Extração APX, DHAII, CAT, SOD e GR

l. Macerar 200 nrg de MF em N2líquido com 50 ol, de pVpp.

2. Homogeneizar conr I.500 prl do'I'ampão de cxtraçiro:

Conc. Final Soluções Estoque 1 Reação

100 mM FosÍirto de Potássio 400 mM, pI{ 7.8 375 p,L

0,1 rnM EDTA l0 mM 15 pL
l0 mM Ácido Ascórbico 200 mM 75 p,L
I
Agua 1.035 pL

Volume Final 1.500 pL

3. Centrifugar a 13.000 g por l0 nrin a 4"C (l 1.800 rpnt).

4. Coletar o sobrenadante.
 Incubação APX

1. colocar no baúo-manaa28"c o seguinte Tampão de incubação:

Conc. X'inal Soluções Estoque l Reação
100 mM Fosfato de Potássio 200 mM, pH 7.0 1.000 pL
0,5 mM Ácido Ascórbico 10 mM 100 pL
Água 700 pL
-
2. Adicionar o Peróxido de Hidrogênio na hora da leitura:

Conc. Final Soluções Estoque

0,1 mM Peróxido de Ilidrogênio 2 mM 100 pL

Amostra 100 pL
Volume Final 2.000 pL

3.Fazer a leitura a290 nm de l5 em l5 segundos durante 3 min.

4. Ocorre decréscimo na absorbância.

Incubação CAT

1. colocarno banho-mariaa28"c o seguinte Tampão de incubação:

Conc. Final Soluções Estoque I Reação

100 mM Fosfato de Potássio 200 mM, pH 7.0 1.000 pL
Água 800 pL

-
2. Adicionar o Peróxido de Hidrogênio na hora da leitura:

Conc. Final Soluções Estoque

12,5 mM Peróxido de Hidrogênio 250 mM 100 pL

Amostra 100 pL
Volume Final 2.000 pL

3.Fazer a leitura a240 nm de 15 em 15 segundos durante 3 min.

4. Ocorre decréscimo na absorbância.
r
íncubação APX _ Elisa Placa Corning trIalf area ç.,r v )

1. Pipetar 9 pL da arnostr4 em fuiplicatas, na placa- Os três primeiros poços constituem os brancos.

2. Pipetar o rnix contendo os seguintes reagentes do tampão de incubação em ternperatura arnbiente:

Conc. Final §oluções Estoque I Reação

100 mM Fosfato 4e Potássio 200 mM, pH 7.0 90 pI-"
0,5rmM Àcido Ascórbico 10 mM
t'
epf
Agua 63 p\
Yolume do *rix 162 pL

-'ç. Àdicionar o Pcróxido de Hid«igênio na

C+ue" Final §oluções Estoq

C,1 mM Perórido deHidrogênio{ mM 9pL

I

V*trume Fin*l 180 FL

4. Fezer a leitura a.290 nm de 15 em 15 segundos drrrante 3 mh"

5, rli*r_rr* ii*créscimo na absorbância.

Incubação CÂT Elisa Placa Corning Half area

rUÍà
I" Fipetnr 9 yL daanaçska ern triplicatas, na placa. Os três prirneiros poços constrtuem os brarcr:s.

2. §sipetar + mix ccnteuâo os seguintes reag*ntes do tanrpão de in*ubação em temperêt'$ê aenbir:ntr

Cçne" Fiual Soluções EsÉoque !.Ileaçâcr

100 mlt{ }'osfsto de Potrâssio 2Sú m*í, pI{ ?.0 90 pl-
Áso, 72 wL

Yalume d+ rnix 16?,pL

-]" Adicisnar o P*róxid* de Hidrogôaio Ea trora da leitura:

Conc. Final Soluções Estoque

i2,5 mM Perórido de tr{idrogênit ?§$ raM 9pL

YoEumeFiaal 18ü #,§,

4" F*zsr a ieifirra a240 nm de i5 çrl 15 .,seguad*s drerante 3 min.

5. ücarre decréscimo na absorbância"
 :-..i jr:i*L-éa;;- -:.ài .SL j:i+:tu:J &+tJ-. :+- : À§d;;:H:iL&;tija;Ê{i

Incubação soD Elisa (Irlaca visÍvel - Funclo Redondo)

I ' Pipetar nos três primeiro poços cla pletca I 0 pL cle água (branco) e nos demais poços alíquotas de l0
pL das anlostras erl triplicata.

2' Adicionar o mix do 'I'amprio dc incubação ern cacla poço cla placa utilizando a multicanal:

Conc. Final Soluções Estoque I Reação

50 mM FosÍato de Pot:issio 100 mM, pH 7.g 100 pL
l4 nrM N'Ictioninl 70 nrM 40 pL
0.1 plr4 EDI'A 10 prM 3pL
Ágra 3l prl
75 ptM NB]" I mM * 15 pL
2 pM RiboÍIavina 0,2 mM * 2 prL

Volunre Final 190 pL

*Adicionar ao mix, NBT
o e a lliboÍlavina momentos antes cle pipetar o mix nos poços da placa.

3. Iluminar a placa com as antostras durante 7 rnin.

4. 1|azer as leituras a 560 nm.

 Incubação SOD

1. Colocar em tubos com mesma espessura e mesma cor o seguinte Tampão de incubação:

Conc. Final Soluções Estoque 1 Reação

50 mM Fosfato de Potássio 100 mM, pH 7.8 1.000 pL
14 mM Metionina 70 mM 400 pL
o,l pM EDTA 10 p.M 20 pL
gua 310 prl,
^
2. Adicionar o NBT, a amostra e por último a Riboflavina:

Conc. Final Soluções Estoque I Reação

75 1tM NBT 1 mM 150 pL
Amostra 100 pL
2 ttl|ví Riboflavina 0,2 mM 20 sL
Volume Final 2.000 pL
3. Iluminar os tubos
"o- ;i* -
4. Preparar um tubo com o mesmo meio de incubação e mantê-lo no escuro para o branco.(enrolado
com papel alumínio) - usar esse para zetar.

5. Fazer as leituras a 560 nm.

 Extração ADH e LDH

1. Macerar 200 mg de MF em Nz líquido.

2. Homogeneizx com 800 pL do Tampão de extração:

Conc. Final Soluções Estoque 1 Reação

100 mM HEPES- 200 mM, pH 7.5 400 pL

l0 mM B-Mercaptoetanol 0,6 pL
15 % Glicerol STTo 138 pL
6% PVPP
Água 261,4 StL
Volume Final 800 pL

3. Centrifugar a 13.000 g por 15 min a4C.

4. Coletar o sobrenadante.
 rncubação ADH _ Blisa praca corning Harf area
l. Tampão de incubção:

Conc. Final Soluções Estoque

1R."çã,
150 mM Tris HCI lM, pH 8,0
27 pL
0,3 mg/ml NAD* 10 mg/mL
3,6 pL
Água
136,8 pL
Volume Final
167,4 pL

2' Deixar o tampão de incubação no banho a 30

"c por l5 minutos sem a amostra.
3. Adicional 9 pL daamostra no tampão de incubaç
áo + 3,6 pL de etanol lyo nahora da leitura
no
espectrofotômetro.
4-Fazer a leitura a340 nm de 15 em 15 segundos durante
3 minutos.

