DISSERTAÇÃO

MAPEAMENTO GENÉTICO E DETECÇÃO

DE QTLs EM UM CRUZAMENTO DE
LIMÃO ‘CRAVO’ E CITRUMELO
‘SWINGLE’

LAURA MACHADO DE FARIA

Campinas, SP
2007
 INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA

TROPICAL E SUBTROPICAL

MAPEAMENTO GENÉTICO E DETECÇÃO DE QTLs

EM UM CRUZAMENTO DE LIMÃO ‘CRAVO’ E
CITRUMELO ‘SWINGLE’

LAURA MACHADO DE FARIA

Orientador: Dr. Marcos Antônio Machado

Co-orientadora: Dra. Mariângela Cristofani-Yaly

Dissertação submetida como

requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Agricultura
Tropical e Subtropical Área de
Concentração em Melhoramento
Genético Vegetal

Campinas, SP
Abril 2007
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e documentação
do Instituto Agronômico

F224m Faria, Laura Machado de

Mapeamento genético e detecção e QTLs em um cruza-
mento de limão ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’ / Laura Machado de
Faria.
Campinas, 2007
93 fls

Orientador: Dr. Marcos Antônio Machado

Co-orientadora: Dra. Mariângela Cristofani-Yaly
Dissertação - Mestrado em Agricultura Tropical e
Subtropical – Instituto Agronômico

1. Limão cravo - vírus da tristeza 2. Citros - padrão foliar

3. TRAP I. Machado, Marcos Antônio II. Cristofani-Yaly, Mariân-
gela
III. Campinas. Instituto Agronômico IV. Título

CDD. 634.33
À minha mãe Maria,
por me possibilitar,
com apoio e amor...
concluir este trabalho,
DEDICO

Aos alunos;

jovens pesquisadores

que creditam na pesquisa um amanhã

melhor,

OFEREÇO

iii
 AGRADECIMENTOS

- Ao pesquisador e orientador Dr. Marcos Antônio Machado pela oportunidade de

orientação e crescimento adquiridos com seu nível de exigência e estímulo frente
aos desafios surgidos;

- À pesquisadora e co-orientadora Dra. Mariângela Cristofani-Yali pelo seu apoio e

ensinamentos que foram constantes e igualmente importantes para este trabalho;

- À pesquisadora Dra. Marinês Bastianel por sua importante contribuição nas

análises estatísticas;

- Aos pesquisadores Drs. Luis Eduardo Aranha Camargo e Maria Imaculada Zucchi
pelas observações enriquecedoras à dissertação como membros examinadores;

- Ao meu avô pelas canções inspiradas que tocamos e cantamos juntos, às minhas
vozinhas pela amizade e histórias que impulsionaram meus sonhos e minhas
esperanças;

- À Lu Faldoni pela divertida companhia e auxílio pontual no desenvolvimento das

etapas finais experimentais deste trabalho;

- Aos colegas de laboratório Carol, Fernanda, Flavia, Francineide, Juliana, Keli,

Mariana, Marcelo, Paulo, Rafael, Raquel, Thiago e Vandeclei pelos momentos de
conhecimentos compartilhados e pela amizade;

- Às colegas Dras. Andréa e Andréia e ao Dr. Berghem, pelas discussões científicas

e prazerosa convivência, principalmente na etapa de finalização do mestrado;

- À toda a equipe de pesquisadores, aos funcionários da administração e colegas do

Centro APTA Citros Sylvio Moreira e aos colegas da PG-IAC pelas preciosas
colaborações e amizade no decorrer do curso;

- Ao IAC e ao Centro APTA Citros Sylvio Moreira pela oportunidade oferecida de

grande aprendizado;

- Ao CNPq pela bolsa de fomento à pesquisa concedida.

iv
 SUMÁRIO

ÍNDICE DE TABELAS........................................................................................... vi
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................ vii
LISTA DE ANEXOS............................................................................................... viii
RESUMO................................................................................................................. ix
ABSTRACT............................................................................................................. x
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 01
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................. 06
2.1 Citricultura no Brasil.......................................................................................... 06
2.2 Genética e Melhoramento de Citros................................................................... 08
2.3 Mapas Genéticos................................................................................................ 14
2.4 Mapeamento Genético de Citros........................................................................ 21
2.5 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 24
2.6 Padrão Foliar, Enraizamento e CTV.................................................................. 26
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 29
3.1 Material Genético............................................................................................... 29
3.2 Extração do DNA Total..................................................................................... 29
3.3 Marcadores RAPD............................................................................................. 30
3.4 Marcadores Microssatélites................................................................................ 31
3.5 Marcadores TRAPs (“Target Region Amplification Polymorphism”)……….. 32
3.6 Avaliação de Características Morfológicas........................................................ 34
3.6.1 Morfologia foliar............................................................................................. 34
3.6.2 Capacidade de enraizamento de estacas.......................................................... 34
3.7 Avaliação de Resistência ao CTV...................................................................... 34
3.8 Análise Estatística dos Dados Morfológicos..................................................... 36
3.9 Construção dos Mapas de Ligação..................................................................... 37
3.10 Identificação de QTLs...................................................................................... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 38
4.1 Caracterização Morfológica dos Híbridos......................................................... 42
4.1.1 Padrão foliar.................................................................................................... 42
4.1.2 Enraizamento de estacas................................................................................. 44
4.2 Avaliação de Resistência ao CTV...................................................................... 45
4.3 Mapas de Ligação.............................................................................................. 48
4.3.1 Marcadores moleculares................................................................................. 49
4.3.2 Análise de ligação........................................................................................... 54
4.4 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 62
5 CONCLUSÕES.................................................................................................... 67
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 68
7 ANEXOS.............................................................................................................. 87

v
 ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Códigos utilizados para os tipos de segregação para uma

população CP (Cross Pollinators)*............................................ 32

Tabela 2 - Seqüências dos “primers” fixos e arbitrários utilizados para os

marcadores TRAPs.................................................................... 33

Tabela 3 - Resultados médios obtidos da mensuração das variáveis CTV,

Enraizamento (E), índice de morfologia foliar (IF) e tipo de
folha em três plantas de 94 híbridos de limão ‘Cravo’ e
citrumelo ‘Swingle’ e genitores................................................ 39

Tabela 4 - Estimativa de parâmetros genéticos obtidos para as

características número médio de estacas enraizadas,
absorbância (CTV) e índice de morfologia foliar em uma
progênie de 94 indivíduos do cruzamento entre limão ‘Cravo’
vs citrumelo ‘Swingle’.............................................................. 41

Tabela 5 - Número, tipo de marcadores e a distância em centiMorgans

(cM) de cada grupo de ligação do mapa de citrumelo
‘Swingle’................................................................................... 55

Tabela 6 - Número, tipo de marcadores e a distância em centiMorgans

(cM) de cada grupo de ligação do mapa de limão ‘Cravo’....... 55

Tabela 7 - Detalhes dos QTLs detectados nos grupos de ligação de

citrumelo ‘Swingle’, pelo método “Multiple QTL Maping”
(MQM) associados às características estudadas........................ 62

vi
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Ilustração de como os híbridos de limão ‘Cravo’ com

citrumelo ‘Swingle’ e os genitores foram inoculados com
material de laranja ‘Pêra’ infectada com CTV estirpe ‘Barão
B’............................................................................................... 36

Figura 2 - Padrão de folíolos e folhas em híbridos de limão ‘Cravo’ com

citrumelo ‘Swingle’. (G= limão ‘Cravo’, H= híbridos, I=
citrumelo ‘Swingle’)................................................................... 42

Figura 3 - Padrão de enraizamento de estacas de limão ‘Cravo’ (A),

citrumelo ‘Swingle’ (C) e híbrido
(B).............................................................................................. 44

Figura 4 - Teste de “primers” RAPD (I07 e I10) para avaliação da

segregação utilizando os genitores (LC e CS) e híbridos (1, 2,
3, 4, 5, 6, 7 e 8)........................................................................... 49

Figura 5 - Teste de “primers” TRAPs para avaliação da segregação

utilizando os genitores (LC e CS) e híbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e
7)................................................................................................. 51

Figura 6 - Teste de “primers” SSR (CCSME9) para avaliação da

segregação utilizando os genitores (LC e CS) e híbridos (1, 2,
3, 4, 5 e 6)................................................................................... 53

Figura 7 - Mapa de ligação de citrumelo ‘Swingle’ com 77 marcadores

(36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) em 8 grupos de ligação........... 57

Figura 8 - Mapa de ligação de limão ‘Cravo’ com 33 marcadores (22

RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) em 7 grupos de ligação................... 58

Figura 9 - Grupos de ligação de citrumelo ‘Swingle’ (A) e limão ‘Cravo’

(B) mostrando marcadores SSR em comum.............................. 60

Figura 10 - Marcador SSR (CCSM19) segregando na proporção 1:2:1. LC

= limão ‘Cravo’, CS = citrumelo ‘Swingle’, 1 a 18 híbridos e
M = Marcador de peso molecular Ladder 1 Kb
Plus............................................................................................. 61

Figura 11 - QTLs associados à morfologia foliar (A), resistência a CTV

(B) e enraizamento de estacas (C e D) em mapas de ligação de
citrumelo ‘Swingle’. * Porcentagem de variação fenotípica
que cada QTL pode explicar....................................................... 66

vii
 LISTA DE ANEXOS

Anexo I - Distribuição de médias para as variáveis: número de estacas

enraizadas, absorbância em ELISA (CTV) e índice de
morfologia foliar mensuradas em 94 híbridos........................... 88

Anexo II - Análise de variância para CTV, enraizamento e morfologia

foliar, referentes à avaliação de uma população de híbridos de
limão ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’ em experimento
completamente casualizado em casa de vegetação
89
(Aplicativo: SASM-Agri, Cantieri et al. 2001).........................

Anexo III - Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregação

Mendeliana................................................................................ 90

Anexo IV - Marcadores Microssatélites obtidos a partir de bibliotecas

genômicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de
repetição, seqüência dos “primers”, tipo de segregação e teste
de homogeneidade para segregação Mendeliana...................... 91

Anexo V - Marcadores TRAPs, seqüência dos “primers”, tipo de

segregação e teste de homogeneidade para segregação
Mendeliana................................................................................ 93

viii
FARIA, Laura Machado de. Mapeamento genético e detecção de QTLs em um cruza-
mento de limão ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’. 2007. 93f. Dissertação (Mestrado em
Agricultura Tropical e Sub-Tropical) – Pós-Graduação – IAC.

RESUMO

A presença de inúmeros fitopatógenos, entre outros desafios presentes, de natureza

genética e botânica, limitam o melhoramento genético dos citros por métodos
convencionais. A poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade dificultam
grande parte das estratégias empregadas, principalmente aquelas como a hibridação
sexual. O objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de mapas de ligação de
limão ‘Cravo’ (C. limonia) e citrumelo ‘Swingle’ (C. paradisi x P. trifoliata), com vistas
ao estudo da herança do vírus da tristeza dos citros (CTV). Ao mapa foram incluídas
ainda características contrastantes como padrão foliar e capacidade de enraizamento de
estacas. A estratégia “pseudo-testcross” foi utilizada para a construção de mapas
genéticos de ligação, utilizando marcadores moleculares RAPD, SSR e TRAP. Foram
genotipados 94 híbridos para constituir a população de mapeamento. Para tanto, os
marcadores foram integrados aos mapas de ligação utilizando o programa JoinMap v 3.0,
enquanto que para a detecção e mapeamento de QTLs foram realizadas análises por meio
do programa MapQTL v. 4.0. O número médio de marcadores obtidos por par de
“primers” TRAPs (7,75) foi quase quatro vezes maior que o número de marcadores por
“primer” RAPD (2,14). Foi observada a possibilidade de que dois genes complementares
e dominantes possam estar envolvidos na característica folha trilobada, sendo cada
espécie heterozigótica para um deles. Porcentagens de enraizamento de 70% foram
encontradas para citrumelo ‘Swingle’, 60% para limão ‘Cravo’ e de 0 a 90% para os
híbridos. Em CTV foi encontrado um controle genético monogênico, com proporção 1:1.
As análises pelo método de “Multiple QTL Mapping” (MQM) detectaram a presença de
um QTL para resistência a CTV no grupo de ligação 6 (GL 6 - explicando 95,1% da
variação fenotípica), um para morfologia foliar (GL 4 - 76,1%) e dois QTLs para a
característica enraizamento de estacas (GL 3 e 6 - 50,8% e 37,8%, respectivamente).
Embora os genitores possuam genótipos bastante diferentes, a sintenia entre eles foi
observada em alguns grupos de ligação.

Palavras-chave: vírus da tristeza dos citros, padrão foliar, TRAP

ix
FARIA, Laura Machado de. "Genetic mapping and detection of the QTLs in the crossing
of ‘Rangpur’ lime and ‘Swingle’ citrumelo". 2007. 93f. Dissertação (Mestrado em
Agricultura Tropical e Sub-Tropical) - Pós-Graduação - IAC.

ABSTRACT

Countless and different phytopathogens among other challenges of genetic and botanical
nature, limit conventional approaches for citrus breeding. Poliembryony, sexual
incompatibility and long juvenility hinder in a considerable amount of the adopted
strategies, mainly the approaches based on sexual hybridization. The main objective of
this was to development linkage maps of ‘Rangpur’ lime (C .limonia) and the ‘Swingle’
citrumelo (C .paradisi x P. trifoliata), aiming to evaluate the inheritance to citrus tristeza
virus (CTV). Contrastive characteristics were included on the map, like the foliar pattern
and the rooting capacity of cuttings. The pseudo-testcross strategy was used to build the
genetic linkage maps, with RAPD, SSR and TRAP markers. 94 hybrids were genotyped
in the map population. In order to achieve that, the markers were integrated to the linkage
maps using the software JoinMap v3.0, whereas the software MapQTL v4.0 was used for
the detection and mapping of the QTLs. The mean number of markers obtained by pair of
primers TRAPs (7.75) was almost four times greater than the number of markers per
primer RAPD (2.14). Two complementary and dominant genes seem to be involved in the
trifoliate leave characteristic, considering that each species is heterozygote for one of
them. Rooting capacities of 70% were obtained for the ‘Swingle’ citrumelo, 60% for
‘Rangpur’ lime and from 0 to 90% for hybrids. In CVT, a monogenic genetic control was
found, in a 1:1 ratio. The analysis by the Multiple QTL Mapping (MQM) method detected
the presence of a QTL for CTV resistance on linkage group 6 (GL 6 - explaining 95,1%
of the phenotypic variation), one for foliar morphology on linkage group 4 (GL 4 -
76,1%) and two QTLs for rooting of cuttings on the linkage groups 3 and 6 (GL 3 and 6 -
50,8% e 37,8%, respectively). Although the parents are quite different genotype, sinteny
between them was also observed in some linkage groups.

Key words: citrus tristeza virus - foliar pattern – TRAP

x
 1 INTRODUÇÃO

A indústria citrícola é uma das principais atividades do agronegócio

brasileiro, sendo o suco concentrado congelado sua principal “commodity” para
exportação. O Brasil lidera as exportações mundiais de suco concentrado de laranja
e de sua produção, com participação acima de 70% e de 29% do mercado
internacional, respectivamente. Internamente valores expressivos também são
alcançados, visto que a laranja representa 49% de toda a produção de frutas do país
(NEVES & LOPES, 2005). Com uma área cultivada em torno de 600 mil hectares
e produção de 352 milhões de caixas de 40,8 kg/planta/ano, o setor citrícola conta
com uma cadeia altamente organizada desde viveiros até a indústria exportadora e
mantêm-se há anos na liderança mundial (IEA, 2007). A exportação de suco de
laranja concentrado e sub-produtos (pectina, “pellet” para ração, óleos, etc.)
movimentam algo próximo de 1,5 bilhões de dólares anuais (OLIVEIRA et al.,
2005).
É importante destacar que o aumento da produção nos últimos anos
explica-se, essencialmente, por um acréscimo de áreas de plantio. As condições
edafoclimáticas têm favorecido a cultura dos citros em várias regiões do Brasil,
entretanto, a produtividade média ainda é muito baixa, quando comparada com
outras importantes regiões produtoras, como a Flórida, que alcança uma média de
6,0 caixas/planta/ano com intensivo uso de irrigação, diferentemente da produção
média brasileira de 2,0 caixas/planta/ano. Nestes moldes, pode-se afirmar que a
baixa produtividade brasileira, associada à ausência de irrigação, deve-se em
grande parte a fatores de ordem fitossanitária e às estratégias de manejo do pomar e
pós-colheita dos frutos (MACHADO et al., 2005). No entanto, doenças e pragas
são os principais fatores limitantes da agroindústria citrícola brasileira,
representando mais de 60% do custo de produção.
A conseqüente vulnerabilidade dos citros a pragas e doenças decorre de
uma estreita base genética ocasionada pela adoção de um sistema de produção
considerado monocultural, em que um número reduzido de variedades é cultivado
em grandes extensões. É importante salientar que, apesar de o gênero Citrus
apresentar uma grande diversidade de espécies, apenas um pequeno número é

1
utilizado comercialmente.
Como exemplos dos diferentes fitopatógenos de citros que trouxeram
graves problemas ao Brasil no século XX, podem ser citados o vírus da tristeza dos
citros (CTV) e a leprose nos anos 40, o cancro cítrico nos anos 50, o declínio nos
anos 70, a clorose variegada dos citros e a pinta preta nos anos 90 (ROSSETTI et
al., 1990) e, mais recentemente, a morte súbita dos citros (MSC) e o huanglongbing
(HLB) (ex-greening) (GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MÜLLER
et al., 2001; COLETTA-Filho et al., 2004).
Uma alternativa racional frente ao usual controle químico dessas doenças
ou de seus vetores é a obtenção de genótipos com maior resistência a esses
principais patógenos (CRISTOFANI et al., 1999). Sendo assim, os programas de
melhoramento genético e seleção dos citros focam a obtenção de novos porta-
enxertos e variedades copa que sejam resistentes às doenças e pragas, e mais
adaptados a condições abióticas adversas.
Frente a este cenário, o melhoramento de citros tem se destacado nas
últimas décadas, principalmente devido à possibilidade de utilização e
incorporação de ferramentas de biotecnologia aos programas tradicionais de
melhoramento. Nesse aspecto, a utilização de marcadores moleculares para a
seleção precoce de plantas de origem sexual, oriundas de cruzamentos dirigidos,
possibilitou a seleção de um número elevado de novas combinações e,
consequentemente, o estabelecimento de um maior número de populações híbridas
em condições de campo para seleção de novas variedades e características
agronômicas desejáveis. Entretanto, segundo NOVELLI et al. (2006), ROOSE
(2003) e CRISTOFANI et al. (2000) algumas limitações fazem das espécies do
gênero Citrus, um desafio para os estudos genéticos, especialmente, sua alta
heterozigosidade genética, longo tempo de geração necessário para a seleção,
recombinação e poliembrionia nucelar adventícia. Podem aparecer, em citros, cerca
de três a doze embriões apomíticos formados a partir de células da nucela. O grau
da embrionia nucelar varia entre os porta-enxertos de 100 para menos de 50%.
Entretanto, alguns tipos de citros são monoembriônicos, produzindo somente
plântulas zigóticas (QUEIROZ-VOLTAN & BLUMER, 2005).
Embora os desafios na obtenção de progênies no cruzamento dentro do
gênero Citrus e entre gêneros próximos sejam consideráveis, existem várias fontes
de resistência a fatores bióticos e abióticos que podem ser potencializadas na

2
obtenção de indivíduos com características agronômicas desejáveis (MESTRE et
al., 1997a). Essa abordagem é particularmente importante quando a ela se agregam
ferramentas, auxiliando na seleção de indivíduos zigóticos, na obtenção de
marcadores, no mapeamento genético, culminando com a seleção assistida por
marcadores, uma etapa ainda em processo de incorporação aos programas de
melhoramento de citros.
Em se tratando de uma abordagem metodológica, uma das formas mais
eficientes de associar características fenotípicas com características genéticas é por
meio de mapas genéticos de ligação, no qual essas características são ordenadas
sequencialmente correspondendo de modo aproximado à posição dos genes nos
cromossomos (ROOSE, 2003). Mapas de ligação têm contribuído de maneira
significativa para programas de melhoramento e pesquisa genética, sendo uma das
mais eficientes estratégias para condução de estudos genéticos avançados
facilitando a seleção de plantas, o entendimento da herança, estrutura e organização
do genoma. Os citros possuem características favoráveis que auxiliam a construção
de mapas genéticos. Eles são espécies predominantemente diplóides (2n = 18),
possuem um genoma pequeno, bom nível de polimorfismo entre espécies e várias
espécies produzem híbridos férteis (OLIVEIRA et al., 2005).
Diferentes marcadores têm sido usados no desenvolvimento de mapas de
ligação em várias populações de citros. Marcadores dominantes como RAPD -
“random amplified polymorphic DNA” (WILLIAMS et al.,1990) e AFLP -
“amplified fragment lenght polymorphism” (VOS et al.,1995) são os mais usados,
embora apresentem especificidade de população e sejam mais difíceis de serem
aplicados em outras populações por serem bialélicos. Marcadores AFLP são
capazes de acessar vários pontos de polimorfismo, com 10 a 20 bandas
polimórficas em um único gel (ROOSE, 2003). Os TRAPs - “target region
amplification polymorphism” (HU & VICK, 2003) são outra classe de marcadores
que utilizam “primers” mais longos que RAPD, melhorando significativamente a
reprodutibilidade. Tais marcadores facilitam o desenvolvimento de mapas densos
que são efetivos para localização de características quantitativas
(QTL,“quantitative trait loci”). A estratégia de mapeamento prioriza o
desenvolvimento de um mapa detalhado usando marcadores dominantes de alta
resolução, mas suplementado com marcadores co-dominantes que podem ser
mapeados em muitas populações. Marcadores co-dominantes como SSR - “simple

3
sequence repeats” (LITT & LUTTY, 1989), são polimórficos e transferíveis entre
espécies/variedades e, portanto, mais apropriados para o uso como âncoras para
interligar mapas desenvolvidos em diferentes populações.
Neste contexto, marcadores moleculares, especialmente marcadores
baseados em PCR, como TRAP (HU & VICK, 2003), AFLP (VOS et al., 1995) e
SSR (LITT & LUTTY, 1989), abrem a possibilidade de construção de mapas
genéticos de modo mais rápido. O desenvolvimento de mapas de ligação de alta
resolução é um pré-requisito para se isolar genes usando estratégias de clonagem
baseada em mapas (SCHWARZ, et al., 2000). O uso de marcadores ancorados em
seqüências repetidas, os denominados microssatélites (SSR), permite a integração e
seleção assistida por marcadores em um amplo espectro de populações. Um mapa
de referência com marcadores multialélicos co-dominantes fornece a possibilidade
de ligar os mapas dos dois genitores envolvidos e permite mapeamento
comparativo (BARKLEY, et al., 2006; ROOSE, 2003; CRISTOFANI, et al., 2000).
Nos últimos 12 anos cerca de 20 mapas genéticos foram desenvolvidos para
citros. Como exemplos; C. grandis (LURO et al., 1996), C. aurantium, C. latipies
(SIMONE et al., 1998), C. volkameriana, C. sunki e Poncirus trifoliata
(CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2004b).
Todavia, apesar de diferentes grupos de pesquisa no mundo estarem engajados
neste processo, tem sido bastante difícil correlacionar e integrar os grupos de
ligação identificados nesses mapas devido ao pequeno número de marcadores em
comum (RUIZ & ASÍNS, 2003). Em outros casos, um mapa consenso foi obtido
para os dois genitores sem levar em consideração a possível reorganização
cromossômica que deve ter acontecido durante a evolução da família
Aurantioideae.
Esses mapas possibilitaram o mapeamento do gene de resistência à tristeza
e características como nanismo, acidez do fruto, resistência a Tylenchulus
semipenetrans Cobb, número de sementes, apomixia, resistência a salinidade,
macho esterilidade e resistência à gomose causada por Phytophythora (CAI et al.,
1994; CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997;
MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999;
GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al.,
2000; SIVIERO et al., 2001; SIVIERO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005).
Características estas que serão úteis em estratégias de seleção assistida por

4
marcadores na condução de estudos avanços em melhoramento de citros; ainda em
fase de implementação. A maior parte dos mapas reportados relaciona-se com
estudos de herança da resistência a doenças, muitas delas com herança simples
(genes de resistência ou R), outras poligênicas (“quantitative resistance locus” ou
QRL). A estratégia de BSA (“Bulked Segregant Analysis”) descrita por
MICHELMORE et al. (1991) foi utilizada em alguns desses mapas.
Recentemente, com o aparecimento da morte súbita dos citros (MSC)
(GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MÜLLER et a1., 2001),
detectou-se a necessidade de obtenção de novas combinações de porta-enxerto que
pudessem ser utilizados como uma alternativa ao limão ‘Cravo’ e que
possibilitassem estudos sobre a herança a essa anomalia. Considerando que a morte
súbita dos citros é uma doença de combinação entre copa e porta-enxerto (limão
‘Cravo’ e limão ‘Volkameriano’), ela é altamente preocupante uma vez que o limão
‘Cravo’ responde por mais 85% dos porta-enxertos no Estado de São Paulo.
Portanto, existe grande interesse no desenvolvimento de novos porta-enxertos.
Nesse sentido, é importante o desenvolvimento de novos híbridos com
características favoráveis presentes em genitores contrastantes. Seguindo este
raciocínio, seria de grande interesse um porta-enxerto híbrido, com grande número
de sementes poliembriônicas por fruto, rústico, de indução de produção precoce,
com boa tolerância ao estresse hídrico, que confira boa qualidade aos frutos e
produção à copa. Todas essas características estão presentes no limão ‘Cravo’ e,
algumas delas, no citrumelo ‘Swingle’ (MULLER et al., 2001). Com o surgimento
e expansão da MSC, um dos principais objetivos da pesquisa com porta-enxertos
passou a ser o desenvolvimento de porta-enxertos que possam substituir o limão
‘Cravo’, porém sem perder significativas qualidades dessa espécie, principalmente
a tolerância à seca.
A hipótese principal desse trabalho é que existe suficiente variabilidade
genética dentro dos genótipos dos genitores que permita mapeamento e produção
de novos híbridos com tolerância à morte súbita. Uma vez que a avaliação de morte
súbita exige experimentação de campo acima de cinco anos, foi feita a avaliação
preliminar da tolerância ao vírus da tristeza, com um dos candidatos associados ao
desenvolvimento da doença. Como o patógeno da MSC possui etiologia incerta,
trabalha-se com a possibilidade de uma associação do patógeno da MSC com o de
CTV. Além do fato de ambas as doenças serem de combinação copa e porta-

5
enxerto. Esse projeto faz parte do Programa de Melhoramento de Porta-Enxertos
do Centro APTA Citros Sylvio Moreira do IAC.
Portanto, o objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de
mapas genéticos de ligação de limão ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’, com vistas ao
estudo da herança da resistência ao vírus da tristeza dos citros e de características
contrastantes como padrão foliar e capacidade de enraizamento de estacas. Para
tanto, foi utilizada uma população de mapeamento de híbridos, utilizando-se a
estratégia de “pseudo-testcross” com locos marcadores RAPD, SSR e TRAP.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Citricultura no Brasil

A citricultura brasileira apresenta números expressivos que traduzem a
grande importância econômica e social que a atividade gera para a economia do
país. Segundo AZEVEDO (2003), a área plantada é próxima a 600 mil hectares,
enquanto que no ano de 2006, somente o Estado de São Paulo produziu cerca de
352 milhões de caixas de 40,8 kg, superando 14 milhões de toneladas anuais (IEA,
2007).
O parque citrícola no Brasil se iniciou no século XX, com citricultores
iniciando o plantio de citros em larga escala, quando estimulados pela crise do café
no final da década de 1920. Desde o início da sua fase comercial, a citricultura
concentrada, até então, em São Paulo e Rio de Janeiro, já era planejada para
atender ao mercado externo. Estatisticamente, em 1920, o Brasil já era considerado
o quinto maior produtor mundial de citros (BOTEON & NEVES, 2005).
Mas, somente a partir dos anos 30 do século passado, segundo AZEVEDO
(2003), a citricultura começou a ser implantada comercialmente nos Estados de São
Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Entre 1940 e 1960, após uma sucessão de fatos,
como a decadência do café nos anos 20, a Segunda Guerra Mundial em 1939,
disseminação de doenças, como a tristeza na década de 40, cancro cítrico em
meados dos anos cinqüenta, e conseqüente baixo incentivo aos produtores, houve
um declínio da citricultura no país, como apontam BOTEON & NEVES (2005).
Em meados da década de 1960, o parque citrícola retoma o crescimento. Os
primeiros investimentos visando à industrialização da laranja no Brasil foram

6
incentivados pela queda da produção norte-americana, devido à geada que, em
dezembro de 1962, destruiu cerca de 16 milhões de laranjeiras na Flórida
(AMARO et al., 2005). Impulsionado por uma série de outros fatos como
incentivos fiscais, condições naturais do Brasil, o parque citrícola mudou seu foco
comercial de fruta fresca para indústria processadora. Em desenvolvimento, a partir
da década de 1980, o Brasil se consolida como o maior produtor mundial de suco
de laranja. Desde o processo de industrialização até o momento, o foco principal da
citricultura paulista tem sido a produção de suco destinado ao mercado externo
(ABECITRUS, 2001; BOTEON & NEVES, 2005).
Atualmente, um custo de produção competitivo aliado a um parque
industrial atuante em escala global são pontos fortes da citricultura brasileira. Por
outro lado, o ponto fraco encontra-se no aparecimento de severas doenças nos
pomares, tanto para variedades copa como porta-enxerto. Nas últimas décadas, o
aparecimento de doenças como a tristeza dos citros (CTV) na década de 40
(MOREIRA & MOREIRA, 1991) e a clorose variegada dos citros (CVC) na
década de 90 (ROSSETI et al., 1990), comprometeu o custo e a oferta futura.
Entretanto, o aparecimento das novas doenças neste início de milênio, como morte
súbita dos citros (MSC), (GIMENES & BASSANEZI, 2001; MULLER et al.,
2001) e huanglongbing (ex-greening) (COLETTA-Filho et al., 2004), é um risco
econômico muito presente no setor e pode comprometer a produtividade brasileira
no futuro.
Enquanto isso, segundo AMARO et al. (2005) e BOTEON & NEVES
(2005), o aumento do consumo, a redução das barreiras tarifárias e fitossanitárias,
investimentos em qualidade da fruta fresca, modernização da sua estrutura de
beneficiamento e comercialização, produção a custos competitivos, investimentos
em diversidades de sucos de laranja e sólida retaguarda de pesquisa, são estratégias
a se considerar mantenedoras da estrutura citrícola nacional rentável.
No ano de 2004, o seqüenciamento genético, funcional e comparativo dos
citros foi concluído e assim foi possível saber quais são e onde estão localizados os
genes responsáveis pela resistência às principais doenças da laranja, assim como
quais são os genes existentes nos vírus, viróides, bactérias e fungos que provocam
as doenças (CARLOS et al., 2007). Com isso se torna possível disponibilizar no
mercado variedades de laranjas resistentes a um ou dois patógenos, gerando
economia à cadeia citrícola, principalmente levando-se em conta que as doenças é

7
o principal fator limitante da citricultura brasileira, representando mais de 60% do
custo de produção, segundo MACHADO et al. (2005).
A citricultura brasileira detém o maior banco de informações sobre citros no
mundo, com cerca de 300 mil seqüências de genes como discorre AMARAL et al.
(2007). Colocando o Brasil também na liderança mundial nas pesquisas científicas
do setor, como exemplos o seqüenciamento e mapeamento genético já realizados
de Poncirus trifoliata e de pelo menos seis espécies do gênero Citrus (AMARAL et
al., 2007).
Avaliando o agronegócio citrícola brasileiro, por trás de todo o caminho que
percorre a produção da fruta até chegar às mãos dos consumidores, há uma cadeia
que gera empregos, pesquisa, movimenta economias locais e gera conhecimento
global (BOTEON & NEVES, 2005).

