MICROBIOLOGIA

Microbiologia

A microbiologia é o ramo da Biologia que estuda os microrganismos.

A palavra microbiologia, deriva da combinação das palavras gregas mikros, "pequeno", bios e lo-
gos "estudo da vida".

Os microrganismos são seres vivos de tamanho pequeno, cujas dimensões não permitem que sejam
observados a olho nu pelo homem. Assim, eles só podem ser visualizados ao microscópio.

O estudo da microbiologia abrange a identificação, forma, modo de vida, fisiologia e metabolismo dos
microrganismos. Além das suas relações com o meio ambiente e outras espécies.

Os principais grupos de microrganismos são: vírus, bactérias, protozoários, algas e fungos.

De modo geral, os microrganismos contribuem na fertilização do solo, reciclagem de substâncias e

participam de ciclos biogeoquímicos. Ainda podem ser usados na fabricação de produtos como io-
gurte, vinhos, queijos, vinagres e pães.

Existem ainda os microrganismos patogênicos que causam doenças em seres humanos, animais e
plantas.

Vírus

Os vírus são organismos microscópicos que não possuem células. Por isso, são considerados parasi-
tas intracelulares.

Os vírus só conseguem realizar suas atividades vitais dentro de outra célula viva.

Alguns vírus são patogênicos e causam doenças ao homem. Alguns exemplos são: gripe, sarampo,
febre amarela, meningite, caxumba, hepatite, aids e varíola.

Bactérias

As bactérias são seres unicelulares e procariontes. Elas fazem parte do Reino Monera.

As bactérias podem ser encontradas em diversos ambientes e são capazes de suportar condições
ambientais inóspitas à maioria dos seres vivos.

Algumas bactérias podem ser patogênicas e causam doenças como a cólera, difteria, febre tifóide,
lepra, meningite, tuberculose.

Protozoários

Os protozoários são seres eucariontes, unicelulares e heterótrofos.

Eles apresentam variadas formas corporais e ocupam ambientes úmidos ou o interior de outros orga-
nismos.

Alguns são parasitas, causadores de doenças. Entre as doenças causadas por protozoários estão:
amebíase, giardíase, malária e doença de chagas.

No Reino Protista, existe também as algas. As algas são organismos aquáticos que têm a capacidade
de realizar fotossíntese. Elas podem ser micro ou macroscópicas, eucariontes ou procariontes.

Fungos

Os fungos são seres macroscópicos ou microscópicos, unicelulares ou pluricelulares, eucariontes e

heterótrofos. Eles fazem parte do Reino Fungi.

Os fungos possuem diversos tipos de habitat visto que são encontrados no solo, na água, nos vege-
tais, nos animais, no homem e nos detritos em geral.

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Alguns fungos podem ser patogênicos. Entre as doenças relacionadas com fungos estão: micoses,
sapinho, candidíase e histoplasmo.

A existência de seres microscópicos foi levantada há muitos séculos, próximo do século VI a.C. Esses
registros foram feitos através de escrituras que indicavam criaturas que viviam na terra, água, ar e
fogo, que possuíam vida conjunta, e que tinham tempo de vida curto ou longo.

Em 1546, a civilização islâmica registrou que doenças epidêmicas pudessem ser transmitidas por
contato direto ou indireto. Chegou-se a essa conclusão através de observações apenas.

Em 1676 Antonie Van Leeuwenhoek, observou alguns microrganismos e bactérias através de um mi-
croscópio.

Próximo ao século 19, Ferdnand Cohn fundou um subcampo de microbiologia, incentivado por um
trabalho de Louis Pasteur. Ferdnand era botânico, e seu trabalho com algas e bactérias fotossintéti-
cas o levou para o campo microscópico. Pasteur ficou conhecido popularmente como pai da microbio-
logia por ter praticado grande quantidade de trabalhos envolvendo essa ciência, ele teve grande con-
tribuição em processos práticos e teóricos.

Apesar de Pasteur ser considerado o pai da microbiologia, Beijerinck fez duas contribuições importan-
tíssimas para essa ciência, a descoberta dos vírus e o desenvolvimento de técnicas de cultura de en-
riquecimento. Winogradsky também contribuiu de maneira destacada, ele foi responsável pelo pri-
meiro isolamento seguido de descrição de bactérias fixadoras de nitrogênio.

Hoje entendemos como microbiologia o estudo de organismos microscópicos, sendo eles unicelula-
res, multicelulares e acelulares. O uso da microbiologia permitiu compreender e avançar os estudos
sobre a virologia, a micologia, a parasitologia e a bacteriologia. A microbiologia pode ser classificada
como ciência pura ou aplicada e também pode ser classificada de acordo com sua taxonomia.

Fazem parte dos inúmeros seres estudados, com os microrganismos eucarióticos, que possuem or-
ganelas celulares ligadas à membrana, entre eles estão os protistas e os fungos, e procarióticos, que
não possuem membrana, entre eles estão as eubactérias e arqueobactérias.

Os microbiologistas utilizam frequentemente técnicas que envolvem cultura, coloração e a microsco-

pia de microrganismos.

Os vírus são classificados como organismos que possuem moléculas desde muito simples até muito
complexas.

Uma ramificação da microbiologia pode ser considerada para a medicina, sendo introduzida em ca-
sos de imunologia. A microbiologia pode ser muito útil, partindo do principio de que grande parte das
contaminações poderiam ser evitadas através de cuidados básicos, como lavar as mãos ou cobrir o
rosto ao espirrar ou tossir, por exemplo.

A microbiologia pode ser aplicada de diversas maneiras, entre elas:

Microbiologia médica – Estudo dos micróbios patogênicos e sua relação com a imunologia.

