ICB057 – Introdução à Sistemática Molecular- Quarto Tutorial

Prof. Almir R. Pepato

Aluno:

Programas/Algoritmos a serem abordados:

 TNT “Tree Analysis using new Technology”

Instruções básicas:

Não pule nenhum passo, siga com a turma cada etapa deste tutorial. Lembre-se: Ele é parte
de sua avaliação. Você deve preenchê-lo de maneira sucinta, mas completa, eventualmente
com a captura de telas (Ctrl+PrtScr e Ctrl+V). Ao final da aula, mande o arquivo para
apepato@gmail.com com o assunto “Tutorial DATA ALUNO”.

1- TNT

Obviamente o tutorial não abarca todas as análises possíveis com o TNT. Vamos tentar um
tutorial que vai do começo ao fim do básico, usando principalmente a interface gráfica no
Windows. Ou seja: Carregar os dados, buscar a árvore mais parcimoniosa, estimar o suporte
e os índices descritivos básicos (CI, RI)

1.1- Para iniciar o TNT basta clicar sobre seu ícone na área de trabalho.

1.2. Em primeiro lugar, vamos analisar um pequeno conjunto de dados utilizando a opção de
busca exata do programa. O primeiro passo, naturalmente é abrir os dados. O caminho é
File>Open input file. Selecione o arquivo cytbmamiferos.nex obtido a partir da Mammalian
Mitochondrial Genomics Database (http://www.mammibase.lncc.br/). Caso o arquivo não abra
corretamente, repare se o programa de fato esperava que o tipo de dados a serem lidos fosse
sequências de DNA. O caminho é Format>Data format>DNA

1.3 Para rodar uma análise tradicional (com mecanismos de busca como TBR e SPR) siga o
caminho Analyze>Traditional Search. Neste sub-menu vamos tentar algumas opções:

1.3.1- Rode uma análise com as opções de default. Quantos rearranjos (árvores) foram
testados?Qual o comprimento da menor árvore encontrada?

1.3.2-Tente mudar os valores para 10 e 1000 (10 sequências de acréscimo de táxons e 1000
sessões de busca). Que mensagem de erro aparece? Quantas árvores foram visitadas? Qual o
comprimento mínimo obtido?

1.3.3 O problema que tivemos na tentativa anterior foi de alocação de memória. Para análises
mais exigentes é necessário reter mais árvores por iteração. Para isso siga o caminho
Settings>Memory e aumente para 10000 árvores na memória e repita a análise. As mesmas
perguntas: Quantas árvores foram visitadas? Qual o comprimento mínimo obtido?
1.3.4 Inverta: Mude os valores para 1000 e 10 (1000 sequências de acréscimo de táxons e 10
sessões de busca). Quantas árvores foram visitadas? Qual o comprimento mínimo obtido? Este
método é mais ou menos eficiente que o anterior?

1.4 Repita o item 1.3.3. Parabéns! Vc tem a árvore mais parcimoniosa! Agora seria boa idéia vê-

la. Vc pode fazê-lo simplesmente clicando no ícone . Além disso, uma boa idéia é salvá-la
em um arquivo, de forma a utilizá-la no futuro. Siga o caminho File>Tree Save File> Open,
parenthetical (append). Essa opção leva à criação de um arquivo com as árvores em notação
parentética. A cada nova busca árvores podem ser adicionadas ao arquivo. Para de fato salvar
as árvores deve-se seguir o caminho File>Tree Save File> Save trees to open file. Para ver o que
está salvo lá, siga o caminho File>Tree Save File> Close tree file e feche o arquivo. Abra o
arquivo no notepad e cole a árvore em notação parentética abaixo:

1.5 Para obter valores de suportes associados aos nós através de “bootstrapping”: Em
primeiro lugar, vc deve ter ao menos uma árvore ativa no buffer de memória. Não é
obrigatório, mas é uma boa idéia, ter aberto um arquivo de árvores. Para que os valores sejam
guardados na memória vc precisa primeiro solicitar que ele associe esse tipo de valor à árvore.
Isso é feito seguindo o caminho Trees>Multiple tags >Store tree tags.