2.2 Genética e Melhoramento de Citros

Estima-se que Citrus e gêneros correlatos se originaram entre 20 a 30
milhões de anos atrás, nas regiões tropical e subtropical da Ásia e do arquipélago
Malaio, de onde se dispersaram para outras regiões do mundo. Em se tratando dos
sistemas de classificação existentes, o mais utilizado foi o proposto por SWINGLE
(1943), que reconheceu 16 espécies verdadeiras de citros e as classificou entre os
seis gêneros que compunham o grupo subtribal denominado "árvores de citros
verdadeiros" (“true citrus fruit trees”), subtribo Citrinae, tribo Citreae, subfamília
Aurantioideae da família Rutaceae (SWINGLE & REECE, 1967).
O número de cromossomos dos representantes desse gênero foi
corretamente estabelecido pela primeira vez por FROST (1925) como n = 9.
Assim, segundo GUERRA et al. (2000), a subfamília Aurantioideae pode ser
caracterizada pela dominância de diplóides, sendo que de suas 60 espécies
estudadas até então, a grande maioria é 2n = 2x = 18 e, ocasionalmente, ocorrem
autopoliplóides intra-específicos (3x e 4x). Poliplóides comprovadamente
estabilizados são raramente encontrados. A estabilidade do cariótipo em
Aurantioidea está aparentemente ligada à alta capacidade de hibridação inter-
específica (GUERRA et al., 1997, 2000).
Em relação ao sistema de classificação sistemática, esse grupo de plantas
apresenta grande complexidade. A taxonomia da subfamília Aurantioideae foi
marcada pela proposição de novos gêneros, segregados de Citrus, como Poncirus,

8
Fortunella e Microcitrus. No entanto, não há fortes evidências morfológicas para a
manutenção desses gêneros, uma vez que caracteres diagnósticos de um deles
podem ser encontrados em outros representantes do referido grupo. Seus
representantes apresentam grande compatibilidade sexual, o que possibilitou a
origem natural de híbridos intergenéricos e interespecíficos ao longo do processo
de evolução do grupo (ARAÚJO & ROQUE, 2005).
As espécies do gênero Citrus reproduzem-se sexuadamente por
autopolinização e polinização cruzada, assexuadamente por apomixia nucelar
adventícia e agronomicamente por propagação vegetativa. Suas sementes possuem
tanto embriões zigóticos, como apomíticos, apresentando, em geral, apomixia
facultativa, com número variável de embriões entre um a doze. Algumas espécies
são monoembriônicas e não aproveitadas como porta-enxertos em função da alta
variabilidade na progênie, conduzindo o plantio com baixa uniformidade. Os
métodos de seleção de embriões zigóticos e nucelares podem se basear em
características morfológicas (TEICH & SPIEGEL-ROY, 1972), químicas e
bioquímicas (FURR & REECE, 1946; PIERINGER & EDWARDS, 1967;
TATUM et al., 1974; TORRES et al., 1978; ANDERSON et al., 1991) ou
moleculares (BASTIANEL et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2002, 2003).
Espécies do gênero Citrus e outras de gêneros correlacionados como
Poncirus e Fortunella apresentam compatibilidade genética, produzindo híbridos
férteis de interesse para o melhoramento. Exemplos típicos dessa compatibilidade
sexual são os híbridos do gênero Citrus com P. trifoliata. Após as devastadoras
geadas ocorridas na Flórida em 1894-1895, pesquisadores do Departamento de
Agricultura dos Estados Unidos iniciaram, em 1897, um programa de produção de
cultivares copas resistentes ao frio mediante a hibridação de trifoliata com
cultivares de citros. Desse trabalho, surgiram dezenas de híbridos – citranges,
citrumelos, citrandarinas, citradias, citremons e citrumquats – alguns dos quais
vieram a se tornar porta-enxertos comerciais em diversos países, inclusive no
Brasil (BOTEON et al., 2005).
Após hibridação com Poncirus, os descendentes denominados citranges,
citrandarins, citrumelos, entre outros, apresentam folhas trifoliadas, que é uma
característica morfológica governada por um gene dominante, que determina essa
característica quando em homozigose e heterozigose. Contudo, vale ressaltar, que o
uso de Poncirus como um dos genitores em programas vai muito além de sua

9
marcante morfologia de folha trilobada, haja visto que esse gênero apresenta
inúmeras características agronômicas importantes, como resistência a doenças e
melhor qualidade de fruta na variedade copa enxertada sobre ele.
O citrumelo ‘Swingle’ é originado do cruzamento entre o pomelo (C.
paradisi Macf.) ‘Duncan’ e P.trifoliata, sendo utilizado como porta-enxerto devido
a muitas características como tolerância à tristeza, exocorte, xiloporose (GRANT et
al., 1961; HUTCHISON, 1974) e ao declínio (BERETTA et al., 1994). Também é
resistente à gomose de Phytophthora, ao nematóide dos citros (O'BANNON &
FORD, 1978) e à morte súbita dos citros (GIMENES & BASSANEZI, 2001).
Plantas enxertadas em citrumelo ‘Swingle’ produzem bem em solos arenosos ou
argilosos, porém não têm bom comportamento em solos com pH elevado e nos
solos mal drenados (WUTSCHER, 1979). É moderadamente resistente à seca e a
geadas. Entretanto, suas plântulas são suscetíveis à mancha bacteriana dos citros,
causada por Xanthomonas axonopodis pv. citri, que causou a queima de milhões de
mudas na Flórida nos anos oitenta.
As laranjeiras e outras espécies enxertadas no trifoliata (P.trifoliata) ou em
seus híbridos apresentam maior diâmetro do tronco do porta-enxerto que o da copa,
o que não impede que as plantas sejam produtivas e longevas. Poucas cultivares
apresentam combinações denominadas de incompatíveis. Como exemplo, a laranja
‘Pêra’ e o tangor ‘Murcott’ são incompatíveis com os trifoliatas e diversos de seus
híbridos, entre eles os citranges e os citrumelos (POMPEU, 2005).
Em São Paulo, laranjeiras ‘Valência’ enxertadas em citrumelo ‘Swingle’
produziram menos que as enxertadas em limão ‘Cravo’ (POMPEU Jr. &
BLUMER, 2002), porém com frutos de qualidade superior àqueles obtidos sobre os
limões ‘Cravo’ e ‘Volkameriano’. Ele esteve entre os porta-enxertos que induziram
maior produção à lima ácida ‘Tahiti’ em Bebedouro e Aguaí (FIGUEIREDO et al.,
2001). No Rio de Janeiro, laranjeiras ‘Natal’ em citrumelo ‘Swingle’ foram mais
produtivas que as enxertadas em limão ‘Cravo’, limão ‘Volkameriano’, tangerina
‘Cleópatra’ e outros porta-enxertos (GRAÇA et al., 2001).
De acordo com SWINGLE (1967), o limão ‘Cravo’ é um lemandarin, isto é,
um híbrido natural de limão (C. limon L.) e uma tangerina (C. reticulata Blanco),
originado na região de Canton, no Sul da China, onde é conhecido como limão
Canton. Na classificação de TANAKA (1954), o limão ‘Cravo’ é considerado uma
espécie (C. limonia) nativa da Índia, onde é conhecido pelo nome de Jamir. Supõe-

10
se que ele tenha sido levado do sudeste da Ásia para a Europa e daí para as
Américas, tendo sido introduzido no Brasil pelos colonizadores (POMPEU, 2005).
A primeira referência ao seu uso como porta-enxerto no Brasil foi feita por
ROLFS & ROLFS (1931), que encontraram em Minas Gerais laranjeiras
enxertadas nesse porta-enxerto, plantadas na década de 1900. Esses autores ficaram
entusiastas com o uso do limão ‘Cravo’, considerando-o excelente porta-enxerto.
Em São Paulo, vem sendo comercialmente empregado desde a década de 1920,
porém seu uso foi ampliado a partir dos anos cinqüenta, quando veio a substituir a
laranja Azeda pela suscetibilidade desta ao vírus da tristeza dos citros. Há muitas
razões para seu uso por viveiristas e citricultores: tolerância à tristeza, resistência à
seca, facilidade na obtenção das sementes, grande vigor no viveiro antes e depois
da enxertia, bom pegamento das mudas por ocasião do plantio no pomar, rápido
crescimento das plantas, produção precoce, altas produções de frutos de regular
qualidade, compatibilidade com todas as cultivares copa, média resistência ao frio e
bom comportamento nos solos arenosos (POMPEU, 2005).
De modo geral, o limão ‘Cravo’ apresenta média resistência à gomose de P.
parasítica e P. citrophthora, embora existam variações entre as seleções. Segundo
MUNTANER et al. (1976), as seleções ‘Santa Bárbara’ e ‘EEL’ são as mais
resistentes, e o limão ‘Cravo’ Periforme e lima ‘Borneo red’, as mais suscetíveis.
Sendo considerado suscetível aos nematóides Tylenchulus semipenetrans e
Pratylenchus jaehni (CAMPOS, 2002), não tendo sido encontradas referências
sobre o comportamento das suas diversas seleções a esses nematóides. É tolerante
ao vírus da tristeza dos citros (COSTA et al., 1954; GRANT et al., 1961), mas
mostra caneluras quando infectado por raças severas do vírus, como a variante
Capão Bonito (MÜLLER et al., 1968).
Recentemente, com o aparecimento da morte súbita dos citros (MSC)
(GIMENES & BASSANEZI, 2001; MÜLLER et al. 2001), detectou-se a
necessidade de obtenção de novas combinações de porta-enxerto que pudessem ser
utilizados como uma alternativa ao limão ‘Cravo’ e que possibilitassem estudos
sobre a herança da resistência a MSC. O interesse no desenvolvimento desses
híbridos é evidente, uma vez que se pretende associar as características favoráveis
que estão presentes nos dois genitores.
Segundo CRISTOFANI et al. (2000) e NOVELLI et al. (2005), os citros
possuem muitas características agronômicas que são difíceis de selecionar por

11
técnicas convencionais de melhoramento, devido à maioria delas possuírem
herança aparentemente quantitativa, com exceção de algumas, como resistência à
CTV, leprose e morfologia foliar, que são aparentemente governadas por um ou
dois genes. No melhoramento genético de citros, o estudo do modo de herança de
resistência a doenças e de outras características importantes, apresenta um
determinado grau de complexidade especialmente devido a fatores de ordem
genética, botânica e agronômica. Tais como a heterogeneidade genética do gênero,
poliembrionia natural, recombinação, longo período pré-reprodutivo,
incompatibilidade, alta heterozigosidade, complexidade dos mecanismos genéticos,
depressão por autogamia e as longas gerações necessárias para se realizar seleções
(CRISTOFANI, 1999). O uso de um número reduzido de variedades com base
genética estreita e o sistema de produção de citros como monocultura fez com que
a indústria citrícola se tornasse vulnerável a pestes e doenças. Como aconteceu com
o vírus da tristeza dos citros (CTV) na década de 1940, cancro cítrico na década de
50, clorose variegada de citros nos anos 90 e mais recentemente morte súbita de
citros (MSC) e huanglongbing (greening).
Os programas de melhoramento genético de Citrus focam, principalmente, a
obtenção de novos porta-enxertos e variedades copa resistentes às doenças, pragas
e mais adaptados a condições abióticas adversas. Vale destacar que como os
programas de melhoramento de espécies anuais, o melhoramento de plantas
perenes lenhosas também deve basear-se no conhecimento do controle genético da
herança de características importantes e no uso e manutenção dos recursos
genéticos disponíveis (POMPEU, 2005). Neste contexto, uma das formas mais
eficientes de associar as características fenotípicas da cultura com as características
genéticas é por meio de mapas de ligação, no qual essas características são
ordenadas seqüencialmente, correspondendo de modo aproximado à posição dos
genes nos cromossomos (MACHADO et al., 2005).
Em se tratando do método mais eficiente de se obter híbridos é, sem dúvida,
mediante hibridação artificial com polinização controlada. Além de permitir o
controle da identidade de ambos os genitores, reduz significativamente os riscos de
cruzamentos indesejáveis e de auto-fecundação, o que ocasiona a perda de
identidade do genitor masculino (MACHADO et al., 2005). Entretanto, a maioria
das pesquisas de melhoramento de Citrus tem pretendido selecionar variedades que
são resistentes a doenças. Sendo que poucos estudos genéticos, de fato, usando uma

12
progênie controlada, têm sido realizados para entender a herança com relação à
resistência a importantes doenças.
Embora os desafios na obtenção de progênies F1 no cruzamento dentro do
gênero Citrus e entre gêneros próximos sejam consideráveis (NOVELLI, et al.,
2006) a introgressão de genes em Citrus por hibridação sexual é freqüentemente
dificultada pela poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade. Essa
abordagem é particularmente importante quando a ela se agregam ferramentas da
biotecnologia, auxiliando na seleção de indivíduos zigóticos, na obtenção de
marcadores, no mapeamento genético, culminando com a seleção assistida por
marcadores.
No tocante às diferentes estratégias de melhoramento de citros, atualmente,
a grande referência na literatura são as pesquisas envolvendo genética-genômica.
De maneira, que pode-se dizer que estudos de mapeamento genéticos completam a
genômica funcional que por sua vez completam os de mapeamento. Assim sendo, a
genética-genômica vem surgindo como a nova opção para se observar os
fenômenos da herança, determinando o genótipo por análise direta das seqüências
de DNA.
Segundo KONING et al. (2005), a genômica funcional tem sido aplicada na
dissecação genética de Citrus em diferentes caminhos; para detectar locos de
características quantitativas (QTLs), no cruzamento experimental entre linhagens
que diferem nas características contrastantes, delineando estas diferenças;
mapeamento genético e físico; estudos de expressão gênica, na medição dos níveis
de expressão ou inferências de expressão diferencial para milhares de genes usando
microarranjos, entre outras inúmeras aplicações.
Uma estrutura de mapeamento, chamada mapeamento funcional, tem sido
proposta para caracterizar, em um único passo, os locos de características
quantitativas – “quantitative trait loci” (QTLs) ou mesmo os nucleotídeos de
características quantitativas – “quantitative trait nucleotide” (QTN), segundo WU
& LIN (2006). Os QTNs são bastante úteis integrando finas estratégias de
mapeamento e clonagem posicional de genes localizados. A abordagem fornece
uma proveitosa estrutura quantitativa e analisável para estimar a interação entre
ações gênicas e mudanças desenvolvimentais.
Outra poderosa abordagem genética-genômica é uma combinação dos
métodos de mapeamento tradicional “quantitative trait loci” (QTL) com dados de

13
“microarray”, resultando em uma notável utilidade em um grande número de
investigações recentes biológicas. Estes estudos de locos associados com variação
herdável na expressão de outros genes no genoma (eQTL) são similares aos
estudos tradicionais de QTLs, com um objetivo principal em identificar os locais
genômicos aos quais as características expressas são ligadas (KENDZIORSKI et
al., 2006).
Neste contexto, a seleção assistida por marcadores, uma etapa ainda em
processo de incorporação aos programas de melhoramento de citros (MACHADO
et al., 2005), pode combinar todas estas diferentes estratégias. Estas vão desde
análises QTL de fenótipos associadas com análises QTL de níveis de expressão de
genes até à transformação genética. KIRST et al. (2004), conduziram um
retrocruzamento interespecífico de uma população de Eucalyptus e observaram que
QTLs para crescimento do diâmetro estavam co-localizados com eQTLs para genes
relacionados com lignina, sugerindo que características de crescimento e lignina
são controladas pelos mesmos locos.
Neste sentido, “microarrays” têm sido usados para determinar níveis de
expressão de genes em populações segregantes e identificar regiões genômicas
(QTLs de expressão de genes ou eQTLs), explicando variações do transcrito em
genes co-regulados. Portanto, quando os “microarrays” são correlacionados com
dados fenotípicos de uma característica quantitativa, é possível identificar com
sucesso genes candidatos posicionais. Desta forma, dados do transcrito, dados
fenotípicos e genotípicos podem ser integrados para identificar genes controlando
variação no crescimento em diversas espécies. Nos trabalhos de KIRST et al.
(2004), as análises em populações de Eucalyptus spp revelaram uma redução
coordenada de níveis de transcrito para enzimas codificando genes envolvidos na
biossíntese de lignina na progênie que mostra um crescimento superior.

2.3 Mapas Genéticos

Em função do ciclo de reprodução e da perenidade de muitas espécies
lenhosas de polinização aberta e altamente heterozigóticas, o mapeamento
genético, mesmo com marcadores moleculares, ainda não está tão avançado quanto
o de espécies anuais. A disponibilidade de progênies de cruzamentos entre
diferentes espécies e variedades de Citrus, por exemplo, ainda é muito rara. Na
maioria das vezes, somente progênies do cruzamento entre dois genitores, com

14
certa heterozigosidade, encontram-se disponíveis para estruturação de mapas de
ligação. Para superar problemas dessa natureza, GRATTAPAGLIA & SEDEROFF
(1994) propuseram a utilização de uma estratégia, por eles denominada de
“pseudo-testcross", que permite a construção de mapas de ligação com base em
progênie F1 de genitores altamente heterozigotos. Nessa abordagem, a configuração
do cruzamento não precisa ser planejada a priori, como em um cruzamento teste
clássico, mas pode ser inferida a posteriori, após a análise de segregação dos
marcadores na progênie.
O método mais importante e comum de mapeamento utiliza a freqüência de
recombinação para determinar a distância relativa entre duas características ligadas.
STURTEVANT (1913) estabeleceu que a freqüência de quiasmas entre dois genes
ligados é de certa forma proporcional à distância física entre ambos. Esse princípio
é a base para o mapeamento genético. Uma unidade de centiMorgan equivale a
aproximadamente 1% de recombinação quando os marcadores estão bastante
próximos, ou podem diferir da porcentagem de recombinação quando estão mais
distantes em vista da ocorrência de “crossing-over” duplo, triplo, etc. Diversas
funções de mapeamento têm sido utilizadas na correção das distâncias calculadas
em porcentagem de recombinação para a distância em centiMorgan (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1996).
Com base na freqüência de recombinação é realizada uma análise para
distribuição independente entre os locos segregantes para identificar pares de
características ligadas. Após essa etapa, os marcadores ligados são combinados em
grupos de ligação. A ordem linear dos marcadores dentro de cada grupo é deduzida
da distância genética relativa a cada um em estimativas dois a dois (RITTER et al.,
1990). Outros métodos utilizando estimativas de máxima verossimilhança da
freqüência de recombinação entre os marcadores e algoritmos de ordenação rápida
de um grande número de marcadores têm sido empregados para a construção de
mapas com maior precisão. Existem disponíveis diversos programas
computacionais com base no método da máxima verossimilhança, tais com
Linkage 1 (SUITER et al., 1983), Mapmaker (LANDER et al., 1987), GMendel
(LIU & KNAPP, 1992), Joinmap (STAM, 1993), entre outros. O JoinMap é
baseado em um LOD modificado em função de um teste de Qui-quadrado
independente, permitindo, assim, a integração de marcadores de diferentes tipos de
segregação em mapas genitores e a construção de mapas consensos.

15
 Assim como para outras espécies, o mapeamento genético de plantas
perenes requer alguns requisitos, como: i) escolha dos genitores com fenótipo
contrastante em relação à característica de interesse, por exemplo, resposta
diferenciada em relação à resistência a alguma doença; ii) polinização controlada
entre os genitores com produção de uma progênie com tamanho mínimo e
representativo de eventos meióticos, e iii) obtenção de centenas de marcadores com
segregação mendeliana clássica. Ao se caracterizar um loco marcador é desejável
que os marcadores moleculares sejam polimórficos, que não sofram seleção, sejam
co-dominantes para que todos os possíveis alelos dos locos marcadores possam ser
identificados e contenham maior informatividade que os dominantes. Cada vez
mais, mapas genéticos de ligação vêm sendo utilizados em várias espécies,
principalmente após o desenvolvimento de diferentes classes de marcadores
moleculares, segundo CARNEIRO & VIEIRA (2002). No entanto, os primeiros
mapas genéticos baseavam-se em marcadores morfológicos e citológicos. Estes
últimos eram obtidos a partir de alterações cromossômicas (aneuploidias,
translocações, deleções e inversões), principalmente em culturas de mais fácil
observação das alterações fenotípicas causadas por essas modificações, como
milho, tomate e ervilha. No entanto, esses marcadores são restritos às espécies de
amplo conhecimento citológico. A partir do desenvolvimento de marcadores
bioquímicos (isoenzimas) e moleculares (DNA), o mapeamento genético passou a
ser utilizado em várias espécies, até mesmo naquelas para as quais nem sequer
havia ainda estudos de ligação a algum marcador.
Portanto, os mapas genéticos têm importante papel em muitas áreas da
genética: análise de QTLs, clonagem baseada em posição no mapa, melhoramento
por meio da seleção assistida por marcadores (SAM) e, mais recentemente, na
genômica comparativa. A seleção indireta, por meio de marcadores genéticos, tem
sido sugerida para características de baixa herdabilidade, que requerem grandes
populações para sua mensuração (FERREIRA, 1995).
O mapeamento comparativo (“comparative mapping” ou “synteny
mapping”) constitui outra importante aplicação dos mapas genéticos (FEUILLET
& KELLER, 2002). A comparação das estruturas genômicas de diferentes espécies,
do ponto de vista de homologia de genes e conservação de distâncias e da ordem de
ligação nos cromossomos, permite melhor compreensão da evolução dos genomas
(CARNEIRO & VIEIRA, 2002). Outra utilização do mapeamento comparativo é

16
como estratégia de obtenção de um mapa único de referência para a maioria das
espécies vegetais cultivadas, pelo menos ao nível de famílias taxonômicas
(CARNEIRO & VIEIRA, 2002).
Desse modo, um mapa genético saturado do genoma passou a ser a base
para estudos avançados de genética, incluindo a identificação e isolamento de
genes e estudos da estrutura, expressão e função desses genes, como enfatizam
OLIVEIRA et al. (2005) em seus trabalhos. Altas resoluções em regiões específicas
(isto é, próximas a genes de interesse) são fundamentais para a identificação,
isolamento e clonagem de genes, que vem se tornando uma realidade em espécies
com mapas genéticos bem definidos (ROOSE et al., 2000).
Nos últimos poucos anos, mapas integrados de muitas espécies têm sido
publicados. Devido ao aumento na densidade dos locos e decréscimo no número de
“gaps”, estes mapas consensos têm fornecido uma identificação mais precisa de
genes principais e/ou QTLs de importância agronômica. Adicionalmente eles têm
auxiliado a conduzir a seleção assistida por marcadores e estudar a estrutura e
organização do genoma, estudos de evolução e introgressão de genes.
O mapeamento genético se tornou mais freqüente, principalmente após o
advento da tecnologia de seqüenciamento de alta produção, que tem gerado
informações abundantes sobre seqüências de DNA para os genomas de muitas
espécies de plantas. Isto inclui o seqüenciamento de seqüências genômicas
completas para o modelo de planta Arabidopsis thaliana em 2000 e para o arroz
(Oryza spp.) em 2002. Adicionalmente, as “Expressed Sequence Tags” (ESTs) de
outras importantes espécies cultivadas têm sido geradas, e ferramentas poderosas
de bioinformática têm anotado milhares de seqüências como genes funcionais
putativos. Neste contexto, marcadores moleculares representam a tarefa de
relacionar estas informações geradas de seqüências de DNA com fenótipos
particulares. Conseqüentemente, há uma forte demanda em melhorar técnicas de
marcadores para se melhor utilizar a informação de seqüências disponíveis.
Um mapa saturado é a base para estudos avançados de genética, incluindo a
identificação, isolamento e estudos da estrutura, expressão e função dos genes. A
clonagem de genes se tornou uma realidade em espécies com mapas genéticos bem
definidos. Entretanto, a construção de mapas de alta resolução, vale ressaltar, isto é,
que permitam encontrar marcadores bastante próximos ou até mesmo
completamente ligados ao gene é um pré-requisito para a clonagem de genes