Microbiologia farmacêutica – Estudo dos microrganismos relacionados a produção de antibióticos.

Microbiologia industrial – Exploração de microrganismos para uso em processos industriais.

Biotecnologia microbiana – Manipulação genética e molecular de microrganismos.

Microbiologia ambiental – Estudo da função e diversidade dos micróbios em ambientes naturais.

Microbiologia aérea – Estudo de microrganismos que flutuam e se transportam com facilidade no ar.

Os microrganismos são considerados como organismos maléficos para a saúde, porém isso não é
uma completa verdade, os microrganismos possuem funções extremamente importantes para o ciclo
da vida e também apresentam funções importantes de caráter antrópico, resultando em processos
benéficos para a sociedade. Alguns exemplos: produção de antibióticos, álcool, vinagre, queijo, enzi-
mas, etc.

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Pensando somente em processos naturais importantes para o ciclo da vida, os microrganismos po-
dem fazer biorremediação de resíduos e biodegradação de forma natural. Ambas as técnicas são
constantemente estudadas, e associadas ao número altíssimo de lixo que nós produzimos no pla-
neta, lixo esse que não possui destino adequado.

Talvez em um futuro próximo, algum cientista descubra como eliminar grande quantidade de lixo
usando esses microrganismos. Essa técnica já possui estudos avançados com lixos de origem plás-
tica nos mares e oceanos, tendo bactérias que reciclam esse material como protagonistas.

Meios de Cultura em Microbiologia

Milhares de microrganismos vivem no interior e ao redor de nossos corpos e, muitos deles, podem
ocasionar doenças graves. Para estudar os microrganismos foram desenvolvidas diversas técnicas
para isolar e identificar o agente em laboratório.

A microbiologia clínica tem um papel importante no diagnóstico e controle de doenças infecciosas.

Porém a qualidade da análise está diretamente relacionada a qualidade de espécime coletado do pa-
ciente, a maneira como é transportado e as técnicas para detecção do microrganismo na amostra.

A maioria dos testes baseia-se na capacidade de crescimento do microrganismo. Assim, as condi-

ções de coleta e transporte são fundamentais para garantir a viabilidade do patógeno. Mas o que é
necessário para cultivar microrganismos em laboratório?

Diferentes microrganismos têm diferentes exigências para o seu crescimento. Para que seja possível
realizar a cultura e análise em laboratório é necessário conhecer quais as necessidades nutritivas e
condições físicas para cada um.

O material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos é chamado de meio de cultura.

Pelo fato de a cultura em laboratório ser requerida para o estudo detalhado de qualquer microrga-
nismo, é necessária atenção criteriosa na seleção e no preparo dos meios para que o cultivo seja
bem-sucedido.

Deve-se verificar também a quantidade de água suficiente, pH adequado e a presença ou não de oxi-
gênio.

Cultivo de Microrganismos em Laboratório

Para a identificação do patógeno é necessário que uma amostra seja obtida do lugar da infecção. A
amostra deve ser coletada com cuidado evitando contaminação com outros organismos.

Depois o meio de cultura com os nutrientes necessários é preparado e esterilizado. Assim, garante-se
que não há nenhuma outra forma de vida ou contaminação no meio. O patógeno é então inoculado.

A cultura é incubada em condições que permitem o crescimento. Normalmente a inoculação será de

uma cultura pura em um meio líquido ou sólido.

Classificação das Bactérias

As bactérias são organismos procariontes agrupados, de acordo com a classificação de cinco reinos,
no Reino Monera. Quando analisamos a classificação em três domínios, as bactérias pertencem ao
domínio Eubactéria e Archea, sendo esse último composto por bactérias que vivem em ambientes ex-
tremos, com alta concentração de sal, ácidos e temperatura.

Principais Formas de Classificação das Bactérias

As bactérias são organismos bastante simples que podem ser agrupados de diferentes formas. Anali-
sando a forma e o arranjo das bactérias, temos as seguintes classificações:

Cocos: Bactérias com formato esférico ou oval. Exemplo: Staphylococcus e Streptococcu.

Diplococos: Duas bactérias em formato de cocos unidas;

Tétrades: Quatro cocos agrupados;

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Sarcina: Oito cocos unidos formando uma estrutura semelhante a um cubo;

Estreptococos: Cocos unidos como uma cadeia (veja figura do início deste texto);

Estafilococos: Cocos agrupados como um cacho de uvas.

Bacilos: Bactérias com formato cilíndrico ou em forma de bastão, que pode ser curto ou longo. Exem-
plo: Escherichia, Bacillus e Clostridium.

Diplobacilos: Bacilos dispostos aos pares;

Estreptobacilos: Bacilos unidos formando uma cadeia.

Espiraladas: Bactérias com formato espiral. Exemplo: Vibrio cholerae e Leptospira.

Espirilos: Bactérias em forma de espiral que apresentam corpo rígido e locomovem-se com a ajuda
de flagelos;

Espiroquetas: Bactérias em espiral que são mais flexíveis e locomovem-se por contrações citoplas-
máticas;

Vibriões: Bactérias que apresentam corpo semelhante a uma vírgula.

Observe os diferentes formatos e arranjos das bactérias.

Existem ainda bactérias que se apresentam como um bacilo extremamente pequeno. Elas são consi-
deradas uma forma de transição entre cocos e bacilos e recebem a denominação de cocobacilo.

Além da classificação a partir da morfologia das bactérias, esses organismos podem ser classificados
ainda em micoplasmas, gram-positivas e gram-negativas. Essa forma de classificação analisa a estru-
tura da parede celular das bactérias.

