CURSO: FISIOTERAPIA DISCIPLINA: BIOLOGIA E GENTICA PROFESSOR: LUCIANO KALABRIC SILVA

P RTICA DE LABORATRIO N O. 10
TTULO Cromatografia em papel e eletroforese em gel.

INTRODUO Cromatografia em papel A cromatografia um procedimento usado para separar componentes de uma mistura baseada na diferena de mobilidade das substncias. Uma pequena quantidade de amostra da mistura colocada no papel de cromatografia (fase estacionria) acima da linha de um solvente (fase mvel). O papel colocado em contato com uma soluo solvente. Este solvente move-se atravs do papel devido ao capilar e dissolve o ponto contendo a mistura. Alguns componentes da mistura a ser separada tm maior atrao pelo papel de cromatografia, assim se movem a uma distncia m enor, enquanto que outros tm uma atrao menor, assim se movem a uma distncia maior no papel. Cada mistura especfica colocada no papel de cromatografia ser separada em padres consistentes de acordo com o solvente, tipo de papel e quantidade de tempo de separao. Solventes diferentes mudam o padro de separao da mistura. As misturas que so coloridas podem ser separadas em seus componentes coloridos pela cromatografia de papel. Entretanto, misturas no coloridas tambm podem ser testadas bastando apenas que sejam coloridas adequadamente aps a corrida.
Caroteno

O valor do Rf de um dado soluto padro nas condies da cromatografia e pode ser calculado pela formula abaixo. Cada componente de uma soluo ter um Rf especfico para o mesmo solvente quando a cromatografia ocorre por um mesmo perodo de tempo. Rf = distncia viajada pelo soluto (ds) distncia viajada pelo solvente (dS)

Xantofila

Clorofila a

Clorofila b

Um uso clssico da cromatografia num laboratrio a separao dos pigmentos vegetais. Note na figura ao lado como os pigmentos laranja (caroteno), os amarelados (xantofila) e os esverdeados (clorofila a e b) so separados (figura ao lado).
Cromatografia em pigmentos vegetais. papel de

A cromatografia em papel apesar de ser um mtodo bem simples e barato bastante poderoso. Foi comprovada a sua utilidade em anlises farmacuticas (vitaminas), de alimentos e do ambiente (identificao de metais pesados). Entretanto, outras modalidades de cromatografia tem ganho mais espao como mtodo analtico: utilizao de fase mvel gasosa (cromatografia gasosa) para a separao de gases e a utilizao de fase lquida em colunas capilares (cromatografia lquida ou HPLC) para separao de ons e solutos em geral. Eletroforese em Gel Eletroforese a habilidade que uma molcula com carga lquida (balano de cargas) possui em mover-se num meio lquido quando submetida a um campo eltrico. Esta uma tcnica que te se revelado muito til na separao de protenas e outras molculas, como DNA e RNA. A velocidade de migrao (v) das substncias no campo eltrico depende de uma srie de fatores: intensidade do campo eltrico (E), carga lquida da substncia ( ), e do z coeficiente de atrito (f). E.z v= f Onde a fora eltrica E.z que puxa a molcula carregada para o eletrodo com carga oposta encontra a resistncia viscosa f.v originada do atrito entre a molcula em movimento e o meio. O coeficiente de atrito f depende tanto da massa e da forma da molcula migrante quanto da viscosidade do meio. As corridas eletroforticas so quase sempre feitas em gel, em vez de uma soluo livre, por dois motivos: primeiro, o gel suprime correntes de conveco produzidas por pequenos gradientes de temperatura, requisito para uma separao eficaz; segundo, o gel age como uma peneira molecular que melhora a separao. As molculas que so menores em relao aos poros no gel, movem-se facilmente atravs dele, ao passo que as molculas muito maiores que os poros so quase imveis. As molculas de tamanho intermedirios movem-se atravs do gel com vrios graus de facilidade. Os compostos gelatinosos mais usados so a poliacrilamida e o agarose por serem quimicamente inertes. O tamanho dos poros nesses gis pode ser controlado pela escolha de concentraes variveis no momento da gelificao. A visualizao dos resultados feita mediante colorao dos gis com corantes especficos, azul de Coomassie, por exemplo, para protenas, e brometo de etdio para cidos nuclicos. O azul de Coomassie colore especificamente as protenas de azul que revela as faixas (bandas) de protenas em diferentes alturas do gel, relativas velocidade de migrao de cada uma. O brometo de etdio, por sua vez, forma um complexo estvel com o DNA ou RNA e, quando exposto luz ultravioleta, emite uma florescncia alaranjada que revela semelhantemente a posio das bandas dos cidos nuclicos. OBJETIVO PRINCIPAL Executar, na prpria sala de aula, um experimento simples de cromatografia em papel para separar os diferentes pigmentos vegetais. OUTROS OBJETIVOS Fixar conceitos bsicos relativos aos mtodos de analise de protenas e cidos nuclicos. Analisar as condies de separao atravs do teste de diferentes solventes. MATERIAL 05 bqueres de vidro de 1000 mL 02 graus e 02 pistilos