17
baseada em mapeamento.
Marcadores moleculares, segundo CHEN et al. (2006a) e HU & VICK
(2003), realizam um importante papel na genômica estrutural e funcional de
animais, plantas e espécies microbianas. A detecção de “Quantitative Loci Traits”
(QTLs) principais em mapas de ligação genéticos baseada em marcadores
moleculares oferece uma refinada visão da arquitetura genética de caracteres
quantitativos e uma ferramenta potencial para melhoramento efetivo por meio de
seleção assistida por marcadores (YOSHIMARU et al., 1998; LING et al., 2000).
Os estudos de WILLIAMS et al. (1990) demonstraram que “primers” curtos
com seqüências de nucleotídeos arbitrárias podem ser usados para reproduzir
segmentos amplificados de DNA genômico de uma extensa variedade de espécies.
Estes marcadores foram denominados de “random amplified polymorphic dna”
(RAPD).
Entre os métodos baseados em DNA, a análise com RAPD é uma das mais
utilizadas em programas de melhoramento (BASTIANEL et al., 1998). Estes
marcadores utilizam um conjunto de primers universais que podem ser usados para
análise genômica em uma ampla variedade de espécies e são dominantes, visto que
segmentos de DNA de mesmo tamanho são amplificados de um indivíduo, mas não
do outro. Desta forma, não é possível distinguir se um segmento de DNA é
amplificado de um loco que é heterozigoto (1 cópia) ou homozigoto (2 cópias).
Outra eficiente técnica com marcadores inclui os chamados AFLP
(“amplified fragment length polymorphism”), que geram locos dominantes. Eles
têm sido utilizados para determinar a localização cromossomal de fenótipos
mutantes, por meio de uma estratégia de mapeamento de todo o genoma (PETERS
et al., 2004). Recentemente, LI & QUIROS (2001) publicaram uma nova técnica de
marcador molecular denominada “sequence related amplification polymorphism”
(SRAP), em que pares de “primers” com núcleos ricos em AT ou GC são usados
para amplificar fragmentos intragênicos por detecção de polimorfismo. O aspecto
comum de SRAP, RAPD e AFLP é que fragmentos múltiplos podem ser gerados
em uma única reação de amplificação. Entretanto, estas técnicas não usam, a
priori, informação da seqüência, e os marcadores gerados são distribuídos
aleatoriamente no genoma.
HU & VICK (2003) desenvolveram uma técnica rápida e eficiente baseada
em PCR, que utiliza ferramentas de bioinformática e dados de EST para gerar

18
marcadores polimórficos ao redor de genes alvo candidatos. Este polimorfismo de
amplificação de regiões alvo (TRAP) utiliza dois “primers” de aproximadamente
18 nucleotídeos para gerar marcadores. Um dos “primers”, o fixo, é desenhado a
partir de uma seqüência alvo do banco de dados EST, amplificando seqüências
parciais do gene candidato. O segundo “primer”, o arbitrário, é uma seqüência
arbitrária, com 3 a 4 nucleotídeos rica em AT e/ou GC (embora deva existir de 40 a
60% de conteúdo rico em GC para manter a estabilidade adequada do “primer”),
em seu núcleo, para anelar com “introns” e “exons”., amplificando as demais
regiões prováveis do gene candidato. Além desta região, o “primer” arbitrário
possui 3 a 4 nucleotídeos seletivos em sua extremidade 3’ e seqüências de
preenchimento na extremidade 5´. Uma reação de amplificação é então realizada e
os fragmentos de 50-900 pb são separados em um gel de seqüenciamento ou de
poliacrilamida. A técnica tem sido utilizada tendo como alvo genes que governam
características agronômicas de interesse para o melhoramento.
Diferenças morfológicas entre 16 espécies de Helianthus spp obtidas pelo
sistema taxonômico de classificação para estas espécies foram confirmadas e bem
retratadas quando confrontadas com dados obtidos por marcadores TRAP, em
estudos feitos por Hu et al. (2003). Estes autores construíram uma árvore
filogenética com os dados de um sistema multiplex -, utilizando 6 “primers” (2
“primers” fixos, com alvo em seqüências gênicas de genes de resistência a doença
com regiões repetidas ricas em leucina ou sítios de ligação a nucleotídeos e 4
“primers” arbitrários), resultando em mais de 100 fragmentos polimórficos entre
estas espécies.
Outra classe de marcadores, os microssatélites ou “simple sequence
repeats” (SSR) são marcadores codominantes, multialélicos, altamente
informativos, e de ampla utilização na maior parte das culturas. A identificação e
desenvolvimento de marcadores microssatélites têm permitido aumentar
significativamente a densidade dos mapas de ligação obtidos com outros
marcadores. Em girassol, por exemplo, têm sido utilizados na integração de
diferentes mapas genéticos previamente obtidos com marcadores “restriction
fragment length polymorphism” (RFLP) (YU et al., 2003). A utilização de
microssatélites na construção e/ou integração de mapas genéticos em citros tem
sido limitada devido à falta de um número suficiente de marcadores polimórficos
disponíveis para esta finalidade. Embora tenham ajudado a aumentar a densidade

19
em alguns dos mapas genéticos já obtidos (JARREL et al., 1992; GARCIA et al.,
1999), eles ainda não têm permitido obter níveis de saturação apropriados (KIJAS
et al., 1997; ROOSE et al., 2000; RUIZ & ASÍNS, 2003, CRISTOFANI et al.,
2000).
Especialmente em se tratando de microssatélites, segundo LI et al. (2002),
estes estão distribuídos tanto em regiões codificantes como não-codificantes do
genoma; sua distribuição no genoma possui significância evolutiva e dinâmica;
possuindo funções e efeitos na expressão gênica e desordem genética, organização
da cromatina, ciclo celular, processos do metabolismo do DNA e contribuição
relativa de replicação e mecanismos de reparo associado ao DNA. A distribuição
genômica não-aleatória dos microssatélites (SSRs) nos organismos é enfatizada nos
trabalhos de LI et al. (2004), em que discorrem que numerosas linhas de evidência
tem demonstrado este fato, o que é bastante interessante em trabalhos de
mapeamento (FALCÃO et al., 2004). Estes autores enfatizam que a vantagem
adicional do desenvolvimento de microssatélites a partir de ESTs é o fato de que,
ao mapear estes microssatélites, automaticamente são mapeados genes no mapa
genético. Sendo que alguns destes genes mapeados podem constituir potenciais
candidatos para funções importantes devido à sua co-localização com QTLs para
características fenotípicas de importância econômica. Isto, presumivelmente devido
aos seus efeitos na organização da cromatina, regulação da atividade gênica,
recombinação, replicação do DNA, ciclo celular, metabolismo de plantas e na
evolução do gene. FALCÃO et al. (2004) mapearam 1000 microssatélites a partir
de ESTs de diferentes espécies e tecidos de Eucalyptus, esperando com isso a
cobertura de todo o genoma com uma densidade de marcadores suficiente pra
poder fazer mapeamento de QTLs com precisão, bem como a ancoragem com o
mapa físico.
Por outro lado, a utilização de marcadores co-dominantes na construção e
saturação de mapas de ligação é de fundamental importância, pois esses também
permitem resolver as ambigüidades existentes na correlação entre as evidências
citogenéticas e as características dos diferentes grupos de ligação (distribuição dos
marcadores dentro do grupo). Estes marcadores podem ser usados como âncoras
para combinar mapas de ligação obtidos em diferentes laboratórios ou com
diferentes populações, gerando assim um mapa genético que melhor represente a
estrutura e organização dos diferentes grupos de ligação (KIJAS et al., 1997;

20
SANKAR & MOORE, 2001).
ROSTOKS et al. (2003), baseando-se em análises de seqüências genômicas
e mapeamento genético, encontraram quatro diferentes genes de reação-induzida-
hipersensitivos (HIR), relacionados com a hipersensibilidade putativa em cevada,
uma das mais eficientes formas de defesa de plantas contra patógenos biotrópicos.
Neste trabalho de mapeamento, estes autores retratam uma importante contribuição
na caracterização de mecanismos moleculares de resposta hipersensitiva em
plantas. O primeiro mapa genético para seringueira (Hevea spp.) foi feito por
LESPINASSE et al. (1999) utilizando a estratégia “pseudo-testcross” para
saturação com marcadores RFLP, AFLP, SSR e isoenzimas.
Mapeamento molecular do gene da macho-esterilidade nuclear em girassol
(Helianthus annuus L.) usando marcadores TRAP e SSR foi realizado por CHEN
et al. (2006B). Sendo que os marcadores que foram ligados mais firmemente com o
gene ms9, que controla a macho-esterilidade, serão úteis na seleção assistida por
marcadores de plantas macho-estéreis entre populações segregantes, o que
facilitaria o isolamento deste gene pelo uso da abordagem de clonagem baseada em
mapa.

2.4 Mapeamento genético de Citros

Até o ano de 2003, 14 mapas genéticos de Citrus foram publicados (RUIZ
& ASINS, 2003). Neste mesmo ano, estes mesmos autores inovaram e publicaram
o primeiro mapa de ligação genético comparando grupos de ligação de espécies
intergenéricas de Poncirus e Citrus. Contudo, mapas genéticos em especial
dolimão ‘Cravo’, ainda não foram relatados na literatura.
Os primeiros mapas de ligação de citros foram desenvolvidos com locos
isoenzimáticos e RFLP utilizando famílias de retrocruzamento intergenérico de
Citrus e P. trifoliata, de tangerina com pomelo e uma família F2 intergenérica de
Citrus e Poncirus. Vários mapas de citros já foram publicados, embora nenhum
ainda seja consensual, isto é, represente efetivamente todo o gênero (LIOU, 1990;
DURHAM et al., 1992; JARREL et al., 1992; RUIZ & ASINS, 2003). A saturação
com mais marcadores em alguns desses mapas possibilitou o mapeamento do gene
de resistência à tristeza e características como nanismo, acidez do fruto, resistência
a T. semipenetrans Cobb, número de sementes, apomixia, resistência à salinidade,
macho-esterilidade e resistência à gomose de Phytophthora (CAI et al., 1994;

21
CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997;
MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999;
GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al.,
2000; SIVIERO et al., 2001, 2006). A maior parte dos mapas relaciona-se com
estudos de herança da resistência a patógenos, algumas delas monogênica, outras
poligênicas (“quantitative resistance loci” ou QRL).
GUERRA (1984) ressalta que o gênero Citrus e correlatos têm
características vantajosas que facilitam a construção de mapas genéticos, visto que
são diplóides (n = 9, 2n = 18), altamente heterozigóticos, permitindo, a produção de
híbridos inter-específicos e inter-genéricos. Muitos projetos de mapeamento
genético de muitas espécies de Citrus têm sido conduzidos com o propósito de
identificar genes e/ou locos de características quantitativas (QTL) para
resistência/tolerância para sal e frio (MOORE et al., 2000), vírus da tristeza dos
citros (CRISTOFANI et al., 1999), dormência, juvenilidade e vigor (ROOSE et al.,
1992), peso da planta e acidez do fruto (GMITTER et al., 1996). Em 2004, por
exemplo, OLIVEIRA et al. (2004a, b) elaboraram mapas de ligação de laranja
‘Pêra’ e tangerina ‘Cravo’ utilizando marcadores RAPD e a estratégia
“pseudo-testcross”, sendo, este trabalho, de importante relevância para estudos
posteriores da herança ao CVC, cancro cítrico e leprose.
Estudos de mapeamento genético de locos de resistência oligogênica
relacionados à resistência ao Citrus tristeza vírus (CTV) são predominantes
(GMITTER Junior et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c;
CRISTOFANI et al., 1999). Trabalhos de mapeamento para resistência à tristeza,
conduzidos no Centro APTA Citros Sylvio Moreira (CRISTOFANI et al., 1999),
determinaram o loco de resistência a esse vírus no grupo de ligação I do mapa de
P. trifoliata. Por sua vez, dois trabalhos de mapeamento de resistência quantitativa
de citros a patógenos foram reportados (LING et al. 2000; SIVIERO, 2001, 2006).
O primeiro deles determinou a localização de QRLs de citros para o T.
semipenetrans (LING et al., 2000), herdada do genitor P. trifoliata como único
loco gênico dominante, responsável por 53,6% da variação fenotípica do caráter.
CRISTOFANI et al. (1999) relatam o uso de RAPD e BSA
(MICHELMORE et al., 1991) para construir mapa de ligação genético e mapear a
resistência genética ao vírus da tristeza dos citros (CTV) presente em P. trifoliata
usando estratégia “pseudo-testcross”. Em seus trabalhos OLIVEIRA et al. (2005)

22
construíram um mapa genético integrado entre C. sinensis (L.) Osbeck cv. ‘Pêra’ e
C. reticulata Blanco cv. ‘Cravo’ usando dois tipos diferentes de segregação de
marcadores. A saturação dos mapas com a inclusão de novos marcadores aumenta
o número de grupos de ligação com marcadores de ambos os genitores, fazendo
com que o número destes grupos seja o mesmo do número haplóide cromossômico
da espécie. Ademais, vale mencionar que segundo OLIVEIRA et al. (2005) é
pequeno o conhecimento sobre a herança genética das principais características
agronômicas de Citrus.
A identificação de QRLs para Phytophthora parasitica Dastur, fungo
responsável pela gomose de citros (SIVIERO, 2001, 2006), também conduzido no
Centro APTA Citros Sylvio Moreira, constitui o primeiro trabalho de mapeamento
genético de citros de resistência a esse patógeno e no qual se identificou,
inequivocamente, herança quantitativa. SIVIERO et al. (2001, 2006) identificaram
QTLs associados à resistência à gomose de P. parasitica em citros a partir de um
cruzamento entre C .sunki e P. trifoliata. Foram detectados 3 QTLs ligados à
resistência à gomose em P.trifoliata cv. Rubidoux e 1 QTL em C. sunki. Os QTLs
detectados e denominados Ppr-Pt1, Ppr-Pt2 e Ppr-Pt3 (resistência a P.parasitica em
P.trifoliata) são responsáveis por 26, 27 e 38% da variação fenotípica para
resistência à gomose em P.trifoliata cv. ‘Rubidoux’ respectivamente. O QTL Ppr-
Cs (resistência a P. parasitica em C. sunki) é responsável por 14% da variação
fenotípica total para a resistência à gomose. A detecção de vários locos
controladores associados à resistência à gomose em P. trifoliata cv. ‘Rubidoux’ e a
reação dos indivíduos da progênie em relação à resistência a P. parasitica indicam
que esse caráter é de natureza quantitativa, concordando com as hipóteses
defendidas por FURR & CARPENTER (1961) e HUTCHISON (1985).
LING et al. (2000) verificaram que um marcador molecular ligado ao gene
de resistência ao CTV, descrito por DENG et al. (1997), encontra-se mapeado a
10,8 cM do gene de resistência ao T. semipenetrans, podendo tratar-se de uma
região com diferentes genes de resistência no genoma de P. trifoliata
(HAMMOND-KOSAK & JONES, 1997; LING et al., 2000). Evidências
experimentais suportam a hipótese de que o grupo de ligação I de P. trifoliata do
mapa descrito por CRISTOFANI et al. (1999) possa também apresentar uma região
rica de genes de resistência, em face da associação estatística de determinados
marcadores desse grupo ligados ao gene de resistência ao CTV a eventos de

23
resistência de citros à gomose (SIVIERO, 2001, 2006).
A estratégia de clonagem baseada em mapa já vem sendo utilizada para
genes de resistência de citros. O primeiro patossistema de citros a ser contemplado
com esse tipo de abordagem fina de mapeamento foi o gene Ctv (resistência à
tristeza) a partir de P. trifoliata, tendo sido construídos mapas de alta resolução
para o loco Ctv (DENG et al., 2001; YANG et al., 2003).
BASTIANEL et al. (2005), estudaram a herança de resistência do citros à
leprose e localização de QTLs no mapa de ligação usando marcadores AFLP e
RAPD desenvolvidos de 143 híbridos obtidos do cruzamento entre o genitor
resistente, tangor ‘Murcott’ com um genitor suscetível laranja doce ‘Pêra’, sendo
que estas plantas foram estabelecidas em campo, infectadas com o vírus e a
incidência e severidade da leprose avaliada por três anos consecutivos.
Segundo SIVIERO et al. (2006), mapas de ligação genético de P. trifoliata
cv. Rubidoux e C. sunki foram construídos previamente usando marcadores
moleculares RAPD (CRISTOFANI et al., 1999), explorando a estratégia de
mapeamento “pseudo-testcross”. Dois conjuntos de dados separados foram
gerados, uma para cada genitor. Uma análise de ligação preliminar foi realizada
com um modelo de retrocruzamento de fase desconhecida em LOD > 4.0 e máximo

θ = 0,30. Setenta e oito “primers” mostraram combinação “pseudo-testcross”, onde

o marcador estava presente em um dos genitores, ausente em outro e segregando na
progênie. Análises de ligação revelaram que 125 desses locos RAPD se ligaram em
18 grupos de ligação (10 grupos com 63 marcadores RAPD para P. trifoliata. O
comprimento total desses mapas foi 732,32 cM para C.sunki e 866.88 cM para P.
trifoliata, com a distância entre marcadores variando de 0 a 43,8 cM.

2.5 Mapeamento de QTLs

Pouco se sabe sobre a base genética envolvendo o controle de
características fenotípicas de citros, tais como, morfologia foliar e capacidade de
enraizamento de estacas, ou mesmo a tolerância a patógenos, como o vírus da
tristeza dos citros. Provavelmente isso deve ao fato dos estudos quase sempre se
direcionarem para o estudo da resistência de genótipos específicos.
A maior parte das características agronômicas de citros deve ser controlada
por locos quantitativos, com exceção de poucas como; CTV, leprose e,

24
aparentemente, morfologia foliar. O estudo desses locos deverá permitir a
identificação, mapeamento e quantificação de seus efeitos. Porém, a detecção
eficiente de QTLs depende do seu número, magnitude de seus efeitos,
características de herdabilidade, interações entre genes, freqüência de
recombinação entre os QTLs e os tipos de marcadores e grau de saturação do mapa
(TANKSLEY, 1993; YOUNG, 1996; LIU, 1998).
A maioria dos métodos comumente usados para se detectar a associação
entre marcadores QTL e traços fenotípicos, envolve análises de marcadores
individuais, utilizando-se teste t simples, regressão linear, análise da variância,
razão de verossimilhança e estimação da máxima verossimilhança; mapeamento
por intervalo usando novamente a abordagem de verossimilhança, regressão e uma
combinação das abordagens verossimilhança e regressão (LIU, 1998). Finalmente,
o mapeamento por intervalo-composto; uma combinação de mapeamento de
intervalo simples e regressão linear múltipla (ZENG, 1993, 1994). QTLs podem ser
detectados considerando-se ambientes separadamente ou em grupos, por meio de
uma análise integrada dos dados em diferentes ambientes.
SIVIERO et al. (2003) detectaram QTLs associados a marcadores
moleculares para a capacidade de enraizamento de estacas em progênies híbridas
do cruzamento entre C. sunki e P. trifoliata ‘Rubidoux’. Os autores relataram o
primeiro estudo de mapeamento de QTL para enraizamento em Citrus e gêneros
relacionados e concluíram que a presença de marcadores moleculares e QTLs
associados a enraizamento de estacas de citros distribuídas em grupos de ligação de
P. trifoliata ‘ Rubidoux ’ indicam que estas regiões são de interesse para seleção de
genótipos que enraízam facilmente. Deve ser destacado que a capacidade de
enraizamento é uma importante característica para a multiplicação clonal de
indivíduos que serão avaliados como porta-enxertos. De outra forma seria
necessário aguardar por vários anos para que esses indivíduos floresçam e
frutifiquem para então serem avaliados como porta-enxerto.
O baixo conhecimento de como marcadores são associados com QTLs
economicamente importantes, gera inúmeros fatores limitantes na pesquisa de
melhoramento genético, como QURESHI et al. (2004) exemplificaram no caso das
pesquisas com algodão (Gossypium spp). Segundo CRISTOFANI et al. (2000), um
mapa de referência com marcadores multi-alélicos co-dominantes identificam locos
e funciona como ponte entre os mapas dos genitores, fazendo com que um

25
determinado número de locos âncoras se tornem disponíveis para uma mapeamento
refinado de locos de características quantitativas (QTL), permitindo, o que se pode
denominar de mapeamento comparativo.

2.6 Padrão Foliar, Enraizamento e CTV

Em se tratando de híbridos de citros com P. trifoliata, embora exista alta
variação morfológica, são poucas as informações relativas ao estudo da herança
dessas características, como, por exemplo, morfologia foliar e enraizamento.
O caráter folha trilobada é conhecido como mostrando dominância em
cruzamentos sendo que alguns híbridos mostram uma mistura de folhas bifoliadas e
monofoliadas. Em um cruzamento entre C. sunki e Poncirus trifoliata, 100% dos
híbridos obtidos apresentavam folha trilobada indicando a dominância e provável
homozigose do gene ou genes que controlam o caráter em P. trifoliata
(CRISTOFANI, 1997).
Em plântulas de tangor ‘Temple’ e tangerina ‘Clementina’ polinizadas com
citrange ‘Troyer’, um retrocruzamento para folha tipo monofoliada, cerca de 20 a
30 % das plântulas eram monofoliadas (CAMERON E FROST, 1968). Segundo os
autores, estes dados indicam que o caráter folha trilobada é condicionado por dois
genes dominantes. TOXOPEUS (1962) relatou que entre 50 plântulas do
cruzamento entre C. grandis (L.) Osbeck x C. hystrix (ambos monofoliados) cerca
de 1/3 eram trifoliata. Ele sugeriu que dois genes complementares e dominantes
podem estar envolvidos, sendo cada espécie heterozigótica para um deles.
Segundo SIVIERO et al. (2003) a propagação de plantas por meio de
enxertia e enraizamento de estacas pode favorecer a redução de juvenilidade.
Embora sejam tradicionalmente propagadas por enxertia, a estaquia pode ser um
método alternativo e é eficiente na propagação de algumas espécies como lima
‘Tahiti’ (C. latifolia) (PRATI et al., 1999).
Os estudos de enraizamento de estacas de Citrus e gêneros correlatos
procedem geralmente a estudos do potencial genotípico, porcentagem de estacas
enraizadas e as diferenças de híbridos diferentes em enraizar, especialmente com a
indução por reguladores de crescimento. Contudo, pouco é conhecido sobre a base
genética envolvendo o controle dessas características.
O enraizamento de estacas depende de fatores tais como idade, vigor da
planta, lenhosidade, reguladores de crescimento, meio ambiente, localização da

26
estaca, nutrição e fatores genéticos relacionados ao gênero ou espécies de interesse.
(FERGUSON et al., 1986; ABOU-RAMASH et al., 1998). Segundo PIO et al.
(2005), a umidade é um dos fatores externos que mais contribuem para que ocorra
enraizamento das estacas. Outros estudos demonstram que os fatores que afetam a
iniciação e o desenvolvimento de raízes são relacionados à própria planta (estado
hídrico, condições fitossanitárias, balanço hormonal e nutricional) e/ou
relacionados com condições ambientais (temperatura, luminosidade e umidade
relativa) (MAUAD et al., 2004; NORBERTO et al., 2001; PASQUAL et al., 2001).
Em se tratando do efeito de reguladores de crescimento no enraizamento de
estacas, segundo ROCHA et al. (2004), a indução de enraizamento para muitas
espécies é dependente da aplicação de reguladores vegetais de natureza auxínica,
principalmente ácido indolbutírico (IBA), com ação na atividade das células de
câmbio e na formação de raízes adventícias. Este pré-tratamento com auxinas tem
proporcionado em algumas espécies, rapidez e uniformidade de enraizamento, além
de aumento do número de raízes adventícias. Além da necessidade da adição de
auxinas existem outros fatores que influenciam no enraizamento como o potencial
do genótipo da cultivar, as condições ambientais, a posição da origem das estacas,
assim como, a participação de substâncias como auxinas.
SHAZLY et al. (1994) estudaram o efeito de três destes reguladores em
diferentes concentrações para enraizamento de estacas de lima e lima ácida.
Concluíram que IBA promoveu a melhor porcentagem de enraizamento, maior
número e maiores raízes para ambos os genótipos. Segundo PRATI et al. (1999) o
efeito benéfico dos reguladores de crescimento (IBA e NAA) foi observado no
enraizamento de lima ácida ‘Tahiti’ e laranja doce. Enquanto que RAKESH-
KUMAR et al. (1995) relatam que estacas de limão verdadeiro (C. limon) tratadas,
antes de serem plantadas, com ácido indol-3-butírico associado com ácido p-
hidrobenzóico mostraram um melhor enraizamento nas concentrações de 2g/L IBA
e 2 g/L de pHBA.
Ao lado de características morfológicas ou fisiológicas, características
associadas à tolerância a determinados patógenos são tão importantes quanto o
estudo da resistência. Sabe-se que o gênero Citrus é tolerante ao “Citrus tristeza
vírus” (CTV), enquanto alguns gêneros afins, como P. trifoliata, podem apresentar
resistência ou imunidade, representada pela incapacidade do vírus de se replicar em
seus tecidos. Híbridos entre Citrus e Poncirus apresentam segregação mendeliana

27
para a resistência, que deve ser governada por um gene ou por um gene de efeito
principal (MESTRE et al., 1997b; BORDIGNON et al., 2003).
Devido à alta eficiência do T. citricidus como um vetor, é praticamente
impossível eliminar o vírus dos pomares. Estratégias vêm sendo conduzidas para
introduzir resistência, seja com abordagens tradicionais (hibridação, mapeamento,
etc.) ou com transformação genética. Entretanto, vale a pena ressaltar que
estratégias de melhoramento genético, com uma abordagem moderna para
resistência à tristeza, geralmente, envolvem o uso de P. trifoliata (HEARN et al.,
1993), inclusive com mapeamento desta característica.
Segundo BORDIGNON et al. (2003), uma das maneiras de se controlar a
tristeza é usar variedades de copas e de porta-enxertos que interajam conforme a
capacidade de multiplicar as partículas virais em suas células e de tolerar sua
presença nos tecidos do floema. Portanto, a tolerância de citros ao CTV parece
estar associada a uma menor ou maior capacidade de multiplicação dos vírus em
seus tecidos. Embora não exista nenhuma relação entre título do vírus e sua
severidade, tem sido observado que em variedades mais sensíveis, como laranja
‘Pêra’ e limão ‘Galego’, o vírus apresenta-se em alta titulação (MACHADO et al.,
1997).
Os métodos de detecção e caracterização do vírus baseiam-se em sintomas
em variedades indicadoras (ensaios biológicos), métodos sorológicos associados ou
não a microscopia eletrônica (determinação de partículas virais) e métodos
moleculares (determinação de genoma viral). Diferente do método biológico de
detecção, vários outros testes começaram a ser usados a partir de 1978 para a
detecção do vírus, à medida que anticorpos mono e policlonais produzidos contra a
proteína do capsídeo do CTV tornaram-se disponíveis. BAPTISTA et al. (1996)
purificaram partículas do CTV de lima ácida ‘Galego’ que foram utilizadas como
antígeno para produção de anticorpos policlonais. Estes apresentaram título e
especificidade elevados, e não ocorreu reação cruzada com proteínas da planta
hospedeira em ELISA, “dot immunoprint assay” (DIBA), “Western blot” e “tissue
immunoprint”. A proteína do capsídeo do CTV expressa em Escherichia coli T.
Escherich também foi utilizada como antígeno para a produção de anticorpos mono
e policlonais (TARGON, 1997; TARGON et al., 1997. STACH-MACHADO et al.
2002). Esses anticorpos também vêm sendo adotados rotineiramente, para detecção
do CTV por intermédio das técnicas citadas.

28
 3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Genético

Os genitores limão ‘Cravo’ [Citrus limonia Osbeck], resistente à seca,
suscetível à morte súbita dos citros e às estirpes mais severas do vírus da tristeza do
citros e citrumelo ‘Swingle’ [Citrus paradisi Macf. cv. Duncan x Poncirus
trifoliata (L.) Raf.], suscetível à seca, resistente à morte súbita dos citros e ao vírus
da tristeza dos citros, pertencentes ao banco de plantas matrizes do Centro APTA
Citros ‘Sylvio Moreira’/IAC, Cordeirópolis/SP, foram utilizados em hibridação
controlada como genitores feminino e masculino, respectivamente. Foram
genotipados 94 híbridos zigóticos para constituir a população de mapeamento. As
plantas de origem zigóticas já haviam sido previamente selecionadas daquelas
nucelares por meio de marcadores moleculares RAPD e seleção visual, nas quais os
híbridos com morfologia foliar idêntica ao genitor feminino foram descartados para
as análises.

