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com
714 〈1118〉 Dispositivos de monitoramento/ Informações gerais
no final de uma corrente, e a evaporação da água do pavio esfria
o termômetro de bulbo úmido. A diferença de temperatura entre
os termômetros úmido e seco é então comparada a uma tabela,
específica daquele psicrômetro, baseada na temperatura de
bulbo seco, e a umidade relativa é determinada. O uso de um
psicrômetro tipo funda em um ambiente comercial é
impraticável.
Higrômetro de cabelo—Este tipo de aparelho se baseia no fato de que
o comprimento de um cabelo sintético ou humano aumenta em função da
umidade relativa. Essa alteração é usada para mover um indicador ou
afetar um medidor de tensão. Um higrômetro de cabelo pode ser preciso
para±3%, mas é incapaz de responder a mudanças rápidas de umidade e
perde precisão em níveis muito altos ou muito baixos de umidade relativa.
Higrômetro Infravermelho—Este tipo de higrômetro determina
a umidade relativa comparando a absorção de dois comprimentos de
onda diferentes de radiação IV através do ar. Um comprimento de
onda é absorvido pelo vapor de água e o outro não. Este tipo de
higrômetro pode medir com precisão a umidade relativa em grandes
ou pequenos volumes de ar. É sensível a mudanças rápidas de
umidade e pode ser integrado a um sistema eletrônico de tratamento
de dados.
Higrômetro de ponto de orvalho—Este tipo de dispositivo usa
um espelho resfriado para determinar o ponto de orvalho de uma
amostra de ar. O ponto de orvalho é a temperatura na qual o vapor
de água do ar começa a condensar, ou seja, a temperatura na qual a
umidade relativa é de 100%. A partir dessa medição e de uma
medição precisa da temperatura ambiente, a umidade relativa pode
ser calculada. O higrômetro de ponto de orvalho é o padrão contra o
qual a maioria dos instrumentos disponíveis comercialmente são
calibrados.
Higrômetro Capacitivo de Filme Fino—O princípio deste
tipo de higrômetro é que o dielétrico de um polímero não
condutor muda em proporção direta com a umidade relativa.
Essa mudança é medida como uma mudança na capacitância.
Este tipo de higrômetro é preciso para±3%.
Higrômetro Resistivo de Filme Fino—Esse tipo de
higrômetro é semelhante ao tipo de filme fino capacitivo, pois
usa o efeito da mudança da umidade relativa em um circuito
elétrico. No higrômetro de filme fino resistivo, o sensor é um
polímero orgânico cuja resistência elétrica muda em proporção
logarítmica com a umidade relativa. Este tipo de higrômetro é
preciso para±5%.
VALIDAÇÃO DE TEMPERATURA E
DISPOSITIVOS DE MONITORAMENTO DE UMIDADE
Os termômetros e higrômetros, utilizados para fornecer dados
sobre a exposição à temperatura e umidade de um produto, devem
ser adequados ao uso a que se destinam. Especificamente, eles
devem ser devidamente validados. A validação é um processo que
garante ao usuário do dispositivo de monitoramento que o
dispositivo foi testado antes do uso pelo fabricante ou pelo usuário,
para avaliar a precisão da medição, a capacidade de resposta da
medição e a precisão do tempo, quando apropriado. Os monitores
utilizados na fabricação, armazenamento e transporte de
medicamentos devem ser devidamente qualificados por seus
usuários para garantir que os monitores sejam recebidos e mantidos
em bom estado de funcionamento. Farmácias e consumidores
podem aceitar a validação realizada pelo fabricante do dispositivo.
Precisão de medição—Para dispositivos de monitoramento
de temperatura e umidade, a precisão da medição refere-se à
proximidade do valor obtido com um determinado dispositivo em
relação ao valor real que está sendo medido. Na prática, isso é
determinado pela comparação com um dispositivo que foi
calibrado em relação a um padrão obtido ou rastreável ao
Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST).
Capacidade de resposta da medição—Qualquer monitor leva
tempo para responder a uma mudança na temperatura ou umidade.
Quanto mais rápida a resposta, mais clara será a imagem da história
ambiental de um produto monitorado. A medida-
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1/2, re- t
A capacidade de resposta do mento pode ser definida como o tempo
necessário para um dispositivo ler um valor de (x + y)/2 após uma
mudança instantânea na propriedade sendo medida de x para y. A
capacidade de resposta da medição é normalmente definida para a faixa
operacional de um dispositivo.
Diferentes níveis de capacidade de resposta são necessários para diferentes
aplicativos de monitoramento. Para dispositivos usados para monitorar locais
de armazenamento, onde é improvável que a temperatura e a umidade mudem
rapidamente, em / ≤ 15 minutos podem ser apropriados. Para dispositivos
1 2
usados para monitorar o transporte, onde mudanças mais rápidas são
possíveis, em / ≤5 minutos podem ser necessários.
1 2
Precisão do tempo—Mais comumente, a precisão do tempo é
expressa como uma± porcentagem da duração total do período de
gravação. Para aplicações farmacêuticas, um±A precisão de tempo de
0,5% é adequada.
Validação de TTIs de base química—Este tipo de dispositivo
apresenta um problema para validação porque testar o dispositivo
individual causa sua destruição. Por esta razão, a calibração de TTIs
individuais baseados em produtos químicos contra um padrão
rastreável NIST não é possível. Idealmente, os TTIs de base química
seriam feitos de acordo com as Boas Práticas de Fabricação, e seu
uso em conexão com o monitoramento do ambiente de
armazenamento e transporte de medicamentos seria devidamente
regulamentado. Na ausência dessas condições, o desempenho de um
lote desses dispositivos pode ser avaliado estatisticamente
submetendo uma amostra de tamanho apropriado a condições de
temperatura elevada por um período de tempo definido e
observando os resultados. Critérios de aceitação apropriados devem
ser adotados.
O USO DE DADOS HISTÓRICOS DE TEMPERATURA
É claro que o tipo de monitoramento de temperatura necessário é
uma função das condições ambientais que podem ser esperadas.
Portanto, os dados climáticos são úteis ao selecionar as condições
locais de armazenamento e métodos de monitoramento mais
apropriados. Por exemplo, um detector de limite barato pode ser
tudo o que é necessário quando há uma baixa probabilidade de
ocorrência de temperaturas excessivas. Alternativamente, um
registrador de dados pode ser preferido quando for útil demonstrar
que a exposição às temperaturas mais altas foi muito breve.