A redução do NAD+ será acompanhada a340nm por 3 minutos.

o cálculo da atividad e er,,imáúíca
será dado pela quantidade de NADH produzido por
minuto de incubação.

fncubação LDH Elisa placa Corning Half área

1. Tampão de incubção:

Conc. Final Soluções Estoque -r

R*çã"
150 mM Tris HCI lM, pH 8,0 27 pL
0,3 mg/ml NAD* 10 mg/ml 3,6 pL
1,25 mM MgCl2100mM l,g
Água 111,6 pL
Volume Final 144 pL

2. Deixar o tampão de incubação no baúo a 30 oc por 15 minutos

sem a amostra.
3' Adicionalg pL da amostra no tampão de incubaç ão + 27 pL
de lactato de sódio 60yo nahora da
Ieitura no espectrofotômetro.
4.Fazer a leitura a340 nm de 15 em 15 segundos durante 3 minutos.

A redução do NAD+ será acompanhada a340nm por 3 minutos. O cálculo

da atividade enzimática
será dado'pela quantidade de NADH produzido por minuto
de incubagão.
 Incubação DHAR

1. Colocarno banho-mariaa28oC o seguinte Tampão de incubação:

Conc. Final Soluções Estoque l Reação

50 mM X'osfato de Potássio 100 mM, pH 7r0 1.000 pL
0,5 mM DHA (Dehidroascorbato) 10 mM 100 pL
1 mM GSH (Glutationa reduzida) l0 mM 200 pL
Água
-
200 pL

2. Adicionar o Amostra na hora da leitura:

Conc. f inal Soluções Estoque

Amostra 500 pL
Volume Final 2.000 pL

3.Fazer a leitura a265 nm de 15 em l5 segundos durante 3 min.

4. Ocorre aumento na absorbância.

Incubação GR

l. colocarno banho-manaa28"c o seguinte Tampão de incubação:

Conc. final Soluções Estoque I Reação
50 mM f,'osfato de Potássio 100 mM, pH 7.8 1.000 pL
1 mM Glutationa Oxidada l0 mM 200 pL
Água 270 pL

2. Adicionar o NADPH na hora da leitura:

Conc. X'inal Soluções Estoque

0,075 mM NADPH 5 mM 30 pL
Amostra 500 pL
Volume X'inal 2.000 pL

3.Fazer a leitura a340 nm cle 15 em 15 segundos durante 3 min.

4. Ocorre decréscimo na absorbância.
 Extração invertase solúvel (ácida do vacúolo
e neutra do citosol)

]. Mry9rar 0,4 gdeMF em Nz tíquido.

2. Adicionar 1,5 mL do seguinte t-u*pao
de extração:

Conc. Final Soluções Estoque

l Reação
200 mM Tampão HEPES +OO *tU pff Z,S 750 pL
lmM PMSF' 100 mM
15 pL
5mM MgCl2 500 mM
15 pL
lmM DTT 200 mM 7,5 pL
50 mM Ácido Ascórbico
0,01761 g
Agua
450 pL
Volume Final
1500 pL

i. gToifugar, por 20 minutos, à4oc,sob 1g.000g (13.000 rpm).

4. Coletar o sobrenadante.

se não for utilizado imediatamente, deve ser congelado.

caso confrário, retirar uma alíquota de 0,5 ml parã
ser adicionada em meio de incubação.

Incubação da invertase ácida do vacúolo

Conc. f inal Soluções Estoque
I Reação
200 mM Tampão Citrato Sódio 400 mM pH 4"s
500 pL
5mM MgC12
10 pL
200 mM Sacarose
0,06946 g
Água
Alíquota do extrato lsobrenadantel
490 pL
Volume Final
1000

1. Incubar em eppendorÍf de 1,5 mL.

-
2. lncubar no banho por 10 min e 40 min.
3.Parulizar a reação com N líquido.
 Incubação da invertase neutra do citosol
Conc Final Soluções Estoque
1 Reação
100 mM Tampão Fosfato a"rota@ 500 pL
5mM Mecb
10 pL
200 mM Sacarose
0,06946 g
Agua
Alíquota do extrato lsonr.raããn§
490 pL
Volume Final
1000 pL
l. Incubar em eppendorff de 1,5 mL.
2. Incubar no banho por l0 min e 40 min.
3. Paralizar a reação com N líquido.
4. Quantificar pelo método núS.
 Extração da invertase insolúvel (ácida da parede celular)
1. Ressuspender o pellet com 1,5 mL de tampão de extração constituído de:

Conc, Final Soluções Estoque l Reação

200 mM Tampão Citrato Sódio 400 mM pH 4,S 750 pL
lmM PMSF 100 mM 15 pL
5mM MgCIz 500 mM 15 pL
1mM DTT 50 mM 7,5 pL
50 mM Ácido Ascórbico 0,01761g
1M NaCl4 M 375 pL

337,5 1tL
Volume Final 1500 pL

2. Centrifugar a 18.0009 (13.000 rpm), por 20 minutos, a4oC.

3. Coletar o sobrenadante para avaliar a atividade da inveÍase de parede.
4. Depois de proceder a extragão das 3 enzimas invertases, o extrato deve ser adicionado
a u:
meio de incubação, o qual deve ter características específicas de cada enzima. A alíquota
a sr
utilizada é de 0,5 ml.

Incubação da invertase ácida da parede celular

Conc. Final Soluções Estoque -r R."çã,

200 mM Tampão Citrato Sódio 400 mM pH 4,5 500 pL
5mM MgC12 10 pL
200 mM Sacarose 0,06946 g
Agua
Alíquota do extrato (sobrenadante) 490 pL
Volume Final 1000

1. Incubar em eppendorffde 1,5 mL.

2. Incubar no baúo por 10 nrin e 40 min.
3.Paralizar a reação com N líquido.
4. QuantiÍicar pelo método DNS.
 " Metodologia Susy
1. Macerar 500 mg de matéria fresca em N líquido;
2. Adicionar 2 ml de tampão de extração. O meio extratqr deve ser constituído de:

Conc. Final Soluções Estoque l Reação

0,05 M Tampão HEPES 0,1M pII7,0 1000 pL
0,002 M MgCl2 0,5 M 8 trl-
0,002 M Ditiotreitol (DTT) 0,2 M 201tL
0,001 M EDTA dissódico 0,005 M 400 pL
Água destilada 572 pL
0,1 mM Ácido Ascórbico 0,0176 g
Volume Final 2000 L

3. Centrifugar a 18.000 g (13.000 rpm) por 20 min a4oC;

4. Coletar o sobrenadante e colocar no gelo. 'l

Incubação Susy
1. Adicionar 100 pL do extrato (sobrenadante) em 1900 pL de meio de incubagão, a 37 oC,
constituído de:

Conc. Final Soluções Estoque 1 Reação

0,1 M Tampão MES (Morpholino ethanesulgonic acid)

400 pL
0,5 M pH 6,0
0,005M MgCl2lM 10 pL
0,3M Sacarose 0,10269 g
0,005 M UDP 0,04 M 2501:,L
Ágra destilada 240 p,L
Volume Final 1900 pL
 Método do Ácido Dinitrosalicilico (DNS) - Miller (1959)
Utilizado paraaquantificação de açúcares redutores (AR)

1) Reagentes:

. Ácido dinitrosalicílico @NS);

o NaOH 2N;
o Tartarato duplo de Sódio e Pottássio (Sal de Rochelle);
o Glicose ou una mistura de frutose e glicose (10 mM).