3.2 Extração do DNA Total

O DNA total foi extraído de folhas frescas de acordo com a metodologia
descrita por MURRAY & THOMPSON (1980), com adaptações introduzidas por
MACHADO et al., (1996). Cerca de 200mg de folhas frescas foram lavadas e
trituradas em almofariz com nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino. Após
transferência do macerado para tubos de polipropileno de 1,5 mL, foram
adicionados 750 µL de tampão de extração (1% CTAB; 100 mM Tris-HCI pH 7,5;
10 mM EDTA; 0,7M NaCl; 2% sarcosil; 2% mercaptoetanol) à 60°C. Os tubos
foram mantidos por 40 min sob agitação periódica para completa homogeneização.
Após o resfriamento, foi adicionado ao extrato o mesmo volume de
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), e feita uma incubação por 5 min a 60° C e,
em seguida, uma centrifugação por 8 min a 2.449 xg. O sobrenadante resultante foi
transferido para um novo tubo e homogeneizado com o mesmo volume de CTAB
10% (10% CTAB; 0,7M NaCl), após o que, igual volume de clorofórmio/álcool
isoamílico (24:1) foi novamente adicionado e centrifugado por 8 min a 2.449 xg. O
sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo e à ele, adicionado igual
volume de tampão de precipitação (1% CTAB; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 10mM

29
EDTA) misturado gentilmente, permanecendo 40 min em repouso e,
posteriormente, centrifugado por 6 min à 12.096 xg. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e o sedimentado ("pellet") formado, dissolvido em 400
µL de TE, com alta concentração de NaCI (10 mM Tris-HCI pH 7,5; 1 mM EDTA;
1M NaCl) à 65°C, até completa dissolução. Posteriormente, após resfriamento, o
DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol 100% e centrifugado por 6 min à
12.096 xg e em seguida precipitado novamente com 1,8 volumes com etanol 70%.
O DNA obtido foi dissolvido em 60 µL de H2O milliQ contendo 10 μg/μL de
RNAse para a eliminação completa de contaminação por RNA. O rendimento foi
de 60ng de DNA/µL.

3.3 Marcadores RAPD

Os “primers” (80) avaliados nas reações de amplificação de fragmentos de
DNA foram de seqüências arbitrárias de 10 nucleotídeos dos kits da Operon
Technologies Inc. As reações de amplificação foram preparadas em um volume
total de 13 µL e constituídas de: H2O milliQ (4,4 µL), Tampão 10X (Invitrogen)
(1,3 µL), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP - Pharmacia (1µL),

0,2 mM de “primer” de 10 nucleotídeos (15 ng) - Operon (3 µL), Taq DNA

polimerase (1,5 unidades), (Invitrogen) (0,3 µL) e de uma solução de 3µL de DNA
(5ng/µL). A amplificação foi conduzida em termocicladores MJ Research
o o
Thermocycler programados para 36 ciclos de 1 min a 92 C, 1 min a 36 C e 2 min
o o
a 72 C. Ao final do último ciclo, foi feita uma extensão final de 10 min a 72 C.
Os produtos da reação foram visualizados em gel de agarose (1,6%)
preparado em tampão TAE (0,04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA) e corados com
brometo de etídio (0,5 µg/mL). A corrida eletroforética foi feita em tampão TAE
1X a 80 V, por aproximadamente 3h e os géis fotografados no sistema “Eagle Eye”
(Stratagene), sobre luz ultravioleta. Para a seleção de “primers” foram inicialmente
preparadas reações para seis indivíduos da progênie, escolhidos ao acaso e ambos
os genitores. “Primers” que geraram polimorfismo entre os genitores e segregação
dos marcadores em pelo menos um indivíduo da progênie foram então genotipados
em todos os indivíduos da população mapa.
O polimorfismo entre os genótipos foi estimado por meio da presença ou
ausência de bandas amplificadas por PCR. O tamanho dos fragmentos RAPD foi

30
estimado por comparação com o marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Gibco). Os
marcadores RAPD de boa intensidade e reprodutibilidade foram analisados quanto
à segregação mendeliana esperada (1:1 ou 3:1) nos 94 indivíduos da progênie.
Marcadores RAPD foram analisados de forma que os marcadores com presença de
bandas no genitor limão ‘Cravo’ (ou citrumelo ‘Swingle’) tiveram os genótipos na
população de mapeamento codificados para lm, quando presente, ou ll, quando
ausente. Para os marcadores provenientes de citrumelo ‘Swingle’ (ou limão
‘Cravo’), os genótipos foram codificados como np, quando a banda estivesse
presente, e nn quando ausente.

3.4 Marcadores Microssatélites

Marcadores microssatélites ou SSR (“Simple Sequence Repeats”) foram
amplificados a partir de seqüências de microssatélites obtidas tanto do banco de
dados do genoma citros (CitEST) (57) como de DNA genômico (171), previamente
obtidas no laboratório.
As reações de amplificação foram preparadas em um volume total de 25 µL
e constituídas de: H2O milliQ (13,95µL), Tampão 10X (Invitrogen) (2,5 µL),
MgCl2 1,5 mM (1,25), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP -

Pharmacia (1µL), 0,1 µM de cada “primer” (2 µL), Taq DNA polimerase (1,5
unidades), (Invitrogen) (0,3 µL) e de uma solução de 2,0 µL de DNA (50ng/µL). A
amplificação foi conduzida em termocicladores MJ Research programado para 30
ciclos de 94°C por 30s, 65-56°C por 30s e 72°C por 5s. A temperatura de
anelamento se inicia a 65°C, decrescendo até 0,3°C a cada ciclo seguido por 3
ciclos de anelamento a 56°C. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de
agarose 4% com brometo de etidio (0,5 ng/mL) e fotografados sobre luz
ultravioleta.
Os marcadores encontrados apresentaram todos os tipos de segregação para
uma população CP (Cross Pollinators). Os códigos utilizados para a construção do
arquivo mapa estão apresentados na tabela 1.

31
 Tabela 1. Códigos utilizados para os tipos de segregação para uma população
CP (Cross Pollinators) *.

Código Descrição
<abxcd> loco heterozigoto em ambos os genitores, quatro alelos
<efxeg> loco heterozigoto em ambos os genitores, três alelos
<hkxhk> loco heterozigoto em ambos os genitores, dois alelos
<lmxll> loco heterozigoto em um genitor
<nnxnp> loco heterozigoto em outro genitor

* códigos do programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001), de uma
população caracterizada como “cross pollinators”. Que são aquelas provenientes de genitores
heterozigotos com fase de ligação dos locos originalmente desconhecida.

3.5 Marcadores TRAPs (Target Region Amplification Polymorphism)

As combinações de “primers” fixos e aleatórios (6) foram avaliadas nas
reações de amplificação de fragmentos de DNA (2 fixos: P1 e P2 e 3 aleatórios:
R1; R2 e R3). O “primer” fixo (gene alvo) foi desenhado de um banco de dados de
seqüência EST, enquanto o segundo “primer”, o arbitrário (18 a 20 pb), possui em
sua extremidade 3’, 3 a 4 nucleotídeos seletivos, 4 a 6 nucleotídeos no centro da
seqüência (rica ou em AT ou GC), amplificando as demais regiões prováveis do
gene candidato e seqüências de preenchimento na extremidade 5´ relacionadas com
o desempenho do “primer”.
A amplificação por PCR foi feita por cinco ciclos iniciais com uma
temperatura de anelamento de 35°C, seguida por 35 ciclos com uma temperatura de
anelamento de 50°C. Os fragmentos, com tamanhos variando de 50 a 900pb, foram
separados em um gel de seqüenciamento de poliacrilamida 6,5%.
“Primers” Fixos - Os “primers” fixos foram desenhados a partir seqüências parciais
de genes diferencialmente expressos detectados nos trabalhos com hibridação “in
silico” a partir da identificação da seqüência no CitEST. Seqüências estas com
homologia aos genes que codificam duas enzimas (‘Cinnamoyl-CoA reductase’ e
‘Caffeic acid-O-Methyltransferase’) envolvidas na rota metabólica de biossíntese
da lignina (CRISTOFANI et al., in press). As seqüências dos “primers” estão
apresentadas na tabela 2.
Um mecanismo de defesa contra o ataque de patógenos é uma rápida
deposição de compostos fenólicos, como a lignina em paredes primárias nos sítios
de infecção, ligando-se a polissacarídeos, para bloquear o avanço do patógeno

32
 (MENZIES et al.,1991).

Tabela 2. Seqüências dos “primers” fixos e arbitrários utilizados para os marcadores

TRAPs.

“Primers” Gene Nomenclatura Seqüência (5’→3’)

“Primers” Fixos Cinnamoyl-CoA
P1 GCCCGTGCTGCCTGATGATT
“Forward” reductase
Caffeic acid-O-
P2 ACAGGGCCAAAGGTAAACACA
Methyltransferase

R1 GACTGCGTACGAATTAAT
”Primers” Arbitrários
R2 GACTGCGTACGAATTTGC
“Reverse” *
R3 GACTGCGTACGAATTGAC

*Os “primers” arbitrários foram desenhados de acordo com Li & Quiros (2001).

Reações de amplificação - As reações de amplificação foram conduzidas a um

volume final de 15 μL com os seguintes componentes: 2 μL da amostra de DNA
(40 ng/mL), 1,5 μL do tampão de reação 10 X, 1,5 μL de MgCl2 (25 mM), 1 μL de
dNTPs (5 mM), 10 nmol dos “primers” arbitrários e 10 nmol dos “primers” fixos e
1,5 U de Taq DNA polimerase. A PCR foi realizada com temperatura de
desnaturação do DNA a 94°C por 2 min. A seguir, 5 ciclos a 94°C por 45 s, 35°C
por 45 s, e 72°C por 1 min, seguidos de 35 ciclos a 94°C por 45 s, 50°C por 45 s, e
72°C por 1 min e um passo de extensão a 72°C por 7 min.
Eletroforese dos produtos amplificados - Após a reação de amplificação, 7 μL de
tampão da amostra 5X [0,313 M Tris-HCl (pH 6.8)] a 25°C, 10% SDS, 0,05% azul
de bromofenol, 50% glicerol) foram adicionados às reações. Uma alíquota de 1 μL
foi aplicada no gel de seqüenciamento (poliacrilamida 6.5%) conforme
recomendações do fabricante. A eletroforese foi conduzida a 1500 V por 3,5 h em
cuba vertical para eletroforeses de ácidos nucleicos, tipo Sequi-Gen System da Bio
Rad, sendo o gel corado com prata.
Os marcadores TRAPs de boa intensidade e reprodutibilidade foram
analisados quanto à segregação mendeliana esperada (1:1 ou 3:1) nos 94 híbridos,
de forma idêntica à análise adotada para os marcadores RAPD descritos

33
anteriormente.

3.6 Avaliação de Características Morfológicas

As características morfológicas, como morfologia foliar, capacidade de
enraizamento de estacas e avaliação de resistência a CTV foram avaliadas e
incluídas ao mapa de ligação.

3.6.1 Morfologia foliar

A morfologia foliar foi avaliada em 90 híbridos e seus 2 genitores, como
monofoliada ou trifoliada. As determinações foram realizadas em plantas juvenis
mantidas em casa-de-vegetação em três repetições. O delineamento experimental
utilizado foi inteiramente casualizado. A avaliação da morfologia das folhas foi
realizada em três folhas de cada repetição, coletadas em uma posição mediana em
relação à altura das plântulas, estimando-se um índice (comprimento/ largura) das
folhas monofoliadas (simples) e trifoliadas (englobando as folhas mistas -
bifoliadas e suas variações) Estes dados foram incluídos como características
fenotípicas no mapa de ligação.

3.6.2 Capacidade de enraizamento de estacas

A capacidade de enraizamento de estacas foi avaliada em 94 híbridos e seus
2 genitores. Dez estacas com cinco gemas axilares de cada genótipo foram imersas
por 10 min em solução contendo 5% de etanol, 1g/L de IBA (ácido indol-butírico)
e 1g/L de NAA (ácido naftaleno acético) em tubetes (100cm3) contendo vermiculita
e mantidos em casa de vegetação sob nebulização. O delineamento experimental
utilizado foi inteiramente casualizado, com cinco repetições com duas estacas por
parcela. A avaliação foi realizada contando-se o número de estacas enraizadas em
cada repetição e estimando-se a porcentagem de estacas enraizadas, que foi
incluída como característica fenotípica no mapa de ligação.

3.7 Avaliação da Resistência ao CTV

A avaliação da tolerância (capacidade de multiplicação do CTV) ou
resistência (incapacidade de multiplicação do vírus nos tecidos) foi avaliada em 85
híbridos e seus dois genitores e conduzida determinando-se o título do vírus por
meio de ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay Sandwich”). Plantas

34
originadas das plântulas originais livres de CTV foram multiplicadas por enxertia
sobre limão ‘Cravo’ e inoculadas por enxertia com borbulhas infectadas com a
estirpe Barão B do vírus (Figura 1). Todos os ensaios foram conduzidos em casa
de vegetação com três repetições para cada indivíduo. A avaliação da presença de
CTV foi feita aos 60 e 120 dias após a enxertia com as borbulhas contaminadas. A
presença do vírus foi avaliada em nervuras de folhas jovens e cascas de ramos
apicais.
Nervuras centrais das folhas e cascas foram trituradas com nitrogênio
líquido até a obtenção de um pó fino, o qual foi ressuspendido em tampão de
extração numa concentração final de 100 mg da amostra por ml de tampão. A
detecção do CTV foi realizada por meio de ELISA, segundo a metodologia descrita
por CLARK et al. (1986). Placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100
μL/poço de antissoro policlonal (BR 1006) (BAPTISTA et al., 1996) de coelho
anti-CTV diluído a 1:10.000 em tampão carbonato 0,2 M pH 9,6 e incubadas a 4ºC
por um período de 2 h. As placas foram bloqueadas com 200 μL/poço de PBS-T
pH 7,2 (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KH2PO4, 29 g/L Na2HPO4.12 H2O (1,15 anidro) e 0,2
g/L KCl) e 2% de leite em pó desnatado e incubadas por 30 min a 37ºC. As placas
foram lavadas três vezes com PBS-T. Em seguida foram adicionados 100 μL/poço
das amostras, mais uma amostra positiva e outra negativa como controles do
imunoensaio.
A incubação foi feita à noite a 4ºC, repetindo em seguida as três lavagens
com PBS-T. Posteriormente, foram adicionados 100 μL/poço de uma mistura dos
anticorpos monoclonais 3DF1 e 3CA5, universais para isolados de CTV
produzidos na Espanha (ROMAN et al., 2004) a uma diluição de 1:5.000 e
incubados por 1h a 37ºC, repetindo-se as lavagens das placas conforme já descrito.
Foram adicionados 100 μL/poço do anticorpo anti-mouse IgG conjugado a
fosfatase alcalina diluído 1:15.000 em PBS e incubadas por 1h a 37º C. Após as
lavagens, foram adicionados 100 μL/poço do substrato pNPP (p-nitrofenil fosfato)
na concentração de 1 mg/mL diluído em tampão substrato dietanolamina pH 9,8
(9,7 mL/L Dietanolamina e 0,2 g/L NaN3). As amostras foram ensaiadas em
duplicata. As placas foram incubadas no escuro por 1h à temperatura ambiente e a
leitura da absorbância foi efetuada a 405 nm em leitor de ELISA (3550 BIORAD).
As plantas foram consideradas positivas se as médias das leituras de
absorbância em leitor de ELISA (baseadas em três repetições para cada um dos 94

35
 híbridos e seus genitores) foram significativamente maiores (pelo teste Scott–Knott
a 5%) que o controle negativo.

Local de enxertia da Laranja

Local de Pêra
enxertia do híbrido
P. trifoliata
laranja Pêra

Limão Cravo
(porta-enxerto)

Figura 1. Ilustração de como os híbridos de limão ‘Cravo’ com citrumelo

‘Swingle’ e os genitores foram inoculados com material de laranja ‘Pêra’ infectada
com CTV estirpe ‘Barão B’.

3.8 Análises Estatística dos Dados Morfológicos

Histogramas de distribuição das médias de todas as variáveis foram obtidos
pelo aplicativo Statistica v. 6.0 (Anexo I). A análise de variância e teste de
comparação de médias foram realizadas utilizando o aplicativo SASM-Agri
(CANTERI et al., 2001).
Para comparação de médias foi utilizado o teste Scott–Knott (SCOTT &
KNOTT, 1974) a 5% de probabilidade, que separa as médias por meio de
comparações entre grupos de média de dados.
O aplicativo SELEGEN – REML/BLUP (RESENDE, 2002) foi utilizado
para calcular os parâmetros genéticos (herdabilidade, variância, coeficiente de
variação) para todas as variáveis.

36
3.9 Construção dos Mapas de Ligação
Os marcadores foram integrados aos mapas de ligação utilizando o
programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN & VOORRIPS, 2001). Este programa
permite análise conjunta de marcadores segregando nas proporções 1:1, 3:1, 1:2:1 e
1:1:1:1. De acordo com as instruções contidas no programa, a população foi
caracterizada como CP (“Cross Pollinators”) proveniente de genitores
heterozigotos com fase de ligação dos locos originalmente desconhecida. Os
grupos de ligação foram formados e ordenados utilizando-se LOD 3,0 e máximo de
40% de recombinação. As freqüências de recombinação, estimadas em análises
multiponto foram convertidas em distância genética (centiMorgans) por meio da

função de Kosambi. O teste qui-quadrado [ χ 2

(P ≤ 0,05, GL=1)] (STELL &
TORRIE, 1980) foi utilizado para testar as hipóteses de segregação Mendeliana
1:1, 3:1, 1:2:1 e 1:1:1:1 para cada um dos marcadores SSR, RAPD e TRAP.

3.10 Identificação de QTLs

Os dados fenotípicos utilizados (índice para morfologia foliar, absorbância-
CTV e número de estacas enraizadas) foram obtidos por meio das médias ajustadas
dos clones. Para a detecção e mapeamento de QTLs na população derivada de
limão ‘Cravo’ x citrumelo ‘Swingle’, foram realizadas análises por meio do
programa MapQTL v. 4.0 (VAN OOIJEM et al., 2002), utilizando-se os testes
paramétricos “Interval Mapping” (LANDER & BOTSTEIN, 1989; VAN OOIJEN,
1992) e Multiple QTL Mapping (MQM) (JANSEN, 1994). A detecção dos QTLs
foi realizada pelo módulo “Interval Mapping” (IM), com fator de significância de
95% (P > 0,05) para identificar QTLs com efeitos principais significativos. O
módulo MQM foi então utilizado para detectar possíveis QTLs mascarados pelos
QTLs identificados pelo IM. A estratégia MQM recorre-se ao uso dos marcadores
que flanqueiam os QTLs identificados pelo IM como co-fatores, por meio da opção
“automatic cofator selection” do aplicativo. O LOD crítico de cada QTL foi
calculado usando-se o teste de permutação randômica (1000 repetições),
(CHURCHILL & DODGE, 1994) disponível no MapQTL.
O teste para verificar se um QTL está ligado ao marcador, é baseado na
estatística da razão de verossimilhança (utiliza logaritmos naturais): LR= -2ln
[Max L(Ha)/MaxL(H0)], em que Ha refere-se à hipótese da presença de um QTL

37
ligado a esse marcador, com a pressuposição de que a distribuição dos fenótipos é
normal. No mapeamento de QTLs é muito comum o uso do LOD score (logaritmo
das probabilidades, na base 10). Um LOD score igual a 3 indica que a hipótese
alternativa é 103 ou 1000 vezes mais provável de ocorrer do que a hipótese nula. A
diferença entre o LD score e estatística LR é a base do logaritmo usada no teste
(SILVA, 2002).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos da mensuração de todas as variáveis estudadas no

presente trabalho: absorbância a 405 nm após 60 min de reação com substrato no
ELISA (avaliação para CTV), enraizamento de estacas, índice de morfologia foliar
e tipo de folha nos respectivos híbridos e os genitores estão apresentados na tabela
3. As estimativas de parâmetros genéticos para estas variáveis estão apresentados
na tabela 4.
Analisando as freqüências de distribuição das médias das características
estudadas (Anexo I), as variáveis associadas ao número de estacas enraizadas e
leitura da absorbância em ELISA (CTV) mostram distribuição em classes distintas,
enquanto que o índice de morfologia foliar mostra uma distribuição contínua,
aproximadamente normal.

38
Tabela 3. Resultados médios obtidos da mensuração das variáveis: título de
CTV (CTV), enraizamento das estacas (E), índice de morfologia foliar (IF) e
tipo de folha em três plantas de 94 híbridos de limão ‘Cravo’ e citrumelo
‘Swingle’ e genitores. (Continua)...

Planta/ Planta/ Planta/

CTV [1] E [%] E[2] IF[3]] Tipo de folha
Híbrido Híbrido Híbrido
L. ‘Cravo’ 1.40 a 18 90 1.8 a 40 3.94 a Mista
54 1.12 a 29 80 1.6 a 58 3.53 b Monofoliada
70 1.11 a 61 80 1.6 a 35 3.46 b Monofoliada
86 1.10 a 58 70 1.4 a 33 3.30 b Mista
93 1.09 a 56 70 1.4 a 64 3.24 b Mista
72 1.07 a 9 70 1.4 a 13 3.22 b Mista
56 1.05 a 57 60 1.2 a 59 3.19 b Mista
64 1.04 a 14 60 1.2 a 76 3.18 b Mista
91 1.01 a C. ‘Swingle’ 70 1.2 a 93 3.16 b Mista
40 1.00 a L. ‘Cravo’ 60 1.2 a 8 3.16 b Mista
1 0.99 a 41 50 1 a 60 3.09 c Mista
76 0.96 a 13 50 1 a 4 3.04 c Mista
32 0.95 a 81 50 1 a 51 3.03 c Mista
4 0.93 a 2 50 1 a 49 3.00 c Mista
59 0.92 a 11 50 1 b 72 2.99 c Mista
84 0.91 a 7 50 1 b 87 2.98 c Mista
71 0.89 a 86 40 0.8 b 62 2.96 c Mista
8 0.87 a 54 40 0.8 b 69 2.92 c Mista
28 0.79 a 33 40 0.8 b 36 2.91 c Mista
37 0.79 a 27 40 0.8 b 44 2.89 c Mista
45 0.78 a 25 40 0.8 b 37 2.89 c Mista
61 0.75 a 21 40 0.8 b 14 2.89 c Mista
5 0.74 a 20 40 0.8 b 20 2.89 c Mista
18 0.72 a 75 40 0.8 b 56 2.87 c Mista
17 0.71 a 55 40 0.8 b 19 2.86 c Mista
47 0.71 a 30 40 0.8 b 91 2.81 c Mista
81 0.71 a 88 30 0.6 b 66 2.81 c Trifoliada
48 0.67 a 74 30 0.6 b 61 2.80 c Mista
12 0.66 a 69 30 0.6 b 29 2.79 c Mista
9 0.64 a 47 30 0.6 b 52 2.77 c Mista
87 0.62 a 10 30 0.6 b 34 2.77 c Mista
82 0.61 a 1 30 0.6 b 30 2.77 c Mista
42 0.61 a 76 30 0.6 b 83 2.76 c Mista
2 0.61 a 32 30 0.6 b 65 2.76 c Trifoliada
57 0.57 a 5 30 0.6 b 92 2.75 c Mista
21 0.57 a 91 20 0.4 c 23 2.73 c Monofoliada
43 0.56 a 83 20 0.4 c 11 2.70 d Monofoliada
67 0.56 a 46 20 0.4 c 12 2.68 d Monofoliada
10 0.55 a 40 20 0.4 c L. ‘Cravo’ 2.66 d Monofoliada
65 0.54 a 31 20 0.4 c 54 2.64 d Mista
33 0.46 b 28 20 0.4 c 79 2.64 d Mista
20 0.45 b 19 20 0.4 c 28 2.64 d Monofoliada
78 0.45 b 8 20 0.4 c 63 2.62 d Mista
63 0.43 b 6 20 0.4 c 86 2.59 d Mista
25 0.41 b 4 20 0.4 c 7 2.59 d Mista
74 0.40 b 79 20 0.4 c 5 2.59 d Mista
26 0.40 b 68 20 0.4 c 27 2.58 d Mista
41 0.39 b 59 20 0.4 c 42 2.56 d Monofoliada
39 0.39 b 39 20 0.4 c 16 2.56 d Mista
60 0.39 b 38 20 0.4 c 68 2.55 d Monofoliada
49 0.38 b 17 20 0.4 c 75 2.55 d Mista
62 0.37 b 94 10 0.2 c 48 2.54 d Mista

39
Tabela 3. Resultados médios obtidos da mensuração das variáveis: título de
CTV (CTV), enraizamento das estacas (E), índice de morfologia foliar (IF) e
tipo de folha em três plantas de 94 híbridos de limão ‘Cravo’ e citrumelo
‘Swingle’ e genitores. (Continuação)

Planta/ Planta/ Planta/

CTV [1] E [%] E[2] IF[3]] Tipo de folha
Híbrido Híbrido Híbrido
30 0.37 b 92 10 0.2 c 25 2.53 d Monofoliada
75 0.36 b 89 10 0.2 c 15 2.52 d Monofoliada
23 0.30 b 85 10 0.2 c 39 2.51 d Monofoliada
46 0.30 b 70 10 0.2 c 74 2.50 d Monofoliada
58 0.29 b 66 10 0.2 c 70 2.50 d Trifoliada
13 0.25 b 65 10 0.2 c 26 2.50 d Monofoliada
6 0.24 b 62 10 0.2 c 31 2.49 d Monofoliada
11 0.21 b 50 10 0.2 c 84 2.48 d Monofoliada
50 0.15 b 36 10 0.2 c 57 2.48 d Mista
80 0.11 b 35 10 0.2 c 24 2.48 d Mista
52 0.10 b 34 10 0.2 c 1 2.48 d Monofoliada
24 0.10 b 26 10 0.2 c 18 2.48 d Mista
31 0.10 b 16 10 0.2 c 94 2.47 d Mista
34 0.10 b 15 10 0.2 c 45 2.47 d Mista
27 0.08 b 12 10 0.2 c 2 2.45 d Monofoliada
51 0.07 b 93 0 0 c 71 2.45 d Monofoliada
29 0.07 b 90 0 0 c 47 2.45 d Mista
14 0.07 b 87 0 0 c 17 2.44 d Mista
94 0.06 b 84 0 0 c 41 2.44 d Monofoliada
69 0.06 b 82 0 0 c 53 2.43 d Monofoliada
90 0.05 b 80 0 0 c 89 2.43 d Monofoliada
92 0.04 b 78 0 0 c 38 2.43 d Monofoliada
15 0.04 b 77 0 0 c 50 2.40 d Monofoliada
85 0.04 b 73 0 0 c 81 2.40 d Mista
53 0.04 b 72 0 0 c 85 2.38 d Monofoliada
89 0.04 b 71 0 0 c 90 2.33 d Monofoliada
66 0.04 b 67 0 0 c 6 2.32 d Monofoliada
7 0.03 b 64 0 0 c 9 2.30 d Mista
44 0.03 b 63 0 0 c 32 2.29 d Mista
35 0.03 b 60 0 0 c 43 2.27 d Mista
55 0.02 b 53 0 0 c 88 2.26 d Mista
38 0.02 b 52 0 0 c 21 2.26 d Mista
88 0.02 b 51 0 0 c 82 2.24 d Mista
C. ‘Swingle’ 0.01 b 49 0 0 c 80 2.19 d Mista
68 0.01 b 48 0 0 c 78 2.19 d Mista
3 - 45 0 0 c 55 2.15 d Mista
16 - 44 0 0 c 10 2.13 d Mista
19 - 43 0 0 c 46 1.81 e Mista
22 - 42 0 0 c 67 1.73 e Monofoliada
36 - 37 0 0 c C. ‘Swingle’ 1.33 f Trifoliada
73 - 24 0 0 c 3 - -
77 - 23 0 0 c 22 - -
79 - 22 0 0 c 73 - -
83 - 3 0 0 c 77 - -
[1]
média de três medidas de absorbância a 405 nm após 60 min de reação com substrato no
ELISA
[2]
média de 5 repetições
[3]
média de 3 repetições
Médias seguidas de letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste Scott–Knott a
5%. Vale ressaltar que o teste de Scott Knott empregado, não utilizada DMS (diferença mínima
significativa) entre um tratamento e outro.

40
Tabela 4. Estimativa de parâmetros genéticos obtidos para as características número médio
de estacas enraizadas, absorbância (CTV) e índice de morfologia foliar em uma progênie
de 94 indivíduos do cruzamento entre limão ‘Cravo’ vs citrumelo ‘Swingle’.

Característica hg2 2
hmc Acclon CV gi (%) CVe (%) CVg / CVe Média

Número médio de
0,29 0,67 0,81 83 129 0,64 0,44
estacas enraizadas
Absorbância (CTV) 0,44 0,70 0,84 64 72 0,88 0,47
Índice de Morfologia
0,62 0,83 0,91 120 100 1,2 2,63
Foliar

2
Legenda: hg2 : herdabilidade individual no sentido amplo, ou seja, efeitos genotípicos, hmc : herdabilidade
média; CVe (%) : coeficiente de variação ambiental em porcentagem; CV gi (%) : coeficiente de variação
genotípica em porcentagem; Acclon: acurácia da seleção; Média: média geral do experimento.

