Programa de Pós-Graduação em

Genética e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS

Aluna: Bertha Dévora Agurto Berdejo

Orientador: Ricardo Antunes Azevedo

Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
SUMÁRIO

Introdução

Aminoácidos

Vias Metabólicas

Diferentes vias

Via Metabólica do Aspartato

Quatro essenciais

Estratégias de Pesquisa

Três formas

Considerações Finais
INTRODUÇÃO

O que são aminoácidos

Molécula que contém os grupos funcionais amina e
ácido carboxílico.

Formam a estrutura das proteínas

Aminoácidos Essencias

São vinte tipos de aminoácidos incorporados nas
proteínas,

nove (lisina, treonina, metionina, fenilalanina, triptofano,
isoleucina, leucina, valina e histidina) são denominados
essenciais

não são sintetizados por humanos e animais monogástricos, sendo
adquiridos nas dietas alimentares.
INTRODUÇÃO

Características

As enzimas que atuam na síntese destes aminoácidos estão

normalmente localizadas dentro dos cloroplastos das folhas ou
em plastídeos de órgãos não fotossintéticos, como raiz e
sementes.

Principais moléculas de acumulo de nitrogênio para as plantas.

Mais de 300 aminoácidos não protéicos foram isolados de
plantas, os quais tem papel importante na medicina, nutrição e
agricultura
INTRODUÇÃO

Importância

Desempenham importantes funções

transportadores de nitrogênio para diferentes partes nos vegetais,

reguladores em diversos processos envolvidos em resposta a
diferentes condições ambientais,

relacionados também com a qualidade nutricional das proteínas
presentes nas sementes.
INTRODUÇÃO

Síntese

São sintetizados nos vegetais em complexas vias metabólicas

sujeitas a uma regulação muito complexa e restrita para evitar
o desperdício de energia e de nutrientes importantes como,
carbono, nitrogênio e enxofre.

A regulação das vias metabólicas é feita por enzimas,
substratos e pelos próprios aminoácidos obtidos como
produtos finais
INTRODUÇÃO

Assimilação de Nitrogênio

Normalmente, o nitrato é a principal fonte de nitrogênio

disponível para as plantas.

O nitrato absorvido pelas raízes é reduzido e incorporado na
célula através de uma série de reações catalisadas por enzimas
assimilatórias.

Inicialmente, o nitrato absorvido é reduzido a nitrito em uma
reação catalisada pela enzima nitrato redutase (NR, EC 1.6.6.1).

Posteriormente, o nitrito é reduzido a amônio pela ação da
enzima nitrito redutase (NiR, EC 1.7.7.1),

O amônio é convertido em aminoácidos pela ação das enzimas
glutamina sintetase e glutamato sintase (GS - GOGAT; EC
6.3.1.2 e EC 1.4.7.1, respectivamente)
INTRODUÇÃO
BIOSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS

COO-
+H Esqueleto
3N C H
carbônico
amônia
COO-
R
NH4 +
aminoácidos C H

R
Intermediários
da via
N2 Intermediários das pentoses
da via glicolítica

Intermediários
do ciclo do
ácido cítrico
Via metabólica dos aminoácidos
Ser Gly Cys
Ser Gly Cys

As sínteses de serina e glicina

estão intimamente relacionadas
com a via de fotorrespiração nos
vegetais. São transportados para
outros órgãos e usados como
precursores da cisteína e da
glutationa.

Na ausência de fotorrespiração a
serina também é sintetizada a
partir de fosfoglicerato, uma vez
sintetizado, o aminoácido serina é
convertido em glicina.
Ser Gly Cys

• Serina

O aminoácido glicina
formado é, então, utilizado
para a síntese de serina nas
mitocôndrias.

• Glicina
O glicolato formado nos
cloroplastos é oxidado a
• Cisteína
glioxalato e convertido a
glicina nos peroxissomos. Regula a estrutura e a função das
proteínas.
O mais importante constituinte da
glutationa.
O esqueleto de carbono é cedido
pela serina.
Tyr Phe Trp
Tyr Phe Trp

• Aromáticos
-Reguladores de crescimento
-Agentes químicos de defesa
-Atrativos para polinizadores

• Via do Shikimato

-20% do carbono fixado pela planta passa por esta via.

-Todas as enzimas estão localizadas no cloroplasto, mas

há evidências de que ocorre uma segunda via no
citoplasma.