Recebem a denominação de micoplasmas aquelas bactérias que não possuem parede celular. As
bactérias gram-positivas destacam-se pelas várias camadas de peptidoglicano em sua parede. Já a
parede da bactéria gram-negativa é mais complexa e apresenta uma camada mais estreita de pepti-
doglicano, mas com uma membrana externa de lipopolissacarídeo e outras macromoléculas comple-
xas.

Coloração de Gram Para Diferenciar Bactérias Gram-Positivas E Gram-Negativas

Para identificar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, utiliza-se uma técnica conhecida
como coloração de Gram. Nessa técnica, inicialmente, utiliza-se o corante violeta de cristal, submete-
se a bactéria a uma solução de iodo, que aumenta a afinidade do corante com a célula, e, posterior-
mente, utiliza-se um solvente.

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As bactérias gram-negativas, após serem submetidas às solventes, descoloram-se, mas isso não
ocorre com a gram-positiva. Após descoloração, as bactérias são submetidas à fucsina ou safranina.

As bactérias gram-positivas, ao final do procedimento, ficam coradas de roxo em virtude da atuação

do violeta de cristal. As gram-negativas, por sua vez, ficam coradas de vermelho por causa da fuc-
sina.

Essa coloração é uma forma importante para diferenciar bactérias e garantir a escolha adequada de
um antibiótico em casos de doenças, por exemplo.

Principais Métodos de ColoraçãoA perfeita visualização dos micro-organismos e/ou das suas estrutu-
ras só é possível se, além da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação estiver ade-
quada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do micro-organismo a ser
avaliado. Duas técnicas são empregadas: a fresco (direto e sem coloração) e fixado e corado.

De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de corantes, principalmente
aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de metileno, cristal violeta e fucsina básica).
Dentre todos os métodos existentes, aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de mi-
crobiologia são os métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.

A Fresco: As preparações deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas condições normais
de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações: quando a morfologia fica distorcida
devido aos processos de fixação e coloração, durante a verificação da motilidade, durante os proces-
sos fisiológicos (divisão celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacú-
olos e material graxo).

Entre Lâmina e Lamínula: Salina

Esta técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio líquido e fungos. A técnica
consiste em gotejar com o auxilio de uma alça de platina, esterilizada, no centro da lâmina, uma gotí-
cula da cultura a ser investigada.

Ou um fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser analisado. Em seguida cobrir com la-
mínula e examinar ao microscópio.

Hidróxido de Potássio (KOH): esta técnica é usada para pesquisa de fungos, proveniente de material
biológico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A técnica consiste em colocar uma pequena
amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina; suspender o material com uma
ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a
lâmina para acelerar o clareamento.

Exame de Campo Escuro: esta técnica é empregada para observar a motilidade de bactérias dificil-
mente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em atritar as bordas da le-
são suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o exudato com a própria alça ou fazer um
imprint com a lâmina e cobrir com a lamínula (utilizar uma gota de salina).

Realizar a pesquisa rapidamente. Ou, se o material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e
examinar o sedimento. A microscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.

Tinta da China (nanquim): esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido cefalorraqui-
diano e outros materiais permitindo destacar a cápsula deste fungo contra um fundo negro.

A técnica consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano sedimentado ou uma amostra do meio de cul-
tura líquido e ressuspender em uma gota de tinta da china fazendo um filme bem delgado entre lâ-
mina e lamínula.

Fixados e Corados: as preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características
morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das bactérias, pois tornam mais fácil a visua-
lização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do micro-organismo em rela-
ção às colorações diferenciais.

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Coloração Azul de Metileno: esta técnica é utilizada principalmente na avaliação da morfologia de

bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados as células são meno-
res devido ao menor número de manipulações. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o
esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos.

Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observa-
ção ao microscópio.

Coloração de Wright Giemsa: esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfrega-
ços sanguíneos, para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para demonstrar
inclusões intracelulares em esfregaços diretos, de pele ou mucosas.

Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar
por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para
posterior observação ao microscópio.

Coloração de Gram: a coloração de Gram, descoberta há pouco mais de 100 anos por Hans Christian
Joaquim Gram é utilizada com muita frequência para o exame microscópico direto de amostras e sub-
cultivos, para demonstrar as propriedades tintoriais de todos os tipos de bactérias.

As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram
negativas. A diferença básica entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celula-
res.

A técnica consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e iodeto
de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então, tratada
com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir as células.

As bactérias Gram positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração
e aparecem em azul escuro. As bactérias Gram negativas não são capazes de reter o complexo cris-
tal violeta e iodo após a descoloração e são contra coradas com um segundo corante (fucsina ou sa-
franina), chamado corante de contraste e adquirem a coloração vermelha.

Coloração de Ziehl-Neelsen: esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes
(BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo que é resistente
a coloração.

Para o corante penetrar na célula é necessário calor ou detergente. Uma vez coradas, as bactérias
álcool-ácido resistentes resistem à descoloração, enquanto outras bactérias descoram com o álcool-
ácido.

A técnica consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina (aquecer 3 vezes),
descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.

Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

O reconhecimento do padrão de sensibilidade à terapêutica antimicrobiana é fundamental na medida

em que se assiste ao aparecimento de estirpes microbianas resistentes a alguns antibióticos que, por
isso, deixam de ser eficazes no tratamento das infecções.

Contudo, o antibiograma não deverá ser efectuado em espécies bacterianas de padrões de suscepti-
bilidade e resistência conhecidos.