1.5.1 Em seguida siga o caminho Analyze>Resampling. Escolha “Resampling matrix with...”

Bootstrap e “Standard (sample with replacement)”; como o TNT é um programa veloz e o
conjunto de dados é pequeno podemos fazer 1000 replicas ao invés de 100 e no item
“Cutof...” escolha a opção “Use groups from tree” (como vc só tem uma árvore é só selecionar
essa opção. Caso contrário, vc teria que escolher uma das árvores guardadas na memória. Tecle
“OK”.

1.5.2 A análise termina e parece que não aconteceu nada, não é? Mas agora volte ao sub-
menu “trees” e siga o caminho Trees>Multiple tags >Show/Save tags. Repare que esse caminho
agora está disponível (antes dos cálculos não estava). Aparecerá a arvore com os valores de
bootstrap anotados. Essa opção, como verificaremos depois, também salva esses valores no
arquivo aberto para o registro de árvores.

1.5.3 Aí talvez tenha encontrado um Bug no programa, mas aparentemente minha versão não
salvava as arvores através da interface gráfica do Windows. Nesses casos, temos uma bela
oportunidade para usar os comandos de linha. Tecle na barra de comandos “save *;”. Feche o
arquivo de árvores, abra-o no notepad, recorte e cole a árvore em notação parentética com os
valores abaixo.

1.6 Para obter os valores de suporte de “Bremer”: O suporte de Bremer é calculado graças à
comparação dos comprimentos da árvore ótima com o de árvores subótimas. Para tanto, o
programa precisa dessas árvores na memória. Então repetiremos as análises salvando as
árvores sub-ótimas através do caminho: Analyze>suboptimal. Em seguida aparecerá uma
janela em que se pode optar por o quão inferiores serão as árvores em relação a sua árvore
ótima. Uns 20 passos são o bastante para o nosso caso.
1.6.1 Da mesma forma que para os valores de bootstrap, para que os valores sejam guardados
na memória, vc precisa solicitar que ele associe esse tipo de valor à árvore. Isso é feito
seguindo o caminho Trees>Multiple tags >Store tree tags

1.6.2 Também no subdiretório Trees procure pela opção Bremer support. Abrirá uma janela.
Pressione OK e siga com os valores de default mesmo.

1.6.3 Repetindo o que fizemos para Bootstrap, voltamos ao sub-menu “trees” e siga o caminho
Trees>Multiple tags >Show/Save tags. E depois salvamos com save *; Se vc conseguiu seguir
sem interrupções esse tutorial, a árvore salva terá os dois valores: bootstrap e Bremer. Recorte
e cole abaixo.

1.7 Índices de consistência e retenção (CI e RI). Este item é útil para exemplificar o uso de
scripts no TNT. Scripts são conjuntos de comandos, seja no TNT ou em outro programa ou
sistema operacional. O TNT vem acompanhado por vários scripts. Um usuário avançado
comumente prefere preparar seus próprios scripts.

Para rodar um script basta digitar seu nome. No nosso caso: “stats”. Anote abaixo os valores de
RI e CI.

1.8 Escolhendo um novo ponto de enraizamento. Por default, a árvore é exibida enraizada no
primeiro elemento da matriz (no nosso caso 'Ornithorhynchus_anatinus'). Para enraizar a
árvore em outro ponto use o caminho Data>outgrup taxon e escolha um novo grupo externo.
Depois vá a Trees>reroot. Pronto, vc mudou o ponto de enraizamento.

1.9 Consenso. Eventualmente você pode obter mais de uma árvore ao fim de sua análise. Faça
uma análise tradicional da matriz nd1mamiferos.nex. Quantas árvores mais parcimoniosas

foram encontradas? Para obter o consenso estrito delas, clique no ícone . Na janela que
se abrirá escolha a opção “Save to RAN” para manter a árvore junto com as duas originais de
forma a salvá-las todas ao gravar as árvores no arquivo para salvamento de árvores (vimos os
detalhes disso acima). Agora verifique o comprimento das árvores na memória (com o botão

). O consenso tem o mesmo comprimento que as demais árvores?

1.9 Buscas com novas tecnologias. Agora que você já conhece os elementos básicos do
programa, faça algumas experiências de combinações de parâmetros de busca na janela que
encontrará ao fim do caminho Analyze> New Technology Search. Faça ao menos quatro
combinações diferentes e anote abaixo quantas vezes o programa encontrou a árvore mais
parcimoniosa.