Deve-se notar, no entanto, que as temperaturas externas não são
necessariamente indicadores confiáveis das temperaturas
experimentadas por diferentes itens na cadeia de distribuição. Por
exemplo, estudos recentes relataram desvios significativos da
temperatura ambiente nos dias de verão para caixas de correio,
caminhões e armazéns. Dados históricos detalhados de temperatura
estão disponíveis na Administração Nacional Oceânica e Atmosférica,
mostrando a temperatura máxima e mínima média diária em
qualquer dia do ano em uma região geográfica de interesse (por
exemplo, http://www.cdc.noaa.gov/ Usclimate /states.fast.html).
〈1119〉 PRÓXIMO AO INFRAVERMELHO
ESPECTROSCOPIA
INTRODUÇÃO
A espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) é um ramo da
espectroscopia vibracional que compartilha muitos dos princípios que
se aplicam a outras medições espectroscópicas. A região espectral
NIR compreende duas subfaixas associadas a detectores
USP 35 Informações gerais /〈1119〉 Espectroscopia de infravermelho próximo 715
usado no desenvolvimento inicial da instrumentação NIR. O
comprimento de onda curto (Herschel ou região de silício) se estende
de aproximadamente 780 a 1100 nm (12.821–9.000 cm–1); e
comprimentos de onda mais longos, entre 1100 e 2500 nm, compõem
a região NIR tradicional (sulfeto de chumbo). Aplicações de
espectroscopia NIR usam espectros exibidos em unidades de
comprimento de onda ou número de onda. Como é o caso de outras
medições de espectroscopia, as interações entre a radiação NIR e a
matéria fornecem informações que podem ser tanto para avaliação
qualitativa quanto quantitativa da composição química das amostras.
Além disso, a caracterização qualitativa e quantitativa das
propriedades físicas de uma amostra pode ser feita devido à
influência da amostra nos espectros NIR. As medições podem ser
feitas diretamente nas amostras in situ, além das aplicações durante
os procedimentos padrão de amostragem e teste.
As aplicações da análise qualitativa incluem a identificação de matéria-
prima, amostra em processo ou produto acabado. Essas aplicações
geralmente envolvem a comparação de um espectro NIR de uma amostra
com espectros de referência e a avaliação de semelhanças com os critérios
de aceitação desenvolvidos e validados para uma aplicação específica. Em
contraste, as aplicações de análise quantitativa envolvem o
desenvolvimento de uma relação preditiva entre os atributos espectrais
NIR e as propriedades da amostra. Essas aplicações normalmente usam
modelos numéricos para prever quantitativamente as propriedades
químicas e/ou físicas da amostra com base nos atributos espectrais NIR.
A espectroscopia vibracional na região NIR é dominada por
sobretons e combinações que são muito mais fracas do que as
vibrações fundamentais de infravermelho médio das quais se
originam. Como as absortividades molares na faixa NIR são baixas, a
radiação pode penetrar vários milímetros em materiais, incluindo
sólidos. Muitos materiais, como o vidro, são relativamente
transparentes nessa região. A tecnologia de fibra óptica é
prontamente implementada na faixa NIR, o que permite o
monitoramento de processos em ambientes que, de outra forma,
seriam inacessíveis.
Os testes de qualificação de instrumentos e os critérios de aceitação
fornecidos neste capítulo podem não ser apropriados para todas as
configurações de instrumentos. Nesses casos, a qualificação de
instrumentos alternativos e as verificações de desempenho devem ser
cientificamente justificadas e documentadas. Além disso, os parâmetros
de validação discutidos neste capítulo podem não ser aplicáveis a todas
as aplicações de espectroscopia NIR. Os parâmetros de validação
caracterizados para uma aplicação NIR específica devem demonstrar a
adequação da aplicação NIR para o uso pretendido.
Transmissão e Reflexão
As medições mais comuns realizadas na faixa espectral NIR
são a espectroscopia de transmissão e reflexão. A radiação
NIR incidente é absorvida ou espalhada pela amostra e é
medida como transmitância ou refletância, respectivamente.
A espectrometria de transflexão é um híbrido de transmissão
e reflexão em que um refletor é colocado atrás da amostra
para que o caminho óptico através da amostra e de volta ao
detector seja dobrado em comparação com uma medição de
transmissão de uma amostra da mesma espessura. A
transflexão é usada para descrever qualquer técnica de
transmissão de passagem dupla. A luz pode ser refletida de
um refletor difuso ou especular (espelho) colocado atrás da
amostra.
TRANSMISSÃO, T, é uma medida da diminuição da intensidade da
radiação em função do comprimento de onda quando a radiação é
passada através de uma amostra. A amostra é colocada no feixe
óptico entre a fonte e o detector. Os resultados das medições de
transmissão e transflexão são geralmente apresentados diretamente
em termos de absorbância, ou seja, log10(1/T).
REFLETÂNCIA, R, é uma medida da razão da intensidade da
luz refletida da amostra, I, àquela refletida de um fundo ou
superfície refletora de referência, IR. Mais refleti-
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as medições de ção no NIR são feitas de amostras de dispersão, como
pós e pastas. Para tais materiais, a radiação NIR pode penetrar a uma
distância substancial na amostra, onde pode ser absorvida quando o
comprimento de onda da radiação corresponde a uma transição
entre o estado vibracional fundamental do analito e um harmônico de
um determinado modo vibracional (umharmônico) ou a soma de dois
ou mais modos diferentes (umbanda de combinação). A radiação não
absorvida é espalhada de volta da amostra para o detector. Os
espectros de reflexão NIR são acessados calculando e plotando
log(1/R) em função do comprimento de onda. Esta forma logarítmica
é a pseudo-absorvância do material e é comumente chamada de
absorbância.
Fatores que afetam os espectros NIR
A lista a seguir não é exaustiva, mas inclui muitos dos
principais fatores que afetam os espectros NIR.
Temperatura da amostra—A temperatura da amostra influencia os
espectros obtidos de soluções aquosas e outros líquidos com ligação de
hidrogênio, e uma diferença de alguns graus pode resultar em mudanças
espectrais significativas. A temperatura também pode afetar os
espectros obtidos de líquidos menos polares, bem como sólidos que
contenham solventes e/ou água.