Por exemplo, não está indicado fazer esse estudo quando isolado Streptococcus β hemolítico já que
todas as estirpes são sensíveis a penicilina. Por outro lado, o teste de pesquisa da β lactamase de-
verá ser efectuado quando Haemophilus influenzae e N. gonorrhoea. Estirpes resistentes à penicilina
produtoras de β lactamase têm sido isoladas com grande frequência, devendo ser identificadas antes
que a terapêutica antibiótica se inicie.

Existem várias técnicas para determinar a sensibilidade à terapêutica antibiótica, mas, na essência,
baseiam-se na determinação da capacidade que um microrganismo tem de se multiplicar in vitro, na
presença de diferentes fármacos.

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Fig. 1 – Antibiograma

Em bacteriologia, o teste de sensibilidade aos antibióticos, ou antibiograma, é habitualmente execu-

tado numa placa de Petri, com um meio de cultura sólido (meio Mueller-Hinton agar (1)).

Na placa semeada por inoculação ou espalhamento (suspensão de bactérias semeadas sobre toda a
superfície do meio de cultura), verifica-se que os discos de papel com antibiótico causam, se a bacté-
ria lhe é sensível, um halo de inibição de crescimento bacteriano, enquanto que se a bactéria lhes é
resistente não se forma o halo de inibição suficiente ou há crescimento bacteriano à volta do disco.

No meio líquido com antibiótico, a inibição, maior ou menor, da turvação, causada pelo crescimento
bacteriano, dá-nos a medida da sensibilidade da bactéria ao antibiótico.

Em Parasitologia, no caso de alguns protozoários, e em Micologia podem ser usados métodos seme-
lhantes com medicamentos antiparasitários ou antifúngicos.

Para avaliar in vitro a susceptibilidade bacteriana aos antibióticos ou antibiograma, podem usar-se vá-
rias metodologias:

Métodos de diluição – utilizam-se meios de cultura líquidos ou sólidos adicionados de concentrações

crescentes de um dado antibiótico. A cada um destes meios adiciona-se a mesma quantidade de inó-
culo (suspensão bacteriana). Após incubação a temperatura adequada, observa-se se ocorreu cresci-
mento bacteriano.

É assim possível avaliar a Concentração Mínima Inibitória (CMI, em mg/L) de antibiótico que inibe o
crescimento bacteriano. É igualmente possível para alguns antibióticos determinar também a Concen-
tração Mínima Bactericida (CMB), isto é, a concentração mínima de antibiótico que leva à morte de
99,9% da população bacteriana;

Métodos de Difusão – utilizam-se meios de cultura sólidos em placas de Petri, a inocular com uma
dada suspensão bacteriana por espalhamento à superfície do meio. Na superfície do meio sólido ino-
culado, colocam-se discos de papel impregnados com diferentes antibióticos. O tamanho dos halos,
expresso em milímetros, e traduzido em Susceptível (S), Intermédio (I), ou Resistente (R).

Vários parâmetros podem influenciar o tamanho do halo, pelo que esta técnica tem que ser padroni-
zada. Em clínica utiliza-se muito a Técnica de Kirby-Bauer. Nesta técnica utiliza-se um meio de cul-
tura Mueller-Hinton agar, distribuído em placas de Petri, com uma espessura de meio de cultura de 4
mm.

A densidade de suspensão bacteriana a inocular deve ser equivalente a 0,5 unidades MacFarland
(padrão). A concentração de cada antibiótico nos discos de papel é determinada segundo as normas
do CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). Trata-se de um método qualitativo.

Fig. 2 – E-Teste

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Recentemente foi criado um método de difusão em gelose, nas condições descritas acima, que per-
mite avaliar a CMI (mg/L) de cada antibiótico contra a estirpe bacteriana em ensaio.

Trata-se do E-Teste (Epsilon Test), em que se usa uma tira de plástico impregnada de um gradiente
de antibiótico, tornando possível determinar o CMI pela linha de intercepção do crescimento bacteri-
ano com a respectiva tira.

Actualmente existem alguns sistemas automatizados comercializados já utilizados na rotina laborato-

rial para a execução do teste de sensibilidade aos antimicrobianos.

Notas:

– O do meio de Mueller-Hinton agar contém 30,0% de infusão de carne, 1,75% de hidrolisado de ca-
seína, 0,15% de amido e 1,7% de agar. O pH é ajustado a 7,00 a 25⁰C. Quando se realiza testes de
susceptibilidade com espécies de Streptococcus, também se costuma adicionar 5% de sangue de
carneiro de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+).

É ainda importante referir-se que o amido absorve toxinas produzidas pelas bactérias, pelo que deste
modo os metabolitos bacterianos não interferem com os antibióticos em estudo.

– As unidades de MacFarland, usadas para medir comparativamente a turvação de uma suspensão

bacteriana, são medidas através da mistura de quantidade específicas de cloreto de bário e ácido sul-
fúrico, que reagem e originam um precipitado de sulfato de bário. Um padrão de 0,5 unidades Ma-
cFarland corresponde à mistura de 0,05 mL de cloreto de bário diidratado (BaCl2•2H2O) a 1,175%,
com 9,95 mL de ácido sulfúrico a 1%.

Armas Biológicas

As armas biológicas são as mais temidas na atualidade, pois são capazes de devastar várias socie-
dades contaminando a água, o ar, a terra e os alimentos. São feitas a partir de toxinas, bactérias, ví-
rus, fungos ou outros microorganismos que são fabricados em laboratório e prejudicam a saúde do
homem.