2
Os coeficientes de herdabilidade individual no sentido amplo ( hg ) para
todas as características estudadas variaram de 0,29 a 0,62. A variabilidade

genotípica, expressa pelo coeficiente de variação genotípica ( CV gi ) foi alta para

todas as variáveis (83 a 120) (Tabela 4).
A precisão experimental, inferida pelo coeficiente de variação experimental
em associação com o coeficiente de variação genotípica, por meio da razão

CV g / CVe (VENCOVSKY, 1987), variou de 0,64 a 1,2 (Tabela 4).

2
A herdabilidade em nível de média de clone ( hmc ) (RESENDE, 2002)
variou de moderada a alta para as variáveis (0,67 a 0,83). A acurácia na avaliação
genotípica (Acclon), que se refere à correlação entre o valor genotípico verdadeiro
e aquele predito pelo método estatístico (BLUP, no caso) (RESENDE, 2002), foi
alta para todas as características.

41
4.1 Caracterização Morfológica dos Híbridos

4.1.1 Padrão foliar

Figura 2. Padrão de folíolos e folhas em híbridos de limão ‘Cravo’ com citrumelo

‘Swingle’ (G = limão ‘Cravo’, H = híbridos, I = citrumelo ‘Swingle’).

P. trifoliata (L.) Raf. apresenta folhas subdividida em três folíolos (Figura

3), caráter considerado dominante sobre folhas simples de citros (CAMERON &
FROST, 1968).
Dos 94 híbridos, em 4 indivíduos houve perda de material foliar. Portanto
foram avaliados 90 híbridos e seus 2 genitores (Tabela 3). Quando se considera a
quantidade de híbridos com folhas trilobadas (englobando as folhas mistas -
bifoliadas e suas variações), o experimento resultou em uma taxa de 3:1 de folhas

trilobadas para folhas simples (65:29; χ 2 = 1,70, α = 0,05 ). Esta taxa de

segregação é consistente com dois genes dominantes segregando
independentemente. É notável a grande variação no padrão da morfologia foliar
(Figura 2) nos híbridos com folhas trilobadas.
O índice de morfologia foliar (comprimento/largura foliar) foi de 2,66 para
o limão ‘Cravo’ e 1,33 para o citrumelo ‘Swingle’, indicando que as folhas de
citrumelo ‘Swingle’ apresentam uma relação comprimento/largura menor que as
folhas de limão ‘Cravo’. Alguns híbridos apresentam folhas com relação

42
comprimento largura semelhantes ao do limão ‘Cravo’ e alguns apresentam esta
relação superior, com folhas com largura menor e comprimento maior. De qualquer
forma, parece que todos os híbridos apresentam folhas mais estreitas que o genitor
citrumelo ‘Swingle’.
O índice utilizado representa um marcador morfológico, como análise
suplementar, para avaliar o quanto estatisticamente os híbridos e os genitores
podem ser diferentes entre si por uma abordagem comprimento dividido pela
largura. Este índice foi contrastado com um outro índice que multiplica essas
medidas, que se aproxima à área foliar. Contudo, foi observado que o índice obtido
por multiplicação não é aplicável para a análise em questão. Porque, considerando
o fator juvenilidade das plantas em estudo, as diferenças morfológicas, neste último
caso, são supra-estimadas, por apresentarem, nesta fase, tamanhos variados de
folhas com distribuição aleatória em diferentes locais da planta.
As médias estatisticamente diferentes dos índices não tiveram correlação
com a morfologia trilobada e monofoliada, possivelmente, por apenas o lobo
central foliar ter sido considerado para as medidas dimensionais comprimento e
largura. Bianco et al. (2005) utilizaram-se das mesmas medidas dimensionais,
multiplicadas, para estudar a área foliar na avaliação de crescimento vegetal de
Brachiaria plantaginea. Isto, por meio de equações de regressão entre a área foliar
real e os parâmetros dimensionais lineares de suas folhas.

43
4.1.2 Enraizamento de estacas

A B C

Figura 3. Padrão de enraizamento de estacas de limão ‘Cravo’ (A), citrumelo

‘Swingle’ (C) e híbrido (B).

No presente trabalho foram avaliadas 94 plantas híbridas e seus 2 genitores,

com cinco repetições e duas estacas por parcela. O citrumelo ‘Swingle’ e o limão
‘Cravo’ apresentaram as mesmas médias (1,2) de enraizamento de estacas,
considerando médias de duas plantas por parcela e cinco repetições, sendo que
alguns híbridos mostraram médias de enraizamento semelhantes aos dos genitores,
sem apresentar diferença estatística significativa. Grande parte dos híbridos
apresentou enraizamento de estacas menor que os genitores e vários genótipos
mostraram dificuldade em enraizar (Tabela 3).
A estaquia é um método de propagação em que segmentos destacados de uma
planta, sob condições adequadas, emitem raízes e originam uma nova planta, com
características idênticas àquela que lhe deu origem (MELETTI, 2000). Em citros, a
propagação vegetativa ou clonal de porta-enxertos é realizada por meio do uso das
sementes devido à existência da apomixia e embrionia nucelar. Entretanto, a
estaquia é um método interessante de propagação para os trabalhos de
melhoramento, quando se pretende avaliar uma progênie híbrida sem a necessidade
de esperar que os híbridos produzam frutos para a obtenção de repetições.

44
 PIO et al. (2004) obtiveram porcentagens de enraizamento de 2,5 a 58% em
diferentes variedades de marmeleiros. Em citros, estudos conduzidos por SABBAH
et al. (1991) mostraram que 44 e 77% das estacas de tangerina Cleopatra e P.
trifoliata, respectivamente, enraizaram após tratamento com ácido indol butírico.
SIVIERO et al. (2003) encontraram 10% de enraizamento para C. sunki, 70% para
P. trifoliata e 50 a 100% de enraizamento entre os híbridos do cruzamento entre
ambos.
No presente trabalho foram observadas porcentagens de 70% para citrumelo
‘Swingle’, 60% para limão ‘Cravo’ e de 0 a 90% para os híbridos.

4.2 Avaliação de Resistência ao CTV

O ELISA tem sido utilizado em outros estudos para medidas quantitativas
de populações de fungos, bactérias e vírus (ADLERLIESTE & VAN EEUWIJK,
1992; IKUTA et al., 2000; MEYER et al., 2000). Em estudos realizados por
ALBAR et al (1998), a técnica foi utilizada para quantificar acúmulo de vírus em
tecidos de plantas com a finalidade de mapear QTLs para resistência a vírus em
arroz. Em uva, o uso do ELISA no estudo da quantificação do número células de
Xylella fastidiosa, bactéria causadora da Pierce’ s disease, nos tecidos dos vasos
condutores provou ser um instrumento efetivo para a detecção de QTL associado à
resistência. (KRIVANEK et al., 2006)
No presente trabalho, as 94 plantas híbridas e seus genitores limão ‘Cravo’
e citrumelo ‘Swingle’, com três repetições cada, foram inoculadas com o isolado
severo do vírus da tristeza mantido na variedade de laranja ‘Barão B’ [C. sinensis
(L.) Osbeck] por meio da enxertia de borbulhas contaminadas. Em nove híbridos
não houve pegamento das borbulhas utilizadas como fonte de inóculo, assim sendo,
foram avaliadas 85 plantas híbridas e os 2 genitores. Os resultados médios obtidos
da mensuração desta variável encontram-se resumidos na tabela 3. A análise pelo
teste Scott–Knott das médias de três leituras de absorbância do ELISA, resultou na
separação da população de híbridos em plantas com médias de leitura de
absorbância que não diferiram estatisticamente da média do genitor limão ‘Cravo’
(médias acima de 0,5), e plantas com médias que não diferiram estatisticamente da
média obtida para o genitor citrumelo ‘Swingle’ (médias abaixo de 0,5).
Até 60 dias de inoculação poucas plantas multiplicaram o vírus, com a
maior parte das amostras apresentou resultados negativos (dados não

45
apresentados). De modo geral, a presença do vírus após inoculação com borbulhas
infectadas pode ser detectada por RT-PCR cerca de 20 a 30 dias após enxertia e 60
a 90 dias por ELISA (FREITAS-ASTÚA et al., 2005).
Após 120 dias de inoculação, o vírus se replicou suficientemente para ser
detectado em ELISA e a avaliação de 85 plantas resultou em uma taxa de 1:1 de

híbridos resistentes e suscetíveis (46: 39; χ 2

= 0,56, α = 0,05), caracterizando
que, possivelmente, apenas 1 gene está controlando a resistência a CTV.
As estirpes de CTV, segundo Bordignon et al. (2003), se classificam
genericamente em fracas, médias e severas. No caso do porta-enxeto limão
‘Cravo’, este apresenta tolerância em relação às estirpes fracas e severas de CTV
denominadas normais, com exceção àquela denominada extremamente severa,
como o complexo Barão B e apenas tolerada pelas tangerinas, P. trifoliata e alguns
outros tipos de citros (Muller et al., 1990; Bordignon et al., 2003). Deve ser
destacado que a inoculação por enxertia é considerada uma forma intensa de
infecção pelo fato de a planta receptora estar sob contínua exposição ao vírus que
está sendo gerado no tecido utilizado como fonte de inóculo (Garnsey et al., 1987).
Muitos autores apontam duas classes fenotípicas ocorrendo na tolerância a
CTV, mas com proporções de 3:1 e 2:1, diferentemente da que pode ser encontrada
no presente trabalho (1:1); onde foram considerados aqueles indivíduos com
médias que não diferiram estatisticamente do genitor masculino citrumelo
‘Swingle’. Esses genótipos destes indivíduos podem ser considerados resistentes,
pelo fato de não permitirem a replicação do vírus, sendo que os resultados do
ELISA poderiam ser atribuídos a vírus residual do inóculo (borbulha) que não foi
retirado posteriormente; ou representar um um atraso na infecção e replicação do
vírus em relação às plantas suscetíveis.
Portanto, o limão 'Cravo' é considerado tolerante ao CTV, enquanto o
citrumelo 'Swingle', resistente sendo essa característica herdada do genitor P.
trifoliata. Esta resistência de Poncirus ao vírus da tristeza dos citros foi
corroborada, por exemplo, por Mestre et al. (1997c), em que os autores testaram a
resistência de cultivares de Poncirus para três isolados severos de CTV e todos
mostraram resistência aos isolados do vírus, não desenvolvendo a doença em
qualquer situação (Yoshida et al., 1983; Garnsey et al., 1987; Yoshida, 1996;
Mestre et al., 1997b; Bordignon et al., 2003). Os dados de segregação de progênies

46
resistentes e suscetíveis analisadas por Mestre et al. (1997a) são consistentes com
um controle monogênico da característica de que o alelo de resistência é
dominante, permitindo que híbridos resistentes a CTV possam ser obtidos entre P.
trifoliata e Citrus spp. Demais pesquisadores, como Bar-Joseph et al. (1989);
Gmitter et al. (1995), também encontraram semelhantes resultados.
Entretanto, em análises posteriores, Mestre et al. (1997b) observaram que
CTV é hábil para se mover passivamente com o fluxo do floema quando
inoculados em progênies autopolinizadas de P. trifoliata 'Flying Dragon'
possuidoras de genótipos resistentes Ctr-Rr e Ctr-RR. Diferenças com relação à
acumulação de CTV próximas ao inóculo foram encontradas em indivíduos Ctr-Rr
da progênie, indicando que Ctr não é o único loco responsável por resistência a
CTV em P. trifoliata, e que, pelo menos um outro gene está envolvido. Somando-
se a isso, os autores observaram desvios nas taxas de segregação Mendeliana,
abrindo possibilidades de interação entre Ctr e Ctm, apontando, inclusive, para uma
possível dominância incompleta e Ctr-R, em que doses diferentes de Ctm-M possa
ser ou não efetiva no controle da resistência. Contudo, diante do fato de isolados de
CTV hábeis para se multiplicassem em P. trifoliata nunca terem sido encontrados,
os resultados de Mestre et al. (1997b) deixam margens para dúvidas sobre a
atuação de dois genes no mecanismo de resistência a CTV, uma vez que um largo
espectro de resistência pode ser devido à interação de muitos domínios virais
conservados com Ctr, ou devido à inabilidade do CTV de se sobrepor a dois ou
mais genes de resistência diferentes supostamente presentes em P. trifoliata.
Seguindo esse raciocínio, três genes independentes foram identificados
segundo Bordignon et al. (2003), conferindo resistência ou imunidade ao CTV, que
se manifestam nas plantas como a incapacidade de multiplicar o vírus: Ctv1
(Gmitter et al., 1996; Cristofani et al., 1999) presente em P. trifoliata; Ctv2 (Fang e
Roose, 1999) encontrado em C. maxima; ambos dominantes, não permitindo a
multiplicação do vírus, e Ctm (Mestre et al., 1997a) que restringe a movimentação
do vírus na planta.
Bordignon et al. (2004) divergem nas hipótese/teorias quanto a
tolerância/resistência apresentada por Mestre et al. (1997a,b), quando estes
afirmam a resistência à tristeza do P. trifoliata, os primeiros propõem um modelo
de epistasia dominante-recessiva para tolerância à CTV. Assim, análises de
diferentes híbridos realizadas por Bordignon et al. (2004) sugerem que tolerância é

47
uma característica dominante, inclusive sugerindo que P. trifoliata e limão 'Cravo'
são tolerantes. Análises cuidadosas desse mecanismo genético realizadas pelos
mesmos autores e proporções modificadas de locos segregantes observadas,
indicam que nenhuma hipótese testada baseada em herança quantitativa ou na ação
de um único gene ou dois ou mais locos poderia ser aceita sem considerar a
epistasia. Análises de muitos sistemas interagindo conhecidos, demonstram uma
alternativa de que um modelo de epistasia dominante-recessiva esteja ocorrendo,
envolvendo dois locos, designados como Az e t, que controlam a tolerância de
plantas de CTV. Desta forma, genótipos intolerantes poderiam ser azaz T_,
enquanto que aqueles tolerantes poderiam ser Az_ _ _ e _tt. Assim, o genótipo da
laranja 'Azeda' intolerante seria azaz TT, enquanto 'Sunki' e 'Cravo' tolerantes
poderiam ser Azaz tt e trifoliata Azaz TT. Bordignon et al. (2004) ressaltam ainda
que análises adicionais de cruzamentos e análises de QTL dessas populações
poderiam auxiliar a explicar diferenças genéticas entre indivíduos com graus
diferentes de intolerância.
Ademais, um outro aspecto a ser considerado pelos mesmos autores para
explicar alterações nas proporções observadas de indivíduos tolerantes/intolerantes,
diz respeito não a modelos de epistasia, mas sim a desvios de segregação de razões
teoricamente esperadas. Uma razão para isso poderia ser seleção pré-zigótica de
indivíduos e uma desigual viabilidade de embriões, particularmente quando se
considera a natureza de cruzamentos inter-genéricos e inter-específicos. Outra
possível fonte de distorção na segregação nos trabalhos de Bordignon et al. (2004),
poderia ser a transmissão diferencial de alelos como um resultado de meiose
irregular, passível de ser considerada quando se trata de híbridos interespecíficos.
Contudo, tais observações não influenciam sobremaneira nas conclusões
concernentes ao controle genético monogênico encontrado no presente trabalho,
com proporção 1:1.

4.3 Mapas de Ligação

A possibilidade de identificar, mapear e medir os efeitos dos genes
controladores dos caracteres quantitativos, utilizando-se marcadores moleculares, é
uma importante contribuição para o melhoramento dos citros. A relativa facilidade
com que se obtêm híbridos entre espécies e/ou gêneros de citros, sua condição
predominantemente diplóide, reduzido número cromossômico (2n = 9) e pequeno

48
tamanho do genoma (2C = 0,62 pg de DNA por núcleo) (GUERRA, 1993),
favorecem a construção de mapas genéticos para esse grupo (JARREL et al., 1992;
CRISTOFANI et al., 1999).

4.3.1 Marcadores moleculares

Para a seleção de “primers” na análise de RAPD um total de 80 “primers”

com seqüência arbitrária de 10 nucleotídeos (“kits” C, F, I, R e Y da Operon
Technologies Inc.) foram avaliados utilizando-se os dois genitores (limão ‘Cravo’ e
citrumelo ‘Swingle’) e uma amostra de seis indivíduos da progênie (Figura 4).

Nas condições em que os experimentos foram realizados as reações

possibilitaram a amplificação de 7,2 bandas em média, bem detectadas em gel de
agarose 1,6%. Com este formato (os dois genitores e seis a oito indivíduos da
progênie), a origem dos locos polimórficos assim como seu estado alélico
(homozigoto ou heterozigoto) foram diretamente inferidos a partir da presença em
um genitor, ausência em outro e pelo menos uma presença/ausência na amostra da
progênie. Dos 80 “primers” analisados 23 não produziram qualquer produto de
amplificação, 30 não detectaram polimorfismo na progênie e 27 mostraram
polimorfismo com bandas com pesos moleculares variando entre 0,4 a 4,5 Kb,
gerando um total de 58 marcadores. O número médio de marcadores por “primer”
selecionado foi de 2,14.

M LC CS h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 LC CS h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7

Figura 4. Teste de “primers” RAPD (I07 e I10) para avaliação da segregação

utilizando os genitores (LC e CS) e híbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8).

49
 Por intermédio da técnica TRAP foram avaliadas 6 combinações de
“primers” (2 fixos: P1 e P2 e 3 aleatórios: R1; R2 e R3) e uma amostra de 7
indivíduos da progênie (Figura 5). Duas combinações (P2R1 e P2R3) não
apresentaram produtos de amplificação do DNA após PCR. Quatro combinações
(P1R1; P1R2; P1R3; P2R2) resultaram em 31 marcadores TRAPs com uma média
de 7,75 marcadores por par de “primer” avaliado. Portanto, o número de
marcadores por par de “primers” TRAPs foi quase quatro vezes maior que o
número de marcadores por “primer” RAPD.
MIKLAS et al. (2006) estudaram a aplicação de marcadores TRAPs para
mapeamento e localização de marcas associadas a genes de resistência às doenças
em feijão (Phaseolus vulgaris). Grande parte dos TRAPs desenvolvidos a partir de
genes de resistência mapearam próximo ou dentro de “clusters” de genes
relacionados à resistência a doenças. Outros, mapearam próximos a QTLs
relacionados à resistência a doenças. Os autores encontraram de 1,3 a 20
marcadores TRAPs por reação PCR e atribuíram o alto nível de polimorfismo ao
tipo de população de mapeamento. Os cruzamentos entre genitores mais distantes
foram os que apresentaram maior polimorfismo para os TRAPs.

50
 CS LC 1 2 3 4 5 6 7

Figura 5. Teste de “primers” TRAPs (P1R1) para

avaliação da segregação utilizando os genitores (LC e
CS) e híbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7).

Desde que marcadores TRAP foram desenvolvidos por HU & VICK

(2003), suas aplicações foram direcionadas para acessar variabilidade genética
entre girassóis (Helianthus annuus L.) (HU et al., 2003), em “fingerprint” em
cultivares de alface (Lactuca sativa L.) (HU et al., 2005), em mapeamento de QTLs
(LIU et al., 2005), entre outras.
Na análise RAPD, os 27 “primers” randômicos validados, geraram pelo
menos um fragmento polimórfico na etapa pré-seletiva realizada com os genitores e

51
seis indivíduos da progênie. Os “primers” selecionados (OPC9, 0PC19, OPI7,
OPI10, OPR1, OPR2,OPR5, OPR6, OPR7, OPR9, OPR10, OPR13, OPR14,
OPR15, OPY14, OPI1, OPR12, OPF3, OPF1, OPF4 OPI13, OPC10, OPI14,
OPF13, OPC6, OPR7, OPC7 ) possibilitaram a amplificação de 58 fragmentos,
sendo 36 e 22 com padrão de segregação heterozigoto para o citrumelo ‘Swingle’
e limão ‘Cravo’, respectivamente.
Em mapas de ligação de tangor ‘Murcott’, BASTIANEL (2005)
encontraram uma alta porcentagem (50%) de fragmentos AFLP com mesmo
tamanho em ambos genitores, e que segregaram na proporção 3:1 na progênie,
sugerindo uma elevada similaridade genética entre os genitores tangor ‘Murcott’ e
laranja ‘Pêra’. Isso estaria de acordo com a origem híbrida do tangor ‘Murcott’, que
tem na laranja doce um dos genitores (HODGSON, 1967; ARAÚJO et al., 2003).
Neste trabalho, nenhum marcador RAPD foi encontrado apresentando segregação
3:1. Enquanto que para os marcadores TRAPs, dois marcadores foram encontrados
apresentando esta proporção de segregação.
O número de marcadores SSR avaliado foi de 57 pares de “primers” obtidos
de seqüências de ESTs e 171 obtidos a partir de DNA genômico, totalizando 228
pares de “primers” avaliados utilizando-se os dois genitores uma amostra de seis
indivíduos da progênies (Figura 6).Vinte e cinco pares de “primers” foram
selecionados com base no polimorfismo entre os genitores e segregação na
progênie para os primers SSR provenientes de seqüências de ESTs e 40 pares de
“primers” foram selecionados das bibliotecas genômicas.

52
 M LC CS h1 h2 h3 h4 h5 h6

Figura 6. Teste de “primers” SSR (CCSME9) para avaliação da

segregação utilizando os genitores (LC e CS) e híbridos (1, 2, 3, 4,
5 e 6).

A porcentagem de pares de “primers” polimórficos selecionados a partir dos

SSR de bibliotecas de ESTs foi maior (43,85%) do que os pares de “primers”
selecionados das bibliotecas genômicas (23,39%). Segundo a literatura, os SSR
derivados de bibliotecas de ESTs têm se mostrado menos polimórficos que aqueles
derivados de seqüências genômicas (SCOTT, 2001). Assim, era de se esperar
maior polimorfismo de “primers” de bibliotecas genômicas, no presente trabalho.
Entretanto, para o desenho dos “primers” a partir de seqüências ESTs do CitEST
foi realizada uma seleção “in silico” de “primers” que apresentassem maior
polimorfismo (PALMIERI et al., in press). Para esta seleção, um PCR virtual foi
simulado com várias espécies de citros; o primer sintetizado foi aquele polimórfico
para uma ou mais espécies. “In silico” é uma expressão usada no âmbito da
simulação computacional e áreas correlatas para indicar algo ocorrido por
intermédio de uma simulação computacional que modelam um processo natural ou
de laboratório (DANCHIN, et al., 1991). Esta seleção, provavelmente, contribuiu
para o desenvolvimento de marcadores SSR mais polimórficos nas bibliotecas
ESTs quando comparados aos das bibliotecas genômicas.
Em uma análise reunindo os marcadores selecionados RAPD, SSRs e
TRAPs, a hipótese nula de segregação foi testada (χ2, p < 0,05 ) para as proporções
mendelianas esperadas (1:1; 1:2:1, 1:1:1:1 e 3:1), empregando-se o teste estatístico
do Qui-quadrado individualmente para todos os marcadores selecionados. Os
resultados encontram-se nos anexos III, IV e V. Uma freqüência de 31% dos

53
marcadores apresentou segregação distorcida em relação às proporções
mendelianas de segregação esperada.
A literatura relata desvios de segregação em marcadores em mapas de
ligação genética em vários níveis em híbridos intergenéricos e interespecíficos com
valores entre 3,9% (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF , 1994) e 100%
(NIENHUIS et al., 1987). OLIVEIRA et al. (2005) observaram 61,5% de desvio de
segregação em marcadores de laranja ‘Pêra’ e 25,5% em tangerina ‘Cravo’, quando
comparado com a segregação mendeliana esperada de 1:1 (p < 0,05), sendo que
marcadores heterozigóticos em ambos os genitores mostraram 40% de desvio de
segregação esperada de 3:1 (p < 0,05). Em P.trifoliata cv Rubidoux RUIZ &
ASINS (2003) encontraram 39,7% dos marcadores com desvio de segregação.
TANKSLEY et al. (1992) sugeriram que rearranjamentos cromossômicos, seleção
gamética, zigótica e/ou pós-zigótica podem causar desvios de segregação em várias
espécies. Segundo RUIZ & ASINS (2003), a presença de fatores letais recessivos e
o favorecimento de alguns alelos na seleção gamética ou aborto do embrião, por
exemplo, são possíveis causadores de segregação distorcida em citros em nível
gamético e zigótico.

4.3.2 Análise de ligação

Os 65 pares de “primers” SSR, 27 “primers” RAPD e 4 pares de “primers”
TRAP selecionados, resultaram em 154 marcadores. Os marcadores polimórficos e
segregantes foram avaliados em um total de 94 indivíduos da progênie. Uma matriz
de dados foi então gerada onde as colunas representavam os diferentes indivíduos
da progênie e as linhas constituem os marcadores moleculares. As relações de
ligação dos marcadores segregantes foram estabelecidas utilizando-se o programa
JoinMap.
Com base na análise de ligação, 77 marcadores dos 154 encontrados se
agruparam em 8 grupos de ligação de citrumelo ‘Swingle’ (Figura 7) e 33
marcadores se ligaram em 7 grupos de ligação de limão ‘Cravo’ (Figura 8). 44
marcadores não se ligaram em nenhum dos mapas. Contudo, com um grau de
saturação maior do mapa, alguns destes marcadores poderiam estar ligados, além
de poderem ser utilizados em outras análises empregando-se ANAVA para
encontrar associações significativas com outras características.
A distância entre os marcadores nos grupos de ligação variou de 0 (isto é,

54
dois marcadores que co-segregam – completamente ligados) a 45 cM, com média
de 9,9 cM entre marcadores para o citrumelo ‘Swingle’. Para o mapa de limão
‘Cravo’, a distância entre marcadores de 2 a 45 cM, com média de 13,78 cM entre
marcadores. Os tamanhos individuais dos grupos de ligação variaram de 54 a 129
cM para citrumelo ‘Swingle’ e 32 a 105 cM para o limão ‘Cravo’. O comprimento
total dos mapas foi de 765 cM para citrumelo ‘Swingle’ (Tabela 5) e 455 cM para
o limão ‘Cravo’ (Tabela 6).

Tabela 5. Número, tipo de marcadores e a distância em centimorgans (cM)

de cada grupo de ligação do mapa de citrumelo ‘Swingle’.

Grupo de ligação* Número e tipo de marcadores Distância (cM)

GL1 3 RAPD, 4 SSR e 1 TRAP 129
GL2 9 RAPD e 1 SSR 118
GL3 2 RAPD, 4 SSR e 3 TRAP 116
GL4 8 RAPD e 2 TRAP 105
GL5 3 RAPD, 8 SSR e 6 TRAP 90
GL6 7 SSR e 4 TRAP 80
GL7 6 RAPD 73
GL8 5 RAPD e 1 SSR 54
Total 77 765

* Os grupos de ligação foram numerados seqüencialmente do mais longo para o mais

curto.

Tabela 6. Número, tipo de marcadores e a distância em centimorgans (cM)

de cada grupo de ligação do mapa de limão ‘Cravo’.

Grupo de ligação*
Número e tipo de marcadores Distância
(cM)
GL1 12 RAPD 105
GL2 3 SSR e 1 TRAP 85
GL3 5 RAPD e 1 SSR 82
GL4 1 RAPD e 1 SSR 68
GL5 4 RAPD 45
GL6 2 SSR 38
GL7 3 SSR 32
Total 33 455

* Os grupos de ligação foram numerados seqüencialmente do mais longo para o mais

curto.

Um mapa com menor número de marcadores foi obtido para o limão

55
‘Cravo’. Em estudos realizados por RUIZ & ASINS (2003), mapas de ligação
genético construídos para os cruzamentos C. volkameriana x P. trifoliata e C.
aurantium x P. trifoliata, o genitor da espécie Citrus foi heterozigoto em mais
locos que P. trifoliata, fazendo com que a densidade dos mapas de Citrus spp
fossem maiores do que qualquer mapa com P. trifoliata. No presente trabalho, o
genitor citrumelo ‘Swingle’, por se tratar de um híbrido entre C. paradisi x P.
trifoliata, apresentou maior número de locos em heterozigose e, portanto, um mapa
mais denso em marcadores pode ser obtido para este genitor.
Considerando o tamanho do genoma de citros estimado, utilizando o
programa Mapmaker (LANDER et al., 1987) como sendo entre 1.500 cM e 1.700
cM (JARREL et al., 1992), os mapas de ligação construídos no presente trabalho,
utilizando o aplicativo JoinMap, cobriram de 45 a 51% o mapa de citrumelo
‘Swingle’ e 27 a 30% o mapa de limão ‘Cravo’.
No caso de mapeamento utilizando “pseudo-testcross”, a ocorrência de
marcadores comuns aos dois genomas em um mesmo grupo de ligação dependerá
da presença do mesmo marcador em ambos os genomas e do seu estado alélico.
Enquanto em nível interespecífico, a sobreposição é muito baixa, em nível
intraespecífico, irá aumentar à medida que indivíduos da mesma população forem
utilizados (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF, 1994).
Para integrar mapas de ligação construídos com a estratégia “pseudo-
testcross”, marcadores codominantes multialélicos com alelos de ambos os
genitores segregando são mais eficientes, fornecendo um conjunto de locos que
podem ser utilizados como ponte (GRATTAPAGLIA & SEDEROFF, 1994).