2) Metodologia
o Preparação do reagente DNS:

Adicionar 50 mL de hidróxido de sódio (NaOfD 2N a2,5 g de DNS e aproximadamente

125 mL de água destilada e 4gltar até à dissolução. Posteriormente, adicionar 75g do sal
de Rochelle e completar o volume da solução pam250 nú. Este reagente é insüável na

preseúça de luz e COz.

o Obtenção dacurvapadrão:
Conforme Tabela 1, após adicionar o reagente de DNS, agltar a mistura e levar os tubos
oC durante 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e
ao banho-maria a 100
completar o volume paÍa 5 mT' com água destilada. Fazer a leihra a 540 nm no
espectrofotômetro.

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores.

Tubos Glicose (10 mM) Agua DNS Hmol de AR

(mL) (mL) (mL)

I 0,0 4,75 0,5 0,0

2 0,1 0,65 0,5 1,0

3 0,2 0,55 0,5 2,0

4 0,3 0,45 0,5 3ro

5 0,4 0,35 0,5 4,0

Volume reacional 5 mT.

 Metodologia Atividade da enzima sacarose fosfato sintase (SPS)

1. Macerar 250 mgde MF em N2 líquido; ':

2. Adicionar 1,5 mL de tampão de extração. O meio extrator deve ser constituído de:

Conc. Final Soluções Estoque l Reação

100 mM Tampão HEPES 200 mM pH 7,0* 7501tL

2 mM MgCl2 200 mM 15 pL
5 mM EDTA dissódico 50 mM 150 pL
10 mM 2 mercaptoetanol 1,125 UL

Água destilada 584 pL

2% Ácido Ascórbico 30 mg

Volume tr'inal 1500 FL

*Mantido a4oC
't

3. O extrato será deixado em gelo por trinta minutos, com agitagão ocasional e depois
centrifugado a27.000 g por 20 minutos, a4"C.

Incubação da enzíma sacarose fosfato sintase

1. Após quantificação de proteínas na amostra, retirar uma alíquota contendo 60 pg de

proteína e adicionar ao seguinte meio de incubação:

Conc. Final Soluções Estoque l Reação

25 mM UDP-Glicose 0,02288 g
':
25 mM Frutose 6-fosfato 0,01141 g
30 mM Glicose 6-fosfato 0,01269 g
50 mM Tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,5 750 pL
Água (Completar de acordo com a quantidade
de extrato utilizado)

Volume Final 1s00 É

*Modificado de Lowell et al., 1989

2. As reações serão incubadas por I h, a 37"C e paralisadas com a adigão de KOH 30%
e fervidas por 10 minutos. A sacarose formada será dosada pelo método de Antrona.
 QUANTIFICAÇÃO »N PEROXIDO DE HIDNOCÊTVIO - EIiSA
Placa Corning Half Area

l. Armazenar o material emNz líqúdo.

2. Macerar 200 mg de MF em N líquido com PVPP e homogeneizar em 1500 pL de Ácido

Tricloroacético (TCA) O,lYo:
3. Cenffifugar a 12000 g por 15 minutos, a4o C.
4. Coletar o sobrenadante.
5. Retirar uma alíquota do sobrenadante (aspl-) e pipetar em um eppendorf contendo:

Soluções Estoque l Reaçilo

Tampão fosfato de poüássio l0 mM pH 7 45 pL
Iodeto de potássio lM 90 pL
Volume Final 180 pL

6. Realizar a leitura em espectofotômetro a 390 nm.

CURVA.PADRÃO DE PERÓ)ilDO DE HIDROCÊTVTO

1. Preparar uma solução de HzOz 250pM.

2. Proceder o preparo da curva conforme a tabela abaixo:

Tubo IIzOa2í) pM H2O Tampão fosfato de potríssio Iodeto de poíá*rio [ | final IIzOz
(Ft) (tú) 10mM pH 7,0 (UL) lM (pL) (pmoVmL)
1 0,0 45,0 45 90 0
) 3,6 41,4 45 90 5

J 10,8 34,2 45 90 15

4 18,0 27,0 45 90 25
5 25,2 19,8 45 90 35
6 32,4 12,6 45 90 45

3. Realizar a leitura a 390 nm.

4. Os cálculos podem ser feitos baseados na curva padrão de peróxido.

**'r Os três primeiros poços da placa devem conter o branco
 -:Ji&, j= ::_:- :.j-;-_ .,:j.Ã.,; j,,,
=a:,=:--_ ;. ._: :::; . e r -
--.:

QUANTTIICAÇÃO DE ASCORBATO

1. Macerar 50 mg de MF em N líquido com PVPP e homogeneuar em 1500 pL de Ácido

Tricloroacético (TCA) 5%:
2. centrifugar a 13000 g por 15 minutos, a4o c e coletar o sobrenadante.
3. Retirar uma alíquota do sobrenadante (20ú) e pipetar em um eppendorf, ssmpletando o volume
paru250 pL com TCA1%.
4. Acrescentar os seguintes reagentes nesta ordem:

Soluções Estoque 1R""çã,

TCA5% 250 pL
Etanol99,8% (PA) 250 pL
H3PO+ 0,4Yoemetanol 125 pL
Bathophenantolina (BP) 0,5Yo em etanol
-
250 pL
FeCl: 0,03Yo em etanol 125 1tL
Volume Final 1000 rú
5. Levar ao banho-mariapor 90 min 6 300C.
6. Realizar a leitura em espectrofotômeho a 534nm.

CURVA-PADNÃO DE ASCORBATO
1. Preparar uma solução de Ácido Ascórbico 100 pg/ml e proceder o prepilo da curva:
Tubo TCASyo AsA TCA Etanol H:pOr BP FeCIs I Ifinal
(rú) (FL) 50Â (PA) 0,4V" 0,5y" 0,O3yo (Fglml, de
ÉFLÉFLÉ AsA)
I 2s0 0 2sa 250 t2s 250 125 0,0
2 237,5 12,5 250 250 t2s 250 125 1,0
3 225 2s 250 250 t25 250 125 2r0
4 212,5 37,5 2s0 254 125 250 125 3,0
5 200 50 2s0 250 lzs 250 125 4,0
6 187,5 62,5 250 250 125 2s0 125 5,0

QUAIYTIHCAÇÃO DE ASCORBATO - Elisa (Placa VisÍvel - Fundo Redondo)

Pipetar 200 mr' do meio reacional do eppendorf na placa de Elisa Os dois primeiros poços devem
conter o branco.
 QUAI§TTFICAÇÃO DE PEROXIDAÇÃO LIPbICA PELO
naprooo TBARs 1Ácmo TroBannrrúnrco)

l. Armazenar o material em N líqüdo

2' Macerar 2a0 mgde MF em N líquido com

PVPP e homogeneizar em 1500 pL de
Ácido
Tricloroacético (TCA) O,lyo.