Atualmente existem laboratórios produtores de armas biológicas espalhados pelo Iraque, Irã, Síria,
Líbia, Índia, Paquistão, China, Estados Unidos, Rússia, Coréia do Norte e Afeganistão. As armas bio-
lógicas mais fabricadas são feitas a partir do Anthrax, Botulismo, Varíola e Ebola, pois são baratos,
de fácil transporte e de grande potência devastadora, em pouca quantidade destrói grande território.

Tais agentes patológicos ao serem inalados, ingeridos e acesso por meio das vias cutâneas conse-
guem agir rapidamente no organismo tornando-se extremamente letal. Inicialmente os indivíduos sen-
tem os mesmos sintomas da gripe, porém após um rápido tempo começam a sentir dores pelo corpo,
irritação da garganta, tosse, catarro e manchas sobre a pele.

A guerra movida por questões políticas, religiosas ou por território é a justificativa para tais produ-
ções, uma vez que se lançadas sobre um território podem, dependendo do agente utilizado na fabri-
cação, matar a sociedade em cinco dias. A intrigante produção de tais agentes patológicos coloca em
questão a falta de tratamento para muitas doenças incuráveis, pois assim como o homem é capaz de
produzir agentes que matam deveria também ser capaz para encontrar a fórmula de cura.

Armas biológicas são agentes vivos patogênicos (vírus, fungos, bactérias, etc) que são utilizados para
atingir e contaminar um grande número de pessoas.

Esses artefatos são manipulados há séculos - existem registros de contaminações, quando os exérci-
tos usavam cadáveres em deterioramento para contaminar o abastecimento de água ou quando lan-
çavam corpos de vítimas de varíola em território inimigo. Os registros mais recentes são os dos atos
terroristas que enviavam correspondências contaminadas com Anthrax.

Ainda não houve uma grande contaminação (em massa), até porque este evento só pode ser efetu-
ado com um grande apoio científico-militar, ou seja, em período de uma grande guerra ou por grupos
terroristas bem treinados.

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A arma biológica de maior potencial conhecida é o anthrax, uma doença causada pela bactéria Baci-
llus anthracis. Típica de regiões agrícolas da Ásia, África e América Latina, a transmissão da doença
se dá quando esporos da bactéria penetram algum ferimento cutâneo, ou quando os mesmos são
inalados ou ingeridos.

Na pele, que corresponde a 95% dos casos, a doença se manifesta como uma infecção com pus, se-
melhante ao furúnculo, formando posteriormente uma mancha-negra. No caso de inalação, provoca
pneumonia, febre alta e dificuldades respiratórias, e geralmente é fatal.

Uma guerra biológica pode produzir efeitos assustadores, por isso um grupo de países assinou um
acordo em 1972 para evitar tal guerra, mas de fato, esse acordo não estipula penalidades e nem faz
um controle rigoroso, apenas registrou a intenção destes países.

O que é uma Arma Biológica?

É um artefato desenvolvido para espalhar agentes vivos – vírus ou bactérias – capazes de infectar
um grande número de pessoas. Há registros de manipulação de agentes infecciosos para contaminar
inimigos desde o século 14.

É quase impossível desenvolver armas biológicas eficazes sem um aparato científico-militar. Por isso,
um ataque desse tipo só aconteceria numa guerra ou feito por terroristas muito bem treinados por go-
vernos que detenham essa tecnologia. Felizmente, até agora um desastre como esse ainda não
aconteceu.

Mas, se algum maluco decidir fazer um ataque em massa, a gente torce para que ele não escolha o
antraz, a arma biológica com maior potencial de destruição. “Com o antraz não há chance de contá-
gio de homem para homem.

Mas, dependendo do agente utilizado na arma biológica, a transmissão pode ocorrer também de indi-
víduo para indivíduo, causando uma epidemia e aumentando seu efeito devastador”, afirma o geneti-
cista Roque Monteleone Neto, membro da Comissão de Vigilância, Verificação e Inspeção da ONU.

As armas biológicas são tão temidas quanto as químicas, que usam substâncias tóxicas como gases
mortais criados em laboratório.

De fato, elas têm várias semelhanças: causam mortes em massa, preservam a infra-estrutura física
(edifícios, documentos, etc.) e podem ser espalhadas sem explosões. Para evitar que esses artefatos
sejam usados com propósitos militares, 144 países assinaram em 1972 uma convenção internacional.
O problema é que o acordo é só uma espécie de carta de intenções – ou seja, não estipula penalida-
des para os infratores.

O Ataque

Perigo Aéreo

O jeito mais mortal de fazer um ataque com antraz seria uma pulverização aérea por spray. Para flu-
tuar na altura ideal para infectar o ser humano, cada partícula com esporos de antraz precisaria ter de
10 a 15 mícrons, cinco vezes menor que o diâmetro de um fio de cabelo

Efeitos Nefastos

Em condições ideais, um ataque biológico com 100 quilos de antraz tem potencial para matar até 3
milhões de pessoas. No mesmo cenário, uma tonelada de gás sarin, uma arma química, causaria
“apenas” 8 mil mortos

A Arma

Bactéria Mortal

O Bacillus anthracis, nome científico do antraz, é uma bactéria comum na natureza, que infecta bois e
ovelhas pela alimentação. O homem pode ser contaminado de propósito ou por acidente, pelo con-
tato da bactéria com a pele, por inalação ou ingestão

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Semente do Mal

Para causar destruição em massa, o antraz precisaria ser manipulado em laboratório para assumir a
forma de esporo, um estágio em que a bactéria resiste a altas temperaturas e à falta de água, mas
permanece viva e capaz de causar infecções