56
 1 2 3 4 5 6

0 R13-550 0 R9-3000 0 R1-1750 0 R5-925 0 P2R2-5

0 CCSME22 1 CCSME102
4 C9-700 1 CCSME20
7 CCSME92
12 CCSM57 13 CCSME109

22 Y14-1650 22 R10-1200 19 P2R2-7

27 P2R2-9
27 P1R2-1
32 C9-400 30 R14-900 CCSME49
34 P1R2-2 34 CCSME114
38 Y14-500 38 I10-580 36 R5-1325
38 P1R3-9
43 Y14-3000 44 P1R2-7 41 P1R3-10 43 CCSME89
45 CCSME26 45 CCSME91
45 P1R2-6
49 R2-2150 50 CCSM163 49 P1R1-9
55 CCSM40 52 R7-630
56 C9-5500 51 P2R2-6
57 CCSM29 56 P2R2-4 54 CCSM161
56 R13-575
64 R15-750 63 CCSM118 65 P1R1-3
69 CCSM119 67 P1R2-3
74 P1R2-4 74 R14-1500 70 CCSM128
76 P2R2-10
80 CCSME97
82 I10-1800
85 CCSM53
89 R1-870 89 CCSM55
90 R14-2500
97 CCSM147
102 CCSM17 7 8
105 R6-1100
0 F1-620 0 I14-540
116 CCSME50 13
118 I10-1650 CCSM170
24 F13-990
26 C2-610 27 C6-490
129 R7-1100
30 R9-1500
40 R12-950 R7-630
35
I13-815
61 54 C7-900
73 C10-540

Figura 7. Mapa de ligação de citrumelo ‘Swingle’ com 77 marcadores (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) em 8 grupos de ligação.

57
 1 2 3 4 5 6 7

0 R5-80
0 CCSME89
0 F4-161
1 R7-57 1
CCSME107
2 I10-165
2 R14-130
CCSM91
3 R13-57 0
2 0 CCSM46
4 R5-35 I1-45
1 CCSM118 0
R12-150 CCSME114
0
5 R14-75
2 Y1 -400
5 R1-35
3 CCSM55
R15-35 3 2
5 P2R2-2 5 CCSM53 F3-49
6 R7-45
6 T14-84 CCSME109
8 2
R15-95 6 CCSM39
4
6 CCSM163 I11-93
CCSM29 4 F10-82 CCSME52
9 R12-60 8 8 R2-135 6 CCSM161 3 3 CCSM102

10
I10-45

Figura 8. Mapa de ligação de limão ‘Cravo’ com 33 marcadores (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) em 7 grupos de ligação.

58
 Dos 65 pares de “primers” SSR, 23 provenientes de seqüências de ESTs e
23 provenientes das seqüências genômicas foram incluídos nos mapas de ligação
de citrumelo ‘Swingle’ e limão ‘Cravo’. Destes, 19 pares de “primers” (Anexo IV)
produziram bandas que segregaram de forma informativa em todas as progênies,
isto é, ambos os pais são heterozigotos e pelo menos três alelos diferentes estão
segregando, de modo que quatro genótipos diferentes podem ser identificados na
população. Isso possibilita o reconhecimento de grupos de ligação homólogos entre
os genitores, diferentemente de quando somente um dos pais é heterozigoto e o
marcador SSR somente é mapeado em um dos mapas. Marcadores mapeados em
ambos os genitores (configuração completamente informativa), pode ser constatado
pelos marcadores CCSM53, 55, 161 e 163 que foram mapeados no grupo 4 de
limão ‘Cravo’ e no grupo 5 de citrumelo ‘Swingle’, mostrando marcadores SSR em
comum entre estes grupos de ligação (Figura 9).
BRONDANI et al. (2006) observaram que dos 234 marcadores SSR
utilizados em trabalhos de mapeamento genético em Eucalyptus, 74 eram
informativos para o genitor feminino (E. grandis), 32 eram informativos para o
genitor masculino (E. urophylla) e 128 (55%) eram completamente informativos,
isto é, segregavam em ambos os genitores com um total de três a quatro alelos. Os
autores não observaram nenhum marcador SSR segregando na proporção 1:2:1,
isto é, igualmente heterozigoto em ambos os genitores. No presente trabalho, foram
observados 15 marcadores SSR segregando na proporção 1:2:1 (Figura 10).
Assim, locos que foram heterozigotos em ambos os genitores (tipos de
segregação hkxhk, abxcd e efxeg) podem ser considerados para a comparação de
mapas possibilitando a exploração de relações de genes colineares (sintenia) por
mapeamento comparativo. Mapeamento comparativo trata da comparação da
ordem e posição relativa de genes e marcas em mapas de diferentes espécies.
Comparações entre espécies mais próximas revelam alto grau de sintenia e
colinearidade dos mapas. Nestes casos, o local de muitos genes pode ser estimado
por simulação. Comparações entre espécies mais distantes revelam perda crescente
de sintenia. A colinaridade ocorre quando a ordem dos genes em um grupo de
ligação ou no cromossomo é preservada entre espécies distintas.
O mapeamento comparativo (“comparative mapping” ou “synteny
mapping”) constitui outra importante aplicação dos mapas genéticos. A
comparação das estruturas genômicas de diferentes espécies, do ponto de vista de

59
homologia de genes e conservação de distâncias e da ordem de ligação nos
cromossomos, permite melhor compreensão da evolução dos genomas (FEUILLET
& KELLER, 2002). Outra utilização do mapeamento comparativo é como
estratégia de obtenção de um mapa único de referência para a maioria das espécies
vegetais cultivadas, pelo menos ao nível de famílias taxonômicas (CARNEIRO &
VIEIRA, 2002).

GL 5 GL 4

0 CCSME20
0 CCSM91
1 CCSME22

19 P2R2 -7 15 CCSM119
CCSM118

27 P1R2 -1
30 R14-900CCSME49
27 Y14-4000
38 P1R3 -9 30 CCSM55
41 P1R3 -10 33 CCSM53

50 CCSM163
51 P2R2 -6
54 CCSM161
56 R13-575
63 CCSM118
67 P1R2 -3
70 CCSM128

65 CCSM161
85 CCSM53 68 CCSM163
89 CCSM55
90 R14-2500

A B

Figura 9. Grupos de ligação de citrumelo ‘Swingle’ (A) e limão ‘Cravo’ (B)

mostrando marcadores SSR em comum.

A comparação de mapas é importante para se inferir sobre diferenças e

observações pontuais entre as espécies ou variedades em estudo. Como, por
exemplo, os trabalhos de RUIZ & ASINS (2003), em que foram comparados
mapas de duas variedades de P. trifoliata ‘Flying Dragon’ e ‘Rubidoux’, onde
explanações são feitas sobre a possível origem mutante da característica peculiar
que ‘Flying Dragon’ apresenta, o de ser um porta-enxerto ananicante. Como dois
marcadores distanciados de 7,1 a 8,7 cM no mapa do ‘Flying Dragon’ não estão

60
ligados em ‘Rubidoux’, os autores sugerem ou a ocorrência de uma translocação ou
uma inversão paracêntrica envolvendo ambos marcadores.

M LC CS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M

Figura 10. Marcador SSR (CCSM19) segregando na proporção 1:2:1. LC = limão

‘Cravo’, CS = citrumelo ‘Swingle’, 1 a 18 híbridos e M = Marcador de peso
molecular Ladder 1 Kb Plus.

RUIZ & ASINS (2003), em semelhante análise, para mapas comparativos

de Poncirus e Citrus observaram translocações afetando a homeologia dos grupos
de ligação em marcadores que se caracterizam por uma ordenação diferente em
mesmo grupo de ligação, apontando diferenças dos mapas dos dois genitores em
estudo. Nestes estudos, essas diferenças podem ser devido a deleções, diferenças na
fração de recombinação ou ao número amostral de indivíduos utilizados (RUIZ &
ASINS, 2003).
Com relação à aplicabilidade dos mapas genéticos nas análises de QTLs e
seleção assistida por marcadores, diferenças na ordem dos marcadores têm
conseqüências mais intensas do que diferenças em suas distâncias. Por isso, fatores
que afetam a ordem dos marcadores e a colinearidade dos mapas merecem
destaque a escolha do critério LOD, que pode ser mais ou menos estringente, as
diferentes fases de ligação dos alelos, distorções na segregação e reorganizações
cromossômicas.
Devido ao menor número de marcadores selecionados para a construção dos
mapas de limão ‘Cravo’, um critério de ligação LOD > 3 foi empregado, sendo que
um LOD > 4 foi utilizado para o mapa de citrumelo ‘Swingle’ que possuia maior
número de marcadores. Esta diferença do critério LOD pode ter resultado na

61
 diferença da ordem dos marcadores nos grupos de ligação 4 de limão ‘Cravo’ e 5
de citrumelo ‘Swingle’ (Figura 9).

4.4 Mapeamento de QTLs

As análises de segregação dos marcadores na progênie resultaram em 77
marcadores no mapa de citrumelo ‘Swingle’ (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) e 33
marcadores no mapa de limão ‘Cravo’ (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) do total de
marcadores mapeados. No mapa de citrumelo ‘Swingle’, apenas foram
considerados grupos de ligação com mais de três marcadores.
Para a localização de QTLs, os dados fenotípicos avaliados foram
analisados separadamente e associados aos mapas de ligação com a utilização do
programa MAPQTL v.4.0 (Figura 11).

Tabela 7. Detalhes dos QTLs detectados nos grupos de ligação de citrumelo ‘Swingle’,
pelo método “Multiple QTL Maping” (MQM) associados às características estudadas.

Grupo
Intervalo LOD Efeito
Característica de LOD Variância
(cM) Crítico (%)
ligação
Morfologia
4 0,0 – 22,0 3,87 3,80 0,0140 76,10
foliar
CTV 6 18,4 – 23,4 5,94 5,80 0,0061 95,10
Enraizamento 6 0,0 – 7,0 15,96 7,10 0,0012 50,80
de estacas 3 76,4 – 91,4 7,86 7,10 0,0260 37,70

As análises pelo método de “Multiple QTL Mapping” (MQM) detectaram a

presença de um QTL para resistência a CTV no grupo de ligação 6 (GL 6), um para
morfologia foliar no grupo de ligação 4 (GL 4) e dois QTLs para a característica
enraizamento de estacas nos grupos de ligação 3 e 6 (GL 3 e 6). O teste de
Permutação (1000 repetições) detectou um LOD score crítico inferior (P < 0,05) ao
LOD gerado e a presença de QTLs com efeitos de 76,1%, 95,1%, 50,8% e 37,8%
na variação fenotípica observados para as características morfologia foliar,
resistência a CTV e enraizamento de estacas, respectivamente (Tabela 7 e Figura
11 ). Três QTLs de menor efeito foram encontrados para enraizamento de estacas
(dados não apresentados). Nenhum QTL foi localizado no mapa de limão ‘Cravo’,

62
muito provavelmente devido à baixa densidade de marcadores no mapa.
Os QTLs para resistência a CTV e morfologia foliar apresentaram grandes
efeitos na expressão fenotípica. Estas características foram relatadas na literatura
como condicionadas por pelo menos dois genes de grande efeito. A tolerância à
tristeza dos citros está condicionada por pelo menos dois locos, Az e t interagindo
em uma epistasia dominante-recessiva (BORDIGNON et al., 2004). No presente
trabalho, foi encontrado um QTL para CTV explicando 95% da variância
fenotípica no grupo de ligação 6, entre os marcadores CCSME109 e P2R2-9, sendo
este último marcador é um loco marcador TRAP e está relacionado a genes
envolvidos com a síntese de lignina. Um aumento na expressão de genes
associados com a síntese de lignina foi observado em trabalhos em que houve a
comparação de genes diferencialmente expressos em plantas infectadas e não
infectadas com vírus (CRISTOFANI et al., in press).
Vale ressaltar que ligninas são compostos fenólicos encontrados nas paredes
secundárias do sistema vascular vegetal e desempenham importantes papéis
biológicos, reduzindo a permeabilidade da parede celular em relação à água,
estando também envolvidas em mecanismos de defesa contra patógenos. A via
metabólica da lignina e as enzimas envolvidas na sua síntese vem sendo
caracterizadas nos últimos anos. Uma série de genes que codificam diferentes
enzimas envolvidas na biossíntese da lignina foram identificados em diferentes
espécies de plantas. A biossíntese de lignina está acoplada ao metabolismo dos
fenilpropanóides, apresentando enzimas compartilhadas com outros processos
metabólicos tais como ácido caféico O-metiltransferase (COMT) assim como
enzimas específicas como cinamoil-CoA redutase (CCR) RAMOS et al. (2001),
utilizadas no presente trabalho.
Um dos mecanismos de ataque dos fitopatógenos é a produção de enzimas
lignolíticas, que atuam sobre a lignina da parede celular, rompendo as barreiras e
defesas do hospedeiro e colocando em disponibilidade nutrientes, a partir de
substâncias constituintes dos tecidos vegetais infectados MENZIES et al. (1991)
Nos trabalhos de KUHN (2007), foi observado que na ausência do
fitopatógeno e, após a aplicação do indutor químico ASM [indução mediada por
acibenzolar-S-metil (ASM), indutor químico], a indução de resistência foi
associada ao aumento da síntese de lignina e redução no teor de fenóis; aumentos
no teor de proteínas solúveis e de açúcares redutores nas folhas; redução do

63
crescimento e da produtividade.
Mecanismos genéticos de herança simples e oligogênica já foram
observados para outras doenças e patógenos dos citros, como por exemplo, a
resistência ao nematóide T. semipenetrans (LING et al., 2000) e ao vírus da tristeza
(MESTRE et al., 1997a, b, c; CRISTOFANI et al., 1999).
Um QTL significante associado à resistência a “Pierce’s disease” (PD) em
uva, causada pela bactéria Xylella fastidiosa foi localizado no mapa do genitor
resistente explicando 72% da variância fenotípica (KRIVANCK et al., 2006). Os
autores acreditam que a resistência seja controlada por um alelo dominante em um
loco de maior efeito com algumas modificações fenotípicas causadas pelo ambiente
ou por genes de menor efeito.
BASTIANEL (2005) obteve resultados semelhantes com as análises de
QTL para resistência à leprose em citros. Encontrou um QTL explicando 80% da
variação fenotípica para leprose.
No presente estudo, os resultados obtidos pelo “MQM mapping” sugerem
um QTL para a folha trilobada explicando aproximadamente 76,1% da variância
fenotípica (Tabela 3 e Figura 11). Entretanto, a proporção de segregação de 3:1 de

folhas trilobadas para folhas simples (65:29; χ 2

= 1,70 α = 0,05%) é consistente
com dois genes dominantes segregando independentemente. A alta herdabilidade
observada e a distribuição em classes fenotípicas distintas (monofolioladas, mistas
ou trifolioladas), corroboram com as análises de QTL, ou seja, possivelmente, um
gene de grande efeito esteja envolvido, embora não exclua a possibilidade de
outros genes, de efeito menor, possam estar envolvidos na herança das
características.
No presente estudo, os resultados obtidos pelo “MQM mapping” utilizando
as médias de índice de morfologia foliar, sugerem a presença de um QTL. A alta
herdabilidade observada e a distribuição em classes fenotípicas distintas (folhas
simples e mistas ou trifolioladas), corroboram com as análises de QTL, ou seja, de
que possivelmente pelo menos um gene de grande efeito esteja envolvido, embora,
não exclua a possibilidade de outros genes, de efeito menor, possam estar
envolvidos na herança da característica uma vez que observamos uma grande
variação no morfologia tanto nas folhas simple como nas trilobadas (Figura 2) em
relação aos genitores. OLIVEIRA et al. (2002) obtiveram um índice de morfologia

64
do ápice foliar onde os híbridos exibiam um nível intermediário do índice em
relação aos genitores tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pêra’.
Os altos valores de coeficientes de herdabilidade individual no sentido

amplo ( h 2 g > 0,40), a alta precisão experimental ( CV g / CVe ≥ 1 ) e a alta acurácia

na avaliação fenotípica ( Acclon > 0,85 ) observados para as características

resistência a CTV e índice de morfologia foliar indicam que o próprio fenótipo é
um bom indicador do valor genotípico dos indivíduos (VENCOVSKY, 1987;
RESENDE, 1995). Caracteres de alta herdabilidade apresentam controle genético
mais simples, sendo provavelmente controlados por um menor número de genes, e
assim, para esses caracteres existe uma maior probabilidade de detecção de QTLs
(REZENDE, 2002).
2 2
Os baixos valores hg ( hg = 0,29) encontrados para a característica
enraizamento de estacas e a detecção de dois QTLs em grupos de ligação de
Poncirus trifoliata são indicativos de que esta característica é controlada por alguns
genes de efeito principal. Em um trabalho visando mapear QTLs associados ao
enraizamento de estacas utilizando uma progênie de C. sunki x Poncirus trifoliata,
SIVIERO et al. (2003) encontraram dois QTLs no mapa de ligação de Poncirus
trifoliata. Os QTLs identificados eram responsáveis por 15,8% e 20,9% da
variação fenotípica para a característica enraizamento de estacas (Figura 11).

65
 Índice de Morfologia Foliar - MQM Mapping Resistência a CTV - MQM Mapping

4 6

5
3
4

2 76,1% * 95,1% *
3

2
1
1

0 0

CCSME97
P2R2-5 CCSME102

CCSME89
CCSME92
R5-1325
P1R2-7 P1R2-6

R15-750

R6-1100

CCSME109

CCSME114
R5-925

R14-1500
R10-1200

R7-630

R1-870

CCSME91
P2R2-9

P1R1-9

P1R1-3
lod
lod crítico lod
Grupo de ligação 4 (cM) Grupo de ligação 6 (cM) lod crítico

A B
Enraizamento de estacas - MQM Mapping Enraizamento de estacas - MQM Mapping

20
9
8

50,8% * 7
37,8% *
6
10 5
4
3
2
1
0
0
P2R2-5 CCSME102

P2R2-9

P1R1-3
CCSME109
CCSME92

CCSME114

CCSME97
CCSME89
CCSME91
P1R1-9

P1R2-2

P2R2-4 CCSM40
R1-1750

P2R2-10
CCSM57

I10-580

CCSME50
CCSM119
lod lod
Grupo de ligação 6 (cM) Grupo de ligação 3 (cM) lod crítico
lod crítico

C D
Figura 11. QTLs associados à morfologia foliar (A), resistência a CTV (B) e enraizamento de estacas (C e D) em mapas de ligação de
citrumelo ‘Swingle’. * Porcentagem de variação fenotípica que cada QTL pode explicar.

66
 5 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que:

a) A população de mapeamento analisada é considerada representativa para os
estudos das características apresentadas nos genitores limão ‘Cravo’ e citru-
melo ‘Swingle’.
b) O polimorfismo obtido pelos marcadores TRAPs, com uma média de 7,75
marcadores por par de "primers”, foi superior aos RAPDs (2,14 por “pri-
mer”), permitindo aumentar de forma significativa a densidade dos mapas
de ligação.
c) A configuração completamente informativa com 19 marcadores SSR mape-
ados em ambos os genitores, permite um maior poder de detecção de grupos
de ligação com marcadores em ambos os genitores, possibilitando explorar
as relações de genes colineares (sintenia) por mapeamento comparativo.
d) Os marcadores apresentando 31% de taxa de desvio de segregação podem
ser considerados para a construção dos mapas de ligação para Citrus, em
virtude de rearranjos cromossômicos, seleção gamética, zigótica e/ou pós-
zigótica, assim como, presença de fatores letais recessivos que ocorrem, ge-
ralmente, neste gênero e naqueles correlatos, como Poncirus.
e) A alta herdabilidade para a característica morfologia foliar é confirmada
com as análises dos QTL em citrumelo ‘Swingle’ e um gene de grande efei-
to está envolvido na determinação dessa característica.
f) Em função da baixa densidade do mapa de limão ‘Cravo’ não foi possível
detectar QTLs para nenhuma característica.
g) Embora existam na literatura diferentes classes fenotípicas ocorrendo na re-
sistência ou mesmo tolerância a CTV, abrindo possibilidades de uma possí-
vel dominância incompleta ou mesmo hipóteses de epistasia dominante-re-
cessiva, tais observações não influenciam sobremaneira nas conclusões con-
cernentes ao controle genético monogênico encontrado no presente traba-
lho, com proporção 1:1.

67
 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABECITRUS – ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DOS EXPORTADORES DE

CÍTRICOS, http://www.abecitrus.com.br.Arquivos , (agosto 2001).

ABOU-RAMASH, M.; EL-WAKEEL, H.F.; KASSEM, N.; MOHAMED, E.A.

Studies on the vegetative propagation of some citrus rootstocks. In: Annals of
Agricultural Science Cairo, v.43, p.523-537, 1998.

ADLERLIESTE, M.F.J.; VAN EEUWIJK, F.A. Assessment of concentrations of

beet necrotic yellow vein virus by enzyme-linked immunosorbent assay. Journal
of Virological Methods, v.37, p.163-176, 1992.

ALBAR, L.; LORIEUX, M.; AHMADI, N.; RIMBAULT, I.; PINEL, A.; SY,
A.A.; FARGETTE, D. et al. Genetic basis and mapping of the resistance to rice
yellow mottle virus: I. QTLs identification and relationship between resistance and
plant morphology. Journal of the American Society for Horticultural Science,
v.97, p.1145-1154, 1998.

AMARAL, A.M.; ASTUA, J.F.; BERGER, I.J.; CAMARGO, R.L.B.C.; CARLOS,

E.F., et al. Analysis of citrus transcriptome: CitEST in Brazil. In: The International
Conference on the Status of Plant & Animal Genome Research, San Diego, CA,
Abstract, p.22, 2007.

AMARO, A. Estratégias para a laranja no Brasil. In: NEVES, M.F. et al. Editora
Atlas/PENSA, 2005.

ANDERSON, C.M.; CASTLE, W.S.; MOORE, G.A. Isozymic identification of

zygotic seedlings in Swingle citrumelo Citrus paradisi x Poncirus trifoliata nursery
and field populations. Journal of the American Society for Horticultural
Science, v.116, p.322-326, 1991.

ARAÚJO, E.F.; QUEIRÓZ L.P.; MACHADO M.A. What is Citrus? Taxonomic

implications from a study of cp-DNA evolution in the tribe Citreae (Rutaceae
subfamily Aurantioideae). Organisms Diversity & Evolution, v.3, p.55-62, 2003.

ARAÚJO, E.F.; ROQUE, N. Taxonomia dos citros. In: MATTOS Jr. D.; NEGRI,
J.D; PIO, R.M; POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas: Instituto Agronômico e
Fundag, 2005.

AZEVEDO, C.L.L. Sistema de Produção: Versão Eletrônica. Embrapa Mandioca e

Fruticultura,
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Citros/CitrosNordeste/i
mportancia.htm , (16 dezembro 2003).

68
BAPTISTA,C.R.; VEJA, J.; STACH-MACHADO, D.R.; TARGON, M.L.P.N.;
MULLER, G.W.; MACHADO, M.A.. Método simplificado de purificação do vírus
da tristeza dos citros e obtenção de anti-soro de alta especificidade. Summa
Phytopathologica, v.22, p. 234-238, 1996.

BAR-JOSEPH, M.; MARCUS, R.; LEE, R.F. The continuous challenge of citrus
tristeza virus control. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.27, p.291-
316, 1989.

BARKLEY, N.A.; ROOSE, M.L.; KRUEGER, R.R.; FEDERICI, C.T. Assessing

genetic diversity and population structure in a citrus germplasm collection utilizing
simple sequence repeat markers (SSRs). Theoretical and Applied Genetics,
v.112, p.1519-1531, 2006.

BASTIANEL, M.; SCHWARZ, S.F.; COLETTA-Filho, H.D.; LIN, L.L.;

MACHADO, M.; KOLLER, O.C. Identification of zygotic and nucellar tangerine
seedlings (Citrus spp.) using RAPD. Genetics and Molecular Biology, v.21,
p.123-127, 1998.

BASTIANEL, M. Resistência à leprose e à mancha marrom de alternaria em citros:

caracterização de híbridos, herança, mapeamento genético e expressão gênica.
2005. 294p. Tese (Doutorado). Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, Campinas.

BASTIANEL M.; CRISTOFANI M.; OLIVEIRA, A.C.; FREITAS-ASTÚA J.;

GARCIA A.A.F.; et al. (2006). QTL associated to citrus leprosis resistance. Tree
Genetics and Genomes (in press).

BENNETT, C.W.; COSTA, A.S. Tristeza disease of citrus. Journal of

Agricultural Research, Washington, v.78, n.8, p.207-237, 1949.

BERETTA, M.J.G.; POMPEU JR., J.; DERRICK, K.S.; LEE, R.F.; HEWITT, B.;
BARTHE, G. Evaluation of roostocks in Brazil for field resistence to declinio. In:
International Citrus Congress. Proceedings. Acireale: International Society of
Citriculture, v.2, p.831-843, 1994.

BORDIGNON, R.; MEDINA-Filho, H.P.; MULLER, G.W.; SIQUEIRA, W.J. A

tristeza dos citros e suas implicações no melhoramento genético de porta-enxertos.
Bragantia, Campinas, v.62, n.3, p.345-355, 2003.

BORDIGNON, R; MEDINA-Filho, H.P.; SIQUEIRA, W.J.; TEÓFILO Sobrinho,

J. The genetics of tolerance to tristeza disease in citrus rootstocks. Genetics and
Molecular Biology, v.27, n.2, 199-206, 2004.

BOTEON, M.; NEVES, E.M. Citricultura Brasileira: aspectos econômicos. In:

69
MATTOS Jr. D.; NEGRI, J.D; PIO, R.M; POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas:
Instituto Agronômico e Fundag, 2005.

BOUHIDA, M.; ZEMZAMI, M.; CEVIK, B.; FEBRES, V.J.; LEE, R.F., et al.
Biological and molecular characterization of isolates of citrus tristeza virus from
Morocco. In: CONFERENCE OF INTERNATIONAL ORGANIZATION OF
CITRUS VIROLOGISTS, 14th, Campinas. Proceedings... Campinas: International
Organization of Citrus Virologists, p.33, 1998.

BROADBENT, P.; BRLANSKY, R.H.; INDOSTO, J. Biological characterization

of Australian Isolates of citrus tristeza virus and separation of subisolates by single
aphid transmissions. Plant Disease, v.80, p.329-333, 1996.

BRONDANI, R.P.V.; WILLIAMS, E.R.; BRONDANI, C.; GRATTAPAGLIA, D.

A. Microsatellite-based consensus linkage map for species of Eucalyptus and a
novel set of 230 microsatellite markers for the genus. BMC Plant Biology, v.6,
n.20, p.1471-2229 2006.

CAI, Q.; GUY, C.L.; MOORE, G.A. Extension of the linkage map in Citrus using
random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and RFLP mapping of cold-
acclimation-responsive loci. Theoretical and Applied Genetics, v.89, p.606-614,
1994.

CAMERON. J.W.; FROST, H.B. Genetics, breeding and nucelar embryony. In:
REUTHER, W.; BATCHELOR, L.D.; WEBBER, H.J. (eds.). The citrus industry.
Riverside: University of California, v.2, p.325-370, 1968.

CAMPOS, A.S. Distribuição de Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni

em citros, no Estado de São Paulo, e estudo morfométrico comparativo de
populações anfimíticas de Pratylenchus spp. 2002. 65p. Dissertação (Mestrado em
Agronomia, Área de Concentração em Entomologia Agrícola) - Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Jaboticabal.

CANTERI, M. G., ALTHAUS, R. A., VIRGENS-Filho, J. S., GIGLIOTI, E. A.,

GODOY, C. V. SASM - Agri : Sistema para análise e separação de médias em
experimentos agrícolas pelos métodos Scoft - Knott, Tukey e Duncan. Revista
Brasileira de Agrocomputação, v.1, n.2, p.18-24. 2001.