Umidade e Solvente—A umidade e o solvente presentes no
material da amostra e no sistema analítico podem alterar o
espectro da amostra. Tanto a absorção por umidade e solvente
quanto sua influência na ligação de hidrogênio dos APIs e
excipientes podem alterar o espectro NIR.
Espessura da amostra—A espessura da amostra é uma fonte
conhecida de variabilidade espectral e deve ser compreendida e/ou
controlada. A espessura da amostra no modo de transmissão é
normalmente controlada usando um comprimento de caminho
óptico fixo para a amostra. No modo de reflexão difusa, a espessura
da amostra é normalmente controlada usando amostras que são
“infinitamente espessas” em relação à profundidade de penetração
detectável da luz NIR em um material sólido. Aqui, “espessura
infinita” implica que o espectro de reflexão não muda se a
espessura da amostra for aumentada.
Exemplo de propriedades ópticas—Em sólidos, as propriedades de
dispersão de superfície e volume dos padrões de calibração e amostras
analíticas devem ser levadas em consideração. A morfologia da superfície e as
propriedades do índice de refração afetam as propriedades de dispersão dos
materiais sólidos. Para materiais em pó, o tamanho da partícula e a densidade
aparente influenciam as propriedades de dispersão e o espectro NIR.
Polimorfismo-A variação na estrutura cristalina (polimorfismo) de
materiais com a mesma composição química pode influenciar a
resposta espectral NIR. Diferentes polimorfos e formas amorfas de
material sólido podem ser distinguidos uns dos outros com base em
suas propriedades espectrais NIR. Da mesma forma, diferentes
estados de solvatação ou hidratação cristalina do mesmo material
podem exibir diferentes propriedades espectrais NIR.
Idade das Amostras—As amostras podem apresentar alterações em suas
propriedades químicas, físicas ou ópticas ao longo do tempo. Deve-se tomar
cuidado para garantir que tanto as amostras quanto os padrões usados para
análise NIR sejam adequados para a aplicação pretendida.
INSTRUMENTAÇÃO
Aparelho
Todas as medições NIR são baseadas na exposição do material à
radiação de luz NIR incidente e na medição da atenuação da luz
emergente (transmitida, espalhada ou refletida). Vários
espectrofotômetros estão disponíveis; eles são baseados em diferentes
princípios operacionais - por exemplo: filtros, filtro dispersivo baseado em
grade, filtro acústico-óptico sintonizável (AOTF),
716 〈1119〉 Espectroscopia de infravermelho próximo/ Informações gerais
NIR com transformada de Fourier (FT–NIR) e filtro sintonizável de
cristal líquido (LCTF). Silício, sulfeto de chumbo, arsenieto de índio e
gálio e sulfato de triglicina deuterado são materiais detectores
comuns. Porta-amostras convencionais, sondas de fibra ótica,
células de imersão de transmissão e porta-amostras giratórios ou
transversais são exemplos comuns de interfaces de amostra para
introduzir a amostra no trem óptico de um espectrômetro.
A seleção de instrumentação NIR específica e acessórios
de amostragem deve ser baseada na aplicação pretendida, e
atenção especial deve ser dada à adequação da interface de
amostragem para o tipo de amostra que será analisada.
Espectros de referência de infravermelho próximo
As referências NIR, fornecendo medições estáveis conhecidas com
as quais outras medições podem ser comparadas, são usadas para
minimizar as variações instrumentais que afetariam a medição.
Transmitância—A medição da transmitância requer um
espectro de referência de fundo para determinar a absorção pela
amostra em relação ao fundo. Os materiais de referência de
transmitância adequados dependem da aplicação NIR específica
e incluem ar, uma célula vazia, um branco de solvente ou uma
amostra de referência.
Refletância—A medição da refletância requer a medição de
um espectro de reflexão de referência para determinar a
atenuação da luz refletida em relação ao feixe incidente não
atenuado. O espectro de refletância é calculado como a razão
entre o espectro de feixe único da amostra e o do material de
referência. Os materiais de referência de refletância adequados
dependem da aplicação específica do NIR e incluem cerâmica,
polímeros perfluorados, ouro e outros materiais adequados.
Qualificação de Instrumentos NIR
Qualificação-A qualificação de um instrumento NIR pode ser
dividida em três elementos: Qualificação da Instalação (IQ);
Qualificação Operacional (OQ); e Qualificação de Desempenho (PQ).
Para uma discussão mais aprofundada, consulte o capítulo de
informações gerais propostoQualificação de Instrumento Analítico 〈
1058〉.
Qualificação de instalação—Os requisitos do IQ ajudam a
garantir que o hardware e o software sejam instalados para
acomodar o uso seguro e eficaz do instrumento no local
desejado.
Qualificação Operacional—Na qualificação operacional, o desempenho
de um instrumento é caracterizado por meio de padrões para verificar se o
sistema opera dentro das especificações de destino. O objetivo da
qualificação operacional é demonstrar que o desempenho do instrumento
é adequado. Como existem tantas abordagens diferentes para medir
espectros NIR, recomenda-se a qualificação operacional usando padrões
com propriedades espectrais conhecidas. O uso de materiais padrão de
referência rastreáveis externos não justifica a omissão dos
procedimentos internos de controle de qualidade do instrumento. Como é
o caso de qualquer dispositivo espectroscópico, a incerteza do
comprimento de onda, a linearidade fotométrica e as características de
ruído dos instrumentos NIR devem ser qualificadas em relação às
especificações de destino para a aplicação pretendida.
Qualificação de Desempenho—A qualificação de desempenho
demonstra que a medição NIR opera consistentemente dentro das
especificações definidas pelo usuário para uma aplicação específica; é
muitas vezes referido comoadequação do sistema.A qualificação de
desempenho para medições NIR pode incluir a comparação de uma
amostra ou espectro padrão com espectros registrados
anteriormente. Comparações de espectros obtidos ao longo do
tempo de amostras idênticas e estáveis ou materiais padrão de
referência podem formar a base para avaliar a estabilidade a longo
prazo de um sistema de medição NIR. O objetivo é
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demonstrar que nenhuma mudança anormal de comprimento de onda ou alteração
na sensibilidade do detector ocorreu durante a análise em andamento.
Caracterizando o Desempenho do Instrumento—Procedimentos
específicos, critérios de aceitação e intervalos de tempo para caracterizar o
desempenho do instrumento NIR dependem do instrumento e da
aplicação pretendida. Muitas aplicações NIR usam modelos previamente
validados que relacionam a resposta espectral NIR a uma propriedade
física ou química de interesse. A demonstração de um desempenho
estável do instrumento durante longos períodos de tempo fornece alguma
garantia de que medições confiáveis podem ser feitas a partir de
espectros de amostra usando modelos NIR previamente validados.