-EPSPS penúltimo passo da via

alvo do glifosato
aumenta a concentração de shikimato
Leu Val Ala
Leu Val Ala

• Leucina e Valina
As reações ocorrem no
cloroplasto, o carbono é derivado apenas de
duas moléculas de piruvato. • Alanina
Provavelmente estão relacionados Um dos aminoácidos mais
à degradação de aminoácidos. simples
As vias metabólicas de síntese de Pouco reativo quimicamente
leucina e valina são consideradas
Reconhecimento de
bioquimicamente paralelas.
substratos em sítios ativos ou
de regulação enzimática
Glu Gln Pro Arg His
Glu Gln Pro Arg His

• Glutamato e Glutamina

Inicialmente o amônio absorvido do

solo ou reduzido a partir de nitrato
via NR e NiR é assimilado em
glutamina e glutamato via ciclo GS-
GOGAT:
- GS: glutamina sintetase
- GOGAT: glutamato
sintase

O Glutamato formado origina a

Glutamina com o auxílio de
amônio.
Glu Gln Pro Arg His

• Prolina
A prolina é sintetizada em outro ramo em quatro
reações enzimáticas;
O principal aminoácido das proteínas de
sementes;
Papel importante como osmoprotetor na
resistência à seca;
Estoque de energia para o crescimento do tubo
polínico;
Fixação de nitrogênio nos nódulos das raízes de
leguminosas.
Glu Gln Pro Arg His
•Arginina

A síntese de arginina representa

um conveniente mecanismo
de armazenamento de
nitrogênio, cada molécula é
composta por 4 átomos de
nitrogênio. As sementes
freqüentemente contêm uma
alta concentração deste
aminoácido.

Este aminoácido é acumulado

em diferentes tecidos da
planta e tem um papel
importante em sua
diferenciação, incluindo o
florescimento, a nodulação da
raiz e também a resistência
ao estresse.
Glu Gln Pro Arg His

•Histidina:
- Aminoácido não essencial que
apresenta funções essenciais como a
manutenção do status de oxi-redução
(Boldyrev, 1999).
- A quelação dos metais através
de biomolécula serve como um mecanismo
de defesa utilizado por algumas espécies
para resistir a exposição a íons de metais
tóxicos. Nas plantas denominadas
hiperacumuladoras, por exemplo, a
histidina é conhecido por iniciar a principal
função da quelação e transporte de metais
como zinco, níquel, cobalto e cobre lidando
com a intolerância do metal (Lasat, 2000).
VIA METABÓLICA DO ÁCIDO ASPÁRTICO

Devido a baixa concentração de lisina e treonina nas

sementes de cereais, e sua importância como
aminoácidos essenciais, estudos tem sido realizados para
se obter um melhor entendimento da regulação da via
metabólica.
Asn Asp Lys Met Thr Ile
• O Aspartato atua como
precursor comum em duas
Asparagina Aspartato vias metabólicas
AK A primeira conduz
à síntese do aminoácido
β-aspartil fosfato
β-Aspartil fosfato asparagina,
A segunda conduz à
síntese de quatro dos nove
DHDPS HSDH aminoácidos essenciais:
lisina, treonina, metionina e
Homoserina isoleucina.

TS

Treonina
Lisina
Metionina

Isoleucina
Asn Asp Lys Met Thr Ile
• Aspartato
Formado pelo processo de
transaminação do ácido
oxaloacético, originado no ciclo
de Krebs nas mitocôndrias ou
através da ação da enzima
fosfoenolpiruvato carboxilase no
citoplasma

• Asparagina
-Composto usado no armazenamento e
transporte de nitrogênio na planta
-As enzimas do metabolismo da asparagina
estão localizadas no citosol, embora estudos
de seqüenciamento genético recentes
confirmaram que as enzimas envolvidas na
síntese dos restantes dos aminoácidos
derivados do aspartato estão localizados no
cloroplasto das folhas, ou em plastídeos dos
orgãos não fotossintetizantes como as
sementes e a raíz.
Asn Asp Lys Met Thr Ile

• AK

β-aspartil fosfato Primeira enzima da via metabólica do ácido

aspártico.

Inicialmente a AK foi estudada em

microrganismos e posteriormente em
diversas espécies vegetais como milho,
arroz, sorgo

Duas isoenzimas distintas da AK têm sido

descritas:
Isoenzima monofuncional e
sensível à inibição por lisina, predominante
• HSDH Presente em um polipeptídeo
bifuncional apresentando um domínio de AK
e outro de HSDH, sendo sensível à inibição
por treonina
A enzima HSDH catalisa a síntese de homoserina

Foi primeiramente estudada em procariotos e

posteriormente em vegetais.

