UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

Departamento de Genética e Biotecnologia

Mestrado Integrado de Medicina Veterinária
Tecnologia Ácidos Nucleicos e OGMs

Extracção e separação electroforética de DNA plasmídico

em gel de agarose

INTRODUÇÃO
As bactérias e arqueas possuem, além do DNA cromossómico, outros elementos genéticos
como os plasmídeos. Estes são normalmente moléculas pequenas (poucas kilobases) e circulares,
fisicamente independentes do DNA cromossómico e com capacidade de replicação autónoma.
Normalmente são portadores de genes dispensáveis para as funções essenciais da célula.
Os plasmídeos possuem, além da origem de replicação (gene ori), um ou mais genes de
resistência que funcionam como marcadores genéticos de selecção. O pUC18 é um plasmídeo de
E. coli que possui um gene de resistência à ampicilina como marcador genético seleccionável. A
estirpe de E. coli que contém este plasmídio é resistente ao antibiótico, ou seja, plaqueando-a em
meio sintético suplementado com ampicilina verifica-se o seu crescimento, sob a forma de colónias
isoladas. Existem variados genes de resistência a antibióticos que são utilizados como marcadores
genéticos seleccionáveis (canamicina, paromomicina, higromicina, estreptomicina, gentamicina,
entre outros) noutros plasmídeos.
Entre os vários métodos utilizados para extracção do DNA plasmídico, o método da lise
alcalina da célula bacteriana permite uma rápida separação do DNA plasmídico do DNA
cromossómico. A pH alcalino (12.0-12.5), o DNA cromossómico desnatura enquanto o DNA
plasmídico se mantém intacto ou, quando desnaturado, renatura muito mais rapidamente que o o
DNA cromossómico. A lise é completada por acção do SDS e do hidróxido de sódio.
Quando o lisado é neutralizado com ácido acético, o DNA cromossómico renatura e agrega-
-se formando uma malha insolúvel. Simultaneamente, a concentrações elevadas de acetato de
potássio ocorre precipitação de complexos SDS-proteína e de RNA de elevado peso molecular.
Com a co-precipitação destas moléculas, obtém-se o DNA plasmídico e algum RNA de baixo peso
molecular.
A electroforese em gel de agarose é o método actualmente mais utilizado para analisar uma
preparação de DNA, detectar a presença de contaminantes, isolar moléculas de diferentes tamanhos
ou conformações e separar fragmentos de DNA após tratamento com enzimas de restrição. Este
método baseia-se no seguinte princípio: se uma molécula é colocada num campo eléctrico, migrará
para o eléctrodo apropriado a uma velocidade (ou mobilidade electroforética) proporcional à força a
que está submetida e à sua carga. Uma mistura de diferentes moléculas (ou fragmentos de molécula)
pode ser resolvida electroforeticamente com base (1) na dimensão da molécula, (2) na forma e
conformação da molécula e (3) na grandeza da carga total da molécula.
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 Neste trabalho usar-se-á um aparelho de electroforese horizontal, com gel de agarose
submerso, o que tem várias vantagens. A preparação do gel é muito simples e as amostras
depositam-se facilmente. A migração das amostras no gel pode ser acompanhada durante o
processo, se se incorporar brometo de etídeo1 na própria malha do gel. Finalmente, o contacto
eléctrico entre gel e tampão dá-se directamente, sendo fácil de reproduzir, em cada ensaio, as
condições utilizadas.
Na análise de moléculas de DNA circular, é muito
importante lembrar que uma molécula de DNA circular não
digerida dará origem, pelo menos a duas bandas,
Forma II correspondentes à forma relaxada (com interrupções numa
das cadeias), que migra mais lentamente, e à forma
superenrolada que migra mais rapidamente, dado oferecer
Forma III
menos resistência (fig. 1). Uma vez cortada a molécula
circular, a forma linearizada correspondente apresentará uma
Forma I
migração intermédia.
Só é possivel comparar tamanhos de moléculas (em
Figura 1. Mobilidades electroforéticas
relativas das duas formas diferentes de kb) se todas elas estiverem na forma linear. Para isso, vai
DNA circular e da forma linearizada. proceder-se ao corte (digestão) com uma enzima de restrição.
Forma I: circular superenrolada; Forma II:
circular relaxada com interrupções; Forma
As enzimas de restrição são endonucleases que fazem parte
III: linear.
do sistema de restrição e modificação encontrado em quase
todas as bactérias. Estas enzimas têm um grande leque de aplicações na Biologia Molecular, dado
que cortam DNA em cadeia dupla após reconhecimento de sequências, cortando as duas ligações
fosfodiester (uma em cada cadeia). Dependendo do tipo de corte, elas são classificadas em enzimas
do tipo I, II ou III. Para a Engenharia Genética, apenas as do tipo II são úteis, já que elas reconhecem
os locais específicos e só aí cortam o DNA (tabela 1).