Incerteza do comprimento de onda—Os espectros NIR de amostras e/
ou materiais padrão de referência podem ser usados para demonstrar o
desempenho de dispersão de comprimento de onda adequado de um
instrumento em relação às especificações alvo. O USP Near IR System
Suitability Reference Standard ou o National Institute of Standards and
Technology (NIST) Standard Reference Material (SRM) 2036 para medição
de refletância e NIST SRM 2035 para medição de transmitância podem ser
usados para verificação de comprimento de onda. Os materiais
adequados para demonstrar o desempenho da dispersão de
comprimento de onda incluem poliestireno, misturas de óxidos de terras
raras e absorção por vapor de água para instrumentos que usam um
interferômetro para dispersão de comprimento de onda. Com justificativa
apropriada, padrões alternativos podem ser usados. A incerteza do
comprimento de onda normalmente é caracterizada a partir de um único
espectro (coletado com a mesma resolução espectral para obter o valor
padrão) usando um mínimo de três picos que cobrem uma faixa espectral
adequada do instrumento. Tolerâncias típicas para acordo com valores
padrão são±1,0 nm de aproximadamente 700 a 2000 nm e±1,5 nm acima
de 2000 nm a aproximadamente 2500 nm (±8 cm–1 abaixo de 5000 cm–1e±
4 cm–1a partir de 5000 cm–1aproximadamente 14.000 cm–1). Tolerâncias
alternativas podem ser usadas quando justificadas para aplicações
específicas.
Linearidade Fotométrica e Estabilidade de Resposta—Os espectros
NIR de amostras e/ou materiais padrão de referência com
transmitância ou refletância relativa conhecida podem ser usados
para demonstrar uma relação adequada entre a atenuação da luz NIR
(devido à absorção) e a resposta do instrumento. Para medições de
refletância, são frequentemente usados padrões de refletância
disponíveis comercialmente com propriedades de refletância
conhecidas. Os espectros obtidos a partir de padrões de reflexão
estão sujeitos a variabilidade como resultado da diferença entre as
condições experimentais em que foram calibrados na fábrica e
aquelas em que são posteriormente colocados em uso. Assim, os
valores de refletância fornecidos com um conjunto de padrões de
calibração podem não ser úteis na tentativa de estabelecer uma
calibração “absoluta” para um determinado instrumento. Desde que
(1) os padrões não mudem química ou fisicamente, (2) o mesmo
fundo de referência também é usado para obter os valores padrão e
(3) o instrumento mede cada padrão sob condições idênticas
(incluindo posicionamento preciso da amostra), a reprodutibilidade da
escala fotométrica será estabelecida na faixa de padrões. As medições
subsequentes no conjunto idêntico de padrões fornecem informações
sobre a estabilidade a longo prazo. A linearidade fotométrica é
tipicamente caracterizada usando um mínimo de quatro padrões de
referência na faixa de 10% a 90% de reflexão (ou transmissão). As
aplicações NIR baseadas na medição de uma absorbância maior que
1,0 podem exigir padrões com propriedades de refletividade entre 2%
e 5% de reflexão (ou transmissão) para caracterizar o desempenho do
instrumento em baixa refletância. O objetivo é demonstrar uma
relação linear entre a refletância e/ou transmitância NIR e a resposta
do instrumento na faixa de varredura do instrumento. Tolerâncias
típicas para uma relação linear são 1,00± 0,05 para a inclinação e 0,00
± 0,05 para a interceptação de um gráfico da resposta fotométrica
medida versus resposta fotométrica padrão. Tolerâncias alternativas
podem ocorrer quando justificadas para aplicações específicas.
Ruído Espectroscópico—O software do instrumento NIR pode incluir
procedimentos integrados para determinar automaticamente o ruído do
sistema e fornecer um relatório estatístico de ruído ou S/N sobre
USP 35
a faixa de operação do instrumento. Além disso, pode ser desejável
complementar tais verificações com medições que não dependam
diretamente dos procedimentos fornecidos pelo fabricante. Os
procedimentos típicos envolvem a medição de espectros de
materiais de referência rastreáveis com refletância alta e baixa. As
tolerâncias para esses procedimentos devem demonstrar S/N
adequado para a aplicação pretendida.
ALTO-FLUXO DE RUÍDO—O ruído do instrumento é avaliado no
fluxo real medindo a refletância ou a transmitância do padrão de
referência, com o material de referência (por exemplo, padrão de
reflexão de 99%) atuando como amostra e referência de fundo.
BAIXO-FLUXO DE RUÍDO—O mesmo procedimento pode ser usado com
um material de referência de baixa refletividade (por exemplo, padrão de
refletância de 10%) para determinar o ruído do sistema com fluxo de luz
reduzido. A fonte, a óptica, o detector e a eletrônica fazem contribuições
significativas para o ruído nessas condições.
MÉTODO DE VALIDAÇÃO
Introdução
O objetivo da validação do método NIR, como é o caso da
validação de qualquer procedimento analítico, é demonstrar que
a medição é adequada para o propósito pretendido. A
espectroscopia NIR é um pouco diferente das técnicas analíticas
convencionais porque a validação da primeira geralmente é
obtida pela avaliação de parâmetros quimiométricos, mas esses
parâmetros ainda podem ser relacionados às características
fundamentais de validação exigidas para qualquer método
analítico.
O pré-tratamento de dados geralmente é uma etapa vital na
análise quimiométrica de dados espectrais NIR. O pré-tratamento de
dados pode ser definido como a transformação matemática de dados
espectrais NIR para aprimorar recursos espectrais e/ou remover ou
reduzir fontes indesejadas de variação antes de usar o espectro.
calibraçãoé o processo de desenvolvimento de uma relação
matemática entre a resposta espectral NIR e as propriedades das
amostras. Existem muitos algoritmos quimiométricos adequados
para pré-tratamento e calibração de dados; a seleção deve ser
baseada em julgamento científico sólido e adequação para a
aplicação pretendida.