3' Centrifugar a 10000 g por 10 minutos , a 4o Ce coletar o sobre,tadante.

4' Retirar Uma alíquota do sobrenadante (250pL)

e pipetar em um eppendorf contendo
1000 pL do
seguinte meio de reação:

- Áciao tiobarbitúrico (TBA) 0,5%

- Ácido tricloroacérico (TCA) l0%

*** Pesar os dois reagentes e dissolvê-los coduntamente
em água destiladapara formar uma
soluçâo.

5. Levar ao banho-maria a 95.C por 30 min

6' Paralisar arcaçãopor resfriamento nápido em

gelo e realizar a leitura em espechofotômetro
a 535 e a
600 nm.

7. Os cálculos serão reatizados da seguinte maneira:

tIvÍDA]:(Asrs-A600) /(Exb),emque6:coeficientedeextinçãomolar=
1,56x l0-5
b = comprimento ótico: I

+ A peroxidaçâo é expressa em nmol de MDA.glM.

PERO)ilDAÇÃO LIPbICA PELO rrÉrONO TBARS

(ÁCIDO
TroBARBrr[rrucoy - Etisa (placa visível Fundo Redondo)
-
- Pipetar 200 p'Ldo meio reacional (apos
aparalisação dareação) do eppendorfnas placas
de Elisa
Os dois primeiros poços devem conter
o branco.
 euANTm'rcAÇÃo on pERo)ilDo DE m»nocÊtll.ro çuro,

1. Armazenar o material emNz líqúdo.

2. Macerar 200 mg de MF em N líquido com PVPP e homogeneizar em 1500 pL de Ácido
Tricloroacético (TCA) O,lYo;
3. Centrifirgar a 12000 g por 15 minutos, a4o C.
4. Coletar o sobrenadante.
5. Retirar uma alíquota do sobrenadante (500pL) e pipetar em um eppendorf corúendo:

Soluções Estoque l Reaçilo

Tampão fosfato de potássio l0 mM pH 7 500 pL
Iodeto de potrássio lM 1000 pL
Volume Final 2000 rú

6. Realizar a leitura em espechofotômetro a 390 nm.

CURVA.PADRÃO DE PERÓ)ilDO DE IIIDROCÊT.NO

1. Preparar uma solução de HzOz 250FM.

2. Proceder o prepaÍo da curva conforme atabela abaixo:
Tubo HzOz 250 pM H2O Tampão fosfato de potássio Iodeto de potássio lM [ ] final EzOz
0ú) úü) 10mM pH 7,0 (pt) (FL) (pmoVml)
10500 500 1000 0
2 40 460 500 1000 5

3 120 380 500 1000 15

4 200 300 500 1000 25

5 280 220 s00 1000 35
6 360 140 500 1000 45

3. Realizar a leitura a 390 nm.

4. Os crálculos podem ser feitos baseados na curva padrão de peróxido de hidrogênio.

 QUANTIT'ICAÇÃO DE PERO)ilDO DE I{IDROCÊTUO
- EIiSA
Placa Corning Half Area

1. Annazenar o material em Nz líqúdo.

Z'}dacerar 200 mg de MF em N líquido com PVPP e homogeneizar em 1500 pL de Ácido
Tricloroacético (TCA) 0,lyo:
3. Centrifugar a 72000 g por 15 minutos, a 4o C.
4. Coletar o sobrenadante.
5' Retirar uma alíquota do sobrenadante (aspl-) e pipetar em um eppendorf contendo:
Soluções Estoque 1R;"çã"
Tampão fosfato de potiássio tO mU plf Z 451tL
Iodeto depotássio lM 90 pL
Volume Final 180 pL

6. Realizar a leitura em especfuofotômetuo a 390 nm.

CURVA.PADRÃO DE PERÓ)ilDO DE EIDROGÊNIO

1. Preparar uma solução de HzOz 250pM.

2. Proceder o pÍeparo da curva conforme a tabela abaixo:

Tubo E Oe2S0 FM H2O Tampão fosfato de potássio Iodeto de potíssio [ ] ÍinalHz0z
(FL) (FL) 10mMpH7,0 (pL) lM([ú) (pnoVmL)
1 0,0 45,0 45 90 0
2 3,6 41,4 45 90 5
3 10,9 34,2 45 90 15
4 18,0 27,0 45 90 25
5 25,2 l9,g 45 90 35
6 32,4 12,6 45 90 45

3. Realizar a leitura a 390 nm.

4. os ciâlculos podem ser feitos baseados na curva padrão de peróxido.
**:r Os tês primeiros poços da placa
devem conter o branco
 Incubação ADH
1. Tampão de incubção:

Conc. Final Soluções Estoque

lüçã"
150 mM Tris HCI lM, plf 8,0 300 pL
0,3 mg/ml NAD* 10 mg/ml 40 pL
Água
1520 pL
Volume Final
1860 pL

2. Deixar o tampão de incubação no banho a 30 oc por

15 minutos sem a amostra.
3' Adicional 100 pL da amostra no4ampão de incubaç ão +
40 pL de etanol lyo nahora da leitura no
espectrofotômetro.
4.Fazer a leitura a340 nm de 15 em l5 segundos durante
3 minutos.

A redução do NAD+ acompaúada a340nm por 3 minutos. O cálculo da atividade

será
enzimática
será dado pela quantidade de NADH produzido por minuto
de incubação.

fncubação LDH
1. Tampão de incubção:

Conc. f inal Soluções Estoque 1 R."çã,

150 mM Tris HCI lM, pH 8,0 300 pL
0,3 mg/ml NAD+ 10 mg/ml 40 pL
1,25 mM MgCI2 100mM 20 pL
Ágo" 1240 pL
Volume Final 1600 pL

2. Deixar o tampão de incubação no banho a 30 oc sem por

l5 minutos a amostra.
3. Adicional 100 pL da amostra no tampão de incubação +
3gg pL de lactato de sódio 60|lzonahoru
da leitura no espectrofotômetro.

4.Fazq a leitura a340 nm de r5 em l5 segundos durante 3 minutos.

A redução do NAD* será acompanhada a 340 nm por 3 minutos. o cálculo

da atividade enzimática
será dado pela quantidade de NADH produzido por minuto
de incubação.
 Extração PDC
t. Macerar 300 mg de MF em N2 líquido e, em seguida, adicionar 1000 pL do seguinte Tampão
de
extração:

Conc. Final Soluções Estoque 1R""çã,

100 mM Tris-HCI300 mM pH 8 335 pL
l0 mM Ascobato de sódio 50 mM 200 pL
10 mM DTT 200 mM 50 pL
50 mM BSA 5mg
5% Glicerol STTo 138 pL
Água destilada 277 pL
Volume X'inal 1000 pL

2. Centrifugara 13.000 gpor20 mina4 oC.

3. Coletar o sobrenadante.

Incubação PDC
Conc. f inal Soluções Esúoque I Reação
85 mM MES pH 6,5 300 mM 280 pL
0,5 mM Tiamina pirofosfato 20 mM 25 pL
0,5 mM MgCl250 mM 10 pL
0,15 mM NADH 10 mM 15 pL
14 unidades ADH 1400 unidades/ml l0 pL
Água destilada 260 pL
Volume Final 1000 pL

1. Deixar o tampão de incubação no banho a 30 oc por 15 minutos sem a amostra.

2. Adicionar 200 pL da amostra no tampão de incubação + 200 pL de piruvato de sódio (10 mM)
na hora da leitura no espectrofotômeho.