Tabela 1. Algumas enzimas de restrição e suas sequências de reconhecimento (adap. de Stansfield et al., 1998)
Nome Origem Sequência de reconhecimento
AvaI Anabaena variabilis C


(T/C)CG(A/G)G
BamI Bacillus amyloliquefaciens G
GATCC
EcoRI Escherichia coli G
AATTC
HaeIII Haemophilus aegyptius GG
CC
HindIII Haemophilus influenzae A
AGCTT
KpnI Klebsiella pneumoniae GGTAC


C
PstI Providencia stuartii CTGCA


G
XhoI Xanthomonas holcicola C


TCGAG

locais específicos de corte

1
O brometo de etídeo é uma molécula que se intercala entre as bases empilhadas do DNA e fluoresce. Assim, uma
molécula de DNA tratada com brometo de etídeo apresenta uma fluorescência laranja, quando excitada com luz U.V. de
254 ou 300 nm (transiluminador), permitindo a visualização de bandas de DNA no gel.
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 OBJECTIVO
Observar a pureza e diferentes conformações do DNA plasmídico não cortado.

MATERIAL

Material biológico Estirpes de Escherichia coli com plasmídeos variados

Micropipetas, microcentrífuga, banho termostatizado, vortex, tina de

Equipamento electroforese horizontal e fonte de alimentação, transiluminador de U.V. e
sistema de aquisição digital de imagem.

Outro material Eppendorfs de 1,5 e 2 ml, pontas, fita adesiva e parafilme

O meio de cultura e soluções são preparados com água ultrapura (tabela):

Para a extracção de DNA plasmídico

Meios e soluções Reagentes Concentração Observações

Bactotriptona 10 g/l Autoclavar 15 min. a 1150C
Meio LB liquído Extracto de levedura 5 g/l
NaCl 10 g/l
Solução 1 Glucose 50 mM Autoclavar 15 min. a 1150C
Tris-HCl pH 8,0 25 mM (excepto a RNase)
EDTA pH 7,8 10 mM Após a adição de RNase,
RNase 100 µg/ml conservar a 4ºC
Solução 2 NaOH 0,8 % Preparada de fresco
SDS 1%
Solução 3 Acetato de potássio 5M Autoclavar 15 min. a 1150C
Ácido acético glacial
Tampão TE Tris-HCl pH 8,0 10 mM Autoclavar 15 min. a 1150C
EDTA pH 7,8 1 mM
Tampão Tris Tris-HCl pH 8,0 10 mM Autoclavar 15 min. a 1150C

Para a electroforese

Soluções Reagentes Quantidade Volume Observações

Tris base 162 g Autoclavar 15 min. a 1210C
Tampão
Ácido bórico 50 g
TBE 10 x 1000 ml
EDTA 9,5 g
Glicerol 50 % 12 ml
Solução
Azul de bromofenol 0,025 % 0,05 g 20 ml
de deposição
TBE 10x q.b.
Agarose a 0.8 % Agarose 0.8 g Juntar a agarose ao TBE e aquecer
Brometo de etídeo Tampão TBE 1 x 100 ml até dissolver. Deixar arrefecer um
100 ml
0,5 µg/ml Brometo de etídeo (10 mg/ml) 2.5 µl pouco e juntar o EtBr.