Parâmetros de validação
As características de desempenho que demonstram a adequação
dos métodos NIR são semelhantes às exigidas para qualquer
procedimento analítico. Uma discussão sobre os princípios gerais
aplicáveis é encontrada emValidação de Procedimentos
Compendiais 〈1225〉. Esses princípios devem ser considerados típicos
dos procedimentos NIR, mas as exceções devem ser tratadas caso a
caso. Para métodos NIR qualitativos, consulte o capítulo Elementos
de dados necessários para validação, categoria IV〈1225〉, ensaios.
Para métodos NIR quantitativos, consulte o capítuloElementos de
dados necessários para validação〈1225〉,Categoria IeCategoria II
ensaios. Critérios de aceitação específicos para cada parâmetro de
validação devem ser consistentes com o uso pretendido do método.
As amostras para validação devem ser independentes do conjunto de
calibração.
Especificidade—A extensão do teste de especificidade depende
da aplicação pretendida. A demonstração da especificidade nos
métodos NIR é normalmente realizada usando as seguintes
abordagens:
Qualitativo—O teste de identificação é uma aplicação comum da
espectroscopia NIR qualitativa. A identificação é obtida comparando
um espectro de amostra com um espectro de referência ou uma
biblioteca de espectros de referência. A especificidade do método de
identificação NIR é demonstrada pela obtenção de identificação
positiva de amostras juntamente com resultados negativos de
materiais que não devem atender aos critérios de identificação
positiva. Materiais para demonstrar especificidade
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Informações gerais /〈1119〉 Espectroscopia de infravermelho próximo 717
deve ser baseado em julgamento científico sólido e pode incluir
materiais semelhantes em aparência visual, estrutura química
ou nome.
Quantitativo—As aplicações quantitativas da espectroscopia NIR
normalmente envolvem o estabelecimento de uma relação
matemática entre a resposta espectral NIR e uma propriedade física
ou química de interesse. A demonstração de especificidade contra
uma propriedade física ou química de interesse baseia-se na
interpretação dos atributos espectrais NIR e dos parâmetros
quimiométricos em termos da aplicação pretendida e pode incluir o
seguinte:
• As regiões espectrais no modelo de calibração podem ser
correlacionadas a uma resposta espectral NIR conhecida associada
à propriedade de interesse.
• Os comprimentos de onda usados pela análise de regressão para a
calibração (por exemplo, para modelos de regressão linear múltipla
[MLR]) ou o vetor de carga para cada fator (por exemplo, para modelos
de mínimos quadrados parciais [PLS] ou modelos de regressão de
componentes principais [PCR]) podem ser examinados para verificar
informações espectroscópicas relevantes que são usadas para o modelo
matemático.
• A variação nos espectros das amostras para calibração pode ser
examinada e interpretada como observações espectrais esperadas.
• A variação na composição do material e na matriz da
amostra pode não ter efeito significativo na quantificação
da propriedade de interesse dentro da faixa de método
especificada.
Linearidade—Os métodos quantitativos NIR geralmente tentam
demonstrar uma relação linear entre a resposta espectral NIR e a
propriedade de interesse. Embora a demonstração de uma resposta
linear não seja necessária para todas as aplicações NIR, o modelo
escolhido, seja linear ou não, deve representar adequadamente a
relação.
A validação da linearidade em métodos NIR pode ser
realizada examinando um gráfico de resposta espectral NIR
versus valores reais ou aceitos para a propriedade de interesse.
Muitos métodos estatísticos estão disponíveis para avaliação da
qualidade do ajuste da relação linear. Outras estatísticas
aplicáveis e métodos gráficos podem ser apropriados.
O coeficiente de correlação, r, pode não ser uma medida
informativa de linearidade. O quadrado do coeficiente de
correlação (Pearson) é uma medida da fração da variação dos
dados que é adequadamente modelada pela equação. A
linearidade depende do erro padrão da equação de calibração (e,
portanto, do método de referência) e da faixa dos dados de
calibração. Assim, embora valores muito próximos de 1,00, como
0,99 ou mais, normalmente indiquem uma relação linear, valores
mais baixos não distinguem entre não linearidade e variabilidade
ao redor da linha.
Variar-A faixa especificada de um método NIR depende da
aplicação específica. A faixa normalmente é estabelecida
confirmando que o método NIR fornece capacidade de
medição adequada (exatidão e precisão) quando aplicado a
amostras dentro dos limites extremos da medição NIR.
Controles devem ser usados para garantir que resultados
fora da faixa validada não sejam aceitos. Em certas
circunstâncias, pode não ser possível ou desejável estender o
intervalo validado para incluir a variabilidade da amostra fora
do intervalo validado. A extensão do alcance de um método
NIR requer a demonstração da capacidade de medição
adequada dentro dos limites do alcance expandido. Exemplos
de situações em que apenas uma gama limitada de amostras
pode estar disponível são amostras de um processo de
fabricação controlado e amostras em processo.
Precisão-A precisão nos métodos NIR é demonstrada mostrando
a proximidade da concordância entre o valor que é aceito como um
valor verdadeiro convencional ou um valor de referência aceito. A
precisão pode ser determinada pela comparação direta entre os
resultados da validação NIR e os valores de referência reais ou
aceitos. A concordância adequada entre NIR e os valores de
referência é baseada na capacidade de medição necessária para uma
aplicação específica. O propósito é
718 〈1119〉 Espectroscopia de infravermelho próximo/ Informações gerais
demonstrar uma relação linear entre os resultados NIR e os
valores reais. A precisão pode ser determinada pela concordância
entre o erro padrão de previsão (SEP) e o erro padrão do método
de referência para validação. O erro do método de referência
pode ser conhecido com base em dados históricos, por meio de
resultados de validação específicos do método de referência ou
pelo cálculo do erro padrão do laboratório (SEL). Um acordo
adequado entre a SEP e a SEL é baseado na capacidade de
medição necessária para uma aplicação específica.
Precisão-A precisão de um método NIR expressa a
proximidade da concordância entre uma série de medições sob
condições prescritas. Dois níveis de precisão devem ser
considerados: repetibilidade e precisão intermediária. A precisão
de um método NIR normalmente é expressa como o desvio
padrão relativo de uma série de resultados do método NIR e deve
ser adequada para a aplicação pretendida. A demonstração de
precisão em métodos NIR pode ser realizada usando as seguintes
abordagens:
Repetibilidade—A repetibilidade pode ser demonstrada pelo
seguinte:
• Avaliação estatística de um número de medições
replicadas da amostra sem reposicionar a amostra
entre cada aquisição espectral individual, ou
• Avaliação estatística de vários resultados do método NIR, cada
resultado de uma análise replicada de uma amostra subsequente
ao reposicionamento entre as aquisições espectrais
Precisão intermediária—A precisão intermediária pode ser
mostrada pelo seguinte:
• Avaliação estatística de várias medições NIR replicadas das
mesmas amostras ou amostras semelhantes no Repetibilidade
estudo de diferentes analistas em dias diferentes.