Fauna Condenada

Na natureza, o antraz pode contaminar não apenas o homem, mas qualquer mamífero que inale o es-
poro. A bactéria pode ficar “incubada” por várias décadas no ambiente, impossibilitando a vida hu-
mana no local

A Doença

Primeiros Sintomas

O corpo humano oferece condições para o esporo se alojar e voltar à ativa na forma de bactéria. Se o
esporo for inalado, o primeiro sintoma é uma gripe. Se o esporo entrar em contato com a pele, apare-
cem pequenas feridas. Isso acontece em até uma semana

Contaminação na Pele

Quando o esporo de antraz só atinge a pele, menos mal: a irritação na pele leva de um a dois dias
para se transformar em feridas abertas com um caroço escuro exposto. Apesar do aspecto horrível,
apenas 20% dos casos não tratados com remédios são fatais

Contaminação Pulmonar

Quando a pessoa inala um esporo de antraz, a coisa fica feia: a infecção que parecia uma simples
gripe contamina rapidamente os pulmões e se espalha pela corrente sanguínea, liberando componen-
tes tóxicos que levam à morte em 48 horas

A Cura

Para quem apresentou os sintomas de infecção pulmonar por antraz, não tem jeito: não há remédio
que salve. Mas é importante medicar possíveis vítimas com antibióticos para inibir a bactéria nos es-
tágios iniciais da contaminação. Existe vacina contra o antraz, mas ela precisaria ser aplicada antes
do ataque, custa caro e tem fortes efeitos colaterais

Limpando a Área

Para eliminar os esporos do ambiente, veículos, prédios e até o solo devem ser esterilizados com
produtos químicos, como formol, ou incinerados. Só para dar uma idéia, o governo britânico levou
mais de quatro anos para limpar a inabitada ilha escocesa de Gruinard, palco de testes com antraz na
Segunda Guerra

Considerada a mais temidas das armas, a biológica tem efeitos devastadores e desconhecidos pela
maioria dos médicos.

São vírus e bactérias transformados geneticamente em laboratórios para se tornarem resistentes aos
tratamentos. Podem matar ou incapacitar um inimigo, ou animais e plantas de uma nação adversária.

O uso de armas biológicas, feitas com vírus e bactérias, é impossível de ser detectado por equipa-
mentos de segurança. Armas que podem dizimar populações ao contaminar o ar, a água ou os ali-
mentos e para as quais não há tratamento.

Uma forma de guerra biológica já era praticada na Antiguidade, quando os exércitos usavam cadáve-
res putrefatos para contaminar o abastecimento de água de uma cidade sitiada, ou atiravam dentro
das muralhas inimigas cadáveres de vítimas de varíola.

Atualmente entre essas armas estão bactérias (ou as toxinas que produzem), vírus e fungos. Labora-
tórios de guerra bacteriológica foram criados pelas superpotências, EUA e a ex-URSS, durante a
Guerra Fria. O único uso documentado de armas biológicas em combate foi pelos japoneses contra

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cidades chinesas no final da década de 30 e início da década de 40. Também foram atribuídos aos
japoneses experimentos com agentes bacteriológicos em “cobaias” humanas (principalmente prisio-
neiros de guerra).

Esses microorganismos são transformados em armas letais em laboratórios de vários países. Na lista
de produtores de armas biológicas estão Iraque, Irã, Síria, Líbia, Índia, Paquistão e China. Além
disso, o serviço de inteligência americano informou que países como Estados Unidos, Rússia, Irã, Ira-
que, Líbia, Coréia do Norte e Afeganistão mantêm esses laboratórios, onde cultivam as chamadas
armas de destruição de massa.

Documento da Organização Mundial da Saúde, divulgado recentemente, alerta ser real a ameaça do
uso de armas biológicas.

Os especialistas da OMS constatam que “avanços em tecnologia tornaram possível aos terroristas
matarem milhões de pessoas com armas biológicas e químicas”. Eles relatam, em 179 páginas, todos
os conhecimentos disponíveis sobre o bioterrorismo. A OMS recebeu vários telefonemas de governos
solicitando conselhos de como combater uma possível guerra biológica.

Anthrax, botulismo, varíola e vírus Ebola integram o arsenal do terrorismo biológico. Como o antraz, o
botulismo e diversas pestes estão presentes na maioria dos continentes, suas toxinas são facilmente
obtidas. Baratos de produzir e simples de transportar podem atingir com pequena quantidade área
muito grande.

A varíola é adquirida através de um vírus, transmitido pelo ar, por isso a contaminação ocorre através
da respiração.

Essa doença, como as outras usadas como armas, apresenta sintomas semelhantes aos da gripe. A
erupção de pústulas na pele é uma das características da doença.

Os últimos casos confirmados de varíola foram diagnosticados há mais de duas décadas. existem, no
mundo, dois laboratórios conhecidos com estoque de vírus vivo: um nos estados unidos e o outro na
Rússia. após exposição respiratória e um período de incubação de 12 dias, a varíola evolui, em paci-
entes não vacinados, com taxas de mortalidade em torno de 30%.

Dois antivirais disponíveis comercialmente têm atividade contra o vírus da varíola: o cidofovir e a riba-
virina. não se dispõe, atualmente, de vacina comercialmente disponível; os centers for disease control
(cdc) tem uma reserva de alguns milhões de doses da vacina para prevenir uma nova emergência da
doença e outro tanto de imunoglobulina para tratar as potenciais complicações da vacina.