3. Fazer a leitura em espectrofotômetro a340 nm por 3 minutos.

4. Ocorre decréscimo na absorbância.

Nesta rcaçâo, o acetaldeído produzido pela PDC será reduzido pela ADH, oxidando
o NADH, o que
será monitorado a 340 nm por 3 minutos (Kato-Noguchi, 2000).
 Extração de macro e micromoléculas

1' Homogeneizar 0,2 g de MS em 5 mL de tampão

fosfato 0,1 M pH 7,O,seguido de
banho-maria por 30 minutos a40 "C.

2' centrifugar a 10'000 g durante 20 minutos, sendo

o processo repetido uma vez e os
sobrenadantes combinados.

3. Armazenar em potes plásticos de filme devidamente

identificados a _20 oc.
4' utilizar alíquotas do sobrenadante para as análises de açúcares solúveis
totais,
açúcares redutores, aminoácidos, proteínas.

Extração e quantificação de amido

1' Após os processos de homogenei zaçáo e centrifugação
dos tecidos vegetais já
descritos anteriormente para obtenção dos extratos
brutos o pellet será ressuspendido
com 8 mL do tampão acetato de potiíssio 200
mM pH 4,g.
2. Descongelar as amostras em banho-m ana
a40 "C.
3' Adicionar 2 mL da solução da enzimaamiloglucosidase
1 mg/ml (1 mg da enzima
em I mL de tampão acetato de potássio 200
mM pH 4,g).
4. Incubar em baúo-m aria a 40 "Cpor 2 horas.
5. Centrifugar-a 10.000 g por 20 minutos.

6. coletar o sobrenadante e completar o vorume p*u'ls mL com água.

7 - Armazenar em tubos falcon de 50 mL devidamente
identihcados a _20 oC.
8. Quantificar amido pelo método da Antrona.

Extração e quantificação de sacarose

I' Em um eppendorf adicionar g00 pL do extrato (macro e micro) e g00 pL
de KoH
30% (YanHandel, 1963).

2. Banho-mariaa37.C por 15 minutos.

3. Quantificar sacarose pelo método da Antrona .,

 Extração e quantiÍicação de cloroÍilas e carotenóides

1' Coletar as folhas em papel alumínio devidamente identificadas

e manter em gelo.

2.Maserer 0,1 g de MF em 5 mL de acetona g0 %.

3. Filtrar o exhato em lã de vidro.

4. Completar o volume com acetona B0 yoparul0 mL, utilizando

balão volumétrico.

5. Realizar as leituras a663,2 nm,646,8 nm e 470nm em espectofotômetro.

6' Se as leihras ultapassarem o valor 1,0 de absorbância no espectrofotômetro,

fazer
diluições utilizando acetona 80%.Anotar as diluições realizadas em
casa amosta.

os ciáIculos de pg de clorofila/g de matéria fresca foliar, seguirão as equações:

Clorofila a: 12.25xA«t t, - 2,7 gxAass;

Clorofi"la b: 21.50xA0«,s _ 5,10xA66::.

os ciílculos de pg de carotenóides/g de matéria fresca foliar:

Carotenóides : ( I 000xAa rc -l,g2xC rg5,02xG)/ I 9 g

 Método de Bradford (1976) - Elisa (Placa visível - Fundo
Redondo)

1) Reagentes:

. Comassie Blue G-250, HIPO+ e etanol;

. Soro Albumina Bovina (BSA) (2,5mglmL).

2) Metodologia:
. Preparagão do reagente Comassie-blue G-250;

Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95oÁ. Adicionar 100 mL de

HIPO+ 85o/oe completarpara 1L.
Deixar overnight com agitação constante e filtrar.
Dessa forma, as concentrações finais serão: 0,0lyo de comassie, 8,50á de ácido
fosfórico e 4,7Yo de etanol.
Obs.: O ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca
o contrário.

o Procedimento para obtenção da curva padrão:

Proceder conforme Tabela 1. Após, agitar os tubo. s em vórtex e fazer a leitura no
espectrofotômetro a 595 nm.

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como

padrão BSA (2,5 mg/ml)
Tubos BSA Agua Comassie Blue pg proteína
(2,5 mglmL) (pL) G-250
(pL) (t L)
i 0,0 6,0 294 0

2 1,0 5,0 294 )\

3 2,0 4,0 294 5,0
4 3,0 3,0 t 294 7,5
5 4,0 2,0 294 10,0
6 5,0 1,0 294 12,5
*Volume reacional 300 pL
 Método de Bradford (197Q
Uülizado para Erantificação de proteÍnas totais

l) Reagentes
o Comassie Blue G-250, HsPOa e etanol;

. Soro AlbunoinaBovina (BSA) (tmglml.).

2)Metodologiil
r Prieparação do reagentÊ Comassie-bhrc G-250:

Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mr.de etaaol 95%. Adicionar 100 mL de

IIrPO+ 85o/o ecompletarpma I L.
Deir@ overniglt com agitaso constante e fiItrar-
Dessa formq as concentrações finais serão: 0,O1Yo de Comassie, 8,5% de ácido
fosf,órico e4JYo de ehnol
Obs.: O rícido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca
o contrário.

. kocedimento para obênção da curvapadrão:

Proceder conforme Tabela 1. Após, agitâr os tubos em vórtex e fazer a leitura no
espectrofotômetro 2 J!§ rrm.

Tabela 1. Procedimento para obtenção da crrrnapadrâo de proteÍnas rrtilizandor-se eomo

padrão BSA (1 mg/ml-)

Tubos BSA Agua ComassieBlue pgproteína

(l mlml-) (r"T) G-250
(mL) (-r)
I 0,00 0,10 5 0
2 4,02 0,08 5 20
3 0,04 0,06 5 N
4 0,06 0rM 5 60
5 0,08 4,02 5 80
6 0,10 0,00. 5 100
*Volume reacional 5,1 mr..
 Método da Antrona - yemm & WiIIis (1954)
utilizado para quantificaçío de açúcares solúveis totais (AST)

1) Reagentes:

o Reagente Antrona;
o IüSOa concentrado;
o Glicose 60 pglml.

2) Metodologia
o PreparaÇão doreagenteantona:
Adicionar 40 mg de anhona a 1 mL de agsadestilada e a1ús, zomL de Hzsor concentrado.
@ste reagente
deve ser preparado na hora do uso e sob resfriamento).

e Obtenção dacuwapadrão
Conforme Tabela 1, adicionar primeiramente a solução de glicose e depois
o reagente Antrona Este sistema
deve ser mantido em gelo. Agltar os tubos e leváJos ao banho-maria
à 100oC por 3 mínutos. Resfriar a
temperatura ambiente ou no gelo e faz-er aleitura a 620nmem espectrofotômeüo.