Robustez—Os parâmetros de medição NIR selecionados para
demonstrar robustez variam dependendo da aplicação e da
interface da amostra com o instrumento NIR. Parâmetros de
medição críticos associados à robustez geralmente são
identificados e caracterizados durante o desenvolvimento do
método. Parâmetros de medição típicos incluem o seguinte:
• Efeito das condições ambientais (por exemplo,
temperatura, umidade e vibração)
• Efeito da temperatura da amostra
• Manuseio da amostra (por exemplo, profundidade da sonda, compressão do
material, profundidade/espessura da amostra, apresentação da amostra)
• Influência de alterações no instrumento (por exemplo, troca de lâmpada, tempo de
aquecimento)
Avaliação contínua do método
Os métodos NIR validados devem estar sujeitos a avaliação
de desempenho contínua, que pode incluir o monitoramento
da exatidão, precisão e outros parâmetros de método
adequados. Se o desempenho for inaceitável, uma ação
corretiva é necessária. Envolve a realização de uma
investigação para identificar a causa da alteração no
desempenho do método e pode indicar que o método NIR
não é adequado para uso contínuo. Melhorar o método NIR
para atender aos critérios de adequação de medição pode
exigir o desenvolvimento de método adicional e
documentação de experimentos de validação demonstrando
que o método aprimorado é adequado para a aplicação
pretendida. A extensão da revalidação necessária depende da
causa da mudança no desempenho do método e da natureza
da ação corretiva necessária para estabelecer o desempenho
adequado do método.
A revalidação de um modelo qualitativo pode ser necessária como
resultado do seguinte:
• Adição de um novo material à biblioteca de referência
espectral
• Mudanças nas propriedades físicas do material
• Mudanças na fonte de fornecimento de material
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• Identificação de atributo(s) crítico(s) previamente desconhecido(s) de
material(is)
A revalidação de um modelo quantitativo pode ser necessária
como resultado do seguinte:
• Alterações na composição da amostra de teste ou
produto acabado
• Mudanças no processo de fabricação
• Mudanças nas fontes ou graus de matérias-primas
• Mudanças no método analítico de referência
• Principais mudanças no hardware do instrumento
Outliers—Os espectros de amostra que produzem uma resposta
NIR que difere do modelo de calibração qualitativo ou quantitativo
podem produzir um valor discrepante. Isso não indica
necessariamente um resultado fora da especificação; mas um valor
atípico indica que testes adicionais da amostra podem ser necessários
e dependem do método NIR específico. Se o teste subseqüente da
amostra por um método apropriado indicar que a propriedade de
interesse está dentro das especificações, então a amostra atende às
suas especificações. Amostras discrepantes podem ser incorporadas
a um modelo de calibração atualizado após a execução e
documentação de estudos de validação adequados.
Transferência de método
Os controles e medidas para demonstrar a adequação do
desempenho do método NIR após a transferência do método são
semelhantes aos exigidos para qualquer procedimento analítico. As
exceções aos princípios gerais para conduzir a transferência de
método para métodos NIR devem ser justificadas caso a caso. A
transferência de um método NIR geralmente é realizada usando um
modelo de calibração NIR em um segundo instrumento semelhante
ao instrumento principal usado para desenvolver e validar o método.
Quando um modelo de calibração é transferido para outro
instrumento, procedimentos e critérios devem ser aplicados para
demonstrar que o modelo de calibração atende aos critérios de
medição adequados no segundo instrumento. A seleção de um
procedimento de transferência de modelo de calibração apropriado
deve ser baseada em um julgamento científico sólido.
GLOSSÁRIO
ABSORVÊNCIA, A, é representado pela equação:
A = –log T = log (1/T)
onde T é a transmitância da amostra. A absorbância também é
freqüentemente dada como:
A = log (1/R)
onde R é a refletância da amostra.
ESPECTRO DE FUNDOé usado para gerar um espectro de amostra
com contribuições mínimas da resposta do instrumento.
Também é referido como umespectro de referênciaoureferência
de fundo.A proporção do espectro da amostra para o espectro
de fundo produz um espectro de transmitância ou refletância
dominado pela resposta espectral NIR associada à amostra. Nas
medições de reflexão, um material de referência padrão difuso
altamente reflexivo é para a medição do espectro de fundo. Para
medição de transmissão, o espectro de fundo pode ser medido
sem nenhuma amostra presente no espectrômetro ou usando
uma célula com o branco do solvente ou uma célula preenchida
com material de referência apropriado.
MODELO DE CALIBRAÇÃOé uma expressão matemática para
relacionar a resposta de um instrumento analítico às propriedades
das amostras.
REFLETÂNCIA DIFUSAé a proporção do espectro de luz
irradiada que penetra na superfície da amostra, interage
com a amostra, passa de volta pela superfície da amostra e
atinge o detector para o espectro de fundo. Isto é
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o componente da refletância geral que produz o espectro
de absorção da amostra.
FIBRA-SONDAS ÓTICASconsistem em dois componentes: fibras
ópticas que podem variar em comprimento e número de fibras e
um terminal, que contém óptica especialmente projetada para
exame da matriz da amostra.
QUALIFICAÇÃO DE INSTALAÇÃOé a coleção documentada de atividades
necessárias para estabelecer que um instrumento seja entregue
conforme projetado e especificado, seja instalado adequadamente
no ambiente selecionado e que esse ambiente seja adequado para a
finalidade pretendida do instrumento.
LARGURA DE BANDA OU RESOLUÇÃO DO INSTRUMENTOé uma medida do
capacidade de um espectrômetro para separar a radiação de comprimentos de onda
semelhantes.
REGRESSÃO LINEAR MÚLTIPLAé um algoritmo de calibração para
relacionar a resposta de um instrumento analítico às propriedades
das amostras. A característica distintiva deste algoritmo é o uso de
um número limitado de variáveis independentes. Cálculos de
mínimos quadrados lineares são realizados para estabelecer uma
relação entre essas variáveis independentes e as propriedades das
amostras.