Ebola

O Ebola é um dos agentes de guerra biológica mais temíveis. A mortalidade atinge quase 100%.
Após a contaminação, a pessoa passa a sentir, em uma semana, febre, muita dor de cabeça, falta de
ar, a ter diarréia com sangue e expectoração também hemorrágica. A vítima morre, no máximo, em
duas semanas. Não há tratamento para essa doença contagiosa, transmitida de pessoa a pessoa
pela respiração, catarro, secreção ou, gotículas de tosse. Para uma pessoa ser contaminada bastam
apenas 10 vírus. A disseminação pode ser por aerossol ou, ainda, por alimento ou água contamina-
dos pelo vírus. Classificado como um vírus de fácil cultivo e armazenamento, o Ebola pode ficar vá-
rios anos em um tubo de ensaio até ser espalhado na população. O Ebola é uma arma letal.

Peste Bubônica

A peste bubônica usada como arma biológica é uma das formas mais temíveis por causa da alta in-
fecciosidade, transmissibilidade e mortalidade. Uma vez disseminada, pode perdurar por muitos me-
ses na água e no solo, continuando sua transmissibilidade.

A peste bubônica pode ser disseminada por aerossóis, mísseis, bombas ou através de pulga infec-
tada. 50 quilos de esporos dessa bactéria podem contaminar uma cidade de 5 milhões de habitantes.
Uma vez infectada, a pessoa vai contagiar todas as outras com que tiver contato.

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Os sintomas aparecem em três dias. A doença atinge o ápice em uma semana, período em que a
pessoa pode morrer. Começa com um quadro parecido com gripe, depois aparecem pústulas e gân-
glios generalizado no corpo e úlcera na pele. É altamente contagiosa.

O tratamento é com antibióticos. E conta que é justamente nas regiões do Oriente Médio, África e su-
deste asiático que a bactéria causadora da peste bubônica é cultivada com extrema facilidade. Então,
com certeza, são muitos os países que têm esse agente infeccioso, que pode ainda ser disseminado
por animais domésticos, como o cão, o gato, gado e porcos.

Desinfecção e Esterilização no setor de Microbiologia

A microbiologia é definida como a biologia dos organismos microscópicos que relaciona os organis-
mos “invisíveis a olho nu”, pelo seu tamanho, com as principais doenças infecciosas do homem e de
seus animais domésticos.

Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes, incluindo solo, ar, água e participam de
todas as funções vitais.

Previamente vamos definir os termos que estudaremos nesse trabalho, como limpeza que é o pro-
cesso no qual a remoção da sujeira e do mau odor é feita com água e sabão detergente, já a desin-
fecção, é o processo de destruição dos microrganismos em forma vegetativa, mediante a aplicação
de agentes físicos ou químicos. Falando em destruição de microrganismos, falaremos de esteriliza-
ção, que é a destruição total de todas as formas de vida microbiana diante da aplicação de agentes
físicos ou químicos, com o uso de estufas e autoclaves.

Fundamentação Teórica

Desinfecção

A desinfecção é definida como a destruição parcial dos microrganismos presentes em um determi-

nado ambiente. Os métodos de desinfecção pretendem principalmente destruir as formas microbia-
nas patogênicas ao homem, por meio da utilização de um agente desinfetante ou antimicrobiano.

Os diversos tipos de agentes antimicrobianos podem ser divididos em três grupos: agentes químicos,
físicos e quimioterápicos. O grau de eficiência de cada um deles é dependente da concentração ou
intensidade, das condições do ambiente e do estado das células.

Esterilização

A esterilização é o processo de eliminação completa de todas as formas vivas de um material ou am-

biente. Por meio da esterilização dos meios de cultura e do instrumental usado nos trabalhos, o isola-
mento e a manutenção das culturas puras de microrganismos se tornaram possíveis.

A esterilização pode ser feita por diferentes processos que empregam métodos físicos e métodos quí-
micos. Normalmente são utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esteriliza-
ção para evitar contaminação posterior.

A eficácia da esterilização é monitorada pelo emprego de indicadores. A maioria dos protocolos re-
quer treinamento especial para adequada preparação dos instrumentos com remoção de toda matéria
orgânica, o correto preenchimento da câmara e operação do ciclo de esterilização dentro dos parâ-
metros definidos.

Os métodos mais utilizados são: calor úmido, que provoca a inativação ou coagulação das proteínas
dos microrganismos (autoclavagem) e o calor seco, que provoca a eliminação dos microrganismos
pela oxidação e queima das proteínas (forno de Pasteur e chama).

Em microbiologia a autoclavagem é utilizada na esterilização de material usado na preparação do

meio de cultura e esterilização em geral. O vapor d’água sob pressão e uma temperatura superior a
100ºC destroem os microrganismos e seus esporos, quando produzidos, em um curto espaço de
tempo.

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Tanto o forno de Pasteur como as esterilizações pela chama são processos que requerem temperatu-
ras elevadas por longos períodos.

O processo de esterilização deverá ocorrer da seguinte maneira: Realizar limpeza/desinfecção, utili-

zando solução de detergente enzimático diluído, conforme orientação do fabricante, colocando-o em
recipiente exclusivo para este fim emergido por 4 minutos, Enxaguar em água corrente, secar com
pano limpo; Colocar na estufa por 01 hora a uma temperatura de 170°C sem interrupção. Não abrir a
estufa durante este período; Retirar as peças da estufa e colocá-las em uma caixa (plástica ou metal)
fechada. As peças que forem de material plástico deverão ser desinfetadas imediatamente após o
uso friccionando-os com álcool a 70% e pano limpo.

Limpeza

A Limpeza é o ato de retirar impurezas de um corpo, de um material ou de um local.