folhas de graxeira (Malva visco) flores de graxeira (Malva visco)

gua filtrada lcool etlico 50% acetona 50% papel de filtro Whatmann (ou filtro de papel para coar caf) 05 lpis

rgua tubos capilares graduadas de 1ml) filme de PVC

(ou

pipetas

PROCEDIMENTOS A - Cromatografia em papel usando-se gua como solvente (grupos 1 e 2) 1. Corte uma tira de papel de filtro de 15x5cm. Marque, com auxlio da rgua, linhas horizontais a 2,5 cm das extremidades inferior e superior da borda menor. Marque sobre a linha inferior o ponto 1 e, mais ou menos a 2cm de distncia, o ponto 2. 2. Coloque gua no bquer de 1000mL at atingir a altura de 1,5cm. 3. Macere as folhas da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 1. 4. Macere as flores da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 2. 5. Com auxlio do tubo capilar recolha uma quantidade do extrato 1 e pingue-o no ponto 1. Faa o mesmo como extrato 2 pingando-o no ponto 2. Aguarde 1 min. para secar. 6. Inicie a cromatografia colocando o papel de filtro apoiado no bquer apenas o suficiente para tocar no solvente. Cuidado: no deixe os extratos submergirem no solvente. 7. Feche a boca do bquer com o filme de PVC para evitar que o solvente evapore. 8. Pare a cromatografia quando o solvente atingir a linha superior. 9. Mea a distncia percorrida por cada pigmento visualizado e preencha a tabela 1. B - Cromatografia em papel usando-se lcool etlico 50% como solvente (grupos 3 e 4) 1. Corte uma tira de papel de filtro de 15x5cm. Marque, com auxlio da rgua, linhas horizontais a 2,5 cm das extremidades inferior e superior da borda menor. Marque sobre a linha inferior o ponto 1 e, mais ou menos a 2cm de distncia, o ponto 2. 2. Coloque lcool etlico 50% no bquer de 1000mL at atingir a altura de 1,5cm. 3. Macere as folhas da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 1. 4. Macere as flores da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 2. 5. Com auxlio do tubo capilar recolha uma quantidade do extrato 1 e pingue-o no ponto 1. Faa o mesmo como extrato 2 pingando-o no ponto 2. Aguarde 1 min. para secar. 6. Inicie a cromatografia colocando o papel de filtro apoiado no bquer apenas o suficiente para tocar no solvente. Cuidado: no deixe os extratos submergirem no solvente. 7. Feche a boca do bquer com o filme de PVC para evitar que o solvente evapore. 8. Pare a cromatografia quando o solvente atingir a linha superior. 9. Mea a distncia percorrida por cada pigmento visualizado e preencha a tabela 1. C - Cromatografia em papel usando-se a acetona 50% como solvente (grupos 5 e 6) 1. Corte uma tira de papel de filtro de 15x5cm. Marque, com auxlio da rgua, linhas horizontais a 2,5 cm das extremidades inferior e superior da borda menor. Marque sobre a linha inferior o ponto 1 e, mais ou menos a 2cm de distncia, o ponto 2. 2. Coloque lcool etlico 50% no bquer de 1000mL at atingir a altura de 1,5cm. 3. Macere as folhas da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 1. 4. Macere as flores da graxeira o suficiente para obter um triturado semilquido, extrato 2. 5. Com auxlio do tubo capilar recolha uma quantidade do extrato 1 e pingue-o no ponto 1. Faa o mesmo como extrato 2 pingando-o no ponto 2. Aguarde 1 min. para secar. 6. Inicie a cromatografia colocando o papel de filtro apoiado no bquer apenas o suficiente para tocar no solvente. Cuidado: no deixe os extratos submergirem no solvente.

7. Feche a boca do bquer com o filme de PVC para evitar que o solvente evapore. 8. Pare a cromatografia quando o solvente atingir a linha superior. 9. Mea a distncia percorrida por cada pigmento visualizado e preencha a tabela 1.

ATIVIDADES 1. Diferencie cromatografia em papel de eletroforese. 2. Como poderamos visualizar protenas separadas pelos dois sistemas? 3. Que pigmentos vegetais foram encontrados em cada rgo estudado? Qual a relao entre a distribuio destes pigmentos e a funo desempenha por estes rgos. 4. Que tipo de informaes esta metodologia poderia nos oferecer? 5. Qual o melhor solvente utilizado? Justifique a sua resposta.

REFERNCIA BIBLIOGRFICA 1. STRYER, Lubert. Bioqumica. Trad. Antnio Jos Magalhes da Silva Moreira. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. 2. Site da Merck - http://www.chromatography.co.uk/ 3. http://ekcs.neric.org/~jbuckley/lelab/chromatography.html Tabela 1 Resultados do teste com gua. SOLVENTE gua lcool 50% EXTRATO Folhas Flores Folhas Flores PIGMENTO ds Rf ds Rf ds Rf ds Rf Caroteno Xantofila Clorofila a Clorofila b Outros, se houver Nota: Distncia percorrida pelo solvente (dS) = 10cm.

Acetona 50% Folhas Flores ds Rf ds Rf