QUALIFICAÇÃO OPERACIONALé o processo pelo qual é
demonstrado e documentado que um instrumento funciona de
acordo com as especificações e que pode executar a tarefa
pretendida. Este processo é necessário após qualquer alteração
significativa, como instalação, realocação ou reparo importante do
instrumento.
REFLETÂNCIA GERALé a soma da refletância difusa e
especular.
MÍNIMOS QUADRADOS PARCIAIS (PLS)é um algoritmo de calibração para
relacionar as respostas do instrumento às propriedades das
amostras. A característica distintiva deste algoritmo é que os dados
relativos às propriedades das amostras para calibração são usados
no cálculo dos fatores para descrever as respostas do instrumento.
QUALIFICAÇÃO DE DESEMPENHOé o processo de usar um ou
materiais de referência mais bem caracterizados e estáveis para verificar
o desempenho consistente do instrumento. A qualificação de
desempenho pode empregar os mesmos padrões ou padrões diferentes
para diferentes características de desempenho.
LINEARIDADE FOTOMÉTRICA, também conhecido comoverificação
fotométrica,é o processo de verificação da resposta da escala
fotométrica de um instrumento.
REGRESSÃO DO COMPONENTE PRINCIPAL (PCR)é um al-
algoritmo para relacionar a resposta de um instrumento analítico
com as propriedades das amostras. Esse algoritmo, que expressa um
conjunto de variáveis independentes como uma combinação linear
de fatores, é um método de relacionar esses fatores às propriedades
das amostras para as quais as variáveis independentes foram
obtidas.
PSEUDO-ABSORVÊNCIA, A, é representado pela equação:
A = –log R = log (1/R)
onde R é a refletância difusa da amostra.
ESPECTRO DE REFERÊNCIA-VerEspectro de fundo.
REFLETÂNCIAé descrita pela equação:
R = eu/euR
em que I é a intensidade da radiação refletida da superfície
da amostra e IRé a intensidade da radiação refletida de um
material de referência de fundo e suas perdas incorporadas
devido à absorção de solvente, refração e espalhamento.
RAIZ-SIGNIFICA-RUÍDO QUADRADO (RMS)é calculado pela equação:
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Informações gerais /〈1119〉 Espectroscopia de infravermelho próximo 719
em que Aeué a absorbância para cada ponto de dados; A é a
absorbância média sobre o segmento espectral; e N é o
número de pontos por segmento.
BIBLIOTECA DE REFERÊNCIA ESPECTRALé uma coleção de espectros de
materiais conhecidos para comparação com materiais desconhecidos. O
termo é comumente usado em conexão com métodos qualitativos de
análise espectral (por exemplo, identificação de materiais).
REFLECTÂNCIA ESPECULAR (SUPERFÍCIE)é a refletância da frente
superfície da amostra.
ERRO PADRÃO DE CALIBRAÇÃO (SEC)é uma medida do ca-
capacidade de um modelo se ajustar aos dados de referência. SEC é o
desvio padrão dos resíduos obtidos comparando os valores
conhecidos para cada uma das amostras de calibração com os
valores que são calculados a partir da calibração. SEC não deve ser
usado como uma ferramenta de avaliação para a exatidão esperada
do método (veracidade e precisão da previsão) do valor previsto de
amostras futuras. A precisão do método geralmente deve ser
verificada calculando o erro padrão de previsão (SEP), usando um
conjunto de amostras de validação independente. Um método aceito
é marcar uma parte do conjunto de calibração como o conjunto de
validação. Este conjunto não é totalmente independente, mas pode
ser utilizado como alternativa para a determinação da precisão.
ERRO PADRÃO DE CRUZ-VALIDAÇÃO(SECV) é o padrão
desvio calculado usando o método leave-one-out. Nesse método,
uma amostra de calibração é omitida da calibração e a diferença é
encontrada entre o valor dessa amostra calculado a partir de seu
valor de referência e o valor obtido da calibração calculada de todas
as outras amostras do conjunto. Este processo é repetido para todas
as amostras do conjunto, e o SECV é o desvio padrão das diferenças
calculadas para todas as amostras de calibração. Este procedimento
também pode ser realizado com um grupo de amostras. Em vez de
deixar a amostra de fora, um grupo de amostras é deixado de fora. O
SECV é uma medida da precisão do modelo que se pode esperar ao
medir amostras futuras se não houver amostras suficientes
disponíveis para que o SEP seja calculado a partir de um conjunto de
validação completamente independente.
ERRO PADRÃO DO LABORATÓRIO (SEL)é um cálculo
com base em leituras repetidas de uma ou mais amostras para
estimar a precisão e/ou exatidão do método laboratorial de
referência, dependendo de como os dados foram coletados.
ERRO PADRÃO DE PREVISÃO (SEP)é uma medida do modelo
precisão de um método analítico baseado na aplicação de um
determinado modelo de calibração aos dados espectrais de um
conjunto de amostras diferentes, mas semelhantes aos usados
para calcular o modelo de calibração. SEP é o desvio padrão dos
resíduos obtidos comparando os valores do laboratório de
referência com os do método em teste para as amostras
especificadas. O SEP fornece uma medida da precisão do modelo
esperada quando se medem amostras futuras.
REFLETÂNCIA DE SUPERFÍCIE, também conhecido comoreflexão especular,é
aquela porção da radiação que não interage com a amostra, mas
simplesmente reflete de volta a partir da camada superficial da amostra
(interface amostra-ar).
TRANSFLEÇÃOé uma técnica de medição de transmitância na
qual a radiação atravessa a amostra duas vezes. A segunda vez
ocorre depois que a radiação é refletida de uma superfície
atrás da amostra.
TRANSMISSÃOé representado pela equação:
T = eu/eu0 ou T = 10UMA
em que I é a intensidade da radiação transmitida através da
amostra; EU0é a intensidade da energia radiante incidente
na amostra e inclui perdas devido ao solvente
720 〈1119〉Espectroscopia de infravermelho próximo/Informações gerais
absorção, refração e espalhamento; e A é a
absorvância.
〈1120〉ESPECTROSCOPIA RAMAN
INTRODUÇÃO
A espectroscopia Raman compartilha muitos dos princípios que se
aplicam a outras medições espectroscópicas discutidas em
Espectrofotometria e dispersão de luz〈851〉.Raman é uma técnica
espectroscópica vibracional e, portanto, está relacionada à espectroscopia
de infravermelho (IR) e infravermelho próximo (NIR). O próprio efeito
Raman surge como resultado de uma mudança na polarizabilidade das
ligações moleculares durante um determinado modo vibracional e é
medido como radiação espalhada inelasticamente.
