudança
conformacional na enzima que não permite a ligação do substrato2.

Esse tipo de inibição, afeta a afinidade da enzima pelo seu substrato (Ks), sem
afetar a reatividade di complexo ativo enzima-substrato (Vmax). Esse problema pode
ser resolvido ao aumentar a concentração do substrato. O grafico típico dessa inibição
está a seguir:

Gráfico 6. Gráfico de uma inibição competitiva (1/v vs 1/[S])2.

- Não competitivo
Um inibidor não competitivo clássico não tem efeito na ligação do substrato e
vice-versa. Substrato e inibidor se ligam reversível, aleatório e independentemente em
sítios diferentes. Isto é, inibidor se liga a enzima e ao complexo enzima-substrato;
substrato se liga a enzima e ao complexo enzima-inibidor. Entretanto, o complexo ESI
resultante é cataliticamente inativo. O inibidor pode impedir o posicionamento
adequado do centro catalítico.
Esta inibição afeta a reatividade da enzima pelo seu substrato (Vmax), sem
afetar a afinidade do complexo ativo enzima-substrato (Ks). A seguir estão um
esquema da inibição não competitiva e gráfico da mesma.

Figura 2. Esquema de uma reação não competitiva.

Gráfico 7. Gráfico de uma inibição não competitiva1.

- Acompetitivo
É uma inibição mista, isto é, afeta tanto a afinidade de enzima por substrato
como a reatividade de enzima-substrato. A seguir estão um esquema da inibição
acompetitiva e gráfico da mesma.

Figura 3. Esquema de uma inibição acompetitiva.


Gráfico 8. Gráfico de uma inibição acompetitiva2.

A enzimologia é um ramo que está em estudo ainda, pois há muitos


mecanismos de reação nos quais o homem desconhece, pois cada enzima tem sua
respectiva especificidade e mecanismo de reação. Portanto, há muitos estudos a serem
realizados, modelos matemáticos a serem modelados, simulados e otimizados.

Bibliogradia

1) Borzani,Walter; Lima, Urgel de Almeida; Aquarone, Eugênio; Schmidell,


Willibaldo; Biotecnologia industrial - Fundamentos; Editora Edgard Blucher LTDA;
volume 1;

2) Júnior, A. Furigo; Pereira, ; Enzimas e suas aplicações enzimáticas-Engenharia


Bioquímica; Departamento de Engenharia química e de alimentos da Universidade
Federal de Santa Catarina;