CARLOS, E.F.; TAKITA, M.A.; AMARAL, A.M.; REIS, M.S.; MACHADO,

M.A. in silico Display of transcriptional factors transcribed in diseased citrus
plants. In: The International Conference on the Status of Plant & Animal Genome
Research, San Diego, CA, Abstract, p.114, 2007.

CARNEIRO, M.S.; VIEIRA, M.L.C. Mapas genéticos em plantas. Bragantia,

v.61, p.89-100, 2002.

70
CHEN, C.; ZHOU, P.; CHOL, Y.A. HUANG. S.; GMITTER Jr., F.G. Mining and
characterizing microsatellites from citrus ESTs. Theoretical and Applied
Genetics, v.112, n.7, 2006a.

CHEN, J.; HU, J.; VICK, B.A.; JAN, C.C. Molecular mapping of a nuclear male-
sterility gene in sunflower (Helianthus annuus L.) using TRAP and SSR markers.
Theoretical and Applied Genetics, v.113, p.122-127, 2006b.

CHENG, F.S.; ROOSE, M.L. Origin and inheritance of dwarfing by the citrus
rootstock Poncirus trifoliata Flying Dragon. Journal of the American Society for
Horticultural Science, v. 120, p.286-291, 1995.

CHURCHILL, G.A.; DODGE, R.W. Empirical threshold values for quantitative

values for quantitative trait mapping. Genetics, v.138, p.963-971, 1994.

CLARK, M.F., LISTER, R.M.; BAR-JOSEPH, M. ELISA Techniques. Methods

in Enzymology, v.118, p. 742−766, 1986.

COLETTA-Filho, H.D.; TARGON, M.L.P.N.; TAKITA, M.A.; DE NEGRI, J.D.;

POMPEU Jr., J.; MACHADO, M.A.; AMARAL, A.; MÜLLER, G.W. First
reporto of the causal agent of Huanglongbing (“Candidatus Liberibacter
Asiaticus”) in Brazil. Plant Disease, v.88, p.1382, 2004.

COSTA, A.S.; GRANT, T.J.; MOREIRA, S. Investigações sobre a tristeza dos

Citrus II. Conceitos e dados sobre a reação das plantas cítricas à tristeza.
Bragantia, v.9, p.59-80, 1949.

COSTA, A.S.; GRANT, T.J.; MOREIRA, S. Behavior of various citrus rootstock-

scion combinations following inoculation with mild and severe strains of tristeza
virus. Proceedings of the Florida State Horticultural Society, v.67, p.26-30,
1954.

CRISTOFANI, M. Mapas de ligação de Citrus sunki Hort. Ex. Tan. e Poncirus

trifoliata (L.) Raf. cv. Rubidoux e localização do gene de resistência ao vírus da
tristeza. 1997. 140p. Tese (Doutorado em Agronomia). Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz, USP, Piracicaba.

CRISTOFANI, M.; MACHADO , M.A.; GRATTAPAGLIA, D. Genetic linkage

maps of Citrus sunki Hort. ex. Tan. and Poncirus trifoliata (L.) Raf. and mapping
of Citrus tristeza virus resistance gene. Euphytica, v.109, p.25-32, 1999.

CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A.; NOVELLI, V.M; SOUZA, A.A.;

TARGON, M.L.P.N. Construction of linkage maps of Poncirus trifoliata and
Citrus sunki based on microssatellite markers. Proceedings. Acireale:
International Society of Citriculture, v.1, p.175-178, 2000.

71
CRISTOFANI-YALY, M.; BERGER, I.J.; TARGON, M.L.P.N.; TAKITA, M.A.;
DORTA, S.O., et al. (2006) Differential expression of genes identified from
Poncirus trifoliata tissue inoculated with CTV through ESTs analysis using an in
silico hybridization (in press).

DANCHIN A, MEDIGUE C, GASCUEL O, SOLDANO H, HENAUT A. From

data banks to data bases. Research in Microbiology, v.142, n.7-8, p.913-916,
1991.

DENG, Z.; HUANG, S.; XIAO, S.; GMITTER, F.G. Development and
characterization of SCAR markers linked to the Citrus tristeza virus resistance gene
from Poncirus trifoliata. Genome, v.40, p.697-704, 1997.

DENG, Z.; HUANG, S.; LING, P.; YU, C.; TAO, Q. Fine genetic mapping and
BAC contig development for the Citrus tristeza virus resistance gene locus in
Poncirus trifoliata (Raf.). Molecular Genetics and Genomics, v.265, p.739-747,
2001.

DURHAM, L.; GMITTER, M. Linkage of restriction fragment length

polymorphisms and isozymes in Citrus. Theoretical and Applied Genetics, v.84,
p.39-48, 1992.

FALCÃO, C.L.; PAPPAS, M.C.R.; LOURENÇO, R.T.; ALENCAR, M.M.;

BATISTA, A.R.S.; PAPPAS Jr., G.J.; GRATTAPAGLIA, D. Desenvolvimento e
mapeamento de microssatélites derivados de ESTs em Eucalyptus 2004. Circular
Técnica EMBRAPA, Brasília, n.32, 2004.

FANG, D.; ROOSE, M.L. Identification of RAPD markers linked to citrus tristeza
virus resistance and fruit acidity in citrus. In: Fourth Int Plant Genome Conf. San
Diego, CA., p.226, 1996.

FANG, D.Q.; FEDERICI, C.T.; ROOSE, M.L. A high-resolution map of Citrus

tristeza virus resistance gene region in Poncirus trifoliata (L.) Raf. Genetics,
v.150, p.883-889, 1998.

FANG, D.Q.; ROOSE, M.L. A novel gene conferring citrus tristeza virus resistance
in Citrus maxima (Burm.) Merrill. HortScience, Alexandria, v.34, n.2, p.334-335,
1999.

FERREIRA, D.F. Eficiência de métodos de mapeamento de locos quantitativos

(QTLs) e da seleção assistida por marcadores moleculares. 1995. 209p. Piracicaba.
Tese (Doutorado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP,
Piracicaba.

FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores

moleculares em análise genética. Brasília: Embrapa/Cenargen, 1996. 220p.

72
FEUGUSON, J; YOUNG, M.; HALVORSON, J. The propagation of citrus
rootstocks by stem cuttings. Proceedings of the Florida State Horticultural
Society, v.98, p.24-39, 1986.

FEUILLET, C.; KELLER, B. Comparative Genomics in the grass family:

molecular characterization of grass genome structure and evolution. Annuals of
Botany, v.89, p.3-10, 2002.

FIGUEIREDO, J.O.; STUCHI, E.S.; LARANJEIRA, F.F.; DONADIO, L.C.;

FILO-sobrinho, J.T; SEMPIONATO, Q.R.; MÜLLER, G.W. Porta-enxertos para
lima ácida Tahiti em duas regiões do Estado de São Paulo. Laranja, v.22, p.203-
213, 2001.

FREITAS-ASTÚA, J.; LOCALI, E.C.; ANTONIOLI-LUIZON, R.; ASTÚA-

MONGE, G.; TARGON, M.L.P.N., et al. RT-PCR for the simultaneous detection
of citrus tristeza and leprosis viruses. Fitopatologia Brasileira, v.30, n.6, p.669,
2005.

FROST, H.B. The chromosomes of Citrus. Journal of the Washington Academy

of Sciences, v.15, p.1-3, 1925.

FURR, J.R.; REECE, P.C. Identification of hybrid and nucellar citrus seedlings by
a modification of the rootstock color test. Proceedings of the American Society
for Horticultural Science, v.48, p.141-146, 1946.

FURR, J.R.; CARPENTEER, J.B. Program for breeding citrus rootstocks tolerant
to Phytophthora root rot. Proceedings of the Florida State Horticultural Society,
v.18, p.18-23, 1961.

GARCIA, M.R.; ASINS, M.J.; FORNER, J.; CARBONELL, E.A. Genetic analysis
of apomixis in Citrus and Poncirus by molecular markers. Theoretical and
Applied Genetics, v.99, p.511-518, 1999.

GARCIA, M.R.; ASÍNS, M.J.; CARBONELL, E.A. QTL analysis of yield and
seed number in Citrus. Theoretical and Applied Genetics, v.101, p.439-487,
2000.

GARNSEY, S.M.; BARRET, H.C.; HUTCHISON, O.J. Identification of citrus

tristeza virus resistance in citrus relatives and its potencial applications.
Phytophylactica. Pretoria, v.19, p.187-191, 1987.

GARNSEY, S.M.; SU, H.J.; TSAI, M.C. Differential susceptibility of pummelho

and Swingle citrumelo to isolates of citrus tristeza virus. In: DA GRAÇA, J.V.;
MORENO, P.; YOKOMI, R.K (eds). Proc 13th Conf. Citrus Int Virologists, IOCV.
University of California Press, Riverside, C.A. p.138-146, 1997.

73
GIMINES, N.F.; BASSANEZI, R.B. Doença de causa desconhecida afeta pomares
cítricos no norte de São Paulo e sul do Triângulo Mineiro. Summa
Phytopathology, v.27, p.93, 2001.

GMITTER, F.G. Applications of genome mapping to citrus cultivar development.

In: COTTIN, R. (ed.) Symp. Mediterraneen Mandarines, INRA, CIRAD, San
Giuliano, France, p.1, 1995.

GMITTER Jr. F.G.; XIA, S.Y.; HUANG, S.; HU, X.L.; GARNSEY, S.M.; et al. A
localized linkage map of the citrus tristeza virus resistance gene region.
Theoretical and Appied Genetics, v.92, p.688-695, 1996.

GRAÇA, J.; BARROS, J.C.S.M.; CELESTINO, R.C.A; VASCONCELLOS, H.Q.

Porta-enxertos para laranja natal no Norte Fluminense. Laranja, v.22, p.449-456,
2001.

GRANT, T.J.; MOREIRA, S.; SALIBE, A.A. Citrus variety reaction to tristeza
virus in Brazil when used in various rootstock and scion combinations. Plant
disease Reporter, v.45, p.416-421, 1961.

GRATTAPAGLIA, D.; SEDEROFF, R. Genetic linkage maps of Eucalyptus

grandis and Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross mapping strategy and
RAPD markers. Genetics, v.137, p.170-177, 1994.

GUERRA, M. Cytogenetics of rutaceae II. Nuclear DNA content. Caryologia,

v.73, p.219-226, 1984.

GUERRA, M.S. Cytogenetics of Rutaceae. V. High chromosomal variability in

citrus species revealed by CMA/DAPI staining. Heredity, v.71, p.234-241, 1993.

GUERRA, M.; PEDROSA, A.; BARROS e SILVA, A.; CORNÉLIO, M.T.M.;

SANTOS, K. G. B.; SOARES-Filho, W.; et al. Chromosome number and
secondary constriction variation in 51 accessions of a citrus germoplasm bank.
Brazilian Journal of Genetics, v.20, p.489-496, 1997.

GUERRA, M.; SANTOS, K.G.; SILVA, A.E.B.; EHRENDORFER, F.; et al.

Heterochromatin banding patterns in Rutaceae-Aurantioideae - a case of parallel
chromosomal evolution. American Journal of Botany, v.87, p.735-747, 2000.

HAMMONDH-KOSACK, K.E.; JONES, J.D.G. Plant disease resitance genes.

Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.48, p.575-
607, 1997.

HEARN, C.L; GARNSEY, M.G; BARRETT, H.C. Transmission of citrus tristeza

virus resistance from citrus breeding line US119. HortScience, v.28, n.5, p.483,

74
1993.

HODGSON, R.W. Horticultural varieties of citrus. In: REUTHER, W.;

BATCHELOR, L.D.; WEBBER, H.J. (eds). The Citrus industry. VI Berkeley:
University of California Press, California, Division of Agricultural Sciences, v.1,
p.431-592, 1967.

HU, J.; VICK, B.A. Target Region Amplification Polymorphism: A Novel Marker
Technique for Plant Genotyping. Plant Molecular Biology, v.21, p.289-294, 2003.

HU, J.; SEILER, G.J, JAN, C.C.; VICK, B.A. Assessing genetic variablility among
sixteen perennial Helianthus species using PCR-based TRAP markers.
Proceedings. 25th Sunflower Research Workshop, p.16-17, 2003.

HUTCHISON, D.J. Swingle citrumelo - a promising rootstock hybrid.

Proceedings of the Florida State Horticultural Society, v.87, p.89-91, 1974.

HUTCHISON, D.J. Rootstocks development screening and selection for disease

tolerance and horticultural characteristics. Fruit Varieties Journal, v.39, p.21-25,
1985.

IKUTA, H.; NODA, N.; EBIE, Y.; HIRATA, A.; TSUNEDA, S.; MATSUMURA,
M.; INAMORI, Y. The rapid quantification and detection of nitrifying bacteria by
using monoclonal antibody method. Water Science and Technology, v.42, p.1-7,
2000.

IEA – INSTITUTO DE ECONOMIA AGRÍCOLA,

http://www.iea.sp.gov.br/out/banco/menu.php, (26 abril 2007).

JANSEN, R.C. Controlling the type I and type II errors in mapping quantitative
trait loci. Genetics, v.138, p.871-881, 1994.

JARREL, D.C.; ROOSE, M.L.; TRAUGH, S.N.; KUPPER, R.S. A genetic map of
citrus based on the segregation of isozymes and RFLPs in an intergeneric cross.
Theoretical and Applied Genetics, v.84, p.49-56, 1992.

JONES, C.L.; EDWARDS, K.J.; CASTIGLIONE, S.; WINFIELD, M.O.; SALA,

F.; VAN DE WIL, C., et al. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR
markers in plants by a network of European laboratories. Molecular Breeding, v.3,
p.381-390, 1997.
KENDZIORSKI, C. M.; CHEN, M.; YUAN, M.; LAN, H.; ATTIE, A.D.
Statistical Methods for Expression Quantitative Trait Loci (eQTL) Mapping.
Biometrics, v. 62, n.1, p.19–27, 2006.

75
KIJAS, J.M.H; THOMAS, M. R.; FOWLER, J. C. S.; ROOSE, M. L. Integration
of trinucleotide microsatellites into a linkage map of Citrus. Theoretical and
Applied Genetics, v.94, p.701-706, 1997.

KIRST, M.; MYBURG, A.A.; LEON, J.P.G; SCOTT, J.; SEDEROFF, R.

Coordinated Genetic Regulation of Growth and Lignin Revealed by Quantitative
Trait Locus Analysis of cDNA Microarray Data in an Interspecific Backcross of
Eucalyptus. Plant Physiology, v.135, p.2368-2378, 2004.

KONING, D.J.; CARLBORG, O., HALEY, C.S. The genetic dissection of immune
response using gene-expression studies and genome mapping. Veterinary
Immunology and Immunopathology, v.105, n.3-4, p.343-352, 2005.

KRIVANEK, A.F.; RIAZ, S.; WALKER, M.A. Identification and molecular

mapping of PdR1, a primary resistance gene to Pierce´s disease in Vitis.
Theoretical and Applied Genetics, v.112, n.6, p.1125-1131, 2006.

KUHN, O.J., Indução de resistência em feijoeiro (Phaseolus vulgaris) por

acibenzolar-S-metil e Bacillus cereus: aspectos fisiológicos, bioquímicos e
parâmetros de crescimento e produção. 2007. Tese (Doutorado em Fitopatologia).
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP, Piracicaba

LANDER, E.S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BARLOW, A.; DALY, M.J.; et
al. Mapmaker: an interactive computer package for constructing primary genetic
linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, v.1, p.174-181,
1987.

LANDER, E. S.; BOTSTEIN, D. Mapping Mendelian factors underlying

quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, v.121, p.185-199, 1989.

LESPINASSE, D.; RODIER-GOUD, M.; GRIVET, L.; LECONTE, A.;

LEGNATE, H.; SEGUIN, M. A saturated genetic linkage map of rubber tree
(Hevea spp.) based on RFLP, AFLP, microsatellite, and isozyme markers.
Theoretical Applied Genetics, v.100, p.127-138, 2000.

LI, G.; QUIROS, C.F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new

marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and
gene tagging in Brassica. Theoretical Applied Genetics, v.103, p.455-461, 2001.

LI, Y., KOROL, A.B.; FAHIMA, T.; BEILES, A.; NEVO, E. Microsatellites:
genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review.
Molecular Ecology, v.11, p.2453-2465, 2002.
LI, Y.; KOROL, A.B.; FAHIMA, T.; NEVO, E. Microsatellites within genes:
structure, function, and evolution. Molecular Biology and Evolution, v.21, n.6,
p.991-1007, 2004.

76
LING, P.; DUNCAN, L.W.; DENG, Z.; DUNN, D.; HU, X.; HUANG, S.;
GMITTER Jr., F.G. Inheritance of citrus nematode resistance and its linkage with
molecular markers. Theoretical and Applied Genetics, v.100, p.1010-1017, 2000.

LIOU, P.C. A molecular study of the citrus genome through restriction fragment
length polymorphism and isozyme mapping. 1990. 143p. Dissertation (Ph.D.) -
University of Florida, UF, Gainesville.

LITT, M.; LUTTY, J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro

amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. The
American Journal of Human Genetics, v. 44, p.398-401, 1989.

LIU, B.H. Statistical genomics: linkage, mapping and QTL analysis. Cleveland:
Cleveland: CRC Press, 1998. 611p.

LIU, D.H.; KNAPP, S.J. Gmendel 2.0: a software for gene mapping. Origon Sate
University, 1992.

LIU, Z.; ANDERSON J.A.; HU, J.; FRIESEN, T.L.; RASMUSSEN, J.B.; FARIS,
J.D. A wheat intervarietal linkage map based on microsatellite and target region
amplified polymorphism markers and its utility for detecting quantitative trait loci.
Theoretical and Applied Genetics, v.111, p.782–794, 2005.

LURO, F.; LAIGRET, F.; LORIEUX, M.; OLLITRAULT, P. et al. Citrus genome
mapping with molecular markers: two maps obtained by segregation analysis of
progeny of one intergeneric cross. Proceedings. Acireale: International Society
of Citriculture, v.2, p.862-866, 1996.

MACHADO M.A.; COLETTA-Filho, H.D.; TARGON, M.L.N.; POMPEU Jr. J.

(1996). Genetic relationship of Mediterranean mandarins (Citrus deliciosa Tenore)
using RAPD markers. Euphytica, v.92, p.321-326, 1996.

MACHADO, M.A.; STACH-MACHADO, D.R.; TARGON, M.L.P.N; C.R.

BAPTISTA, C.R; MÜLLER, G.W. Diagnóstico do vírus da tristeza com diferentes
anticorpos monoclonais. Fitopatologia Brasileira, v.22, n.2, p.191-194, 1997.

MACHADO, M.A.; CRISTOFANI, M.; AMARAL, A.M.; OLIVEIRA, A.C.

Genética, melhoramento e biotecnologia de citros. In: MATTOS Jr. D.; NEGRI,
J.D; PIO, R.M; POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas: Instituto Agronômico e
Fundag, 2005.

MAUAD, M.; FELTRAN, J.C.; CORRÊA, J.C.; DAINESE, R.C.; ONO, E.O.;
RODRIGUES, J.D. Rooting of azálea cuttings treats with NAA concentrations and
differents substrates. Ciência e Agrotecnologia, v.28, n.4, p.771-777, 2004.

77
MELETTI, L.M.M. Propagação de frutíferas tropicais. Guaíba. Agropecuária,
2000. 239p.

MENZIES, J.G.; EHRET, D.L.; GLASS, A.D.M.; SAMUELS, A.L. The influence
of silicon on cytological interactions between Sphaerotheca fuliginea and Cucumis
sativus. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.39, p.403-414, 1991.

MESTRE, P.F.; ASINS, M.J; PINA, J.A.; CARBONELL, E.A.; NAVARRO, L.

Molecular markers flanking citrus tristeza virus resistance gene from Poncirus
trifoliate (L.) Raf. Theoretical Applied Genetics, v.94, p.458-464, 1997a.

MESTRE, P.F.; ASINS M.J.,; CARBONELL, E.A., NAVARRO, L. New gene(s)

involved in the resistance of Poncirus trifoliate (L.) Raf. to citrus tristeza virus.
Theoretical and Applied Genetics, v.95, p.691-695, 1997b.

MESTRE P.F.; ASINS M.J.; PINA J.A.; NAVARRO L. Efficient search for new
resistant genotypes to the citrus tristeza closterovirus in the orange subfamily
Aurantioideae. Theoretical and Applied Genetics, v.95, p.1282-1288, 1997c.

MEYER, U.M.; SPOTTS, R.A.; DEWEY, F.M. Detection and quantification of

Botrytis cinerea by ELISA in pear stems during cold storage. Plant Disease, v.84,
p.1099-1103, 2000.

MICHELMORE, R.W.; PARAN, I.; KESSELI, R.V. Identification of markers

linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to
detect markers in specific genomic regions by using segregating populations.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v.88, p.9828-9832, 1991.

MIKLAS, N.P; HU, J.; GRUNWALD, N.J; LARSEN, K.N. Potential Application
of TRAP (Targeted Region Amplified Polymorphism) Markers for Mapping and
Tagging Disease Resistance Traits in Common Bean. Crop Science, v.46, p.910–
916, 2006.

MOREIRA, S.M; MOREIRA, S. História da citricultura no Brasil. In:

RODRIGUEZ, O.; VIÉGAS, F.; POMPEU, JR, J.; AMARO, A.A. (eds).
Citricultura Brasileira, Fundação Cargill, p.1-21, 1991.

MÜLLER, G.W. A tristeza dos citros. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v.2,

p.245-263, 1976.

MÜLLER, G.W; GARNSEY, S.M. Susceptibility of citrus varieties, species, citrus

relatives, and non-rutaceous plants to slash cut mechanical inoculation with citrus
tristeza virus (CTV). In: Conference of the International Organization of citrus
virologists, Riverside. Proceedings… Riverside: IOCV, p.33-40, 1984.

78
MÜLLER, G.W.; COSTA, A.S.; POMPEU JÚNIOR, J. Importância do porta-
enxerto em relação à tristeza e outras moléstias dos citros no Brasil. In: Seminário
Internacional de Citros, Bebedouro. Anais... Jaboticabal: Funep, p.223-231, 1990.

MÜLLER. G.W.; NEGRI, J.D.; AGUILAR-VILDOSO, C.I.; MATTOS JR. D.;

POMPEU JR. J., et al. QUICK BLIGHT of sweet orange: a new citrus disease in
Brazil. In: Programme & Abstracts of XV Conference of the International
Organization of Citrus Virologists, p.100, 2001.
MURRAY, H.C; THOMPSON, W. F. Rapid isolation of high molecular weight
DNA. Nucleic Acids Research, v.8, p.4321-4325, 1980.

NEVES, M.F.; LOPES F.F. O comportamento do consumidor de laranja in natura

e suco. In: NEVES, M.F.; LOPES F.F. (eds). Estratégias para a laranja no Brasil.
Editora Atlas, p.170-185, 2005.

NIENHUIS, J.; HELENTJARIS, T.; SLOCUM, M.; RUGGERO, B.; SAHAEFER,

A. Restriction fragment length polymorphism analysis of loci associated with
insect resistance in tomato. Crop Science, v.27, p.797-803, 1987.

NORBERTO, P.M.; CHALFUN, N.N.J.; PASQUAL, M.; VEIGA, R.D.;

PEREIRA, G.E.; MOTA, J.H. Efeito da época de estaquia e do AIB no
enraizamento de estacas de figueira (Ficus carica L.). Ciência e Agrotecnologia,
Lavras, v.25, n.3, p.533-541, 2001.

NOVELLI, V.M.; FREITAS-ASTÚA, J.; ASTÚA-MONGE, G.; CARVALHO,

S.A.; LOCALI, E.C., et al. Detection of CLO (Cytophaga-like organism)
endosymbionts in adults and eggs of citrus leprosis vectors. Summa
Phytopathologica, Botucatu, v.31, p.65, 2005.

NOVELLI, V.M.; CRISTOFANI, M.; SOUZA, A.A.; MACHADO, M.A.

Development and characterization of polymorphic microsatellite markers for the
sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck). Genetics and Molecular Biology, v.29,
n.1, p.90-96, 2006.

O’BANNON, J.H.; FORD, H.W. Resistance in citrus rootstocks to Radopholus

similis and Tylenchulus semipenetrans (Nematoda). Proceedings of the
International Society of Citriculture, v.2, p.344-549, 1978.

OLIVEIRA, A.C.; NOVELLI, V.M.; GARCIA, A.N.; CRISTOFANI, M.;

MACHADO, M.A. Identification of citrus hybrids through the combination of a
leaf apex morphology and SSR markers. Euphytica, v.128, p.397-403, 2002a.

OLIVEIRA, A.C.; GARCIA, A.N.; NOVELLI, V.M.; CRISTOFANI, M.;

MACHADO, M.A. Identification of sexual and nucellar citrus seedlings through
single and duplex PCR of simple sequence repeat loci. Proceedings of the
International Society of Citriculture , v.1, p.138-141, 2003.

79
OLIVEIRA, R.P.; AGUILAR-VILDOSO, C.I.; CRISTOFANI, M.; MACHADO,
M.A. Skewed RAPD markers in linkage maps of Citrus. Genetics and Molecular
Biology, v.27, n.3, p.437-441, 2004a.

OLIVEIRA, R.P.; CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A. Genetic linkage maps of

‘Pêra’ sweet orange and ‘Cravo’ mandarin with RAPD markers. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v.39, n.2, p.159-165, 2004b.

OLIVEIRA, R.P.; CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A. Integrated genetic map

of citrus base on RAPD markers. Fruits, v.60, p.187-193, 2005.

PALMIERI, D.A.; NOVELLI, V.M.; BASTIANEL, M.; CRISTOFANI-YALY, M.;

ASTÚA-MONGE, G., et al. (2006). Frequency and distribution of microsatellites
from ESTs of citrus (in press).

PASQUAL, M.; CHALFUN, N.N.J.; RAMOS, J.D.; VALE, M.R.; REZENDE e

SILVA, C.R. Fruticultura Comercial: propagação de plantas frutíferas. Lavras:
UFLA/FAEPE, 2001.137p.

PETERS, J.L.; CNOPS, G.; NEYT, P.; ZETHOF, J.; CORNELIS, K.; VAN
LIJSEBETTENS, M.V.; GERATS, T. An AFLP-based genome-vide mapping
strategy. Theoretical Applied Genetics, v.108, p.321-327, 2004.

PIERINGER, A.P.; EDWARDS, G.J. Identification of nucellar and zygotic citrus

seedlings by infrared spectroscopy. Proceedings of the American Society for
Horticultural Science, v.86, p.226-234, 1967.

PIO, R.; ARAÚJO, J.P.C. de; SCARPARE-Filho, J.A.; MOURÃO-Filho, F. de

A.A.; ALVARENGA, A.A.; ABRAHÃO, E. Potencial de propagação de cultivares
de marmeleiro por estaquis. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.26,
n.2, p.287-289, 2004.

PIO, R.; RAMOS, J.D.; CHALFUN, N.N.J.; GONTIJO, T.C.A.; CARRIJO, E.P.;
MENDONÇA, V.; ALVARENGA. A.A.; ABRAHÃO, E. Rooting of quince
‘Portugal’ and ‘Japonês’ cuttings in different ambient and positions in the
recipients. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.29, n.5, p.968-973, 2005.

PIO, R.; RAMOS, J.D.; GONTIJO, T.C.A.; CARRIJO, E.P.; COELHO, J.H.C.;
ALVARES, B.F.; MENDONÇA, V. Rooting of cuttings of the rootstocks of citrus
‘Fly Dragon’ and ‘Trifoliate’. Revista Brasileira de Agrociência, v.8, n.3, p.195-
198, 2002.

POMPEU, Jr., J. Porta-enxertos. In: MATTOS Jr. D.; NEGRI, J.D; PIO, R.M;
POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas: Instituto Agronômico e Fundag, 2005.

80
POMPEU, Jr., J.; BLUMER, S. Produção de laranjeiras Valência enxertadas em
seleções de citrumelo. In: SEM. INT. CITROS: Melhoramento, Bebedouro: [s.n.],
p.127, 2002b.

POMPEU, Jr., J. Porta-enxertos. In: MATTOS Jr. D.; NEGRI, J.D; PIO, R.M;
POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas: Instituto Agronômico e Fundag, 2005.