Um espectro Raman é gerado excitando a amostra de interesse
para um estado virtual com uma fonte monocromática, normalmente
um laser. A luz espalhada elasticamente (sem mudança no
comprimento de onda) é conhecida como dispersão de Rayleigh e não
é de interesse na espectrometria Raman, exceto para marcar o
comprimento de onda do laser. No entanto, se a amostra relaxa a um
nível de energia vibracional que difere do estado inicial, a radiação
espalhada é deslocada em energia. Essa mudança é proporcional à
diferença de energia entre os estados vibracional inicial e final. Essa
luz “dispersa inelasticamente” é chamada de dispersão Raman.
Apenas cerca de um em cada 106–108 os fótons incidentes na amostra
sofrem espalhamento Raman. Assim, os lasers são empregados nos
espectrômetros Raman. Se o fóton espalhado Raman for de energia
mais baixa, ele é chamado de espalhamento Stokes. Se for de maior
energia, é chamado de espalhamento anti-Stokes. Na prática, quase
todas as medições Raman analiticamente úteis fazem uso da
dispersão Raman deslocada por Stokes.
A aparência de um espectro Raman é muito parecida com um espectro
infravermelho plotado linearmente em absorbância. As intensidades, ou o
número de fótons Raman contados, são plotados contra as energias
deslocadas. O eixo x é geralmente rotulado como “Raman Shift/cm–1” ou
“Número de onda/cm–1”. O deslocamento Raman geralmente é expresso
em número de onda e representa a diferença no número de onda absoluto
do pico e o número de onda do laser. O espectro é interpretado da mesma
maneira que o espectro de infravermelho médio correspondente. As
posições dos números de onda (deslocados Raman) para um determinado
modo vibracional são idênticas aos números de onda das bandas
correspondentes em um espectro de absorção de infravermelho. No
entanto, os picos mais fortes em um espectro Raman são frequentemente
fracos em um espectro IR e vice-versa. Assim, as duas técnicas
espectroscópicas costumam ser consideradas complementares.
A espectroscopia Raman é vantajosa porque medições rápidas e
precisas geralmente podem ser feitas sem destruir a amostra (sólido,
semissólido, líquido ou, menos frequentemente, gás) e com
preparação mínima ou nenhuma amostra. O espectro Raman contém
informações sobre os modos vibracionais fundamentais da amostra
que podem fornecer compreensão da amostra e do processo. O sinal
normalmente está na faixa visível ou NIR, permitindo o acoplamento
eficiente à fibra óptica. Isso também significa que um sinal pode ser
obtido de qualquer meio transparente à luz do laser; exemplos são
vidro, plástico ou amostras em meio aquoso. Além disso, como os
espectros Raman são normalmente excitados com radiação visível ou
NIR, pode ser usada óptica padrão de vidro/quartzo. Do ponto de
vista instrumental, os sistemas modernos são fáceis de usar,
fornecem tempos de análise rápidos (segundos a vários minutos) e
são confiáveis. No entanto, deve-se reconhecer o perigo do uso de
lasers de alta potência, principalmente quando seus comprimentos
de onda estão no NIR e, portanto, não visíveis a olho nu. Fibra-
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as sondas ópticas devem ser usadas com cautela e com referência
aos regulamentos governamentais apropriados sobre lasers e classes
de laser.
Além da espectroscopia Raman “normal”, existem várias
técnicas Raman mais especializadas. Isso inclui ressonância
Raman (RR), espectroscopia Raman aprimorada de superfície
(SERS), atividade óptica Raman (ROA), espectroscopia Raman
anti-Stokes coerente (CARS), espectroscopia Raman de ganho ou
perda e espectroscopia hiper-Raman. Essas técnicas não são
amplamente empregadas em laboratórios farmacêuticos e não
são abordadas neste capítulo de informações gerais.
RAMAN QUALITATIVO E QUANTITATIVO
MEDIDAS
Existem duas classes gerais de medições que são
comumente realizadas por espectrometria Raman:
qualitativa e quantitativa.
Medições Raman Qualitativas
As medições Raman qualitativas fornecem informações espectrais sobre
os grupos funcionais que estão presentes em uma amostra. Como o
espectro Raman é específico para um determinado composto, as medições
Raman qualitativas podem ser usadas como um teste de ID compendial,
bem como para elucidação estrutural.
Medições Raman Quantitativas
Para instrumentos equipados com um detector que mede a
potência óptica (como os espectrômetros de transformada de Fourier
[FT]-Raman), as medições Raman quantitativas utilizam a seguinte
relação entre o sinal, Sn, em um determinado número de onda, ν, e a
concentração de um analito, C:
Sn= Senhorn(neu-nb)4P0C
em que K é uma constante que depende do diâmetro do feixe de
laser, óptica de coleta, volume da amostra e temperatura; σné a seção
transversal Raman do modo vibracional particular; neué o número de
onda do laser; νbé o número de onda do modo vibracional; e P0 é a
potência do laser. A seção transversal Raman, σDENTRO, é característico
da natureza do modo vibracional particular. O volume da amostra é
definido pelo tamanho do foco do feixe de laser na amostra, a ótica
sendo usada para focar e as propriedades óticas da própria amostra.
Os tamanhos dos pontos na amostra podem variar de menos de 1m
m para uma microssonda a 6 mm para um sistema de amostra de
grande área. Para espectrômetros Raman que medem o número de
fótons por segundo (como espectrômetros Raman de dispositivo
acoplado a mudanças [CCD]), a equação correspondente é:
Sn= Senhornneu(neu-nb)3P0C
A partir das equações acima, é evidente que o sinal de pico é
diretamente proporcional à concentração. É esta relação
que é a base para a maioria das aplicações Raman
quantitativas.
FATORES QUE AFETAM A QUANTIFICAÇÃO
Fatores baseados em amostras
Os fatores baseados em amostras mais importantes que
afetam deletério a espectrometria Raman quantitativa são
fluorescência, aquecimento da amostra, absorção pela matriz ou
pela própria amostra e o efeito da polarização. Se a matriz de
amostra incluir compostos fluorescentes, o sinal medido