Duas isoenzimas da HSDH têm sido observadas em

vegetais
uma sensível a treonina, no citoplasma
outra resistente à inibição por treonina.
Asn Asp Lys Met Thr Ile

• DHDPS
Dihidropicolinato sintase
β-aspartil fosfato
Cloroplastos
Diferentemente do observado para
as enzimas AK e HSDH, somente
uma forma altamente sensível à
inibição por baixas concentrações
de lisina tem sido descrita

• Lisina

É sintetizado a partir de β-aspartato

semialdeído em sete reações
enzimáticas iniciadas pela ação da
enzima DHDPS.
Asn Asp Lys Met Thr Ile

• Catabolismo de Lisina Lisina

Duas enzimas estão envolvidas no catabolismo LOR
de lisina
LOR, lisina 2-oxoglutarato redutase Sacaropina
SDH, sacaropina desidrogenase SDH

Embora as enzimas LOR e SDH possam estar 2-aminoadipato semialdeído

presentes em vegetais como enzimas
monofuncionais, a maior atividade da LKR e +
SDH está presente em um polipeptídeo glutamato
bifuncional

O aminoácido lisina pode regular seu próprio

catabolismo com as enzimas sendo moduladas
diferencialmente em uma cascata de sinais
intracelular envolvendo principalmente cálcio e
um processo de fosforilação-desfosforilação da
proteína.
Asn Asp Lys Met Thr Ile

• CGS e TS
β-aspartil fosfato
Ensaios realizados in vitro
indicaram que em plantas a
enzima TS tem de 250 a
500 vezes mais afinidade
pela OPH do que a enzima
CGS

• Metionina
-1ª enzima cistationa-γ-sintase
(CGS).
-Precursor de S-adenosilmetionina
(SAM) • Treonina
-Principal doador do grupo metil em
reações de transmetilações
1ª enzima treonina
-Intermediário na biosintese de sintase (TS), induzida
poliaminas e do fitohormonio etileno por SAM
Asn Asp Lys Met Thr Ile

β-aspartil fosfato

• Isoleucina
Treonina deaminase (TD) é a primeira
enzima na síntese de Isoleucina.
Há duas isoformas de TD
-Biossintética: presente em
tecido jovem em desenvolvimento, que
sofre inibição por isoleucina
-Biodegradativa: presente
em tecido velho, senescente, não
sensível à inibição.
 Multiplicidade
enzimática

Inibição por
feedback sequencial
Estratégias de Pesquisa

Os estudos bioquímicos, genéticos e moleculares da via

do ácido aspártico levaram à compreensão de
mecanismos importantes para a manipulação metabólica
da via e para a elaboração de estratégias para produção
de cereais com alto teor de lisina nas sementes.
Estratégias de Pesquisa

Quatro principais estratégias têm sido utilizadas para

produção de cereais que acumulam alta concentração de
lisina

Melhoramento genético

QPM

Identificação de mutantes naturais

Produção de plantas transgênicas
 Identificação de Mutantes Naturais

• Quinoa • Objetivos
Importante fonte de proteínas devido a sua
Foi realizado um estudo, em sementes imaturas,
digestibilidade e composição balanceada de
com as enzimas envolvidas na biossíntese de lisina,
aminoácidos.
para obter o seu padrão de atividade.
Pseudocereal
Identificação de Mutantes Naturais

As enzimas apresentaram um resultado similar nas três etapas

de desenvolvimento indicando que qualquer uma das três
etapas pode ser usado como fonte de atividade para o estudo
das propriedades reguladoras das enzimas.
Assim para o estudo de atividade foram utilizadas as sementes
com 20 DAP
 Identificação de Mutantes Naturais

A concentração total de aminoácidos solúveis permaneceu inalterada

durante o desenvolvimento, com as folhas exibindo uma concentração
maior que a das raízes.
 Identificação de Mutantes Naturais

Sementes
com 20
DAP

Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina

Lisina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 19,5% e 23,8% respectivamente.

Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 45,2% e 49,7%, respectivamente.
Lys +Thr nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK 37,6% e 47,6%, respectivamente.
 Identificação de Mutantes Naturais

Sementes
com 20
DAP

Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina

Lisina, Metionina e AEC não afetaram a atividade de HSDH.