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 METODOLOGIA
Extracção de DNA plasmídico
1. Inocular as bactéria em 5 ml de meio LB selectivo adequado.
2. Incubar a 370C, com agitação, durante a noite.
3. Centrifugar 1,5 ml da cultura a 5 000 rpm, durante 5 minutos.
4. Eliminar o sobrenadante
5. Ressuspender as bactérias em 200 µl de Tampão 1 e levar ao vórtex.
6. Adicionar 400 µl de Tampão 2, agitar por inversão e incubar no gelo, durante 5 minutos.
7. Adicionar 300 µl de Tampão 3, agitar por inversão e incubar no gelo, durante 15 minutos
8. Centrifugar a 14 000 rpm, durante 1 minuto.
9. Recolher sobrenadante para novo eppendorf.
10. Se tiver lixo, voltar a centrifugar como em 9.
11. Precipitar o DNA com 500 µl de Isopropanol e inverter gentilmente o tubo 4-6 vezes.
12. Centrifugar imediatamente a 14 000 rpm, durante 5 minutos.
13. Eliminar o sobrenadante cuidadosamente.
14. Lavar em 500 µl de Etanol a 70º. Agitar cuidadosamente.
15. Centrifugar a 14 000 rpm, durante 2 minutos.
16. Retirar o sobrenadante com cuidado, para não haver arrastamento de DNA.
17. Inverter o tubo e deixar secar cerca de 10 minutos.
18. Ressuspender o DNA em 100 µl de TE.
19. Conservar a 4ºC.

Esquema da
extracção de
DNA plasmídico

Electroforese em gel de agarose

Preparação do gel de agarose

1. Preparar o molde: isolar as extremidades do tabuleiro com fita adesiva.

2. Colocar o tabuleiro numa plataforma nivelada.
3. Colocar o pente na posição adequada. Não esquecer que o pente molda cavidades que
não devem atingir o tabuleiro (0,5–1mm de distância do fundo do tabuleiro).
4. Deitar no molde a agarose.

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 5. Após polimerização (15 a 30 min), retirar a fita adesiva.
6. Colocar o tabuleiro com a agarose na tina e retirar o pente.
7. Deitar o tampão TBE 1x de modo a cobrir o gel.

Electroforese

8. Preparar “bolinhas” de solução de deposição num pedaço de Parafilme.

9. Com uma micropipeta, retirar o volume indicado para cada amostra (10 µl) e misturar
com a gota de solução de deposição. Fazer o mesmo com o marcador molecular (5 µl).
10. Carregar o gel.
11. Colocar a tampa no aparelho de electroforese
12. Ligar a fonte de voltagem e iniciar a electroforese a 80 V.
13. Após electroforese, desligar a fonte de voltagem e os fios condutores.
14. Retirar o gel do aparelho, levantando o tabuleiro.
15. Para cada corrida de gel, registar os seguintes dados das condições de electroforese:
- Tipo e concentração do gel
- Tampão utilizado
- Voltagem e tempo da corrida
16. Corar o gel em solução com brometo de etídeo.

ATENÇÃO!

Proteja-se da luz U.V.!

Use uma máscara ou coloque-se por trás de uma placa de vidro.
Usar sempre bata e luvas para manusear os géis!
Visualização e aquisição de imagem

17. Colocar, com cuidado, o gel no transiluminador.

18. Observar os fragmentos observados.
19. Transferir o gel para o sistema de aquisição digital de imagem.
20. Salvar a imagem do gel em formato digital.

RESULTADOS

A partir da análise das imagens digitais:

- Observar a pureza e diferentes conformações do DNA plasmídico.

BIBLIOGRAFIA
Adler, C., Frings, J., Leonard, C., Lucius, E.R., Strydonck, M., Wymer, P.E.O., 1997. Unit 1. Microbes and Molecules.
European Initiative for Biotechnology Education. http://www.reading.ac.uk/NCBE
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith., J.A., Struhl, K., (eds.), 1999. Current
Protocols in Molecular Biology, 3 volumes, John Wiley & Sons, Inc..
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. New York.
Stansfield, W.D., Colomé, J.S., Cano, R.J., 1998. Biologia Celular e Molecular. McGraw-Hill.

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