Tabela 1- Procedimento para obtenção da curya padrão de açúcares solúveis

totais.
Tubos Glicose Agua Anfuona pg de AST
(60 pelml,) (mL) (mL)
(mt)
I 0,0 l,o 2 0
2 0,1 0,9 2 6
3 0,2 0r8 2 12
4 0,4 0,6 2 24
5 0,6 0,4 2 36
6 0,9 0,2 2 48
7 1,0 0,0 2 60
*Volume reacional3 mT.
 Ensaio da Ninhidrina - Yemm & Coccking (1955)
Utilizado para quantificação de o-aminoácidos

[) Reagentes

. (A) Tampão cituato de sódio A,2M, pH:5,0;

a @) Ninhidrina 5Yo emMetil Celosolve @tileno glicol monometil éter);
o (C) KCN ZYo emMetil Celosolve QmL de KCN 0,01M em 100 mL de metilcelosolve);
a Etauol 60%(vlv);
a Glicina ou qualquer ouho aminoácido em concentração 0,lpmoVnL.

2) Metodologia

Conforme Tabela 1, após a aüçáo do padrão de aminoacidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar ao
banho-maria à 100"C por 20 minutos para desenvolver a coloração. Posterionnente, completar com etanol
60Yo e agitar novamente. Após o resfriarnento ofazer a leitura a570 nÍn no espectofotômeto.

Tabela 1: Procedimento para obtençáo da curva padrão de aminoácidos.

Tubos Glicina Agua ReageutesA+B+C'r Etanol60% Fmol de aa
(0,1 pmoVml) (mL) (mL) (mL)

(mL)
1 0,0 1,0 lr7 L13 0,00

2 0,2 0,8 1,7 l13 0,02

3 0,4 0r6 1r7 1,3 0,04

4 0,6 0,4 1,7 l13 0,06

5 0,8 0,2 1,7 1,3 0,08

6 1,0 0,0 1,7 1,3 1,00

*A:0,5 mL; B =0,2ntL; C: 1,0 mL
**Volume reacional4 rú

Obs.: Os reagentes, quando guardados separadamente e de modo adequado, podem ser

armazenados por até 30 dias,
 Eletroforese de gel de poliacrilamid a z so/o em TBE lx - Uréia g M
1. Preparo das Placas de Vidro
1.1 . Limpar as placas com álcool.
L'2'Um dos lados da placa de menor tamanho deve ser exaustivamente limpa com 3 mL da segünte
solução (Faz com que o gel fique colado na placa):

Solução

Etanol 990 pL
Bind Silane (Methacryloxypropyltrimethosysilane) 5pL
Ácido Acético 5pL
Volume Final lmL

1.3. A placa de maior tamanho, igualmente, deverá ser limpa com sigma cote. (Com
atgodão)
1.4. Unir as placas com os separadores prendend o-as. (Com ctips)

1.5. Colocá-las sobre uma superficie que permita nivelar.

2. Preparo do GeI de Poliacrilamida a5oÁ em TBE lX-.uréia g M

2.1 separar 100 mL da solução de Poliacrilamida, previamente preparada:

Conc. Final Reagentes

4,75 oÁ Acrilamida 47,5 g

2,5 yo Bis-Acrilamida 2,5 g
8M Uréia 490,49 g
1X TBE (sX) 200 mL
Água p/ 1000 mL
Volume X'inal IL

2.2 P olimerizaçáo do gel :

Solução Poliacrilamida 100 mL

Persulfato de Amônio (10%) lmL
TEMED 87,5 pL
 Solução de Coloração
Conc. Final Reagentes

0,r o/o
Nitrato de Prata 2g
0,056 0Á
Formaldeído 37o/" 3mL
Agua pl 2L

/ Lavar o gel em Água Deionizada por Sseg. (Imediatamente após, submergir na solução de
desenvolvimento)

1'

4.4 Desenvolvimento
/ submergir o gel na solução de Desenvolvimento gelada durante 1 a 2min.
- A soluçdo deve estar gelada (10'C) para o uso.
- A duração do tempo nessq soluçdo depende da resolução das bandas no gel.
- O excesso de tempo escurece todo o gel, prejudicando avisualização das bandas.

Solução de Desenvolvimento

Conc. Final Reagentes

Carbonato de Sódio 6og

Água pl2L
- Preparar um dia antes e manter a l)'C.
- Adicionar os dois outros reagentes'pouco antes do uso.
0,056 o/o Formaldeído 37o/o 3mL
2 mglL Tiosulfato de Sódio (10 mglml.) 400

4.5 Fixação Final

/ submergir o gel na solução de Fixação (Passo l) durante 1 a 3min.

4.6Lavagem
/ Submeter o gel a duas lavagens sucessivas em Água Deionizada por 2min cada.
2.3 Verter a solução entre as duas placas (inclinadas) até derramar naparte inferior sem deixar formar

bolhas.

2.4 Colocar o pente.

2.5 Nivelar as placas para não escorrer o gel.

2.6 Deixar overnight.

3. Eletroforese

3.1 colocar as placas com o gel no aparato da eletroforese (se3 sequencer).

3.2 Colocar Tampão TBE lX nas cubas superior e inferior.

3.3 Aplicar as amostras nas canaletas.

3.4 Condições de corrida:

Voltagem 70Y
Amperagem 65 mA
Potência s5w
Tempo +1,5h

4. Coloração com Nitrato de Prata

Imediatamente após a eletroforese, submeter o gel à coloração com Nitiato de Prata.

4.1 Fixação "i

/ Submergir a placa com o gel na Solução de Fixação durante 30min sob agitação. (O get pode ser
mantido overnight na solução de fi,xação sob agitação)
Solução de Fixação

Conc. X'inal Reagentes

10% Acido Acético 200 mL

Agua 1.800 mL

Volume Final 2L

4.2Lavagem
/ Submeter o gel a três lavagens sucessivas em Água Deiontada por 2min cad4 sob agitação. (Deixar

escorrer 10-20seg antes de mergulhar na próxima água)

4.3 Coloração
/ submergir o gel na solução de coloração durante 30min sob agitação.
 Bletroforese
fs o enzimas (PA G E N ão-D esnat ur ante)

L mm e§pessura (p/ um gel)

Gel Separador Gel Empilhador
(7,5o/o') - 10 mL (4%) - 3 mL
Sol. de Acrilamida 2,5 fiú 0,4 mL
Tampão do gel 2,5 Ít7L 0,75 rnL
5,0 mL 1,85 mL
Persulfato de Amônio 50 pL 15 pL
TEMED 8pL 6wL

I mm esiressur, (p/ dois géis)

Gel Separador Gel Empilhador
(7,5o/o\ -20 mL (4%) - 6 mL
Sol. de Acrilamida 5,0 mL 0,8 mL
Tampão do gel 5,0 mL 1,5 mL
ddH2o 10,0 mL 3,7 mL
Persulfato de Amônio 100 pL 30 pL
TEMED 16 pL 12 p,L
 Eletroforese
Proteínas Totais (SDS-PAGE)

I mm espessura (p/ um gel)

Gel Separador Gel Empilhador
(12,50/") - 10 mL (4%\ - 3 mL
Sol. de Acrilamida 4,2mI- 0,4 mL
Tampão do gel 2,5 mI- 0,75 mL
sDS (10%) 0,1 mL 30 pL
ddH2o 3,2mL 1,85 mL

Persulfato de Amônio 50 pL 15 pL
TEMED 8 prl, 6vL

I mm espessura (p/ dois géis)

Gel Separador Gel Empilhador
(12,50/") - 20 mL (4%) - 6 mL
Sol. de Acrilamida 8,4 mL 0,8 mL
Tampão do gel 5,0 mL 1,5 mL
sDS (10%) 0,2 mL 60 pL
ddH20 6,3 mL 3,7 mL
Persulfato de Amônio 100 pL 30 pL
16 ytL 12 pL
 Gel de Atividade da PO

1. Preparar o gel de poliacrilam ida7,5o/onão-desnatur*1.. '

2. Aplicar 20 ftg de proteína em cada canaleta.
3. Realizar a eletroforese a 150 V.

4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.