Treonina nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de AK em 46,9% e
63,9% respectivamente.
 Identificação de Mutantes Naturais

Sementes
com 20 DAP

Controle lisina treonina metionina S-2-aminoetil L-cisteina

A adição de lisina na mistura com treonina, nas concentrações de 1 e 5 mM induziu uma

forte inibição da atividade de DHDPS, 65,3% e 69,9%, respectivamente.

AEC nas concentrações de 1 e 5 mM inibiram a atividade de DHDPS em 28,7%e 60,1%,

respectivamente.

A treonina e a metionina não alteraram a atividade de DHPS

Identificação de Mutantes Naturais

• Conclusões
-Presença de duas isoenzimas de AK
-Maior concentração de treonina nas sementes de Quinoa
-Presença de duas isoenzimas de HSDH
-Uma isoenzima de DHDPS altamente sensível à inibição por lisina
-Alta concentração de lisina (alta síntese de lisina e acumulo na forma
solúvel)
Produção de Plantas Transgênicas

O estudo dos mutantes apresentando alterações na sensibilidade das

enzimas AK e DHDPS aos aminoácidos lisina, treonina e ao AEC,
contribuíram para a compreensão dos mecanismos regulatórios
envolvidos na via metabólica do ácido aspártico, principalmente aos
relacionados à regulação das enzimas chave da síntese de lisina AK
e DHDPS. O uso de plantas transgênicas se revelou como uma
importante metodologia para o estudo desta via metabólica.
Produção de Plantas Transgênicas

• Objetivo
Aumentar o acumulo de lisina livre combinando duas vias de transformação de
milho.
-CordapA (Corynebacterium glutamicum) gene com expressão resistente ao
feedback de lisina.
-Supressão do gene LKR/SDH
Produção de Plantas Transgênicas

Agrobacterium Vetor binário pMON93066

Embriões imaturos de milho

+ de 90 indivíduos transformados R0

Cópia do gene marcador

autopolinização 16 linhas

+ de 100 sementes R1

Western blot 6 grãos por linha, aleatoriamente

Produção de Plantas Transgênicas
a a c b

• Western blot
A maioria das linhas 11/16 apresentaram expressão de
CordapA e redução de LKR/SDH (a).
Duas linhas mostraram expressão do CordapA, mas sem
redução de LKR/SDH (b).
Uma linha não apresentou expressão de CordapA, mas
redução de LKR/SDH (c).
Duas linhas não apresentaram nem expressão, nem redução.
Produção de Plantas Transgênicas
Produção de Plantas Transgênicas

M – transformãção com os
genes CordapA e LKR/SDH
S – transformação com o
gene CordapA

A análise de lisina livre em sementes maduras da R2, demonstrou que não ocorre
acumulo de lisina nos grãos maduros de milho, quando transformados com apenas o
gene CordapA.
Na transformação M115160, na qual a expressão de CordapA não foi significativa, o
acumulo de lisina foi ~ 2x menor quando comparado com o acumulo nas
transformações com expressão do CordapA e redução do LKR/SDH.
Produção de Plantas Transgênicas

• Conclusão
-Nova metodologia para aumentar a concentração de lisina em grãos de
milho maduro.
-Transgene com CordapA e a supressão do gene LKR/SDH
-Constatou-se um aumento no acumulo de lisina solúvel de 2x e de 3x
no total de lisina nas sementes transgênicas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS

Algumas enzimas secundárias da via metabólica do

aspartato ainda não tiveram sua regulação esclarecida por
completo;

Entretanto, para as principais enzimas reguladoras da vai

ou para aquelas que são alvo da ação de herbicidas, grandes
avanços científicos foram alcançados;

Já foram clonados e expressos em E. coli diversos genes

das enzimas da via metabólica, com isto foi possível a
obtenção da estrutura cristalizada das enzimas, assim como
o estudo de seu mecanismo de reação.
CONSIDERAÇÕES FINAIS

Espécies transgênicas de cereais e leguminosas, contendo o aumento ou

redução da atividade de uma enzima tem demonstrado que a regulação
da via pode ser dramaticamente alterada.

A meta de produzir linhagens comerciais viáveis com uma maior

qualidade protéica, aumentando o conteúdo de aminoácidos essenciais
nas sementes ainda tem que ser alcançada.
OBRIGADA!