A Limpeza Técnica é o processo de remoção de sujidades, mediante a aplicação de energias quí-

mica, mecânica ou térmica, num determinado período de tempo. Consiste-se na limpeza de todas as
superfícies fixas (verticais e horizontais) e equipamentos permanentes, das diversas áreas das Unida-
des de Saúde. É imprescindível que se utilizem critérios de classificação das áreas para o adequado
procedimento de limpeza.

Os métodos de limpeza de superfícies podem ser classificados de três formas: limpeza úmida, lim-
peza molhada e limpeza seca.

Limpeza úmida: consiste-se em passar pano ou esponja, umedecidos em solução detergente ou de-
sinfetante, enxaguando, em seguida, com pano umedecido em água limpa. Esse procedimento é indi-
cado para a limpeza de paredes, divisórias, mobiliários e de equipamentos de grande porte.

É importante ressaltar que a limpeza úmida é considerada a mais adequada e higiênica, todavia ela é
limitada para a remoção de sujidade muito aderida. Na limpeza terminal é necessária a utilização de
métodos mais eficientes para a remoção de sujidades, como a mecanizada.

Limpeza molhada: consiste-se na limpeza de pisos e de outras superfícies fixas e de mobiliários, por
meio de esfregação e de enxágue com água abundante, sendo utilizada principalmente na limpeza
terminal. Na sua realização em pisos recomenda-se o uso de máquinas automáticas que lavam, en-
xáguam e aspiram ao mesmo tempo, principalmente em áreas que não possuam ralos.

Limpeza seca: consiste-se na retirada de sujidade, pó ou poeira, mediante a utilização de vassoura

(varreduras seca), e/ou aspirador.

Conclui-se desse trabalho a diferença entre desinfecção e esterilização dentro de um laboratório de

microbiologia. Vimos que a desinfecção é apenas a destruição parcial dos microrganismos já a esteri-
lização é a destruição total dessas formas vivas. O conceito de limpeza não serve para nenhuma des-
sas duas formas de destruição de microrganismos, pois a limpeza é apenas a retirada da sujeira e
não dos microrganismos.

Principais Métodos de Coloração

A perfeita visualização dos micro-organismos e/ou das suas estruturas só é possível se, além da es-
colha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de pre-
paração depende da informação desejada e do micro-organismo a ser avaliado. Duas técnicas são
empregadas: a fresco (direto e sem coloração) e fixado e corado.

De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de corantes, principalmente
aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de metileno, cristal violeta e fucsina básica).
Dentre todos os métodos existentes, aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de mi-
crobiologia são os métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.

A Fresco: As preparações deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas condições normais
de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações: quando a morfologia fica distorcida

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devido aos processos de fixação e coloração, durante a verificação da motilidade, durante os proces-
sos fisiológicos (divisão celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacú-
olos e material graxo).

Entre Lâmina e Lamínula: Salina

Esta técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio líquido e fungos. A técnica
consiste em gotejar com o auxilio de uma alça de platina, esterilizada, no centro da lâmina, uma gotí-
cula da cultura a ser investigada. Ou um fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser anali-
sado. Em seguida cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.

Hidróxido de Potássio (KOH): esta técnica é usada para pesquisa de fungos, proveniente de material
biológico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A técnica consiste em colocar uma pequena
amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina; suspender o material com uma
ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a
lâmina para acelerar o clareamento.

Exame de Campo Escuro: esta técnica é empregada para observar a motilidade de bactérias dificil-
mente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em atritar as bordas da le-
são suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o exudato com a própria alça ou fazer um
imprint com a lâmina e cobrir com a lamínula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapida-
mente. Ou, se o material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A mi-
croscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.

Tinta da China (nanquim): esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido cefalorraqui-
diano e outros materiais permitindo destacar a cápsula deste fungo contra um fundo negro. A técnica
consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano sedimentado ou uma amostra do meio de cultura lí-
quido e ressuspender em uma gota de tinta da china fazendo um filme bem delgado entre lâmina e
lamínula.
Fixados e Corados: as preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características
morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das bactérias, pois tornam mais fácil a visua-
lização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do micro-organismo em rela-
ção às colorações diferenciais.

Coloração Azul de Metileno: esta técnica é utilizada principalmente na avaliação da morfologia de

bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados as células são meno-
res devido ao menor número de manipulações. Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o
esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida escorre-se o corante,
lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.

Coloração de Wright Giemsa: esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfrega-
ços sanguíneos, para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para demonstrar
inclusões intracelulares em esfregaços diretos, de pele ou mucosas. Esta técnica consiste em colocar
o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida es-
corre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao micros-
cópio.

Coloração de Gram: a coloração de Gram, descoberta há pouco mais de 100 anos por Hans Christian
Joaquim Gram é utilizada com muita frequência para o exame microscópico direto de amostras e sub-
cultivos, para demonstrar as propriedades tintoriais de todos os tipos de bactérias.

As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas: Gram positivas e Gram
negativas. A diferença básica entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celula-
res. A técnica consiste na aplicação de um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e
iodeto de potássio (lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então,
tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir as células.

As bactérias Gram positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração
e aparecem em azul escuro. As bactérias Gram negativas não são capazes de reter o complexo cris-

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tal violeta e iodo após a descoloração e são contra coradas com um segundo corante (fucsina ou sa-
franina), chamado corante de contraste e adquirem a coloração vermelha.

Coloração de Ziehl-Neelsen: esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes
(BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo que é resistente
a coloração. Para o corante penetrar na célula é necessário calor ou detergente. Uma vez coradas,
as bactérias álcool-ácido resistentes resistem à descoloração, enquanto outras bactérias descoram
com o álcool-ácido. A técnica consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina
(aquecer 3 vezes), descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.

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