5. lncubar no escuro a37oC por aproximadamente 30 minutos no seguinte tampão:

Acetato de Sódio 100 mM, pH 4,5 49 mL

O-Dianisidina Bi-HCl 16 mg

H;O23o/o 1mL
Volume Final 50 mL
Dissolver a dianisidina no HzOz e adicionar o
tampão
Filtrar a solução se necessário

6. Lavar novamente em água destilada.

7. Fixar em Gliceroll0 o/o.

8. Fotografar.
 Gel de Atividade da SOD

1. Preparar o gel de poliacrilamidaT,5oÁ não-desnaturante.

2. Aplicar 20 prg de proteína em cada canaleta.

3. Realizar a eletroforese a 150 V.

4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.

5. Incubar sob iluminaçdo a37oC até o aparecimento das b4ndas, no seguinte tampão:

Tris-HCl50 mM, pH 8,5 50 mL

Riboflavina 2mg
EDTA Naz 150 mg
MTT 10 mg
Volume Final 50 mL
Dissolver a riboflavina e o EDTA no tampão
Adicionar o MTT
Filtrar a soluçdo se necessário

6. Lavar novamente em água destilada.

o/o.
7. Fixar em Gliceroll0
8. Fotografar.
 Gel de Atividade da CAT
"i

1. Preparar o gel de poliacrilamidaT,5Yo não-desnaturante.

2. Aplicar20 pgde proteína em cada canaleta.

3. Realizar a eletroforese a 150 V.

4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.

5. Colocar o gel em HzOz0r0l o/o por 5 minutos, sob agitaçáo.

6.Lavar em água destilada.
7. Revelar o gel por 15 minutos na segünte solução:

Ferrocianeto de Potássio 0,5 g

Cloreto de X'erro 0,5 g
Água desülada 50 mL

Volume Final 50 mL
Filnar a solução se necessário

8. Lavar novarnente em água destilada.

o/o.
9. Fixar em Gliceroll0
10. Fotografar.
 Gel de Atividade da ADH

1. Preparar o gel de poliacrilamidaT,5oÁ não-desnaturante.

2. Aplicar 20 ptg de proteína em cada canaleta.

3. Realizar a eletroforese a 150 V.

4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.

5. lncubar no escuro a37oC por aproximadamente 60 minuios no seguinte tampão:

Tris-HCI 200 mM, pH 8.0 40 mL

MTT 10 mg

NAI)* Naz 10 mg

PMS 1mg
Filtrar a soluçdo se necessário

6. Adicionar o Etanol 95o/o nahora da leitura:

Etanol95To 10 mL
Volume Final 50 mL

7. Lavalr em água destilada.

8. Fixar em Gliceroll0'/".
9. Fotografar.
 Extração ü, e B amilase e Fosforilase do Amido

1. Extragão em pH neutro das três enzimas.

2. Macerar 1 g de MF em 4 mL do sequinte Tampão de extração gelado:

Conc. Final Soluções Estoque L Reação

200 mM Acetato de sódio 400 mM pH 5,5 2000 pL

10 mM CaCIz 0,1 M 400 pL
i mM DTT 0,1M 40 pL
1 mM PMSI'0,1 M 401tL
20 mM Ácido Ascórbico 0,01 g

Agua 1520 uL

Volume Final 4000 pL

3. Centrifugar a 5.000 g por 10 min a 4"C.

4. Coletar o sobrenadante.

- O uso de HEPES e não de Fosfato é devido ao fosfato ser co-fator da fosforilase do amido.
- Preparar o tampão com e sem 10 mM de CaClz (co-fator da o-amilase).

Distingão das enzimas:

- B-amilase - extrato bruto
- o- 15 minutos de banho a70 "C
- Fosforilase do amido - extrato bruto.

- Quantificar o extrato bruto e a 70 oC (a quantidade ile proteínas do extrato bruto que será
consideradapara o gel de atividade da o-amilase a fim de comparagão com os demais).
 Gel de Atividade da cr- amilase

1. Preparar o gel de poliacrilamidaT,5%o não-desnaturante acrescido de 0,5 Yo de amido.

1 mm espessurâ (p/ dois géis)

Gel Separador Gel Empilhador
(7,5o/,\ -20 mL (4%) - 6 mL
Sol. de Acrilamida 5,0 mL 0,8 mL
Tampão do gel 5,0 mL 1,5 mL
Sol. Amido Solúvel27o 5,0 mL 0,0 mL
ddH2o 4,9 mL 3,7 mL
Persulfato de Amônio 100 pL 30 pL
TEMED 16 pL 12 pL

2. Aplicar 20 ptgde proteína em cada canaleta.

3. Realizar a eletroforese a 150 V.
4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.
5. Incubar o gel a 50'C por t hora no seguinte Tampão:

rc Acetato de Potássio 50 mM, pH 5,6 100 mL

x CaClz GM 110,99) 20 mM 0,222 g
Yolume f inal 100 mL

6. Lavar em água destilada.

7. Revelar (corar) na seguinte solução:

x Iodo (PM 253,81) 10 mM o

b

* Iodeto de Potássio (PM 166,0) 14 mM g

* Água destilada 50 mL
Volume Final 50 mL

8. Bandas claras em fundo azul.

9. Lavar novamente em água destilada.

o/o.
10. Fixar em Glicerol l0
11. Fotografar.
 Gel de Atividade Fosforilase do amido
1. Preparar o gel de poliacrilamída7,5oÁ não-desnaturante acrescido de 0,5 % de amido.
1 mm espessura (p/ dois géis)

Gel Separador GeI Empilhador

(7,5oÁ\ -20 mL (4%\ - 6 mL
Sol. de Acrilamida 5,0 mL 0,8 mL
Tampão do gel 5,0 mL 1,5 mL
Sol. Amido Solúvel27o 5,0 mL 0,0 mL
ddH2o 4,9 mL 3,7 mL

Persulfato de Amônio 100 pL 30 pL

TEMED 16 pL 121tL

2. Aplicar 20 pgde proteína em cada canaleta.

3. Realizar a eletroforese a 150 V.
4. Após a corrida, lavar o gel em água destilada.
5. Incubar o gel a 30oC por 4 horas no seguinte Tampão:

Citrato de Potássio (PM 324,42)100 mM, pH

5r1 100 mL
Glicose-1-P 300 mg

Volume Final 50 mL

6. Laver em água destilada.

7. Revelar na seguinte solução:

Iodo 10 mM o
b

Iodeto de Potássio 14 mM o
b

Ácido Acético lmL

Água destilada 100 mL
Volume Final 100 mL

8. Bandas marrom intensas em fundo marrom claro.

9.Lavar novamente em água destilada.