PRATI, P.; MOURÃO-Filho, F.A.A.; DIAS, C.T.; SCARPARE-Filho, J.A.

Estaquia semi-lenhosa: um método rápido e alternativo para aprodução de mudas
de lima ácida ‘Tahiti’. Scientia Agrícola, v.56, n.1, p.185-190, 1999.

QUEIROZ-VOLTAN, R.B; BLUMER, S. Morfologia dos citros. In: MATTOS-Jr.

D.; NEGRI, J.D; PIO, R.M; POMPEU Jr. J. (eds). Citros. Campinas: Instituto
Agronômico e Fundag, 2005.

QURESHI, S.N.; SAHA, S.; KANTETY, R.V.; JENKINS, J.N. EST-SSR: A new
Class of genetic markers in cotton. The Journal of Cotton Science, v.8, p.112-
123, 2004.

RAKESH-KUMAR, R.; GILL, D.S.; KAUSHIK, R.A. Effect of indole-butyric

acid, p-hydroxybenzoic acid and season on the propagation of lemon cv. Baramasi
from cuttings. Haryana Journal of Horticultural Science, v. 24, p.13-18, 1995.

RAMOS, R.L.B.; TOVAR, F.J.; JUNQUEIRA, R.M. et al. Sugarcane expressed

sequences tags (ESTs) enconding enzymes involved in lignin biosynthesis
pathways. Genetics and Molecular Biology, v.24, p.235-241, 2001.

RESENDE, M.D.V. Delineamento de experimentos de seleção para a maximização

da acurácia seletiva e progresso genético. Revista Árbore, v.19, n.4, p.479-500,
1995.

RESENDE, M.D.V. Genética Biométrica e Estatística no Melhoramento de Plantas

Perenes, Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2002, 975p.

RITTER, E.; GEBHARDT, C.; SALAMINI, F. Estimation of recombination

frequencies and construction of RFLP linkage maps in plants from crosses between
heterozygous parents. Genetics, v.125, p.645-654, 1990

ROCHA, S.C.; QUISEN, R.C.; QUEIROZ, J.A.L.; ZUFFELLATO-RIBAS, K.C.

Vegetative propagation of “espirradeira” by cuttings. Scientia Agraria, v.5, n.1-2,
p.73-77, 2004.

ROLFS, P.H.; ROLFS, C. A muda de citros. Secretaria da Agricultura do estado de

Minas Gerais, 1931. 126p.

81
ROMAN, M.P.; CAMBRA, M..; JUÁREZ, J.; MORENO, P.; DURAN-VILA, N.
Sudden Death of Citrus in Brazil: A Graft-Transmissible Bud Union Disease. Plant
Disease, v.88, p.453-467, 2004.

ROOSE, M.L.; JARRELL, D.C.; KUPPER, R.S. Genetic mapping in a Citrus x

Poncirus F2 population. Proceedings of the International Society of Citriculture,
v.7, p.210-213, 1992.

ROOSE, M.L.; CHENG, T.; KUPPER, F. Mapping the Citrus genome. Acta
Horticulturae, v.535, p.25-32, 2000.

ROOSE, M.L. Identification and use of genetic resistance and tolerance to new
diseases. Proceedings of the International Society of Citriculture, v.2, p.952-
954, 2003.

ROSSETTI, V.; GARNIER, M.; BERETTA, M.J.G.; TEIXEIRA, A.R.R.;

QUAGGIO, J.A.; BATTAGLIA, O.C.; GOMES, M.P.; DE NEGRI, J.D.; BOVÉ,
J.M. Resultados preliminares de estudos sobre uma nova anormalidade dos citros
observada nos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Congresso Paulista de
fitopatologia, São Paulo, Summa Phytopathologica, v.16, p.1, 1990.

ROSTOKS, N.; SCHMIERER, D.; KUDRNA, D.; KLEINHOFS, A. Barley

putative hypersensitive induced reaction genes: genetic mapping, sequence
analyses and differential expression in disease lesion mimic mutants. Theoretical
and Applied Genetics, v.107, p.1094-1101, 2003.

RUBIO, L.; AYLLON, M.A.; KONG, P.; FERNÁNDEZ, A.; POLEK, M.;
GUERRI, J.; MORENO, P.; FALK, B.W. Genetic variation of Citrus tristeza vírus
isolates from California and Spain: Evidence for mixed infections and
recombination. Journal of Virology, Washington, v.75, n.17, p.8054-8062, 2001.

RUIZ, C.; ASINS, M.J. Comparison between Poncirus and Citrus genetic linkage
maps. Theoretical and Applied Genetics, v.106, p.826-836, 2003.

SABBAH, S.M.; GROSSER, J.W.; CHANDLER, J.L.; LOUZADA, E.S. The

effect of growth regulators on the rooting of stems of citrus, related genera and
intergeneric somatic hybrids. Proceedings of the Florida State Horticultural
Society, v. 104, p.487-491, 1991.

SANKAR, A.A.; MOORE G.A. Evaluation of inter-simple sequence repeat

analysis for mapping in Citrus and extension of the linkage map. Theoretical and
Applied Genetics, v.102, p.206-214, 2001.

SCHWARZ, G.; HERZ, M.; HUANG, X.Q.; MICHALEK, W.; JAHOOR, A.;
WENZEL, G.; MOHLER, V. Theoretical and Applied Genetics, v. 100, p.545-

82
551, 2000.

SCOTT, A.J.; KNOTT, M. A cluster analysis method for grouping means in the
analysis of variance. Biometrics, Washington, v. 30, n. 2, p. 507-512, 1974.

SCOTT, K.D. Microsatellite derived from ESTs, and their comparison with those
derived by other methods. In: HENRY, R.J. (ed). Plant genotyping: the DNA
fingerprinting of plants. CAB1 Publishing, Oxon, UK, p. 225-237, 2001.

SHAZLY, S.M.; SABROUT, M.B.; KASSEM, H.A. Root formation on the stem
cuttings of Eureka lemon and El-Soukari loquat as affected by root-promoting
chemicals and mist. Alexandria Journal of Agricultural Research, vol. 39,
p.559-569, 1994.

SILVA, H.P. Genética da resistencia à Phaeosphaeria maydis em milho.

Jaboticabal, 2002. 105p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciencias Agrárias e
Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.

SIMONE, M.D.; RUSSO, M.P.; PULEO, G.; MARSAN, P.A.; LORENZONI, C.;
et al. Construction of genetic maps for Citrus aurantium and C. latipes based on
AFLP, RAPD and RFLP markers. Fruits, v.53, p.383-390, 1998.

SIVIERO, A. Avaliação de métodos de inoculação de Phytophthora parasitica e

mapeamento de QTLs de resistência em híbridos de Citrus sunki vs. Poncirus
trifoliata à gomose. 2001. 117p. Tese (Doutorado), Faculdade de Ciências
Agronômicas, Unesp, Botucatu.

SIVIERO, A.; CRISTOFANI, M.; BOAVA, L.P.; MACHADO, M.A. Mapeamento

de QTLs associados à produção de frutos e semente em híbridos de Citrus sunki vs.
Poncirus trifoliata. Revista Brasileira de Fruticultura, v.24, p.741-743, 2002.

SIVIERO, A.; CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A. QTL mapping associated

with rooting stem cuttings from Citrus sunki vs. Poncirus trifoliate hybrids. Crop
Breeding and Applied Biotechnology, v.3, n.1, p.83-88, 2003.

SIVIERO, A.; CRISTOFANI, M. FURTADO, E.L.; GARCIA, A.A.F.; COELHO,

A.S.G.; MACHADO, M.A. Identification of QTLs associated with citrus resistance
to Phytophthora gummosis. Journal of Applied Genetics, v.47, n.1, p.23-38,
2006.

STACH-MACHADO, D.R.; PERONI, L.A; DIAS, L.C.F.; CAPORRINO, M.C.;

MULLER, G.W.; et al. Characterization of monoclonal antibodies produced
against severe CTV isolates of ‘Capão Bonito’. In: Proceedings of 15th.
Conference of Internacional Organization of Citrus Virologists, p.165-171, 2002.

83
STAM, P. Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new
computer package: Joinmap. The Plant Journal, v.5, p.739-744, 1993.

STELL, R.G.D; TORRIE, J.H. Principles and procedures of statistics. A biometrical

approach. 2nd ed. McGraw-Hill Book Co., New York, 1980.

STURTEVANT, A.H. The linear arrangement of six sex-linked factors in

drosophila, as shown by their mode of association. Journal of Experimental
Zoology, v.14, n.1, p.43-59, 2005.

SUITER, K.A.; WENDEL, J.F.; CASE, J.S. Linkage-1: a PASCAL computer

program for the detection and analysis of genetic linkage. The Journal of
Heredity, v.74, n.3, p.203-204, 1983.

SWINGLE, W.T. The botany of Citrus and its relatives in the orange subfamily. In:
WEBBER, H.J.; BATCHELOR, L.D. (eds.). The citrus industry. Berkeley and Los
Angeles: University of California Press, v.1, p.128-474, 1943.

SWINGLE, W.T.; REECE, P.C. The botany of citrus and its wild relatives. In:
REUTHER, W.; WEBBER, H.J.; BATCHELOR, L.D. (eds.). The citrus industry.
Berkeley and Los Angeles: University of California, v.1, p.190-430, 1967.

TANAKA, T. Species problem in citrus - a critical study of wild and cultivated

units of Citrus, based upon field studies in their native homes. Tokyo: Japanese
Society for the Promotion of Science, 1954. 152p.

TANKSLEY, S.D.; GANAL, M.W.; PRINCE, J.P.; de VICENT, M.C.;

BONIERBALE, M.W., et al. High density molecular linkage maps of the tomato
and potato genomes. Genetics, v.132, p.1141-1160, 1992.

TANKSLEY, S.D. Mapping polygenes. Annual Review of Genetics, v.27, p.205-

233, 1993.

TARGON, M.L.P.N.; NIKOLAEVA, O.; MANJUNATH, K.L.; LEE, R.F.;

MÜLLER, G.W.; MACHADO, M.A. Coat protein gene of a brazilian isolate of the
citrus tristeza virus: cloning, expression in E. Coli and production of polyclonal
antiserum. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.22, n.1, p.99-102, 1997.

TARGON, M.L.P.N.; CRISTOFANI, M.; MACHADO, M.A.; MÜLLER, G.W.

Ocorrência do complexo capão bonito do citrus tristeza virus (CTV) em tangerina
‘Ponkan’ sobre limão ‘Cravo’ em plantio comercial em campanha (MG). Laranja,
Cordeirópolis, v.24, n.1, p.157-164, 2003.

TATUM, J.H.; BERRY, R.E.; HEARN, C.J. Characterization of Citrus cultivars

and separation of nucellar and zygotic seedlings by thin layer chromatography.

84
Proceedings of the Florida State Horticultural Society, v.87, p.75-81, 1974.

TEICH, A.H.; SPIEGEL-ROY, P. Differentiation between nucellar and zygotic

citrus seedlings by leaf shape. Theoretical and Applied Genetics, v.42, p.314-
315, 1972.

TORRES, A.M.; SOOST, R.K.; DIEDENHOFEN, U. Leaf isozymes as genetic

markers in citrus. America Journal of Botany, v.65, p.869-8881, 1978.

TOXOPEUS, H. Notes on the genetics of a few leaf characters in the genus Citrus.
Euphytica, v.11, p.19-25, 1962.

TOZLU, I.; GUY, C.L.; MOORE, G.A. Analysis of Na+ and Cl- accumulation
related traits in an intergeneric BC1 progeny of Citrus and Poncirus under saline
and non-saline environments. Genome, v.42, p.692-705, 1999a.

TOZLU, I.; GUY, C.L.; MOORE, G.A. QTL analysis of morphological traits in an
intergeneric BC1 progeny of Citrus and Poncirus under saline and non-saline
environments. Genome, v.42, p.1020-1029, 1999b.

VAN OOIJEN, J.W. Accuracy of mapping quantitative trait loci in autogamous

species. Theoretical and Applied Genetics, v. 84, p.803-811, 1992.

VAN OOIJEN J.W.; VOORRIPS, R.E. JoinMap version 3.0: software for the
calculation of genetic linkage maps (software). Wageningen. Plant Research
International, p.51, 2001.

VAN OOIJEN, J.W.; BOER, M.P.; JANSEN, R.C.; MALIEPAARD, C.

MapQTL™4.0: Software for the calculation of QTL positions on genetic maps
Wageningen. Plant Research International, 2002.

VENCOVSKY, R. Herança quantitative In: PATERNIANI E.; VIEGAS G.P.

(eds.) Melhoramento e Produção de Milho, Campinas, Fundação Cargill, p. 137-
214, 1987.

VOS, P.; HOGERS, R; BLEEKER, M.; REIJANS, M.; VAN DE LEE, T.;
HORNES, M.; FRIJTERS, A.; POT, J.; PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU,
M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, v.23,
p.4407-4414, 1995.

WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY,

S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, v.18, n.22, p.6531-6535, 1990.

85
WU, R.; LIN, M. Functional mapping – how to map and study the genetic
architecture of dynamic complex traits. Nature Reviews Genetics, v.7, n.3, p.229-
237, 2006.

WUTSCHER, H.K. Citrus rootstocks. Horticultural Reviews, v.1, p.237-269,

1979.

YANG, Z.N.; YE, X.R.; MOLINA, J.; ROOSE, M.L.; MIRKOV, T.E. Sequence
analysis of a 282-Kilobase region surrounding the citrus tristeza virus resistance
gene (Ctv) locus in Poncirus trifoliata Raf. Plant Physiology, v.131, p.482-492,
2003.

YOSHIDA, T.; SHICHIJO, T.; UENO, I.; KIHARA, T.; YAMADA, Y.; et al.
Survey for resistance of citrus cultivars and hybrid seedlings to citrus tristeza virus
(CTV). Bulletin of the Fruit Tree Research Station, Okitsu, v.10, p.51-68, 1983.

YOSHIDA, T. Inheritance of susceptibility to citrus tristeza virus in trifoliata

orange (Poncirus trifoliata). Bulletin of the Fruit Tree Research Station, Okitsu,
v.12, p.17-23, 1985.

YOSHIDA, T. Graft compatibility of Citrus with plants in the Aurantioideae and

their susceptibility to citrus tristeza virus. Plant Disease, Saint Paul, v.80, n.4,
p.414-417, 1996.

YOSHIMARU H.; OHBA, K.; TURUMI, K.; TOMARU, N.; MURAI, M.;
MUKAI, Y., et al. Detection of quantitative trait loci for juvenile growth, flower
bearing and rooting ability base don a linkage map of sugi (Cryptomeria japonica
D. Don). Theoretical and Applied Genetics, vol.97, p.45-50, 1998.

YOUNG, N.D. QTL mapping and quantitative disease resitance in plants. Annual
Review Phytopathology, v.34, p.479-501, 1996.

YU, J.K.; TANG, S.; SLABAUGH, M.B; HEESACKER, A.; COLE, G. Towards a
saturated molecular genetic linkage map for cultivated sunflower. Crop Science, v.
43, p.367-387, 2003.

ZENG, Z.B. Theoretical basis of separation of multiple linked gene effects on

mapping quantitative trait loci. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA, vol.90, p.10972-10976, 1993.

ZENG, Z.B. Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics, vol. 136,
p.1457-1468, 1994.

86
 7 ANEXOS

Anexo I. Distribuição de médias para as variáveis: número de estacas enraizadas

(mensuradas em 94 híbridos e seus genitores), absorbância em ELISA (CTV)
(mensurada em 85 híbridos e seus genitores) e índice de morfologia foliar
(mensurado em 90 híbridos e seus genitores)......................................................... 88

Anexo II. Análise de variância para CTV, enraizamento e morfologia foliar,

referentes à avaliação de uma população de híbridos de limão ‘Cravo’ e citrumelo
‘Swingle’ em experimento completamente casualizado em casa de vegetação
(Aplicativo: SASM-Agri, CANTERI et al., 2001)................................................. 89

Anexo III. Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregação

Mendeliana.............................................................................................................. 90

Anexo IV. Marcadores Microssatélites obtidos a partir de bibliotecas genômicas

(CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetição, seqüência dos
“primers”, tipo de segregação e teste de homogeneidade para segregação
Mendeliana.............................................................................................................. 91

Anexo V. Marcadores TRAPs, seqüência dos “primers”, tipo de segregação e teste

de homogeneidade para segregação Mendeliana................................................... 93

87
 35
*
30

Número de observações
25

20

15

10

0
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6

Número de estacas enraizadas

24

22

20

18
Número de observações

16

14

12

10

0
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Absorbância em ELISA (CTV)

35

30
Número de observações

25

20

15

10

0
1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.6 3.0 3.2 3.6 3.8 4.2
Índice de morfologia foliar

Anexo I. Distribuição de médias para as variáveis: número de estacas enraizadas

(mensuradas em 94 híbridos e seus genitores), absorbância em ELISA (CTV)
(mensurada em 85 híbridos e seus genitores) e índice de morfologia foliar
(mensurado em 90 híbridos e seus genitores).
*As variáveis associadas ao número de estacas enraizadas e leitura da absorbância em ELISA
(CTV) mostram distribuição em classes distintas, enquanto que o índice de morfologia foliar mostra
uma distribuição contínua, aproximadamente normal.

88
Anexo II. Análise de variância para CTV, enraizamento e morfologia foliar, referentes à
avaliação de uma população de híbridos de limão ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’ em experimento
inteiramente casualizado em casa de vegetação (Aplicativo: SASM-Agri, CANTERI et al.,
2001).

CTV Enraizamento Morfologia foliar

Fonte de
variação GL Q.M F Pr*>F GL Q.M F Pr*>F GL Q.M F Pr*>F

Genótipo 0.21
86 0.407 3,35 0,01348 95 2,99 0,014 91 0,433 6,205 0,015

Resíduo 0.072
174 0,121 384 84 0,069
CV(%)
72,81 29,9 10
N° de
3 5 3
repetições

Pr* > 5%

89
Anexo III. Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para
segregação Mendeliana.

Marcador Tipo de segregação* χ 2

C9-400 nnxnp 8.34042553191**

C9-700 nnxnp 0.680851064
C9-4000 nnxnp 3.446808511
C9-5500 nnxnp 5.14893617021**
C19-950 lmxll 1.063829787
I7-600 nnxnp 0
I10-450 lmxll 0.042553191
I10-580 nnxnp 2.085106383
I10-1650 nnxnp 0.042553191
I10-1800 nnxnp 4.25531914893**
R1-350 lmxll 1.531914894
R1-870 nnxnp 0
R1-1750 nnxnp 7.19148936170**
R2-2150 nnxnp 22.510638297***
R5-350 lmxll 0.680851064
R5-800 lmxll 0.170212766
R5-925 nnxnp 0.170212766
R5-1325 nnxnp 2.085106383
R6-1100 nnxnp 0.382978723
R7-450 lmxll 7.191489362
R7-570 lmxll 0.042553191
R7-630 nnxnp 10.8936170212***
R7-1100 nnxnp 3.446808511
R9-3000 nnxnp 1.063829787
R10-1200 nnxnp 3.446808511
R12-600 lmxll 4.255319149
R13-550 nnxnp 10.8936170212***
R13-575 nnxnp 33.361702127***
R14-750 lmxll 1.531914894
R14-900 nnxnp 1.063829787
R14-1300 nnxnp 12.2978723404***
R14-1500 nnxnp 7.19148936170**
R14-2500 nnxnp 2.085106383
R15-750 nnxnp 5.14893617021**
R15-950 lmxll 0.170212766
Y14-500 nnxnp 0.382978723
Y14-1400 lmxll 9.57446808510***
Y14-1650 nnxnp 0.170212766
Y14-3000 nnxnp 0.382978723
Y14-4000 lmxll 10.8936170212***

Níveis de significância: *códigos do programa JoinMap v 3.0 (VAN OOIJEN

& VOORRIPS, 2001), referentes aos tipos de segregação para uma população
CP (Cross Pollinators) (Tabela 1), ** α =0,05, *** α =0,01 a 1 grau de
liberdade (GL).

90
Anexo IV. Marcadores Microssatélites obtidos a partir de bibliotecas genômicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de
repetição, seqüência dos “primers”, tipo de segregação e teste de homogeneidade para segregação Mendeliana. (Continua...)
Tipo de
“Primer” Repetição “Forward” (5’→3’) “Reverse” (5’→3’)
segregação
χ 2

CCSM 01 (AG)n cagctccaagaaacccta gccaatatatcatgcaggta efxeg 0.680851064

CCSM 09 (AG)n gactggattagagttctctg atggatgtgttatctcactc abxcd 12.29787234**
CCSM 12 (AG)n gattgaatcttctgtagctc atcatcatctagtgtcactg hkxhk 6.127659574**
CCSM 17 (AG)n acatggacaggacaactaag gttatgatacgtctgtgtcc nnxnp 2.085106383
CCSM 19 (AG)n ggacactgtgactaa agctaccaagacaccacc hkxhk 20.59574468**
CCSM 29 (TGA)15(TTA)9 cgtgattgtgtccga cacacttcacaatgttgcac hkxhk 6.127659574**
CCSM 40 (GCAACA)10 acaagagtcgcaacaatc gacaacagtggcaatacc abxcd 1.531914894
CCSM 46 (GCA)6(CAA)8 ataccttatcaagtaacacg tcagaatgagtactagctcc lmxll 5.14893617*
CCSM 51 (CA)21 ccaagcttcccgggtaccgc agtgtgctggaattcggc lmxll 0
CCSM53 (GTT)7 atgacgacatcgacaacg cgttaccacttcaccaatac hkxhk 0.680851064
CCSM55 (CAA)7 agcatgaagagcagcaag gcttggcctctcactcta hkxhk 1.531914894
CCSM 091 (AG)14 gagattaaagatgaagac ttcttgtgactgtactcg lmxll 0.170212766
CCSM 146 (AG)25 tggttagaaggtgaacag acatagaggtttgcttatc lmxll 0
CCSM 118 (GT)12 tcaatagaggatacactacc tgtcaacaaggctatacac hkxhk 5.14893617*
CCSM 128 (GT)6 TTC (T)12 atctgatagatgagccac taacagttgtagttgtcc hkxhk 0.680851064
CCSM 129 (CA)7 (TA)4 gtatgtggagagatgttc atctgctcttatgaccac hkxhk 1.531914894
CCSM 147 (AG)18 agactcacgtaacctacttc gctatgttatgatacgtctg nnxnp 0.170212766
CCSM 151 (TC)12 acgtagagcttgttatagag ctaggattgttagagatagc nnxnp 0.382978723
CCSM 154 (AG)19 gactccgcttctgttctatg acaatagaccagcacttcaa efxeg 0.042553191
CCSM 156 (TC)20 gtctctgttgtgtgtcggtt acgaagtgaagtgtgtaatg nnxnp 8.340425532**
CCSM 161 (GA)14 tacacatacatgcacgtaca actcagtacgctcctcaata efxeg 0.042553191
CCSM 162 (TC)13 cagctgcagtatccatctaa ggtgaagtcaagtgcgag efxeg 0
CCSM 163 (TC)14 actcagtacgctcctcaata tacacatacatgcacgtaca efxeg 0
CCSM 168 (AG)16 acttacatgcaaggagagtg gagacactggaaggtatcaa efxeg 4.255319149*
CCSM 170 (GA)21 agttgagtactgtgtgcgaa ctaatggctgagagagttgc hkxhk 0.382978723
CCSME 020 (CTGCTC)5 catctcagactcctgcacca ccctccacccatatcaagaa nnxnp 0.680851064
CCSME 022 (ATC) 8 ctatcggcaaaggagcagtc tctctgcaggtaaggttggg nnxnp 1.531914894
CCSME 024 (AT) 11 gcttcttggaatggagcaag cgtttttctgaggtcacggt nnxnp 1.531914894
CCSME 026 (GT) 10 gaagaagaagcacgaggacg ccccaaaaataaagcagcaa nnxnp 1.531914894
CCSME 027 (ATAG) 5 gttttgcttgctttgtgtcg caaacccatctaaagcccaa hkxhk 0.042553191
CCSME 049 (GTTGA)6 aataagcgtatcagcagcagg aatcatgaacgggctgaaac nnxnp 0.170212766

91
Anexo IV. Marcadores Microssatélites obtidos a partir de bibliotecas genômicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de
repetição, seqüência dos “primers”, tipo de segregação e teste de homogeneidade para segregação Mendeliana. (Continuação)

Tipo de
“Primer” Repetição “Forward” (5’→3’) “Reverse” (5’→3’)
segregação
χ 2

CCSME 050 (GAA) 7 gagttgggattctgctgttga gactgttgttctgatgccga abxcd 0.170212766

CCSME 052 (TC)14 ctggctcagctctgctcatt tgctgctgcttctgcttcta lmxll 1.531914894
CCSME 053 (TAA) 11 gatctccctatcatcggcaa ttttgagggctggatggata nnxnp 2.085106383
CCSME 089 (ATA)7 gaggtctcgaagtcacggag acttatcttgcacccgacga efxeg 0.680851064
CCSME 091 (GAT)8 cggtaataacgccgtcaagt tacttttaacggcgtcaccc lmxll 0.680851064
CCSME 092 (GCC)6 aagcatcgtcaaagtttggg ttgatgcatgttctcaaggc efxeg 9.574468085**
CCSME 097 (TCA)6 ccattaacgagaaaaccaaaca caaaaaggggttgcaaagaa efxeg 0.170212766
CCSME 099 (TCA)6 cacccacctcgaaaacactt gcccaactgtcgacaaaaat hkxhk 5.14893617*
CCSME 100 (ATT)7 gaaggtgagccaggaccata cctgatacccggaactgaag hkxhk 0.184568387
CCSME 102 (TCT)6 gccccatccaaaaccttatt gaaggttgctgctcttcacc abxcd 1.531914894
CCSME 107 (TGG)6 ggactccaagcaagcaaaag ggttgcgtaagtgtggaggt hkxhk 2.723404255
CCSME 109 (AAT)8 tcaaagtcgatttctgcacg catatggtttggccgttctt hkxhk 9.5744680851*
CCSME 113 (CAA)8 gtgccaacaatagcagcaga tgtaattgctggcataagcg hkxhk 1.063829787

Níveis de significância: * α =0,05, ** α =0,01 a 1 grau de liberdade (GL)

92
Anexo V. Marcadores TRAPs, seqüência dos “primers”, tipo de segregação e teste de homogeneidade para segregação Mendeliana.

Marcadores “Forward” (5’→3’) “Reverse” (5’→3’) Tipo de segregação χ 2

P1R1-1 (745)*** gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat nnxnp 0.680851064

P1R1-2 (735) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat lmxll 35.7872340425**
P1R1-3 (685) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat nnxnp 0.042553191
P1R1-4 (660) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat lmxll 10.8936170212**
P1R1-5 (510) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat lmxll 28.765957446**
P1R1-6 (360) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat nnxnp 0.170212766
P1R1-7 (338) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat nnxnp 12.2978723404**
P1R1-8 (315) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat lmxll 10.8936170212**
P1R1-9 (245) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat nnxnp 22.5106383
P1R1-10 (215) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattaat lmxll 0.170212766
P1R2-1 (850) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc nnxnp 5.1489361702*
P1R2-2 (680) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc nnxnp 1.531914894
P1R2-3 (625) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc nnxnp 1.063829787
P1R2-4 (525) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc nnxnp 3.446808511
P1R2-5 (318) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc lmxll 2.723404255
P1R2-6 (100) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc nnxnp 0.382978723
P1R2-7 (54) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaatttgc hkxhk 0.170212766
P1R3-1(730) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac nnxnp 0.042553191
P1R3-2 (690) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac nnxnp 4.255319149
P1R3-3 (570) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac nnxnp 4.255319149
P1R3-4 (430) gcccgtgctgcctgatgatt gactgcgtacgaattgac nnxnp 1.063829787
P2R2-1 (830) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc lmxll 0.680851064
P2R2-2 (752) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc lmxll 1.531914894
P2R2-3 (640) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc lmxll 1.531914894
P2R2-4 (630) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 7.191489362
P2R2-5 (610) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc hkxhk 0.680851064
P2R2-6 (560) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 35.7872340425**
P2R2-7 (430) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 0.042553191
P2R2-8 (215) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 10.8936170212**
P2R2-9 (110) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 28.765957446**
P2R2-10 (98) acagggccaaaggtaaacaca gactgcgtacgaatttgc nnxnp 0.170212766
Níveis de significância: * α =0,05, ** α =0,01 a 1 grau de liberdade (GL), *** número de pares de bases

93