o/o.
10. Fixar em Gliceroll0
11. Fotografar.
 ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO

1. Coletar o material (folhas às t horas e raízes às 14 horas)

2. Utilizar 500 mg de tecido vegetal (folha ouraz) cortado em segmentos de aproximadamente 3 mm e
submetê-lo ao meio de incubação:

Soluções Estoque I Reação

Tampão Fosfato 0,1M pH 7,5 4,95 mL

N-propanol 0,05 mL
KNO3 100 mM 0,050 g

Volume Final 5mL

3. Infiltrar as amostras a vácuo durante um minuto e repetir o processo mais uma vez.

4. Incubar em banho-maria a 30"C por 40 minutos (no escuro).

5. Retirar uma alíquota de 0,5 mL do meio de incubação (as alíquotas devem ser retiradas aos 10 e
os
40 minutos de incubação) e adicionar ao meio de reação contendo:

Soluções Estoque 1 Reação

Sulfanilamifu (lo/o em HCI 1,5 N) 1,0 mL

N-2-naftil etileno 0,02o/o 1,0 mL
Água destilada 1,5 mL

Volume Final 4mL

6. As absorbâncias serão determinadas a 540 nm. Os valores de absorbância utilizados para os cálculos
são: Abs 40' incubação - Abs 10' incubação.

7. A atividade da enzima deve ser expressa (baseada na curva padrão) em pmol NOz-.Kg MF{.h{.
 CURVA-PADRÃO DE NITRITO

1. Preparar uma solução de NaNOz0,125 BS. mtíl

2. Proceder o prepilo da curva conforme a tabela abaixo:

. lr.l
p* "2, m_irtz
eli['; c*o*/,

(mL) (mL) (mL) q§i§("..1)

0,0 2,0 i,0 1,0 0,0000
0,1 1,9 1,0 1,0 0,0125
0,2 1,9 1,0 1,0 0,0250
0,3 r,7 1,0 1,0 0,0375
'i
0,4 1,6 1,0 1,0 0,0500
0,5 1,5 1,0 1,0 0,0675
0,6 1,4 1,0 1,0 0,0790
0,7 1,3 1,0 1,0 0,0995

3. Realizar a leitura a 540 nm.

ATIVIDADE DA REDUTASB DO NITRATO - Elisa (Placa Visível -

Fundo redondo)
- Pipetar 200 p,L do meio de incubação ou da curva-padrão (trtbo de ensaio) nas placas de Elisa.
Os três
primeiros poços devem conter o branco.
 Redutase do Nitrato o'in vitro"

1. Adicionar 1,0 g de caule ou de folha e 1,25 gderaiz ao meio de extração contendo:

Conc. Final Soluções Estoque 1 Reação

0,1 M Fosfato de Potássio 0,1 M, pH 7.5 5mL

2mM DTT .;
1,5 mg
lmM PMSF' 0,8 mg
5mM EDTA 9,3 mg
Volume X'inal 5mL

2. centrifugar a 16000gpor20 minutos e coletar sobrenadante.

3. Coletar uma alíquota de 150 pL do sobrenadante e adicionar ao meio de reação contendo:

Conc. f inal Soluções Estoque 1 Reação

0,1 M Fosfato de Potássio 0,1 M, pH 7.5 1850 pL

0,2mM p-NADH 0,33 mg
10 mM KNOs 2,02 mg
Volume Final 1850 pL

4. Incubar o meio por 3 min a 30oC.

5-Fazer aleitura a340 nmde l em l minutodwante l0min,tendo-seiniciadoaquantificaçãoapartir
de 5 minutos de decaimento.

6. Ocorre decréscimo na absorbância.

7. Atividade expressa em pmol de NADH por minuto por g MF (prmol min-r g-r)

;
ooin
Redutase do Nitrato vitro" - Elisa placa Corning Half Area

- Pipetar 180 pL do meio de reação imediatamente após a incubação (tubo de ensaio)

nas placas
de Elisa. Os três primeiros poços devem conter o branco.
 ErGfacão e Ouantifica,ç.ão de Prolina
Método de Bates, L973

Preparo do Material Vegetal

Material Seco
1. Folhas - retirar a nervura cenFal, picar e macerar (pode ser moído antes de
macerar).

Extração
1. Pesar 100 mg do materialvegetal e macerar em almofariz com pafte do extrator:
Ácido Sulfosalicílico 3o/o (volume total do extrator: 10 mL);
2. Agitar a temperatura ambiente por 60 minuots;
3. Filtrar com papel de filtro.

Quantificação
1. Seguir a tabela da Curua Padrão de Prolina;
2. A alítquota a ser utilizada deverá ser testada, não podendo ultrapassar o volume
de água correspondente ao tubo 1, Tal volume deverá ser mantido nas amostras
(se a alí?uota de amostra for menor que esse volume, o mesmo deverá ser
completado com água).

Extração e Quantificação de Prolina 1/7

 Determinação de ProlinA
Método de Bates, L973

Preparo dos reagentes

Solugão de ilinhidrina Ácida

1. Pesar 2,5 g de Ninhidrina, adicionar 40 mL de Ácido Fosfórico 6 M e 60 mL de
Ácido Acético;
2. Agitar sob aquecimento até dissolver;
3. Deixar esfria para o uso.

Obs.: Preparar somente a quantidade que for usar,

Solução Padrão de Prolina (1O0 Hglml)

1. Preparar uma solução 500 pg/mL (0,050 g de prolina - dissolver e completar o
volume para 100 mL com água destilada) pode ser armazenada em
congelador;
2. Diluir a solução para 100 pg/ml (2 mL da solução de prolina 500 Ug/mL:10mL de
água destilada - completar o volume).

Curva Padrão de Prolina r/2

Preparo da cura padrão

Tubos
Prolina
(100 pg/ml)
(mL)
Água
(mL)
Solução de
Ninhidrina
(mL)
;j:íJ* #:'Í,""
Acido Acético

1 0ro 2,0 2,0 2,0 \CI

2 0r1 L,9 2,0 2,0 t10
3 0,2 1r8 2,0 2,0 *ao
4 0r3 1,7 2,0 2,0 §ã0
5
6
014
0r5
L,6
1r5
2,0
2,0
2,0
2,0
t{ü
Ül §r)

1. Agitar bem os tubos e levar ao banho-maria a 100oC por 60 minutos;

2. Resfriar em banho de gelo efazer a leitura da absorbância no espectrofotômetro
êffi l.= 520 nm.

Construção do Gráfico

Os dados são projetados em um gráfico de dispersão, onde as concentrações

de Prolina (pmol) são colocadas no eixo das abscissas (x) e a média das
absorbâncias obtidas no eixo das ordenadas (y). Aplica-se uma regressão linear, cuja
fórmula (y = ax + b) servirá para determinar a concentração da substância extraída
do tecido vegetal, sendo f o valor da absorbância e xa concentração da molécula a
ser determinada.
OBS.r Deve ser construída uma Curva Padrão cada vez que se preparam os
reagentes.

Cuwa Padrão de Prolina 2/2